（化学工程专业论文）手性对映体及类似物的色谱和分子印迹膜分离.pdf

中文摘要以牛血清白蛋白( b s a ) 作为手性拆分剂，外消旋的d ，l 一色氨酸为待分离对映体，通过对多种活化方法的比较，发现利用羰基二咪唑活化法制备出的b s a手性固定相对d ，l 一色氨酸对映体具有最好的拆分能力。采用前沿色谱法研究了该手性柱在不同色谱流动相条件下，结合力和结合位点数量( 饱和容量) 的变化趋势及对d ，l 一色氨酸保留作用的影响。同时还研究了d ，l 一色氨酸在b s a 手性固定相上的拆分行为随温度的变化，进一步认识了其分离机理。对羰基二咪唑活化法制备b s a 手性固定相的方法进行改进，在用羰基二咪唑活化之前先偶联一层壳聚糖亲水层，有效减小了d ，l 一色氨酸与b s a 手性固定相的疏水作用。在保证对映体完全拆分的前提下，显著地缩短了l 一色氨酸的保留时间，减少了流动相的用量，实现了对映体的经济、快速、有效拆分。同时还考察了各种流动相和进样条件对d ，l 一色氨酸保留因子七和分离因子a 的影响。采用平衡扩散模型及竞争性双朗格谬尔吸附等温线模拟了d ，l 一色氨酸对映体在b s a 手性固定相上的拆分过程。讨论了模型参数对色谱图形的影响，且通过逆向法( i n v e r s em e t h o d ) 辨识不同色谱条件下d ，l 一色氨酸与b s a 固定相之间的结合常数和结合位点数量的变化。以丙烯酰胺功能单体代替常用的甲基丙烯酸单体，在极性有机溶剂乙腈中，制备出各种印迹氨基酸衍生物的分子印迹聚合物。该聚合物对模板分子的识别作用明显大于以甲基丙烯酸为功能单体制备出的分子印迹聚合物。研究了此印迹聚合物在线性梯度洗脱和以水溶液为流动相时的拆分行为。以非共价键中作用力最强的离子键作为模板分子与功能单体的主要作用力、腺嘌呤为模板分子、聚偏氟乙烯膜为基质膜，利用光接枝共聚原理，制备出新型的分子印迹聚合物膜，该膜不但具有很高的选择性，且具有微滤膜高通量( 模板分子为0 2 6m o l m a h 1 ，二次蒸馏水为3 6m l m i r a 。1 c m 2 ) 的优点。关键词：手性固定相，牛血清白蛋白，色氨酸，壳聚糖，数学模型，分子印迹a b s t i 溃c ts i n c ed ，l - t r y p t o p h a nw e r er e t a i n e db yb o v i n es f f f t l ma l b u m i n ( a s a ) a n dh a daw e l l - c h a r a c t e r i z e dc h a n g ei nr e t e n t i o nu n d e rv a r i o u sc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ，b s aa n dd ，l - a 3 t p t e p h a nw e r eu s e da sc h i r a ls e l e c t o ra n da n a l y t e s ，r e s p e c t i v e l y b yc o m p a r i n gw i t l lb s ac h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e sf b s a c s p s ) p r e p a r e db ys e v e r a lp r o t e i ni m m o b i l i z i n gm e t h o d s ，t h eb s a - c s pp r e p a r e db y1 ，1 - c a r b o n y l d i i m i d a z o l e ( c d i )m e t h o dw a sd e t e r m i n e dt ob et h eb e s t t h eb i n d i n go fd , l - t r y p t o p h a no nt h i sb s a - c s pw a se x a m i n e db yu s i n gt h ef r o n t a la n a l y s i s a ) m e t h o d md a t aw e r eo b t a i n e dt od e t e r m i n et h ea m o u n to fb i n d i n gs i t e so nb s a c s pa n dt h ea s s o c i a t i o ne q u i l i b r i u mc o n s t a n t sf o rd l - t r y p t o p h a na tt h e s es i t e st r a d e raw i d er a n g eo fc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s a n dt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sf o rd ，l - t r y p t o p h a no nt h i sb s a c s pw e r ed e t e r m i n e df r o