（应用化学专业论文）半导体纳米分子灯塔探针.pdf

摘要 近年来，半导体纳米材料已经引起了科研人员的广泛关注。由于半导体纳米 晶体，也称量子点( q d s ) 具有特殊的荧光性能，已被应用于发光二极管、光电 子装置，以及生物标识等领域。尤其，它作为荧光标识在纳米生物技术和生物传 感器领域中的应用已展现出一个崭新的、有着广泛开发和应用前景的高新技术领 域。 本课题主要研究了c d t e 量子点的合成和以c d t e 量子点为荧光剂，d a b c y l 为淬灭剂的分子灯塔探针的合成： 一、c d t e 量子点的合成。在c d c l 2 的水溶液中，加入巯基乙酸( t g a ) 作 为稳定剂，搅拌并调节p h 值，9 0 回流反应，不同回流时间得到不同粒径的 c d t e 量子点。随回流时间增加，c d t e 量子点不断生长，荧光发射峰和紫外吸收 峰逐渐红移。用电子隧道扫描显微镜和电子透射电镜观察得出，回流2 小时的 c d t c 量子点平均粒径在2 3 r i m 。改变c d ”与h t e 。的比例、反应物浓度、t g a 用 量、反应体系p h 值各项反应条件，设计一系列实验，考察了各反应条件对c d t e 量子点生长的影响。 二、在p b s 缓冲溶液中，将c d t e 量子点、d n a 和脱水剂e d c 混合，于室 温下反应2 4 小时，c d t e 量子点表面的羧基与d n a 5 端的氨基缩合，合成分子 灯塔探针。研究了不同琼脂糖凝胶浓度对d n a 电泳的影响，不同p h 值对c d t e 量子点发光性能的影响，e d c 的用量对c d t e 与d n a 连接的影响。通过荧光光 谱观察到，分子灯塔探针的荧光强度比纯c d t e 的降低，与目标d n a 杂交后荧 光强度又有恢复，证明已成功构建了共振能量转移体系。 关键词：c d t e ，量子点，分子灯塔探针，共振能量转移 a b s t r a c t r e c e n t l y , s e m i c o n d u c t o rn a n o c r y s t a l sh a da t t r a c t e dm a n y a t t e n t i o n sf r o ms c i e n c e r e s e a r c h e r s s e m i c o n d u c t o rn a n o c r y s t a l s ，o rq u a n t u md o t s ( q d s ) ，s h o w e du n i q u e s i z e - d e p e n d e n to p t i c a lp r o p e r t i e sa n dw e r eo fg r e a t i n t e r e s tf o r a p p l i c a t i o n s i n l i g h t e m i t t i n gd i o d e ( l e d ) ，o p t o e l e e t r o n i ed e v i c e sa n df o rb i o l a b e l i n g s p e c i a l l y , a s f l u o r e s c e n c el a b e l i n g s ，t h e r ei sab r a n d - n e w , p o t e n t i a la p p l i e df o r e g r o u n di nt h ef i e l d o f n a n o b i o t e e n o l o g ya n db i o s e n s o r t h i sp a p e rm a i n l yr e s e a r c h e dt h es y n t h e t i cr o u t eo fc 仰eq u a n t u md o t sa n dt h e s y n t h e s i so fm o l e c u l a rb e a c o n ( m b ) w i t hc d t c ( f l u o r o p h o r e ) a n dd a b c y l ( q u e n c h e r ) 1 s y n t h e s i so fc ( 1 t e t g aw a sa d d e da st h es t a b i l i z e ri nt h es o l u t i o no fc d c l 2 ， u n d e rs t i r r i n g ，f o l l o w e db ya d j u s t i n gt h ep ht ot h ea p p r o p r i a t ev a l u e s t h e nt h e m i x t u r ew a sr e f l u x e da t9 0 ，w eo b t a i n e dd i f f e r e n ts i z eo fc d t eq d sa td i f f e r e n t r e f l u x i n gt i m e 1 1 1 ec 们eq d sg r e ww i t ht h ei n c r e a s i n go fr e f l