（应用化学专业论文）混合酸酐法合成L脯氨酰L亮氨酰甘氨酰胺（PLG）三肽.pdf

浙江大学顾士学位论文 摘要 p l g 是一种小分子三肽，即工一脯氨酰吐一亮氨酰一甘氨酰胺( 工p r o l y l - l 一l e u c y l g l y n h 2 ) 。该三脓被证实具有抑制黑色素细胞刺激激素释放的生理活性， 故又称为黑色素细胞刺激素释放抑制因子( m i h ) ，可用于治疗帕金森氏症。 本论文通过对各种合成短肽方法的比较，设计了用混合酸酐法合成p l g 三肽， 并且讨论了反应的影响因素。主要包括以下内容： ( 一) 用混合酸酐法合成p l g 三肽。以工稍氨酸、- l 一亮氨酸、和甘氨酰胺为原料， 逐步合成了p l g 三肽，其中l 脯氨酸的氨基甩苄氧羰基保护。最后苄氧羰基保护 基团用钯碳( p d c ) 催化氢化一步脱去，得到终产物，实验证实该路线是一条优 异有效的工艺路线。 ( - - ) 通过正交实验，得到了用苄氧羰基保护工脯氨酸的氨基的最佳工艺条件： n ( c b z ) n 位p r o ) 2 6 ；反应温度一5 ；反应时间2 h 。 ( - - ) 考察了混合酸酐法合成肽的影响因素。通过实验比较了氯甲酸乙酯和氯甲 酸异丁酯两种成酐试剂及反应温度、碱的性质对合成效果的影响。有利于高光学 纯度p i g 的大量合成。 关键词：p l g 三肤；液相合成；混合酸酐法 塑坚叁堂堡主堂垡堡苎 a b s t r a c t t f i p a p t i d el - p r o l y l - l l e u c y l g l y c i n a m i d e ( p l g ) ，a sa m e l a n o c y t es t i m u l a t i n g h o r m o n e i n h i b i t i n gh o r m o n e ( m i h 0 ，h a sb e e nr e p o r t e d t oh a v es o m eu s e f u l p h y s i o l o g i c a la n dp h a r m a c o l o g i c a lf u n c t i o n s c o m p o s e dt oo t h e rm e t h o d s ，t h i sp a p e r u s e dm i x e d c a r b o n i ca n h y d r i d em e t h o dt o s y n t h e s i sp l g , a n dd i s c u s s e dr e a c t i o n f a c t o r s i tm a i n l yi n c l u d e d ： ( 1 ) i nt h ep a p e r , p l gp e p t i d ew a ss y n t h e s i z e dw i t hl - p r o 、l l e ua n dg 1 y c i n a m i d e u s i n gm i x e d c a r b o n i ca n h y d r i d em e t h o d i nt h i sm e t h o d ，t h ea m i d oo fl p r oa n d l l e uw e r ef i r s t l yp r o t e c t e db yc a r b o h e r m o x ya n dt h e nt h ec a r b o ，e n z o x yw a sr e m o v e d b y p d c ( 2 ) t h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o r t h er e a c t i o no f a m i d op r o t e c t e db yc a r b o b e n z o x yw e r em t m n e d ( 3 ) d i f f e r e n te f f e c t so nt h es y n t h e s i so fp l gp e p t i d eu s i n gm i x e d c a r b o n i c a n h y d r i d em e t h o dw e r ed i s c u s s e di nt h i sp a p e r t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a t p l gp e p t i d ew i t hh i 曲0 p c o u l db es y n t h e s i z e da tt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：l s o b u t y l c h l o r o r m a t ea sm i x e d a n h y d f i d ea t 一1 0 k e yw o r d s ：l - p r o l y l - l l e u c y l - g