mt h ep l o t so f l n k v e r s u s1 rp o s t u l a t i n gt o t a l l ye n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o n , i no r d e rt od e c r e a s en e e d e dt i m ea n dm o b i l ep h a s e ，c o r n n o nm e t h o dt op r e p a r eb s a - c s pw i t hc d iw a si m p r o v e d af i l mo fh y d r o p h i l i cc h i t u s a nw a sc o v a l e n t l yc o u p l e do nt h ea m i n o p r o p y ls i l i c ab e f o r ei m m o b i l i z a t i o no fb s a i tc a l lw e a k e nh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nb e t w e e ne n a n t i o m e r sa n da l b u m i na n dd e c r e a s et h er e t e n t i o nt i m eo ft h ee n a n t i o m e r s a n dt h ee f f e c t so fv a r i o u sc o n d i t i o n so fm o b i l ep h a s ea n dt h es a m p l eo nt h er e t e t i o nf a c t o rk a n ds e p a r a t i o nf a c t o rg to f d l - t r y p t o p h a nw e r ei n v e s t i g a t e d c h r o m a t o g r a p h i cb a n dp r o f i l e sw e r es i m u l a t e dw i t he q u i l i b r i u md i f f u s i o nm o d e la n dc o m p e t i t i v eb i l a n g m u i ri s o t h e r m t h ev a r i a t i o n so ft h ep a r a m e t e r si n t h ec h r o m a t o g r a p h i cm o d e la tv a r i e dp r e p a r a t i v ea n dc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r eu s e dt oe x p l a i nt h eb i n d i n gm e c h a n i s mb e t w e e nt h ea n a l y t e sa n dt h eb s a - c s et h e s ep a r a m e t e r sw e r ed e t e r m i n e db yi n v e r s em e t h o da n dag o o df i t t i n gb e t w e e nt h ec a l c u l a t e db a n dp r o f i l e sa n de x p e r i m e n t a lc h r o m a t o g r a m sw a so b t a i n e db ya d j u s t i n gt h ev a l u e so f t h e s ep a r a m e t e r s m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p ) w e r es y n t h e s i su s i n ga e r y l a m i d e ( a a ) a sf u n c t i o n a lm o n o m e ri n s t e a do fm e t h a c r y l i ca c i d ( m a a ) i na c e t o n i t r i l e t h er e c o g n i t i o no fm i pu s i n ga aa sf u n c t i o n a lm o n o m e rw a ss t r o n g e rt h a nm i pu s i n gm a aa sf u n c t i o n a lm o n o m e r m i pu s i n g 从a sf u n c t i o n a lm o n o m e rw a se x a m i n e db yl i n e a rg r a d i e n te t u t i o na n di na q u e o u sm e d i a av e r yt h i no f m i