u x i n gt i m e t h ep e a ko f a b s o r p t i o na n df u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r am o v e di n t on e a r - i r a tt h es a t i l e t e n d e n c y t h es i z eo fc d t eq d sw h i c hw e r er e f u x e d2h o u r sw a s2 3 n m c h a r a c t e r i z e db ys t ma n dt e m w er e s e a r c h e dt h eg r o w i n go fc d t eq d sb y c h a n g i n gt h er e a c t i o nc o n d i t i o n ( c d 2 + ：h t e 。，c o n c e n t r a t i o no fr e a c t a n t ，q u a n t i t yo f t g a a n dp h ) 2 t h es y n t h e s i so fm o l e c u l a rb e a c o n c d t eo d s ，d n aa n de d cw e r ea d d e d i n t ot h ep h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ( p b s ) s o l u t i o n r e a c t e df o r2 4ha tr o o m t e m p e r a t u r e i nt l l i sp e r i o d c a r b o x y lo nt h ec d r r e a c t e dw i t ha m i d oo nd n a t h i s p a p e ra l s or e s e a r c h e dt h ei n f l u e n c eo fg e l c o n c e n t r a t i o nt od n ae l e c t r o p h o r e s i s ，p h t ot h ef l u o r e s c e n c eo fc d t e e d ct ot h ec o n j u g a t i o nb e t w e e nc d t ea n dd n a t h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t vo fm bw a sl o w e rt h a np u r ec d t c a n da f t e rt h eh y b r i d i z a t i o n b e t w e e nt h eq d c o n j u g a t e dm ba n dt h e i rt a r g e tm o l e c u l e s ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y o fm bg r e wh i g h e rt h a nb e f o r e t h i sp r o v e dt h a tt h ef 6 r s t e rr e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) w a s b u i l t k e y w o r d s ：c d t e ，q d s ，m o l e c u l a rb e a c o n ，f 6 r s t e rr e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得云洼王些太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：砂p 萨? 月2 - n 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞婆王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼至些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：五j p导师签名： 酞渤 签字日期：二一厶年) 月阳签字日期：2 ，一年弓月2 - e t 学位论文的主要创新点 一、在水相中合成高发光性能的c d t e 量子点，研究以巯基乙酸( t g a ) 为稳定剂合成c d t e 量子点的反应条件，通过对c d t e 量子点合成反 应条件的摸索，掌握了量子点合成的反应规律和反应条件。 二、利用c d t e 量子点作为荧光剂合成分子灯塔探针，获得成功，在 与目标d n a 杂交后，荧光强度可以恢复到原来的8 0 ，已成功构建 共振能量转移体系。 第一章绪论 1 1 半导体量子点 第一章绪论 纳米技术是在1 - 1 0 0 纳米范围内创造的功能性材料、设备及系统和在此数量 级上对物质新性能及现象的探索。纳米技术在现今取得的进展被科学家们称为 “第三次工业革命”的推动力。