l y c i n a m i d e ；p e p t i d es y n t h e s i s ；m i x e d c a r b o n i c a n h y d r i d em e t h o d ； 浙江大学硕士学位论文 缩写符号 p l g l 脯氨酰七一亮氨酰一甘氨酰胺 l p r ol 一脯氨酸 l l e u l 一亮氨酸 c b z卅苄氧羰基 b o c 叔丁氧羰基 f m o c芴甲氧羰基 b p o c 联苯异丙氧羰基 d c c 二环己基碳二亚胺 n m m n 一甲基吗啡啉 t e a三乙胺 i b c f 氯甲酸异丁酯 e c f 氯甲酸乙酯 t f a 三氟乙酸 t h f 四氢呋喃 浙江大学硕士学位论文 第一章引言 1 1 概述 众所周知，蛋白质是机体内最重要的一类生物大分予，晷前被广泛地作为药 物用于疾病的治疗。但是，蛋白质类药物也有缺点，如分子量大、制各困难、存 在抗原性、体内易降解等。令人惊喜的是，人们发现某些分子量较小的多肽同样 具有类似蛋自质的活性，且功能更显著。随着对这类生物活性敢的进一步研究， 已为新药的研制和开发提供了一个新的途径。d a t a m o n i t o r 公司的研究报告显示： 蛋白质类药物市场在今后1 0 年内将快速增长，并更具吸引力。2 0 0 2 年全球蛋白质 类药物的销量己超过6 0 0 亿美元，是2 0 0 1 年的2 倍以上。这几年蛋白质类药物市 场的发展速度惊人，年增长率达1 9 ，与增长率仅为9 的总体医药市场相比， 该领域令人瞩目，而在蛋白质类药物市场中，肽药物更是不容忽视的亮点。肽发 展具有以下几个新领域 ( 1 ) 抗菌肽 几乎所有类型的生物在微生物入侵时，其机体都会产生一些物质加以抵御， 这些物质中大部分是小分子多肤，即抗菌肽，也称多肽抗生素。 抗菌肽一般由1 2 4 5 个氨基酸构成，来自不同物种的抗菌肽一级结构有相似 之处，如含精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸丽带有正电，呈疏水性或双亲 性。抗茵肽因其结构和作用方式不同可分成两大类：一类是其有螺旋结构的线性 多肽；另一类是由一个或多个二硫键或硫醚连接构成的环形多肽，含有8 一折叠和 ( 或) a 一螺旋。 由于其独特的结构，抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、免疫原性较 低、作用迅速、抗菌谱广等特点，不仅可以抑杀细菌、真菌、病毒和寄生虫，对 多种癌细胞、转化细胞和实体瘤也有明显的抑制作用，且某些抗菌肽在发挥以上 作用时对正常细胞没有破坏作用。目前，传统的抗生素大多出现了与其相应的耐 药致病菌株，常用的抗癌药物又对“敌我”细胞不能区分，而抗菌肽不受已产生 的耐药性突变影响，靶菌株也不易出现耐药性突变，另外其独特的选择毒性作用 和其较低的免疫原性引起人们广泛的兴趣，使其成为新一代的抗菌、抗癌药物。 浙江大学硕士学位论文 ( 2 ) 肽疫苗 传染性疾病，如肝炎、流感、疟疾和血吸虫病等，流行很广，对感染人群的 危害很大。目前，虽然可用化学药物治疗且疗效较好，但治愈后再感染率很高， 在疫区需对再次感染者不停地进行治疗。因此，若要根本防治这些传染性疾病， 就必须借助于疫苗。虽然灭活或减毒疫苗较有效，但仍有引起感染的可能性。因 此，对于危险性很大的传染病，如艾滋病等，人们就不敢使用灭活或减毒疫苗， 对于这类疾病来说，发展合成肽疫苗显得尤为重要。 合成肽疫苗作为疫苗研究的一个方向，目前仍处于发展阶段，但已经取得了 一些可喜的研究结果。如疟疾和计划生育等的合成多肽疫苗目前已经进入i 、i i 期 临床阶段，在非洲的一些国家已开始试用。另外，未来合成多肽疫苗的一个重要 发展方向是联合疫苗，使人们接种一个疫苗的同时就能防治多个传染性疾病，从 而减少接种次数。 ( 3 ) 食品感官肽 作为一种非糖甜味剂，阿斯巴甜( a s p a r t a m e ) 就是一类开发较成功的食品感官 肽。阿斯巴甜由苯丙氨酸与天冬氨酸为原料合成，其甜度为蔗糖的2 0 0 倍，可供 糖尿病患者等忌糖者食用，且热量低，可用于减肥保健品。赖氨酸二肽( 如 n a c - p h e l y s ) 被证明是有效的阿斯巴甜替代品，因为它不含有酯的功能特性，因 而在食品加工和储存过程中更加稳定。其它食品感官肽如苦昧肽、酸味肽、咸味 肽、风味肽、抗氧化肽、表面活性肽等。这些食品感官肽也大有用武之地。如咸 味肽作为无钠调味剂，可为糖尿病患者和高血压患者所用，也可作为保健食品。 而风味肽则可为加工食品的风味和香味的前体，起到增强风味的作用。表面活性 肽可作为食品的稳定剂和乳化剂。食品感官肽在我国生产和应用刚刚起步，但市 场潜力巨大，值得进一步研究与开发。 总之，肽药物的研究与开发作为国际上新兴的生物高科技领域，具有极大的 市场潜力。某些肽已经作为保健食品和药物实现了工业化生产，并取得了明显的 经济效益。国外已开发出以活性多肽为功能因子的各种低抗原食品、婴儿食品、 运动食品、促钙吸收食品、降压食品等系列食品。和发达国家相比，我国在这一 领域有定差距，我们应该充分利用现有的资源，加强产品开发和技术创新，使 肽药物成为我国医药市场的又一亮点。 