pt h a tc a rs p e c i f i c a l l ya n ds e l e c t i v e l ya b s o r bt h eb a s i ct e m p l a t e( a d e n i n e ) w a sg r a f t e do nt h es t 斌a c eo ft h ep o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d em e m b r a n eb yp h o t o - g r a f t i n gc o p o l y m e r i z a t i o n b e c a u s et h em i pi sg r a f t e do nt h es u r f a c edt h em a t r i xm e m b r a n ew i t h o u tb l o c k i n gt h em e m b r a n ep o r e s , t h er e s u l t a n tm o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e rm e m b r a n eh a v eh i 曲f l u xa sm i c r o f i l t r a t i o nm e m b r a n e ( o 2 6t 0 0 1 m 。2 h 1o f t e m p l a t ea n df l u xf o rd i s t i l l e dw a t e rw a s3 6m l - m i m 1 c m 2a t0 8 田钔。k e yw o r d s ：c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，b o v i n es e r u ma l b u m i n , c h i t o s a n , m a t h e m a t i c a lm o d e l ，m o l e c u l a ri m p r i n t i n g独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤洼盘兰或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：彼签字日期：妒j 年1 月盾日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解鑫壅盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权苤盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：痞莛签字日期：砌f 年f 月，ie l导师签名：粼、签字日期：“年1 月1 6 日第一章文献综述1 1 前言第一章文献综述手性是自然界的普遍特征，自然界往往对一种手性有所偏爱，如自然界中糖为d 一构型，氨基酸为l 一构型，蛋白质和d n a 的螺旋构象均为右旋。人们也发现海螺的螺纹和缠绕植物也都是右旋的。然而药物和农药中的手性对映异构体表现出很大的差别。例如，多帕胺是治疗帕金森症的有效药物，临床实验证明仅s 一异构体有效，r 一异构体则产生严重的副作用；镇静剂t h a l i d o m i d e 曾在欧洲广泛使用，但它只有r 一异构体具有镇静作用，一些孕妇服用此药后引起胎儿畸变，实验证明，这是s 一异构体副作用的结果；再如在农用化学品中，杀虫剂a s a n a 中有二个手性中心，有四个异构体，只有一个异构体是强力杀虫剂，而另三个则对植物有毒。在过去2 0 多年中，手性分离技术由于专业人士的潜心研究，得到了飞速的发展和长足的进步【l 】。目前有大量的单一对映异构体药物上市，1 9 9 7 年比1 9 9 6年单一对映异构体药物销售量增长了2 1 ，而且在热销的5 0 0 种药物中有2 6 9种是单一对映异构体药 7 - 9 1 。手性对映异构体药物的研制从急性病向慢性病方面转移，如老年痴呆病，癌症，肥胖症，艾滋病，哮喘病，关节炎等，治疗这些疾病的单一手性对映异构体药物均含有一个或多个手性中心。控制和测定其中另外一种对映异构体的含量十分重要，所以一些国家的卫生管理部门如美国的f d a ( 美国食物药品管理局) 对新的外消旋药提出极为严格的要求，要求对其对映异构体的代谢和药物动力学有明确的说明i 驯。对映异构体的分离在食品和临床分析研究中也有重要的意义，例如检测食物中的d 一氨基酸用以评价其形成、生物功能、安全作用的影响因子【5 】。在考古学领域通过测定某些氨基酸的外消旋程度来确定人类遗留物如骨头和牙齿的留存时间【6 j 。因此手性对映异构体的分离具有十分广阔的应用领域。第一章文献综述1 2 外消旋体的拆分方法若两个对映异构体( 简称对映体) 以1 ：l 组成混合物，则对映体的旋光性彼此抵消，表现为没有旋光性，该混合物称为外消旋体。外消旋体的拆分是指将外消旋体中的两个对映体分开，使之成为对映纯的左旋体和右旋体。最经典的手性对映体拆分方法是结晶拆分法，即通过与对映纯试剂反应，生成非对映异构体，利用它们物理性质的差异达到分离的目的。