从七十年代末起，量子点就引起了物理学家、化 学家、电子工程学家的广泛关注。近几年，在量子点的合成和性质改造上取得的 显著成果使得量子点的荧光标记在生物学上的应用也开始崭露头角。 随着纳米科学技术的飞速发展，半导体纳米晶体由于其独特的物理和化学特 性，尤其是在光学和生物学方面，正日益显示出巨大的学术价值和良好的商业前 剥1 , 2 1 。国际上许多高水平的期刊如s c i e n c e 和n a t u r e 杂志已多次报道了有关半导 体纳米晶体的合成方法、物理化学特征和其在生物医学和光电子领域等方面的应 用口- 9 。目前在北美己成立了开发半导体纳米晶体生物标记荧光探针的公司，并 推出商标为q d o t t m 产品。 目前有四类量子点被用于生物荧光标记【10 】： ( 1 ) 有光学活性的金属量子点【l l 】 e l g h a n i a n 等将寡核苷酸连到巯基烷烃修饰的金量子点表面作为受体，杂交 后，寡核苷酸探针按特定序列与目标聚核苷酸结合，形成一个聚合网络，每一个 受体单元都连接着多个较短的双螺旋片断。因为量子点的光学性质部分依赖于他 们在聚合网络中的距离，当这个距离远大于粒子的平均直径时里红色，大致相等 时，呈蓝色。这种变化是由金的表面等离子体共振引起的。杂交能使量子点间的 距离缩短，从而产生相应的颜色变化，并形成量子点聚集体( 如图1 - 1 ) 随着杂交 反应的进行，体系的颜色将随量子点光学性质的改变而变化。在实验中，反应前 溶液呈红色，杂交后呈紫红色( 或紫色) ，干燥后呈蓝色。若未发生杂交，或温度 超过了热分解温度，则呈粉红色。此方法能检测超痕量的匹配核苷酸的存在以及 匹配程度【1 2 1 。 第一章绪论 3 t 。c - g 。t a 。e c n 。g 。e 。t - a - t c c t - t t g c - t 一酋一日- g a t - c 一一c - 5 。a - g c n 。t 。g - g t c 。g , a t n g g 。a 一日一n 。c g a c t c t n 。叠一c 。g c 3 图1 - 1 用巯基烷烃寡核苷酸修饰的两个金量子点探针和一个目标寡核苷酸杂交 ( 2 ) 荧光纳米球乳液1 3 1 不同于单个的染料分子，乳液中每一个荧光量子点都包含了1 0 0 2 0 0 个分子， 而每个分子又都含有受到乳液环境保护的发色基团，乳液的保护作用就在于隔开 各个发色基团( 由于各种发色基团中一半含有环状共扼结构，如不隔离，往往会 产生n 一叠加，使峰变宽，产生红移) 。这些量子点不易分解，发出的荧光强 而且稳定。t a y l o r 等用纳米球标记e e o ri 酶，该酶能通过十二个氢键识别双螺 旋d n a 分子的特定序列：g a a t t c ，将其与2 0 n m 大小的荧光纳米球通过酞胺键 连接，连接后的复合物与 d n a ( 具有酶识别位点) 混合反应。结果证明，经荧 光球标记的e c o ri 酶仍然能识别、切割 d n a 。 ( 3 ) 磁性纳米晶体 在磁性纳米晶体表面结合药物，目前正应用在抗癌药物设计上，将抗癌药物 结合到含有铁、钻、镍纳米晶体的承载系统，再利用磁性将药物引导至肿瘤部位， 借此提高在肿瘤部位的药物浓度，可有效抑制癌细胞。这种磁性靶向载体 ( m a g n e t i ct a r g e tc a r t r i d g e s ，m t c ) 技术比化学治疗法更有效，同时亦可限制系统 的药物浓度，减少药物的副作用。 ( 4 ) 发光量子点f 3 4 】 发光量子点又可称为半导体纳米微晶体( s e m i c o n d u c t o rn a n o c r y s t a l ) ，是近几 年发展起来的新材料，是由i i 族或i i i v 族元素组成的稳定的、溶于水的、 尺寸在2 - 2 0 n m 之间的纳米晶粒( 见表1 a ) t 1 4 - 1 8 1 。量子点( q 、l a n t u md o t s ，q d s ) 特殊 的光学性质使得它在生物化学，分子生物学、细胞生物学、基因组学、蛋白质组 学、药物筛选、疾病的检测和诊断等研究中有极大的应用前景。( 以下简称量子 点) 目前研究较多的是c d s 、c d s e 、c d t e 、z n s 等。近年来，半导体量子点由 第一章绪论 于其独特的性质越来越受到人们的重视，其研究内容涉及物理、化学、材料、生 物等多学科，已成为一门新兴的交叉学科。 表1 - 1 各种不同量子点 g r o u pq u a n t u md o t s m g s ，m g s e ，m g t e ，c a s ，c a s e c a t e ，s r s i i 一s r s e ，s r l b ， b a s ，b a s e ，b a t e ，z n s ，z n s e i i i v z f f r e ，c d s c d s e ， c a a s ，i n g a a s ， c d t e ，h g s ，h g s e i n p ，i n a s 1 1 2 量子点的基本性质 量子点由于粒径很小( 几个纳米) ，电子和空穴被量子限域，连续能带变成具 有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子( 例如：多环的芳香烃) 很相似，可以发射荧光【1 9 。 