浙江大学硕上学位论文 由于组成蛋白质和活性多肽的氨基酸是具有光学活性的。因此，在多肽合成中， 对所选用的缩合试剂和接肽方法的首先要求是它必须能保证合成产物具有所需要 的光学活性，其次是缩合产率要高，反应速度要快，副产物要易于分离除去。 1 2p l g 的研究意义 随着人1 ：3 平均寿命的增长，老年人的比率不断提高，研究帕金森病已成为当 前神经病学领域中的一个重要课题。左旋多巴、复方多巴以及麦角类多巴胺激动 剂已成为目前治疗帕金森病的有效药物，但长期用药会出现疗效减退或“开关” 现象等问题。为了进一步提高治疗效果，探讨帕金森病的发病机理，人们开始对 肽类神经递质进行研究。 p l g 是一种小分子三肽，即工一脯氨酰_ l 一亮氨酰一甘氨酰胺( 三一p r o l y l - l l e u c y l 一 g l y n h 2 ) 。其结构式和性质见表1 - 1 。1 9 7 1 年c o l i s 等首先发现存在脑内的肽酶 可分解催产素( 九肽) 而得到这个三肽。同年，该三肽被证实具有抑制黑色素细 胞刺激激素释放的生理活性，故又称为黑色素细胞刺激素释放抑制因子( m i h ) 。 m i h 可抑制黑色素细胞刺激释放因子( m s h ) 的释放，因此可用于治疗帕金森氏 症。k a s t i n 等将p l g 用于临床取得良好效果。p l g 副作用轻微，使用安全，为临 床长期应用多巴类药物疗效减退者提供了较为有效的新方法吼 由于工一脯氨酰七一亮氨酰一甘氨酰胺具有重要的生理药理作用，因此，对于这 种肽的合成研究有着重要意义。目前已经报导的p l g 的合成多以三一脯氨酸、工一 亮氨酸和甘氨酸为原料，采用叔丁氧羰基为保护基，通过碳二亚胺法或活化酯法 合成p , 4 1 。这些方法大多过程繁复，成本昂贵，且用碳二亚胺法进行缩合后处理困 难。 本文从经济角度出发，以工一脯氨酸、三一亮氨酸、和甘氨酰胺为原料，研究混 合酸酐法合成工一脯氨酰_ 工一亮氨酰一甘氨酰胺的路线。使治疗帕金森病的神经肽一 p l g 三肽具有积极广阔的市场前景。 1 3 工一脯氨酸、工一亮氨酸和l 一脯氨酰屹一亮氨酰一甘氨酰胺( p l g ) 的 物理化学性质 3 浙江大学硕士学位论文 表1 - 1l 脯氨酸、工亮氮酸、工脯氨酰正琉氨酰甘氨酰胺( p l g ) 的物理化学性质【5 j l 工一脯氨酸三一亮氨酸上一脯氨酰七一亮氢酰一甘氨酰胺 英文名l p r o l i n e 分子式c 5 h 9 n 0 2 分子量 1 1 5 1 3 结构式 工i 七u c i n e c 御t 3 n 0 2 1 3 1 1 7 q人o。h2卅fiio 0 旋光度 q ? 5 6 0 4 。( c = 1 ， + 1 4 9 。+ 1 6 0 。 5 m o l l 盐酸) 一8 6 2 。r c = 1 ， h 2 0 ) m p 2 2 0 2 2 2 c2 9 3 - 2 9 5 1 2 外观在水中得菱柱形结白色晶体 晶，在乙醇中得到 针状结晶 p l gp e p t i d e c 1 3 h 2 4 0 3 - i 4 2 6 8 - 4 6 9 ( c = 0 0 1 ，c h ，o h ) 1 2 2 白色晶体 1 4 立体化学中的概念与表征 1 4 1 概念【6 t 7 】 对映体： 手性是三维物体的基本属性。如果一个物体不能与其镜像重合，该物体就称 为手性物体。在这种情况下，这两种可能的形态被称为对映体，彼此互为对映的。 非对映异构体： 具有相同的化学组成，但不是镜像，在分子中的一个或多个不对称中心具有 不同的构型而彼此不同的物质。 外消旋体： 等量的对映体的混合物，由于对映体旋光作用的相互抵销两失去了旋光性。 浙旺大学硕上学位沦文 袭1 - 1 工- 脯氨酸、工- 亮氨酸、工脯氨酰正璃氨酰甘氨酰胺( p i g ) 的物理化学性质刚 工一脯氨酸 三亮氨酸l 一脯氨酰七一亮氨酰一甘氪酰胺 英文名l p r o l i n e 分_ 式 c 5 h 9 n 0 2 分子量1 1 5 1 3 结构式 l l e u c i n e c 6 h 1 斟0 2 1 3 1 - 1 7 h 2 n 一。童。 “。舡h a 旋光度 n ? 5 6 0 4 。化= 1 ，+ 1 6 9 。+ 1 6 0 。 5 m o i l 盐酸) 一8 6 2 口f c = 1 h 2 0 ) m p 2 2 0 - 2 2 2 。c2 9 3 - 2 9 5 c 外观在水中得菱柱形结白色晶体 晶，在乙醇中得到 针状结晶 p l gp e p t l d e c 1 # i 弘0 3 n 4 2 6 8 4 6 9 ( c ! o m ，c h 3 0 h ) 1 2 2 白色晶体 1 4 立体化学中的概念与表征 1 4 1 概念【t 1 对映体： 手性是三维物体的基本属性。如果一个物体不能与其镜像重台，该物体就称 为手性物体。在这种情况下，这两种可能的形态被称为对映体，彼此互为对映的。 非对映异构体： 具有相同的化学组成，但不是镜像，在分子中的一个或多个不对称中心具有 不同的构型而彼此不同的物质。 外消旋体： 等量的对映体的混合物，由于对映体旋光作用的相互抵销而失去了旋光性。 