1 8 5 8 年，p a s t e u r借助放大镜，用镊子将酒石酸铵盐两种对映体的晶体进行分离，这就是所谓的晶体机械拆分法。晶体机械拆分法要求生成的晶体较大，并且在外观上能直接辨别。符合这些要求的例子很少，即使能找到，操作也很繁琐，效率十分低，故实际应用很少。接种结晶拆分法是机械拆分法的改进：在一个热的外消旋体混合物的饱和溶液中，加入适量的某一异构体晶种，适当冷却，则相当量的这一异构体从外消旋混合物中析出；交替加入两种对映体晶种，可以获得两种对映体分子。接种结晶拆分法工艺简单，成本低且效果较好，因此是比较理想的拆分方法。目前该法已经应用于大规模生产氯霉素、( 一) 一薄荷醇以及抗高血压药甲基多巴等手性药物。但是在生产过程中为了使外消旋混合物饱和，必须采用间歇式结晶，这无疑延长了生产的周期，增加了生产成本。除了上述结晶拆分法外，外消旋体的拆分方法还有：1 化学拆分法此方法是通过化学反应的方法，即用手性试剂将外消旋体中的两种对映体转化为非对映异构体，然后利用非对映异构体之间物理性质和化学性质的不同将二者拆分开。拆分成功的关键是选择合适的拆分剂。合适的拆分剂应该是能够与对映体生成非对映异构体，且溶解度差别较大，经拆分后，又易再生为原来的对映体。虽然这种方法一直被作为重要的拆分方法，但其局限性也很明显：( 1 ) 拆分剂和溶；! j 的选择较为盲目；( 2 ) 拆分的产率和产品的对映纯度不高；( 3 ) 适用于手性拆分的对映体的类型不多。2 酶拆分法由于酶本身就是一个手性催化剂，能选择性的作用于对映体中的某一异构体而对另异构体不起作用，从而达到拆分的目的。另外酶催化的副反应很少、产率高、反应的条件也较为温和，而且酶无毒、易降解、不会造成环境污染。d 一苯甘氨酸和d 一对羟基苯甘氨酸是生产半合成青霉素和头孢菌类抗生素的重要侧链，d s m 公司利用恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 的l 一氨肽酶拆分d 。l一氨基酸酰胺获得了d 一苯甘氨酸和d 一对羟基苯甘氨科1 0 l 。尽管酶法拆分外消第一章文献综述旋体在实验室制备或工业生产手性化合物中都已取得长足的进步，但是仍然存在不少局限，比如可利用的酶制剂品种有限、酶易被破坏、容易失活等。3 色谱拆分法色谱拆分法可分为气相色谱法和高效液相色谱法。气相色谱法仅适用于分子量小且对热稳定的化合物的分析，高效液相色谱法的使用范围大，且可用于制备分离。高效液相色谱法在拆分对映体时通常有三种方法：( 1 ) 手性衍生法( c d r ) ：利用手性试剂与被拆分物进行衍生化反应生成非对映异构体，从而可被传统的非手性高效液相色谱柱拆分。( 2 ) 手性流动相法( c h 但) ：在流动相中加入手性添加剂( c h i r a l a d d i t i v e s 。c a ) ，它可与溶质对映体通过静电吸引或氢键等非共价键结合方式，形成可逆的不稳定的非对映体络合物，然后可在非手性色谱柱上实现对映体的拆分。c m p是一种直接分离法，其优点在于不需要化学衍生，也不需要特殊的手性固定相。c a 必须能提供有效的基团和位置以便与溶质对映体形成非对映体络合物，也必须具有合适的结构以改善色谱性能和提高其立体选择性。原则上讲，能作为手性拆分剂的化合物都可以作为c a 。常用c a 可分为手性离子添加剂( c h i r a lc o u t e ri o n s ，c c i ) 、手性配体添加剂和环糊精( c d ) 添加剂。( 3 ) 手性固定相法( c s p ) ：把手性化合物键合到固定相表面，利用样品中的对映体与键合的手性拆分剂形成非对映异构体络合物能力的差别而达到拆分的目的。这样的固定相被称为手性固定相( c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e 。c s p ) 。由手性固定相液相色谱分离测定对映体己成为对映体分离发展最迅速的领域，表1 1给出的是一些商品化的手性固定相。表1 - 1 各类手性固定相的手性成分与商品名称t a b l e1 - 1c o m m e r c i a l l ya v a i l a b l ec h i r a lc h r o m a t o g r a p h yp h a s e s苎二兰苎茎箜垄二型兰些鱼! ! 二一曼竺坌耋塑曼墨整 塑：( s ) - d n b 。苯甘氨酸( 共价)c s p - 1 cc o v a l e n tl - p h y lg l y c i n cro s 卜d 婚苯甘氨酸( 共价)c s p - 1c o v a l e n td , l - p h c n y lg l y c i n er( s ) - d n b - 亮氨酸( 离子)c s p 1 ci o n i c l l “c i n cr( s ) - d n b 亮氨酸( 共价)c s p - i c诹 d n b 一亮氨酸( 共价)d 一萘基丙氨酸l - - 萘基丙氨酸( o ) _ 萘乙酰胺( r h + 萘基乙基胺氯化苯基异戊酰荤甘氨酸菊胺酰苯甘氨酸特戊基氨羰酰缬氨酸( s i ( s 卜口- 蒙乙基胺羰酰缬氨酸( r x 僻 口- 萘乙基胺羰酰缬氨酸m ) - 一甲基苄基脲b 环状葡聚糖y 环状葡聚糖羟脯氪酸- - c u ”脯氨酸一c u ”缬氨酸一c u ”氨基酸- - c u ”q 