量子点独特的性质基于它自身的量子效应，当颗粒尺寸进入纳米量级时，尺 寸限域将引起尺寸效应、量子限域效应、表面效应，从而派生出纳米体系具有与 宏观体系和微观体系不同的低维物性，展现出许多不同于宏观材料的物理化学性 质，在非线形光学、磁介质、催化、医药及功能材料等方面具有极为广阔的应用 前景，同时将对生命科学和信息技术的持续发展以及物质领域的基础研究发生深 刻的影响1 1 6 1 。 量子点的量子效应集中表现在以下几个方面： ( 1 ) 表面效应 表面效应是指随着量子点的粒径减小，大部分原子位于量子点的表面，量子 点的比表面积随粒径减小而增大。由于纳米颗粒大的比表面积，表面相原子数的 增多，导致了表面原子的配位不足、不饱和键和悬键增多使这些表面原子具有 高的活性，极不稳定，很容易与其它原子结合。这种表面效应将引起量子点大的 表面能和高的活性。表面原子的活性不但引起量子点表面原子输运和构型的变 第一章绪论 化，同时也引起表面电子自旋构象和电子能谱的变化。表面缺陷导致陷阱电子或 空穴，它们反过来会影响量子点的发光性质、引起非线性光学效应。金属体材料 通过光反射而呈现出各种特征颜色，由于表面效应和尺寸效应使纳米金属颗粒 对光反射系数显著下降，通常低于1 ，因而纳米金属颗粒一般呈黑色，粒 径越小，颜色越深，即纳米颗粒的光吸收能力越强，呈现出宽频带强吸收谱。 ( 2 ) 量子限域效应 由于量予点与电子的d eb r o g l i e 波长、相干波长及激子b o h r 半径可比拟， 电予局限在纳米空间，电子输运受到限制，电子平均自由程很短，电子的局域性 和相干性增强，将引起量子限域效应。对于量子点，当粒径与w a r m i e r 激子b o h r 半径a b 相当或更小时，处于强限域区，易形成激子，产生激子吸收带。随着粒 径的减小，激子带的吸收系数增加，出现激子强吸收。由于量子限域效应，激子 的最低能量向高能方向移动即蓝移。最新的报道表明，日本n e c 己成功地制备 了量子点阵，在基底上沉积纳米岛状量子点阵列。当用激光照射量子点使之激励 时，量子点发出蓝光，表明量子点确实具有关闭电子的功能的量子限域效应。当 量子点的粒径大于w a b o e r 激子b o h r 半径时，处于弱限域区，此时不能形成激子， 其光谱由带间跃迁的一系列线谱组成。 ( 3 ) 量子尺寸效应 通过控制量子点的形状、结构和尺寸，就可以方便地调节其能隙宽度、激子 束缚能的大小以及激子的能量蓝移等电子状态。随着量子点尺寸的逐渐减小，量 子点的光吸收谱出现蓝移现象。尺寸越小，则谱蓝移现象也越显著，这就是人所 共知的量子尺寸效应。 量子点的体积大小严格控制着它的光吸收和发射特征。晶体的颗粒越小。其 比表面积越大，分布于表面的原子相对越多，而表面的光激发的正电子或负电子 受到的钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高， 即存在量子尺寸效应( q u a n t u ms i z ee f f e c t ) 1 2 ”，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰 位也相应蓝移：反之则红移( 图1 2 ) 甜。 单独的量子点颗粒容易受到杂质和晶格缺陷的影响，荧光量子产率很低。但 是当以其为核心，用另一种半导体材料包覆，形成核壳( c o r es h e l l ) 结构后，就可 将量子产率提高到约5 0 ，甚至更高，并在消光系数上有数倍的增加，因而有很 第一章绪论 强的荧光发射口3 1 。目前己合成了多种核壳结构的纳米颗粒，如c d s a 9 2 s ， c d s c d ( o h ) 2 ，c d s z n s ， z n s c d s e ，z n s e c d s e ，c d s h g s ，c d s p b s 等 以及多层结构的c d s h g s c d s 。 w a 黼k m o t h 汹m 图l - 2 量子点的大小对发光的影响 1 1 3 量子点的荧光特性 在生物医学研究领域中，探索和发展高灵敏度的非同位素检测方法一直是科 研人员十分关注的课题。现在比较常用的非同位素检测方法有酶联免疫法 ( e l i s a ) 、化学发光法、电化学方法以及荧光分析法等。其中，荧光分析法是一 种重要的分析检测方法，欲了解生物分子之间的复杂相互作用和运动时，可取的 做法即是能实时监测生物体内多样的蛋白和细胞间的相互作用1 2 4 , 2 5 。用有机荧光 染料来荧光标记细胞和生物分子的方法早己用于此1 2 6 l ，但是传统的荧光染料有 着不可逾越的缺陷：激发光谱窄；荧光染料的发射光谱很宽，荧光谱峰( 即半高峰 宽，如1 1w i d t h a t h a l f m a x i m u m ，f w h m ，在1 0 0 n m 以内) 【3 】，有时还有很长的拖 第一章绪论 尾，造成谱峰之间的重叠，限制了能同时被应用的荧光探针数目；有机染料易光 漂白和光解，光解产物对生物分子往往有杀伤作用；生物分子与每种有机荧光染 料连接都需要特定的方法。 量子点，却能克服这些缺陷成为前者的合适替代物。以c d t e 纳米晶体合成 为例，当它的微粒尺寸( 直径) 从2 s n m 生长到4 - o h m 时，它们的发光即可以从 5 2 0 n m 调整到6 5 0 r i m 。