等量的对映体的混合物，由于对映体旋光作用的相互抵销而失去了旋光性。 浙江大学硕士学位论文 表1 - 1l 脯氨酸、工亮氮酸、工脯氨酰正琉氨酰甘氨酰胺( p l g ) 的物理化学性质【5 j l 工一脯氨酸三一亮氨酸上一脯氨酰七一亮氢酰一甘氨酰胺 英文名l p r o l i n e 分子式c 5 h 9 n 0 2 分子量 1 1 5 1 3 结构式 工i 七u c i n e c 御t 3 n 0 2 1 3 1 1 7 q人o。h2卅fiio 0 旋光度 q ? 5 6 0 4 。( c = 1 ， + 1 4 9 。+ 1 6 0 。 5 m o l l 盐酸) 一8 6 2 。r c = 1 ， h 2 0 ) m p 2 2 0 2 2 2 c2 9 3 - 2 9 5 1 2 外观在水中得菱柱形结白色晶体 晶，在乙醇中得到 针状结晶 p l gp e p t i d e c 1 3 h 2 4 0 3 - i 4 2 6 8 - 4 6 9 ( c = 0 0 1 ，c h ，o h ) 1 2 2 白色晶体 1 4 立体化学中的概念与表征 1 4 1 概念【6 t 7 】 对映体： 手性是三维物体的基本属性。如果一个物体不能与其镜像重合，该物体就称 为手性物体。在这种情况下，这两种可能的形态被称为对映体，彼此互为对映的。 非对映异构体： 具有相同的化学组成，但不是镜像，在分子中的一个或多个不对称中心具有 不同的构型而彼此不同的物质。 外消旋体： 等量的对映体的混合物，由于对映体旋光作用的相互抵销两失去了旋光性。 浙江火学硕士学位论文 固态外消旋体有三种类型，即外消旋很合物( r a c e m i cm i x t u r e ) 、外消旋化合物 ( r a c e m i cc o m p o u n d ) 、外消旋固溶体( r a c e m i cs o l i ds o l u t i o n ) 。 消旋： 指一个纯对映体( p u r ee n a n t i o m e r ) 转化为无旋光活性的消旋物，因此易消旋 的化合物称为光学不稳定物。 外消旋物： 等摩尔量的两个异构体的混合物。 1 4 2 表征1 6 , 7 1 ( 1 ) 对映体过量和非对映体过量 当不存在外部手性影响时，对映体具有完全相同的化学和物理性质。但对映 体有一种性质是彼此不同的：手性分子的每个对映体都把偏振光旋转到一定的角 度，其数量相等但方向相反，这种性质称为光学活性。因此，如果一个对映体的 量超过了另一个，手性化合物就可能是光学活性的。获得对映体组成，对于研究 立体化学十分重要。 样品的对映体组成可用术语“对映体过量”，或“e e ”来描述。它表示一个 对映体对另一个对映体的过量，通常用百分数表示。相应地，样品的非对映体组 成可描述为“非对映体过量”，或“鲫”，它是指一个非对映体对另一个非对映 体的过量。即 e 卫= ( 卜陬( 陋 一陋d ) x 1 0 0 扎： s 卜i s + r 摊s 】一盼曲1 0 0 ( 2 ) 比旋光度的测量 用于对映体的组成的术语之一是光学纯度。它是指对映体样品的测定的旋光 与最大( 或绝对) 旋光之比。对于任何一个其纯对映体的旋光为已知的化合物， e e 值可以直接从测定的旋光值来计算： k p ；呢。) 5 浙江大学硕十学位论文 式中，a 为测定的旋光： l 为样品池路长度，d m ： c 为浓度( 1 0 0 m l ) d 为用于测定的光波长d 线； 2 5 为温度( ) 。 光学纯度d p 可由下式来计算： 。只。b k x 1 0 0 测定样品光学纯度的经典方法是使用旋光仪，在本实验中所用w z z - 2 a 自动 数显旋光仪。 ( 3 ) 消旋度 消旋过程中的消旋程度可用其旋光度改变的相对量，即消旋度( r a c e m i z a t i o n d e g r e e ) 来表示： initialo p t i c a lrotation-finalo p t i c a lr o t a t i o n ) c1 0 0 i n i t i a lo p t i c a lr o t a t i o n 7、 浙江人学硕士学位论文 第二章文献综述 2 1 肽的结构与分类 2 1 1 肽的结构 我们在自然界中可以看到各种各样的活性肽，它们具有自己特有的生物功能。 这些种类繁多的肽，从化学结构上来看，又都是由称之为氨基酸的单体组成的。 就今天所知道的结果来说，组成蛋白质和动物组织内的活性肽氨基酸的种类主要 有二十多种，并且都是l - ( 或s - - ) 型的a 一氨基酸。在微生物来源的活性肽组成 中，包括抗菌素肽和细菌细胞壁肽等。则还存在有d 一( 或r - - ) 型的氨基酸和一 些其他的特别氨基酸。各个氨基酸之间通过一个氨基酸的羧基同另一个氨基酸的 氨基以酰胺键( 也叫肽键) 结合连接成肽键，由二个氨基酸连成的叫二肽，三个 氨基酸连成的叫三肽，并依次类推下去。如下图2 一l ： 阱口曰c ! ：h n - c h - 佩ct i h k 删。