一酸性糖蛋白牛血清球蛋白纤维素三乙酸酯c s p 1 cc s p - l dc s p - 1 dc s p - l dc s p 1 dc s p - bc s p 1 ec s p 1 fc s p i fc s p - l fc s p - c s p 卿c s p - c s p - c s p i ic s p - i ic s p c s p c s p - vc o v a l o n t l - l a l c i n cc h i r a ld n b p g - c f f i s i l o o p o l y o lb a k e r b o n dd i i r a lc o n v a l t d n b l c uc h i r a ld n b d l c - - s i l o o p o l y o ld - n a p h t h y l a l a n i n ol - n a p h t h y l a l a n i n cs u m i p a xo a - 1 0 0 0s u m i p a x0 a - 1 0 0 0 as u m i p a x o a - 2 1 0 0s u m i p a x0 a - 2 2 0 0s u m i p a xo a - 3 0 0 0s u m i p a xo a - 4 0 0 0s u m i p a x o a - 4 1 0 0s u p e l e o s i ll c - - ( r ) u r c h i r a lb d e x = s i l o o p o l y o lc y l o b o n dfc h i r a lh y l x oc u - - s i l o o p o l y 0 1n u c l e o s i lc h i 酬一ia c h i m lp r oc u f s i l o o p o i y o !c h i r a l p a kw hc h i r a lv a lc t f - s i l o o p o l y o lc h i r a j p a kw me n a a t i op a cr e s o l v o s i ic e l l u l o s ec e l - a c - 4 0 x fc h i r a l c e lo a纤维索三苯甲酸酯c s p vc h i f a i c do b- 4 r距brrr宕；盯盯宕；占；汀鲫旺aag m距昌j距蛐l帅m啪啪第一章文献综述& d n b = 3 。5 一二硝基苯酰基；b a = a d v a n c e x ls e p m t i o at e c h n o l o g y , h l c ，u s a a n = a n s p c cc ol u e u s a ；b = j tb a k e rc h e m i c a lc o ，u s a ；d = d a i c e l ( e u r o p a ) g m b lf r g ；e = e m e r c k , f r o ；l = l k b ，s w e d e n ；m = m o e h c r yn a g c ! a n dc o , u s a ；r = r c # sc h e m i c a lc o , u s a ；s e - - s c r v a , f r g ；s t - - s u m i t o m o , j a p a n ；s u f f i s u p e l c oi n c , u s a ；y = y m ci n c , u s a 4 膜拆分法氨基酸的生物转移通常是由埋在生物膜中的载体蛋白来完成的，这种转移的对映体选择性是非常高的。很久以来，人们就希望将这种对映体转移体系用于分离技术中，通过膜法拆分对映体正是这种生物过程的模拟。在各种膜技术中，选择性比较好的是使用流动载体的液膜方法。在液膜中，具有手性选择能力的载体溶解于某种液体溶剂之中，通过与某个异构体特异性的结合，将其从上相转移到下相，从而实现对映体的分离。环糊精、酒石酸的衍生物、冠醚等都是常用的特异性载体。p i e t r a s z l d e 等【1 2 】采用冠醚作为载体对手性胺进行了分离，获得了较高的选择性。但是液膜由于稳定性较差，其工业应用一直受到很大的限制。为了克服液膜的不稳定性，固膜得到了很大的发展。在固膜中，不同的对映体是通过选择性扩散或吸附来完成跨膜过程的。选择性扩散固膜一般都不带有特殊的手性拆分剂，形成选择性扩散的原因是一种异构体比另一种异构体在固膜中更容易扩散。其形式一般有：( 1 ) 由带选择性并能自身支撑的高聚物组成，包括带有大型手性侧链基团的聚合物( 聚甲硅烷丙炔【1 3 1 、聚降冰片二烯1 1 4 】等) 以及具有手性主链的聚合物( 手性多聚氨基酸【”】、手性多聚苯基乙炔1 16 】等) 。d ，l一心得安的手性膜拆分即是通过此类膜实现的【1 7 ，1 明；( 2 ) 由不能自身支撑但具有选择性的高聚物涂抹在非选择性的支撑层表面组成。y a s h i m a 【”】等将e e l l u l o t r i s ( 3 。5 d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) 涂在聚四氟乙烯膜的表面，制成的表面修饰膜用于分离s - - o x p r e n o b l ( 氧烯洛尔) 。