它能被从紫外区到红外区的任一波长激发，这样才能有效 地激发和收集发射荧光 4 ；2 7 , 2 8 ，q d s 具有狭窄对称的荧光谱峰( t y p i c a l l y 2 0 3 0 n m ) f 引，可调的发射光谱，它的发射波长( 色) 可以是单一的，也可以是多重 的。可通过改变核心物质的数目而改变，也能通过改变核心物质某成份的数量调 整其荧光强度。这样就能在相同光谱范围内分辨多种q d s 的光谱特征。与传统 的染料分子相比，量子点确实具有多种优势。无机微晶能够承受多次的激发和光 发射，而有机分子却会分解。持久的稳定性可以让研究人员更长时间地观测细胞 和组织，并毫无困难地进行界面修饰连接。量子点最大的好处是有丰富的颜色。 生物体系的复杂性经常需要同时观察几种组分，如果用染料分子染色，则需要不 同波长的光来激发，而量子点则不存在这个问题，可以使用不同大小( 进而不同 色彩) 的纳米晶体来标记不同的生物分子。使用单一光源就可以使不同的颗粒能 够被即时监控。相对于有机荧光染料，q d s 对化学物质和生理代谢的降解有很强 的抵抗力，其光漂白域值也高。美国量子点公司的研究小组【2 9 】比较了q d s 与 a l e x a 染料的荧光强度和光稳定性( 据文献报道a l e x a 染料在已知的有机染料中的 荧光强度和光稳定性是最高的【3 0 1 ) 。实验证明q d s 的荧光亮度明显地高于a l e x a 染料，在a l e x a - 5 6 8 的最大发射波长，q d s 6 0 8 荧光强度为其4 倍；在q d s 的最 大发射波长，为其9 倍；而光稳定性的实验也表现了q d s 的优越性能。在高强 度激发光的照射下，标记于同一细胞的q d s 6 0 8 很稳定，而m e x a - 4 8 8 很快被漂 白。生物分子与q d s 的连接方法简单易行。 量子点最有前途的应用领域是在生物体系中作为荧光探针，与传统的荧光探 针相比，纳米晶体的激光光谱宽，且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄， 颜色可调，即不同大小的纳米晶体能被单一波长的光激发而发出不同颜色豹光， 并且光化学稳定性高，不易分解。如果能解决不同材料量子点与生物分子偶联的 问题，就可以用量子点代替很多荧光染料分子，从而在细胞器定位、信号转导、 第一章绪论 原位杂交、胞内组分的运动和迁移等研究中发挥巨大作用。 尽管q d s 具有以上的种种好处，它也不是无所不适的，仍存在尚需改进的 地方： ( 1 ) 设计合成亲水性的发光量子点，修饰表面的化学基团以适应各种生物学 上的应用。 ( 2 ) 在高选择性、高度特异性标记细胞和生物分子的技术上推陈出新。 ( 3 ) q d s 在活体内的惰性，即对活体的长期毒性还有待验证。 ( 4 ) 非特异性背景的弱化问题。 1 2 量子点在生物领域的研究与应用 量子点特殊的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因 组学、蛋白质组学、药物筛选、生物大分子相互作用等研究中有极大的应用前景 1 3 l - 3 6 。 1 2 1 量子点与生物分子的连接 目前用于半导体量子点与生物的连接有以下几种方式： ( 1 ) 依靠静电吸引力 使生物分子连接到q d s 表面包覆的一层带负电荷的游离基团上。方式有： a 在q d s 外层包覆一层d h l a ( d i h y d r o l i p o i ca c i d ) ，再连接上生物素，以后根据 需要将蛋白、核酸甚至细胞膜生物素化，依靠生物素和抗生物素蛋t ! l ( b i o t i n a v i d i n ) 之间的高度特异性结合力将q d s 标记到目标分子上：b 直接将带正电荷的蛋白 连接到q d s 上：c 通过一个带正电荷的亮氨酸拉链蛋i 刍( l e u c i n e z i p p e rp r o t e i n ) 为桥将连接在拉链另一端的单抗标记上q d s 3 7 3 s 。 ( 2 ) 共价偶联 将q d s 包覆一层聚丙烯酸，然后修饰成疏水性的聚丙烯酸醋，再将抗体、 链酶亲合素、或其他蛋白共价偶联到q d s 上。w a n g 等人用的方法是，用n h sm 羟基琥珀酰亚胺) 和e d c 将量子点活化，再用蛋白将其取代( 如图1 3 ) t 钔i 。 第一章绪论 e 翩? 冬彳喊咐 + 髀m 囊聃- 婚缁伊_ 一 竺。戳更_ 一+ 洲s ( 3 ) 包埋 将共吸附肤用聚乙烯乙二醇层包覆到q d s 上【3 9 1 ；或者埋入磷脂封闭的共聚 合微束, g t 3 0 1 。 1 2 2q d s 在生物化学中的研究及应用 对生物体系越来越深入细微的研究使科研工作者面临着巨大的挑战一一找 寻一种极小，能够进入细胞甚至细胞器却有着高选择性、灵敏性、光谱可调并且 稳定的生物探针。 应用于生物学就意味着，q d s 必须有水溶性。突破性的工作是n i e 研究小组 完成的【4 1 。1 9 9 8 年，他们宣布解决了在有机相中生成的q d s 的疏水性问题。将 巯基乙酸连到c d s z n s 的z n s 外壳上，游离在外的羧基使q d s 具有良好的水溶 性，而且为生物分子( 例如蛋白，肽，核酸) 的共价偶联提供了连接位点，此外， 这层巯基乙酸层还有利于降低带负电荷的蛋白吸附到粒子本身。