p i ；, k h n _ c i 8 _ 曰c r lr 2r 3 一卜铲r n 眦h g 明 图2 一l 肽链结构示意图 f i g2 - 1s t r u c t u r eo f p e p t i d ec h a i n 肽链中的每一个氨基酸部分称为氨基酸残基，肽链的自由氨基一端称为肽链 的氨基末端或n 端，另一端则称为羧基末端或c 端。并不是所有的肽链都具有自 由的n 端或c 端，因为c 端可以成酰胺，n 端可以为焦谷氨酸或者被酰化( 例如 乙酰化) 。肽链还可成各种形式的环肽存在而没有自由的n 端或c 端。 2 1 2 肽的分类 一般可以从肽的大小、结构、来源或功能等几个方面来进行分类。 ( 1 ) 按照肽的大小分类 这里并没有一个十分严格的划分规定，根据目前的合成水平，一般可以把十五 浙江大学硕十学位论文 肽左右以下的划为小肽，十五肽左右到五十肽左右划为中等肽，五十肽左右以上为 大肽。 ( 2 ) 按照肽的结构分类 根据肽链的结构分为同聚肽( h o m o m e r i c ) 和杂聚肽( h e t e r o m e r i c ) 两大类。 然后根据连接键的不同还可再进一步划分。 ( 3 ) 按照肽的来源或功能划分 根据蛋白质和肽的来源或功能来进行分类，这是生物化学中最常用的方法。 例如，肌肉蛋白、血液蛋白、病毒蛋白、脑肽、垂体肽、消化道肽等就是按照来 源不同划分的，而酶蛋白、运动蛋白、激素蛋白和肽激素、肽抗菌素、毒蛋白和 毒肽等则是按照它们的功能作用来进行划分的。 2 2 肽合成的基本原理 在初步了解了蛋白质和天然肽的结构特征以后，我们就可以知道，化学合成 蛋白质和肽的任务就是如何把各种氨基酸单位按照天然物的氮基酸排列顺序和连 接方式连接起来。由于氨基酸在中性条件下是以分子内的两性离子形式 ( h 3 + n c h ( r ) c 0 0 ) 存在，因此，氨基酸之间直接缩合形成酰胺键的反应在一般 条件下是难于进行的。氨基酸酯的反应活性很高，在1 0 0 下加热或者室温下长时 间放置都能聚合生成肽酯，但反应并没有定向性，两种氨基酸a 1 和a 2 的酯在聚合 时将生成a l a 2 、a l a l 、a z a l 等各种任意顺序的混合物。因此，为了得到具有特 定顺序的合成肽，采用任意聚合的方法是行不通的，而只能采用逐步缩合的定向 合成方法。一般是如图22 所示，即先将不需要反应的氨基或羧基用适当的基团暂 时保护起来，然后再进行连接反应，以保证合成的定向进行吼 f t乎z早t卜 x n h c h c o y h 2 n c h c o o q 卜x n h c h c o n h c h c o o q 图2 - 2 肽合成的基本原理 f i g2 - 2p r i n c i p l eo fs y n t h e s i so fp e p f i d e 浙江大学硕士学位论文 图2 2 中的x 和q 分别为氨基和羧基的保护基，它不仅可以防止副反应的发 生，还具有能消除氨基酸的两性离子形式并使之易溶于有机溶剂的作用。q 在有 的情况下也可以不是共价连接的基团，而是由有机强碱( 如三乙胺) 同氨基酸的 羧基氢离子组成的有机阳离子。y 为一强的吸电子基团，它能使羧基活化而有利 于另一氨基酸的自由氨基对其活化羧基的羧基碳原子进行亲核进攻生成酰胺键。 由此所得的连接产物是n 端和c 端都带有保护基的保护肽，要脱去保护基后才能 得到自由的肤。如果肽键不是到此为止，而是还需要从n 端或c 端延长肽链的话， 则可以先选择性的脱去x 或q ，然后再同新的n 保护氨基酸( 或肽) 或c 保护的 氨基酸( 或肽) 进行第二次连接，并依次不断重复下去，直到所需要的肽链长度 为止。对于长肽的合成来说，一般有逐步增长和片断缩合两种伸长肽链的方式， 前者是由起始的氨基酸( 或肽) 开始，每连接一次，接长一个氨基酸，后者则是 用n 保护肽同c 保护肽缩合来得到两者长度相加的新的长肽链。 对于合成含有g l u 、a s p 、l y s 、a r g 、h i s 、c y s 等等带侧链功能团的氨基酸的 肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基 将侧链基团暂时保护起来。 2 3 化学合成肽方法论述 肽合成的化学方法是有机合成和药物合成的一个非常特殊的分支。化学合成 肽的方法，是按照设计的氮基酸顺序，通过定向形成酰胺键方法得到目标分子。 从理论上讲这弗不复杂，但实施起来却非常困难。简单的羧基与胺之间形成酰胺 键，一般是先将羧基转变成一个活泼的羧基衍生物( 如酰氯或酸酐) 再与胺作用， 或者在反应体系中加入缩合剂。氨基酸之间形成酰胺键情况则复杂的多，每一个 氨基酸既含有氨基，同时含有羧基，如果将一种氨基酸的羧基活化，则其可以同 一种或另一种氨基酸分子的氨基反应。 化学合成肽主要是液相法和固相法1 9 。 2 3 1 液相合成法 多肽或蛋白质的液相合成包含有三个基本反应。第一是基团的保护包括氨基、 羧基以及侧链基团的保护；第二是羧基的活化和形成肽键的缩合反应；第三是保 护基团的去除。在合成过程中，每连接一个氨基酸残基都要经过这三步基本反应a 浙江大学硕上学位论文 液相合成短肽是一种很常用的方法，b o c 基团和f m o c 基团仍是氨基的常用保 护基，其他如b p o c 基、c b z 基等都可用于液相合成的氨基的保护。