选择性吸附固膜主要是利用嵌在聚合物母体中的手性拆分剂与对映体之间特殊的分子问作用来进行手性拆分。通常一种异构体被较多的选择性吸附在手性拆分剂上，而另一种异构体则较多的游离在聚合物母体之中。选择性吸附固膜的制备方法大致分为两类，一种采用了分析分离中第一章文献综述常用的手性拆分剂 2 0 - 2 2 ，包括环糊精、冠醚、p l i l d e 型拆分剂等；另一种则利用了新发展起来的分子印迹技术 2 3 冽。由于选择性与透过通量之间的反比例关系，选择性扩散固膜的应用受到了限制，只有通过扩大膜面积或者增加平衡级数来弥补，这在实际应用中很不经济。而选择性吸附固膜可以在选择性和透过通量两方面同时提高，从而使其在手性拆分工业中的大规模应用成为可能。1 3 手性固定相拆分法1 3 1 对映体拆分的基本原理1 3 1 1 三点作用原理1 9 5 2 年d a l g l i e s h 提出“三点相互作用”理论1 1 1 ，用于解释手性固定相对对映体拆分的选择作用。他认为手性固定相与对映体问至少同时存在三种作用：氢键作用、偶极一偶极作用和立体相互作用等，而且至少其中一种作用能引起立体选择。这三种作用不一定都是相互吸引的，而且作用点不仅仅只发生在一个点上，也可以发生在一个面或一个轴上。图1 - 1 三点相互作用示意图f i g 1 - 1i l l u s t r a t i o no f t h r e e - p o i n ti n t e r a c t i o n第一章文献综述如图1 1 所示，左手为一种含有s 构型拆分剂的固定相，它能与r 构型异构体发生三点相互补偿作用，形成一种稳定的非对映络合物，色谱保留时间较长，而与s 构型异构体仅能发生两点作用，形成三种不太稳定的非对映络合物，色谱保留时间较短，所以s 构型异构体先于r 构型异构体从柱中流出。但是有些实验结果发现，三点相互作用不一定是手性识别过程所必需的，例如只含一个能生成氢键取代基的对映体，也可能被拆分，即只要有一种作用就足够了。为了解释这种实验现象，有人提出了下述对映体选择络合理论，由对映体拆分过程中的热力学函数的变化，解释对映体拆分的机理。1 3 1 2 对映体选择络合理论在对映体的手性固定相拆分法中，待分离的对映体与手性固定相作用生成瞬态的非对映络合物。欲实现对映体的手性分离，要求生成的非对映络合物的稳定性有一定的差别，即要求非对映络合物的稳定常数不能相同。实际上，只要瞬态非对映络合物的生成自由能有微小的差别就可以实现分离，由热力学第二定律：( 们) 她哆? - t ( ? ) 以弛盯( 1 - 1 )r l n a = 一( a h ) r + ( s )式中，( g ) 代表非对映体络合物的生成自由能之差，( 世力和a ( a s ) 分别代表焓变差和熵变差，r 是气体常数，r 是温度，a 是对映体的分离因子，由两个对映体保留因子之比得到。由式1 - 1 以r l n a 对1 t 作图，应为一直线，直线的斜率和截距分别为- - a ( a h ) 与a ( a s ) 。根据热力学原理，在色谱分离中焓反映了分子问相互作用力的性质和强弱；而熵是整个体系有序性的量度。焓变差a ( a h ) 和熵变差a ( a s ) 分别反映对映体与c s p 手性识别过程中识别作用的差别以及两者之间形成络合物的立体构象匹配程度的差异，a ( a t - 0 和a ( a s ) 越大，手性拆分程度也就越大。显然，如果a l ，则a ( a n ) 必须小于r a ( a s ) 。如果a ( a t - d 的绝对值大于t a ( a s )的绝对值，则对映体的拆分过程将受焓控制；反之，则对映体的拆分过程将受熵控制。对于一定的手性固定相和对映体来说，分离因子d 值的大小不仅仅依赖于温度而且也依赖于流动相的组成，同时a 值还受手性固定相制备方法的影响。除了a 外，其它能够影响谱蜂宽度的因素( 流速、填料的粒度、填料的均匀性等) 也会影响对映体的分辨率。第一章文献综述1 3 2 手性固定相的种类和应用手性固定相主要分为以下6 类，下面逐一进行简单的介绍。1 3 2 1 兀电子给予体、冗电子受体型手性固定相( p i r k l e 型) 【2 ”l j这一类固定相是将具有手性活性的单链分子通过酰胺键连接到丙胺硅胶基质上而成，图l - 2 是两种此类固定相的分子结构图。在这一类固定相中，固定化的手性基团包含有兀电子给予或受体的芳香基团以及氢键的偶极叠合的基团。由于p i r k l e 对这一类手性固定相的创立和发展作出非常重要的贡献，因此也以p i r k l e 命名这一类固定相。在这类手性固定相发展的初期，选用的手性拆分剂是具有耳电子给予能力的蒽基胺基酸衍生物，以后又选用了作为兀电子受体的二硝基苯甲酰苯基氨基酸的衍生物。这两种固定相分离对映体的成功标志着手性固定相液相色谱的开端【2 6 i 朋。旷卜p y p 。嗍ow “a 。嗍 v “。吣。图l - 2 两种最常用的p i r k l e 型手性固定相的分子结构f i g 1 - 2t w ok i n d so f t h em o s tc o m m o np i r k l ec h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s1 3 2 2 聚合物手性固定相 3 2 3 5 聚合碳水化合物，如纤维和淀粉是通过d 一葡萄糖的1 ，4 一糖苷键形成的具有高度有序螺旋结构的高聚物。