他们用修饰过的 q d s 标记了一种单抗，证实标记不影响单抗与多克隆抗体的反应。光稳定性、水 溶性及与生物分子连接，这几个首要问题的解决，为半导体纳米晶体在生物学的 应用打开了大门。 w a n g ， sp 等人【4 l 用红、绿两种颜色的c d t e 量子点分别标记b s a ， a n t i - b s a ，i g g 。连接后走凝胶电泳，发现标记了q d s 的b s a 和i g g 都比未标 记前对热更稳定。i g g 和q d s i g g 的s d s - p a g e 电泳带的相对强度表明i g g 在 s d s 的作用下9 6 c h e i 热1 5 0 秒后完全碎成4 0 5 0 k d a 的片断，而相同条件处理的 q d s i g g 小片断很少，却在完整的标记抗体处有明显的带。h p l c 分析的峰位移 表明每一个b s a 分子或i g g 分子上最多只连接了一个量子点。 国内的研究人员在量子点的性质及应用上也做了一定研究。林章碧等人以水 ? 撕 r 苎二兰堕丝 相合成的q d s ( c d t e ) 标记胰蛋白酶。观察到连接到蛋白上的q d s 的吸收和发射 光谱均发生蓝移。值得一提的是，张皓等人在水相中合成了单壳层c d t e 半导体 量子点。以往的q d s 都是在有机溶剂中制备的，不适合于在水溶液中进行的生 物反应，且高温高压制备，条件比较苛刻，步骤也比较复杂。而c d t e 量子点的 合成以巯基丙酸作为稳定剂，常温和常压条件下在水溶液中合成，量子产率 1 0 。3 8 。包覆在粒子外层的游离羧基为进一步连接生物分子提供了位点1 4 2 1 。 1 2 3 量子点的荧光共振能量转移在生物检测中的应用 1 2 3 1 量子点应用于共振能量转移研究的优势 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) 是一种非 辐射能量跃迁，通过分子问的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激 发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光( 敏 化荧光) ，也可以不发荧光( 荧光猝灭) ，同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延 长。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：( 1 ) 供、受体 的激发光要分得足够开；( 2 ) 供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠；( 3 ) 供、 受体的发射光谱要足够分得开。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收 光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等 因素有关。人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的 对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结 构功能检测等诸多方面f 4 3 删。 传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发 射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新 的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之 处( 4 5 - 4 9 】。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减 少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的 光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限 度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射 可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能 量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量 9 第一章绪论 转移效率。 1 2 3 2 量子点共振能量转移应用于蛋白特异性结合的研究 w a n g 等应用量子点的共振能量转移原理，以发射光谱为6 1 1n m 、5 5 5r i m 的红、绿量子点分别标记牛血清白蛋白s a ) 和抗牛血清白蛋白抗体( i g g ) ，当 二者形成免疫复合物时，b s a 上的红色量子点荧光增强，i g g 上的绿色量子点 荧光相应减弱，这是因为抗原、抗体彼此结合，将两种量子点拉得足够近，使其 发生偶极2 偶极相互作用，这时尺寸较小的绿色量子点的激发态能量转移给了尺 寸较大的红色量子点激发态，即发生了共振能量转移。