b o c 基可用 c f 3 c o o h ( t f a ) 或h c i 的有机溶液脱去，f m o c 基可用仲胺处理脱去，通常用 2 0 的哌啶n ，n 一二甲基甲酰胺溶液。羧基常用乙酯或苄酯形式保护，皂化或氢 解脱去。对于合成含天冬氨酸、精氨酸等带侧链基团的氨基酸肽来说，为了避免 侧链功能团所带来的副反应，一般需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。 液相合成时，每次接肽以后都需要对产物进行分离纯化，在操作过程中的产 物损失也较大。不过由于液相合成具有操作简单、每次合成产量较大等特点，所 以仍是一种较为主要的短肽的合成手段l 埘。形成肽键的方法主要是羧基活化法。 羧基活化法的基本原理是先将n 保护氨基酸或肽的a 羧基转变成活化型的 r c o x ，它的羰基碳原子带有较强的正电子性，从而有利于n h 2 r 对它进行亲核反 应生成r c o n h r 。一般来说，取代基团x 的吸电子性越强，其对羧基的活化能 力也越强f l l 】，活化主要有d c c 法、混合酸酐法、活化酯法等。 2 3 。1 1 保护基 ( 1 ) 氨基的保护 已经使用过的氨基保护基很多，但归纳起来，可以分为烷氧羰基、酰基和烷 基三大类。烷氧羰基使用最多，因为n 一烷氧羰基保护的氨基酸在接肽时不易发 生消旋化，以下列举和说明了几种代表性的常用的氨基保护基。 苄氧羰基( c b z ) 1 1 2 , 1 3 】 苄氧羰基虽然是1 9 3 2 年由贝尔格曼( b e r g m a n n ) 发现的一个很老的氨基保护 基，但直到今天还在普遍的应用。其优点在于：( a ) 试剂的制备和保护基的导入 都比较容易；( b ) n 一苄氧羰基氨基酸和肽易于结晶而且比较稳定；( c ) 苄氧羰基 氨基酸在活化时不易消旋；( d ) 能用多种温和的方法选择性的脱去。 自由氨基酸在用n a o h 或n a h c 0 3 控制的碱性条件下可以很容易同苄氧羰基 氯反应得到n 一苄氧羰基氨基酸。氨基酸酯同苄氧羰基氯的反应则是在有机溶剂 中进行，并用碳酸氢盐或三乙胺来中和反应所产生的h c l 。一般都是用c b z - - c 1 为导入试剂。 当要选择性的脱去n 一苄氧羰基而向n 端延伸肽链时，一般采用h b r 的醋酸 溶液处理或催化氢解的方法。在片段台成以后，要将c b z 基同其它基团一并脱去 1 0 浙江大学硕士学位论文 时，则多采用液体h f 处理或n a n h 3 ( 液) 还原的方法。 叔丁氧羰基( b o c ) 1 1 4 除苄氧羰基外，叔丁氧羰基( b o c ) 也是目前肽合成中广为采用的氨基保护基， 特别是在固相合成中，氨基的保护多不用苄氧羰基而用叔丁氧羰基【“】。叔丁氧羰 基具有以下的优点：( a ) b o c 一氨基酸除个别外都能得到结晶；( b ) 易于酸解除去， 但又具有一定的稳定性，b o c 一氨基酸能较长期的保存而不分解；( c ) 酸解时产生 的叔丁基阳离子再分解为异丁烯，它不会带来副反应；( d ) 对碱水解和肼解都稳 定；( e ) 叔丁氧羰基对催化氢解稳定，但比c b z 基对酸要敏感的多。当b o c 基和 c b z 基同时存在时，可以用催化氢解脱去c b z 基，b o c 基保持不变，或用酸解脱去 b o c 基而c b z 基不受影响，因而两者能很好的搭配。 芴甲氧羰基( f m o c ) 1 1 5 1 芴甲氧羰基对酸稳定，但能用浓氨水或用哌啶、乙醇胺等胺类的5 0 一- - 氯甲 烷溶液脱去。叔胺( 如三乙胺) 的脱去效果较差。此外，还可用带有环状仲胺基 团的不溶的高分子试剂在室温下处理脱去。芴甲氧羰基可与酸脱去的保护基搭配 而用于液相和固相肽合成。 ( 2 ) 羧基的保护 在肽合成中，除了羧基组分的羧基需要活化来进行接肽以外，其他不反应的 羧基如a 一羧基，即氨基组分的末端羧基也存在需要保护的问题。羧基被保护以后， 除了可以防止在接肽反应中当反应羧基用某些方法活化时不需要反应的羧基也会 被活化而带来的副反应以外，还有一个能使氨基组分的氨基不能同羧基形成内盐 而完全游离出来以便于同羧基组分反应形成肽键的作用。一般是采用成酯的形式 对羧基进行保护1 1 6 】，末端最后要转变为酰胼，则也可以采用取代酰肼的形式进行 保护。当用迭氮物法、活化酯法和混合酸酐法接肽时，也可采用将氨基组分的羧 基的羧基同有机碱成盐的形式来进行反应。这时，虽然可以避免羧基保护基的选 择和大肽去酯时所带来的麻烦，但在接肽的方法上受到一定限制，而且由于羧基 游离的肽在有机溶剂中的溶解度比酯的溶解度要小，从而对接肽反应和产物的分 离提纯方面也有一些不便之处。因此，综合考虑起来，在肽合成中多数仍然采用 以酯或取代酰肼的形式对羧基进行保护。 根据脱去条件不同，目前使用和研究过的羧基保护基大致可分为三类。一类 浙江大学硕士学位论文 是可用碱皂化脱去的，如甲酯和乙酯等。另一类是可用酸脱去【1 7 1 甲氧苄酯和邻苯 二甲酰亚胺甲酯等。第三类是除了能用酸或碱脱去以外，还能用其他的方法选择 性地脱去，如苄酯和苯羰基甲酯能用催化氢解法脱去，三甲硅乙酯能用氟化四乙 铵脱去。在合成工作中，究竟选用哪一种羧基保护基，则应根据其他功能团所用 的保护基是什么来进行选择和搭配。 ( 3 ) 氨基酸侧链的保护【1 8 - 2 0 1 由于不少氨基酸的侧链上都带有能反应的基团，如羟基、巯基、酚基、b 一和t 一 羧基、e 一氨基、胍基、咪唑基、b 一和r 酰胺基、吲哚基和硫醚等，为了避免副反 应的发生，在多肽合成中往往也选用适当的保护基将它们保护起来。其中半胱氨 酸的巯基和赖氨酸的e 一氨基是毫无例外而必须加以保护的，谷氨酸和天冬氨酸的 b 一和y 一羧基在作为羧基组分时必须保护，而作为氨基组分时可以保护也可以不要 保护，其他基团有时也可以不用保护。 ( 4 ) 常用的脱保护基试剂和方法 4 1 三氟醋酸 用于脱保护基的三氟醋酸有两种，一种是浓的三氟醋酸( 无水或9 0 的三氟 醋酸) ，另一种是不同程度的稀的三氟醋酸。用三氟醋酸脱保护基的操作比较简单， 只要在样品中加入适量三氟醋酸振摇至完全溶解，反应时间随具体情况而定( 数 分钟到数几十分钟) 。 h b r h o a c h b r h o a c 溶液的酸解能力比三氟醋酸要强，除了能脱去三氟醋酸所能脱除的 保护基外，还能脱除三氟醋酸所不能脱除的保护基，如苄氧羰基( c b z ) 等。c b z 基的脱除速度随h b r 浓度的增大而增大，因此实际上都是采用高浓度的过量 h b r h o a c 溶液以保证反应的完全。用h b r h o a c 脱除保护基的操作与用三氟醋 酸的情况基本相同，不过在脱除苄氧羰基时，由于苄氧羰基被分解生成溴化苄， 其蒸汽有强烈刺激眼睛粘膜的作用。 浙江大学硕十学位论文 催化氢化 催化氢化可以脱n 一苄氧羰基、苄酯和苄醚等保护基。催化氢化的氢供体是 h 2 ，常用的催化剂为钯黑或5 - 1 0 的p d c 。氢化是在常压下进行，溶剂一般为酸 性有机溶剂( 如h + c h 3 0 h ，稀醋酸等) 。当用h b r h o a c 脱去c b z 基时，产物往往 带有点颜色，而且分解产生的溟化苄会产生一些副反应并难以除尽，而催化氢 解多数能得到无色的产物。 无水氟化氢【2 1 】 除乙氧甲酰基、苯甲酰基、甲酰基、邻苯二甲酰基、甲酯、乙酯、n 苄基、 n 对甲氧苄基、孓甲基、盛乙基、s 异丙基和s 乙酰胺甲基外，一些难于被h b r a i o a c 脱去的保护基如苄酯和对硝基苄酯等保护基在氟化氢中0 - 2 0 。0 反应3 0 - 6 0 分钟即 可被除去，此外，对一些很难酸解脱去侧链保护基团也同样能够脱去。由于液体 h f 的这些长处，他在固体合成中被广泛用来将已合成的肽链从树脂上切落下来并 同时脱去肽链上的各种保护基以得到去保护基产物。 2 3 1 2 碳二亚胺法( d c c 法) 在多肽和蛋白质合成中，d c c 法应用较广泛。碳二距胺法的结构通式为 r n = c = n r , 在多肽合成中最常用的是n ，n 一二环己基碳二亚胺，简称d c c 。 d c c 活化羧基的反应机剐2 2 2 4 】如下： n 一保护的氨基酸同d c c 反应首先生成活化中间体o 一酰基脲，它实际上也 可以看成是一种活化酯。此活化中间体与氨基酸酯反应则生成肽酯，并释放出一 分子的n ，n 一二环己基脲( d c u ) 。由于d c u 在大多数有机溶剂中的溶解度很小， 因而可以过滤除去。但残留在溶剂中少量的d c u 有时会混在连接产物中很难完全 除尽。这时若采用很容易用酸洗除去水溶性碳二亚胺来代替d c c 则可避免这个麻 烦。 浙江大学硕士学位论文 r c o o h + - - n = c = n - ( r c o ) z o + d c u + h ，n r 2 一。0 删r 2 + c e h t x 柑c 。p 。c 6 h ， o ( d c u ) c o r i c 6 h 1 1 - n h - c 。n c 6 h 1 1 ( n - 酰基脲) o 图2 - 3d c c 接肽的反应机理 在图2 - 3 的反应机理中，肽键可以通过0 一酰基脲直接同胺反应或者先经过对 称酸酐再同胺反应生成。但究竟主要是通过哪条途径，则同反应条件有关。在液 相接肽反应中，可能主要是通过o 一酰基脲同胺的直接反应。 2 3 1 3 混合酸酐法 混合酸酐法是5 0 年代初期发展起来的f 矧。开始是用酰基氨基酸同二苯基磷酸 形成的混合酸酐，然后是用同二苄基磷酸形成混合酸酐以及同苯甲酸形成的混合 酸酐。当苄氧羰基氨基酸同苯甲酸形成的混合酸酐与氨基组分反应时，会形成氨 基组分被苯甲酰化的副产物。为了抑制这个副反应，后来还改用了同羰基碳原子 上电子密度较高的或空间位阻较大的其他羧酸形成地混合酸酐。另一方面， w i e l a n d 和b o i s s o n n a s 则发展了用酰基氨基酸的三乙胺盐与等当量氯甲酸乙酯反应 形成混合酸酐，它同氨基组分能得到高的接肽产率。而用同氯甲酸异丁酯反应形 成的混合酸酐则可以进一步提高产率。这也就是后来成功地广泛用于多肽合成中 1 4 浙江大学硕上学位论文 的混合酸酐法。 混合酸酐法的优点是方法简单，反应速度快，比较容易得到高纯度的肽，产 率般也不错。而且氯甲酸酯试剂的制备不难，价格便宜。对于肽的大量制各来 说，如果从经济角度考虑，混合酸酐法可以说是最节约的方法，因此也是较常用 的方法。 