葡萄糖中三个羟基可以被衍生化而围绕手性葡萄糖形成链状结构。衍生化的葡萄糖单元可以作为手性拆分剂用于拆分手性对映体。有些手性拆分可以在天然的纤维素上完成，但固定化的纤维素具有更好的拆分效果 3 2 - 3 卦。所使用的流动相通常是正相色谱用的有机溶液，在有些情况下含水有机溶液也可用于对映体的拆分。纤维素类手性固定相高效率拆分对映体的实例之一是美托洛尔( m e t o p r o l 0 1 ) 的拆分以及对映体s k f9 6 3 6 5 【1 ( p 【3 -第一章文献综述( p - m e t h o x y p h e n y l - p r o p y l o x y ) - p - m e t h o x y p h e n e t h y l ) 】【h i n i d a z o l eh y d r o c h l o r i d e 】与蛋白质立体选择性结合的研究跚。1 3 2 3 空穴型手性固定相【3 纠2 】手性固定相拆分对映体的另一途径是将手性空穴键合到固定相表面，由此产生的客体一受体间的相互作用决定对映体的拆分效果。因此，用这类手性固定相拆分对映体时，首先要考虑的是被分离的对映体分子与手性空穴的匹配性。这一类手性固定相中键合的手性空穴包括冠醚、分子印迹聚合物和环糊精，其中以环糊精最为常用。环糊精是由铷个葡萄糖连接而成的锥形简体，在圆锥型简体内由亚甲基和1 ，4 一糖苷键形成一个相对疏水性的手性空穴，锥形筒体的外部则是由羟基环绕的亲水性表面。环糊精手性固定相液相色谱拆分对映体时，常用的流动相是水与有机溶剂的混合物，但正相色谱的有机溶剂也可作为流动相。当采用含水溶液作为流动相时，环糊精手性固定相的分离机理主要基于包含型络合过程，如图1 3所示。这一机理表示分子的非极性部分被吸引到非极性空穴中。当被分离的分子存在芳香基团时，由于芳香基团与糖苷键上氧原子的作用产生立体选择的趋向，而线性或无环的烷烃则以随机方式占据环糊精的空穴。因此要在反相模式下分离对映体，对映体分子至少要有一个芳香基团，在锥形简体环沿上高密度的羟基可与被分离的化合物产生氢键。因此溶质中的氨基和羰基可与这些羟基产生很强的氢键作用，这一作用与溶质的p k a 值和流动相的p h 值有很大的关系。细+ 娃圭悔，图1 3 环糊精手性固定相的包含络合作用f i g 1 - 3i n t e r a c t i o no f c y c l o d e x t r i nc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e第一章文献综述1 3 2 4 手性配体交换手性固定相【4 3 椰l过渡金属离子大多具有空轨道，容易与具有孤对电子的化合物如氨基酸形成螯合物。，n i ( i i ) ，z n ( i i ) ，h g ( i i ) ，c o ( ) ，f e ( ) 等均可被用作螯合离子。但c u ( i i ) 形成的螯合物最稳定，是最常用的螯合离子。为了使手性拆分剂、被分离对映体及流动相形成的三元复合物具有一定的稳定性，对被分离对映体的分子结构有一定的要求，通常当被分离的对映体与配位离子形成五员环时复合物最稳定，所以a 一氨基酸，a 一羟基酸是最适合在此模式下被拆分的物质。1 3 2 5 蛋白手性固定相将蛋白质键合到硅胶或其它基质上的蛋白手性固定相是一类很有发展前途的手性固定相。许多小的手性分子与血清白蛋白、a 一酸性糖蛋白等具有立体选择性的亲和力。在选用这一类手性固定相分离对映体时，其流动相在绝大多数情况下是低浓度有机溶剂的缓冲液。当蛋白质手性固定相的柱效很好时，与蛋白质的亲和力差别很小的对映体都可得到良好的分离。蛋白质手性固定相的另一优点是当键合的蛋白质保持其原有结合能力和流动相不影响其手性作用性质时，通过色谱参数的测定可以推断蛋白质与药物相互作用的信息。1 血清白蛋白【4 6 】其中最常用的是牛血清白蛋白( b s a ) 和入血清白蛋白( h s a ) 。b s a 是由5 8 2 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质。其氨基酸序列与h s a 非常类似，见图1 - 4 。b s a 肽链含有3 5 个半胱氨酸残基，仅3 4 位上有一个巯基，其余都为二硫键，二硫键中有8 对组成交叉二硫键，只有接近n 端的是一个单个二硫键。1 9 7 3 年首次报道b s a 一琼脂糖用于色氨酸的手性分离，d 一型首先出峰，此后b s a 手性固定相在多方面使用，包括n 一衍生化的氨基酸，芳香族的氨基酸，亚砜等外消旋物的拆分。通过p h 值、离子强度和有机改性剂的改变可优化洗脱液。琼脂糖、硅胶和聚合物，如羟乙基甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯二乙烯基苯色谱球和聚乙烯中空纤维膜都可用做基质固载b s a 。n a k a m t t r a 等人【6 7 ，6 ”制备了b s a 多层吸附中空纤维膜，用做手性固定相，色氨酸在b s a 单层和多层中空纤维膜上的分离因子分别是2 9 和6 6 。