当加入未标记量子点的 b s a 时，它就会与q d 2 b s a 发生竞争，将q d 2 b s a 从免疫复合物上取代下来， 阻止了共振能量转移的发生，这时红色量子点荧光强度降下来，而绿色量子点荧 光强度又恢复原样。 在w i l l a r d 等h 5 】将四甲基罗丹i j f ( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) 标记的链霉 亲和素( s t r e p t a v i d i n ) 与生物素化的b s a 特异性结合，用量子点标记b s a ，形成 了以量子点作为能量供体，有机荧光物质t m r 作为能量受体的共振能量转移体 系，可以对生物素与链霉亲和素的结合进行检测( 如图1 4 ) 。以4 0 0n m 的光进 行激发，对于量子点来说有很高的激发效率，而对于t m r 来说则几乎不被激发。 当以这个波长对连接体进行激发时，由于发生了共振能量转移，t m r 荧光强度 显著增强。 图1 4 利用蛋白质特异性结合的共振能量转移分析 1 2 3 3 量子点的共振能量转移应用于生物传臧器的模型设计 除了用于免疫分析和其他特异性结合分析外，应用共振能量转移原理，量子 1 0 第一章绪论 点在生物传感器方面的研究更是方兴未艾。在这些传感器中都是以量子点作为能 量供体，以有机荧光染料作为能量受体。c l a p p 等m l 将人工改造的并且保持结合 能力的麦芽糖结合蛋l 刍( m a l t o s e b i n d i n g p r o t e i n ，m b p ) 与量子点不可逆静电结合， 花青染料( c y a n i n ed y e s ) 共价结合到m b p 上，形成q d - m b p c y 3 。在连接到量子 点上的m b p 保持一定数目的情况下，增加m b p c y 3 时，量子点荧光强度随之 减弱，c y 3 荧光强度相应增加，也就是说包围在量子点周围的能量受体越多，光 谱重叠越好，能量转移效率越高。可以用如下公式表示： e ：生( 1 1 ) r o + 月。 r o = ( 8 8 x 1 0 2 3 腰2q 0 ) “6 a( 1 - 2 ) n 代表平均一个量子点上结合的受体的个数，风代表能量传递达到5 0 时的距 离，r 代表能量供、受体之间的距离。k 2 ，是偶极一偶极的互动反应的定位因素； ，是光谱交迭整数，m 1 c m 3 ；q o ，是没有受体结合的给体的量子收率。 在连接到量子点上的m b p - - c y 3 数目一定的情况下对q d 5 io r 。q d s 3 0 。、 q d 5 5 5 。3 种量子点的能量转移效率进行比较，得到q d 5 5 5 。能量转移效率最高， 也就是说该量子点的发射光谱与c y 3 吸收光谱重叠程度最佳。 m e d i n t z 等4 7 1 应用麦芽糖结合蛋白作为生物识别物质，设计了浓度型麦芽糖 传感器( 如图1 5 ) 。为了提高与量子点结合能力，将组氨酸五聚体片断与麦芽糖 结合蛋白的碳端相连，形成m b p - - 5 h i s ，它的生物活性仍然保持不变，并可以 稳定地结合到量子点上。这样，通过控制实验条件，一个量子点周围可以结合固 定数目的m b p ，该实验用的比例是l ：1 0 ，形成了个量子产率固定的传感器 模型。他们同时制备了共价的1 3 一环糊精( b - - c y c l o d e x t r i n ，1 3 - - c d ) ，用来结 合m b p 上的糖类结合位点，与麦芽糖形成一个竞争作用。当糖类结合位点被0 一c d q s y 9 ( q s y 9 是一种荧光猝灭物质) 占据时，就形成了单供体一多受体的 共振能量转移模型。由于m b p 的糖类结合位点与1 3 环糊精和麦芽糖有相似的 亲和性能，这样，加入麦芽糖就会很容易地取代1 3 一c d q s y 9 的位置，体系 的量子产率即荧光强度便会随着麦芽糖浓度的增加而增加。但是，相对于有机荧 第一章绪论 光染料和金属螯合物，量子点的物理尺寸较大，增大了供体和受体间的距离，从 而限制了共振能量转移效率。为了消除这一影响， c y 3 被插入供、受体之间， 作为能量转移的桥梁，两步能量转移糖类传感器被设计出来( 如图i - 6 ) 。 图i 5 浓度型麦芽糖传感器设计模型 图1 6 两步能量转移糖类传感器设计模型 由于单供体2 多受体共振能量转移体系提高了共振能量转移效率，为设计光 学传感器提供了有利条件。m e d i n t z 等【4 8 】设计的光学传感器与前面提到的单步麦 芽糖传感器具有相同的结构，只是能量转移受体有所不同，采用光敏物质1 ，3 ， 3 一三甲基一螺【2 ，2 一吲哚啉- - 2 h - - 1 一苯并吡喃】( 简称b i p s ) ，用磺化n 一羟 基琥珀酰亚胺( s u l f o - n h s ) 将其活化，产生s u l f o - n h s b i p s ，当照射光在可见光区 与紫外光区之间变换时，就会产生可逆的光学转换，如图1 7 所示。当用紫外光 激发时，b i p s 就会转换为步花菁( m e r o c y a n i n e ，m c ) 形式，与量子点发生共振 能量转移，使其荧光猝灭；当曝露在白光状态时，m c 转换回螺吡喃( s p i r o p y r a n ， s p ) 的形式，不能发生共振能量转移，量子点的荧光强度增强。 