混合酸酐法的反应机理【2 t 卅如下： 反应一般分两步进行。第一步是将酰基氨基酸在低温和叔胺的存在下同氯甲 酸酯( 乙酯或异丁酯) 反应生成混合酸酐，第二步是所生成的混合酸酐再同氨基 组分反应得到肽，所用的氨基组分的侧链羧基和末端a 一羧基可以是保护的( 以 酯的形式) 也可以是不保护的( 以有机盐的形式) ，两步反应如图2 4 所示。由 于第二步反应中释放出的分解产物是c 0 2 和醇，因此对于连接产物的分离和纯化 是有利的。 c b z n h c h r c o 、 c b z n h c h r c o o o e n h r 3+i - c 4 h 9 0 c o c l + i c 4 h 9 0 c o 二o +nh2chr2cooy c o n h c h r 2 c b z n h c h r c o n h c h r z c o o y + c c h + i - c 4 h 。o h +o() 图2 - 4 混合酸酐法的反应机理 f i 9 2 - 4 m e c h a n i s m o f m i x e d a n h y d r i d e r e a c t i o n 只要在等分子的羧基和氨基组分的混合物中直接加入试剂就可以合成肽键。 其优点是试剂与羧基组分生成的混合酸酐立即与氨基组分反应，因而可以减少歧 化反应或消旋化等副反应。 虽然混合酸酐法具有反应快产率高和操作简便等优点，但他们也有不少副反 应，例如混合酸酐本身的分解和歧化反应，消旋化反应以及对氨基组分反应生成 烷氧甲酰胺类副产物和对肽键反应生成二酰亚胺副产物等。为了得到较好的反应 的结果，对反应条件的选择和控制是很有必要的。 影响混合酸酐法反应的主要因素有：试剂的种类；叔胺的性质；羧基组分的 结构；溶剂；温度和活化时间；氨基组分的结构等。 浙江大学硕士学位论文 2 3 1 4 活化酯法 1 9 5 1 年魏兰德( w i e l a n d ) 和谢飞( s h o f e r ) 采用硫代苯酯，许为彻( s c h w y z e r ) 1 9 5 5 年采用氰甲酯提高了酯的活性，从而可用于肽的合成，但比较成功的要算波 丹斯基( b o d a n s z k y ) 1 9 5 5 年发展的对硝基苯酯。n 一保护氨基酸对硝基苯酯的活 性很好，能在室温条件下很快的与氨基组分反应得到很好的接肽产率。稍后，肯 纳( k e n n e r ) 等人也发表了关于用取代苯酯作为活化酯报道【2 8 1 。除了取代苯酯或 硫代苯酯以外，可以用作为活化酯的还有n 一保护氨基酸与烯醇类化合物形成的 酯，与杂环上羟基形成的酯以及连接在固相载体上的活化酯等。活化酪的优点在 于所用的n 一保护氨基酸活化酯很多都能分离纯化出来得到结晶的纯品，而且比 较稳定，能够放置保存。其与氨基组分缩合的反应速度，虽不及混合酸酐合d c c 法快，但也并不很慢，而且还可以加入适当的添加剂以催化反应的进行。在用活 化酯法接肽时，氨基组分的末端羧基可以是保护的也可以是不保护的，对于一些 侧链功能团，如羟基、酚基等也并不要求定要保护。这对肽合成方案的设计来 说，就给了很大的方便。 活化酯的种类主要有芳基活化酯、烯基酯、活化酰胺等，主要以芳基活化酯 为代表。由于苯环本身的吸电子效应，n 一保护氨基酸的苯酯已具有一定的活性。 硫代苯酯的活性比苯酯稍大一些。当苯环上的氢被强吸电子性的硝基取代以后， 酯的活性大大增加。c b z 一氨基酸对硝基苯酯不仅氨解的速度快( 其半反应时间只 有几分钟) ，而且绝大多数都可以获得结晶【2 9 1 。其不足之处是反应后产生的对硝基 苯酚有时不容易除尽，特别是在所合成的肽不能结晶或成为一种蜡状固体时，很 难完全洗去。 2 3 1 5 迭氮物法 在1 9 0 2 年由考梯斯( c u r t i u s ) 建立起来的迭氮物法虽是一个比较古老的方法， 但由于它最少引起消旋，而且能在液相法中用于大片段的合成，因而直到今天也 仍然作为一个片段缩合的较好方法而被普遍采用。在胰岛素、牛胰核糖核酸酶及 其s 一蛋白( 1 0 4 肽) 、胰蛋白酶抑制剂、核糖核酸酶t 1 的合成中都曾经采用了这 个方法。在用迭氮物法接肽时，侧链上的羟基、眯唑基和酰胺基可以不要保护， 甚至羧基组分的侧链羧基和a 一羧基都可以不保护，而得到最少保护基的“赤足” 肽。 浙江大学硕士学位论文 用于制备肽的迭氮物的方法有三种。( 1 ) 亚硝酸钠法；( 2 ) 亚硝酸烷酯法；( 3 ) 二苯基磷酰迭氮物法。前两种方法都需要肽的酰肼作为共同原料，最后一种方法 则不需要肽的酰肼为原料，而是用a 一羧基游离的保护肽直接进行迭氮化1 3 0 】。 2 3 1 6 肽合成的溶剂 在肽合成中溶剂的选择是很重要的，特别是在液相合成中，如果需要连接的 两个原料肽不能溶解的话，要进行缩合反应以得到产物是很困难的。液相接肽的 常用溶剂是四氢呋喃和二甲基甲酰胺【3 1 】沸点较低，易于蒸去，但溶解能力也较低， 对含g l n 和a s n 的肽或其他较大的肽的溶解度不大，当用四氢呋喃不能溶解时， 可用二甲基甲酰胺为溶剂，它对含g i n 和a s n 的肽或其他较大的肽比四氢呋哺有 更好的溶解度，但沸点较高，需要减压才能蒸去。当二甲基甲酰