b s a 通过聚合物的链吸附在多孔表面上，致使色氨酸的保留时间增加，因而使用b s a 多层吸附中空纤维可获得更好的分离效果。e r l a n d s s o n 等人眇，7 0 i 用酶剪切的方法得到b s a 中质量数为3 8 0 0 0的片段，并通过戊二醛将其交联到氨丙基硅胶上或吸附到硅胶上。但是用这种b s a 片段制备出的固定相容量小、手性选择性不好，而且不如用完整的b s a 傲手性拆分剂时稳定。n a g i n a k a 和k a n a s u g i l 7 1 ，7 2 1 制备出质量数为3 5 2 3 6 ( 用电喷雾第一章文献综述质谱测定) 的b s a 片段，之后把完整的b s a 和b s a 片段分别键合到经n n 一二丁二酸亚胺基碳酸酯( d s c ) 活化的氨丙基硅胶上，b s a 片段的键合量要比完整的b s a 多2 2 2 7 倍。由于b s a 片段固定相的键合量更大，故对氯羟去甲安定( 1 0 r a z e p a m ) 和二苯乙醇酮具有良好的手性选择性，可以分离2 一芳基丙酸的衍生物，苯并二氮，法华令( w a r f a r i n ) ，二苯乙醇酮( b e n z o i n ) 。而对其它化合物的手性选择性比完整的b s a 色谱柱要低，这可能是由于b s a 片段是球状结构以及在作用点周围局部环境变化所致。h s a 手性固定相是由d o m e m d 等【7 3 】首先使用的，在h s a 手性固定相上可以分离多种弱酸和中性化合物包括2 一芳基丙酸衍生物，如甲氧萘丙酸( 萘普生n a p r o x e n ) ，氟联苯丙酸( f l u b i p r o f e n ) ，布洛芬( i b u p r o f e n ) ，酮丙酸( k e t o p r o f e n )和非诺洛芬( f e n o p r o f e n ) ，以及其转化产物叶酸如甲酰四氢叶酸( 1 e u c o v o d n ) ，5一甲基四氢叶酸( 5 - m e t h y l t e t r a h y d r o f o l a t e ) 和苯( 并) 二氮类，如去甲经安定( o x a z e p a m ) 和羟基安定( t e m a z e p a m ) 。h s a 手性固定相和b s a 手性固定相很接近，所以它们的结合特征也类似。有时这两种固定相出峰次序会颠倒，s 一法华令在h s a 手性固定相上先于r 一法华令出峰，而在b s a 手性固定相上则相反。h s a 手性固定相为说明小分子在h s a 上的亲和及结合作用机理提供了信息。2 其它种类蛋白由于血清白蛋白在手性拆分领域的成功应用，其它的蛋白也相继被用于手性分离。包括有n 一糖蛋白【7 4 1 、卵类粘蛋 刍 7 5 , 7 6 1 、维生素结合蛋白7 刀和多种酶，如胰蛋白酣7 8 1 、糜蛋白酶 7 9 1 、胃蛋白酶1 8 0 l 等等。蔓二童苎堕堡垄图1 - 4 牛血清白蛋白一级结构f i g 1 - 4a m i n oa c i ds e q u e n c eo f b o v i n es e r u ma l b u m i n1 2 第一章文献综述1 3 2 6 分子印迹手性固定相色谱手性固定相拆分是近年来分析科学中最引人注目的领域之一。但是常用的手性柱价格极其昂贵，例如一根环糊精手性柱价格高达一万元以上人民币。故而制备一种有效且价格低廉的手性柱显得格外重要。分子印迹手性固定相具有容易制备，价格相对低廉，物理机械性能良好，使用寿命长，能多次重复使用而不损失其分子记忆效应的优点。分子印迹技术是将待分离的模板分子与功能单体在交联剂单体溶液中进行聚合得到固体介质，然后通过物理或化学方法除去介质中的模板分子，便得到“印迹”了模板分子空间结构和结合位点的分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , m i p ) s l 】。分子印迹聚合物同环糊精、冠醚和杯芳烃等相似，都属于主客体化学范畴，常用于手性分离，但分子印迹聚合物更有其独特的优点。它在做手性分离介质时，分离选择性，即对映体的出峰顺序可以预测。被分离的药物分子有n 一乙酰一d ，l 一氨基酸及其酯类衍生物、叔丁氧羰基氨基酸及其衍生物、苄氧羰基氨基酸及其衍生物、丹酰氨基酸及其衍生物、二羟基苯酮、甲基氢化肉桂酸、扁桃酸、萘心安、甲基苯乙胺、卟啉族、三嗪、苄基海因等i 配谢l 。以s 一萘普生为印迹分子，4 一乙烯基吡啶为单体与乙二醇二异丁烯酸酯交联共聚得到的分子印迹聚合物手性固定相成功的分离了外消旋萘普生，并将其从结构类似物酮基布洛芬和异丁基布洛芬中分离出来 8 5 o 模板分子除了手性碳原子上的羧基与4 一乙烯基吡啶有离子化作用外，手性碳原予上的芳基和甲基也对分子识别过程具有立体贡献，这正符合了立体选择性中“三点作用”的原则。k e m p e 8 6 , s 7 】等用整体聚合法制备了分离氨基酸对映体的手性固定相，同时利用表面聚合技术在硅胶上涂敷分子印迹聚合物，得到的手性固定相用来分离生物高分子蛋白质，拓宽了分子印迹聚合物作为色谱固定相的应用范围。h o s o y a 等【s s 】发现使用手性单体，用外消旋体作为模板分子制备分子印迹聚合物固定相，也具有手性分离能力。w a l s h e 等【鲫】采用以分子印迹聚合物填充的毛细管电泳分离了普萘洛尔对