第一章绪论 1 3 分子灯塔 图l 一7 利用麸振能量转移原理的光学传感器 随着分子生物学的迅猛发展，新技术不断出现。其技术应用也日益广泛，特 别是快速简便准确地检测基因序列已变得非常重要。新型的基因检测探针分 子探针( m o l e c u l a rb e a c o n s ) 是将d n a 分子杂交技术和荧光共振能量转移原理 相结合而开发出来的。分子灯塔可以对基因序列准确的检测，操作简便快速而且 可以实现d n a 检测的实时定量。现在已广泛地应用于d n a 序列地测定、等位 基因和点突变检测等方面 5 0 - 5 3 】。 1 3 1 原理 分子灯塔探针( 图1 - 8 ) 是合成一条寡核苷酸链，其链由两部分组成，一部 分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列，是检测靶基因的部分，位于探针 的中间部分，探针形成后构成探针的环部分：另一部分是分别在5 端和3 端标 记荧光物质和荧光淬灭剂，5 端与3 端有几个互补的碱基对存在，因此可以形成 两端反转配对，构成探针的茎部。从而寡核苷酸链成环状，由于这种特定的结构 存在，使荧光剂和荧光淬灭剂相接触，荧光剂激发出的荧光被转移到荧光淬灭剂 上，并以热能的形式散发出去，导致荧光淬灭剂将荧光剂的荧光淬灭，因而探针 的这种茎环状结构不被破坏就不发生荧光。 第一章绪论 当把探针与靶基因、相应引物加入同一个p c r 反映体系中，通过p c r 循环 扩增，使靶基因拷贝数增加。经过变性使靶基因打开双链变成单链，探针的茎环 状结构也同样被打开。探针的碱基序列如和靶基因的碱基序列完全互补，则经复 性即可发生杂交。杂交的结果使探针的5 端和3 端分离，荧光淬灭剂对荧光剂 的淬灭作用消失，从而产生荧光；探针的碱基序列如和靶基因的碱基序列之间不 存在互补，则经复性亦不可能发生杂交，探针的茎环结构又恢复，荧光淬灭剂对 荧光剂的淬灭作用依然存在，在这种情况下无荧光产生：这样通过检测荧光强度， 就可以达到检测d n a 的目的。 十 淬灭荆 目标d n 杂变后 图1 8 分子灯塔探针结构及原理 分子灯塔探针的长度，可以根据需要设计不同长度的寡核苷酸链，其长度范 围一般在5 1 1 0 个b p ，但大多数探针的长度为1 8 3 0 个b p ，平均为2 4 个b p 。 寡核苷酸链过长，探针的浓度下降，最终影响检测灵敏度。在探针的检测序列中 应避免互补序列，同时也应避免过多连续相同碱基的存在( 一般不超过6 个碱基 1 4 第一章绪论 如g g g g g g ) 。 1 3 2 分子灯塔检测d n a 的特点 随着分子生物学技术，尤其是p c r 技术在医学领域的广泛应用，可对标本 的核酸进行定量分析，在基因研究、基因诊断、治疗效果的监测等方面起着十分 重要的作用。常用的以p c r 技术为基础的核酸监测技术，都需要p c r 扩增后的 后处理过程( 凝胶电泳、放射自显影等) ，十分繁琐和费时，而分子灯塔则无需 这些过程。可以通过直接检测荧光强度而达到检测基因的目的。这一技术与传统 的技术相比有以下特点。 这种方法使整个p c r 扩增系统和检测置于一个封闭的系统中，因而可以显 著降低各种污染，而且应用荧光检测仪，可以定量分析d n a 。 实验操作快速，效率高。整个检测过程大约只需2 h 即可完成样本的检测， 这与传统的方法相比大大缩短了实验时间。这种方法的建立，为人群大规模的核 酸检测和疾病检测提供了更有效的方法。 这种方法对检测样本的d n a 含量要求低，灵敏度高，对同一样本取不同的 量d n a ，其检测结果都是完全一致的，所以该技术更适用于经福尔马林固定和 石蜡包埋的组织样本。 实时d n a 定量分析使结果更加准确且重复性也良好。本方法检测乳腺癌的 m y e 、c e n d i 和e r b b 2 基因的结果与s o u t h e r n 印迹分析方法结果相比，在样本d n a 多拷贝情况下，结果完全一致；在样本d n a 低拷贝情况下，分子灯塔分析可以 检测到靶基因，而s o u t h e r n 印迹分析方法则不能检测出。 1 3 _ 3 分子灯塔探针在核酸检测中的应用 分子灯塔探针目前主要的探针标记物有以下几种： 5 - c o u m a r i n 3 d a b c y l：5 - e d a n s - 3 - d a b c y l： 5 - f l u o r e s c e i n - 3 一d a b c y l：5 - l u c i f e ry e l l o w - 3 一d a b c y l； 5 - e o s i n - 3 - d a b c y l ；5 - t a m r a - 3 - d a b c y l ；5 - t e x t sr e d 一3 - d a b c y l 。 其中，d a b c y l 4 ( 4 - d i m e t h y l a m i n o p h e n y l a z o ) b e n z o i ca c i d j 是一种荧 光淬灭剂。它可以将荧光物质的荧光淬灭。 第一章绪论 分子灯塔探针的应用主要有以下一些场合。 1 、p c r 扩增产物的定量测定 b i e c h e 等应用该方法分