（控制科学与工程专业论文）rnai技术中的sirna序列设计方法研究.pdf

国防科学技术大学研究生院学位论文 摘要 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e , r n a i ) 是真核生物体内由双链r n a ( d o u b l e s 虹a n - d e dr n a , d s r n a ) 介导的降解同源r n a 的现象。r n a 干扰利用与靶基因同源的短小双链r n a ( s h o l ti n t e r f e r i n gr n a , s i r n a ，通常是1 9 b p ) 降解靶基因，从而抑制靶基因合成蛋白质，诱 使细胞表现出特定基因缺失的表型。r n a 干扰是一门新兴的技术，在基因功能研究、疾病 治疗、植物抗病性研究等方面具有广泛的应用前景。 在r n a 干扰技术的应用中，s i r n a 的序列设计是一个非常重要的问题。典型哺乳动物 的基因长度都有若干k b p ，而s i r n a 长度仅为1 9 b p 左右，因此靶m r n a 可供选择作用的位点 相当多，但实践表明对靶m r n a 选择不同的作用位点设计s i r n a ，其抑制效果会有很大的 区别，在某些位点抑制效果会很明显，而某些位点可能基本无抑制。而从实验条件及费用 成本方面考虑，对靶m r n a 的所有作用位点一一设计s i r n a 进行实验显然是不可行的，因 此研究影响s i r n a 序列挪制靶m r n a 效果的因素是很有必要的。 本文从两方面研究s i r n a 序列抑制靶m 】r n a 效果的影响因素：( 1 ) s 诹n 笋列的特点。 ( 2 ) 靶m r n a 作用位点的二级结构及序列特点。在研究各种影响因素的前提下，利用b p 神经网络对多种影响因素进行综合，在此基础上对s i r n a 序列的抑制效果进行预测。最后 利用靶m r n a 的二级结构信息对神经网络的预测结果进行进一步筛选。实验结果表明，利 用该方法预测靶m r n a 的有效s i r n a 序列，其真实有效率达到了8 0 以上，可以有效地为 实验或应用提供参考。 关键词：r n a 干扰s i r n a 靶m r n a 序列设计作用位点聊神经网络 第1 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 a b s t r a c t k n a ii sap h e n o m e n o no fg e n es i l e n c ei n d u c e db yd o u b l e - s t r a n d e dr n a ( d s r n a ) t h a ti s h o m o l o g o u st ot a r g e tg e n e t a r g e tm r n ai sd e g r a d e db ys h o r ti n t e r f e r i n gr n at h a ti s h o m o l o g o u st oi ts ot h a tt h ep r o c e s so fs y n t h e s i z i n gp r o t e i ni si n t e r f e r e d r n a ii sak i n do fn e w t e c h n o l o g yt h a tc a l lb eu s e di ni d e n t i l y i n gt h ef u n c t i o no f g e n e ，c 嘶n gd e s e a s ea n dr e s e a r c ho n a n f i v i r u so f p l a n t ，a n ds oo i l i nt h ea p p l i c a t i o no fr n a i ，t h es e q u e n c ed e s i g no fs i r n ai sv e r yi m p o r t a n t m a m m a l i a n g e n e nt y p i c a l l yi n c l u d e ss e v e l a lt h o u s a n dn u c l e o t i d e s , h o w e v e rt h ed e s i g n e ds i r n ai n c l u d e s o n l ya b o u t1 9n u e l e o t i d e s ，s ot h eh u mo ft a r g e ts i t e so fg e n et h a t0 a nb ec h o o s e ni sl a r g e i t s h o w st h a td i f f e r e n tt a r g e ts i t ec h o o s i n ga f f e c ts i r n aa c t i v i t y s i r n am a yi n h i b i t et a r g e t i m p r e s s i o nv e r yw e l li ft h et a r g e ts i t ei sc h o o s e np r o p e r l y , b u ti ti sp o s s i b l et h a ts i r n ah a r d l y w o r kw h e nc h o o s i n gw r o n gt a r g e ts i t e t h i n k i n go ft h ec o s ta n dc o n d i t i o no fe x p e r i m e n t , i ti s u n p r a t i c a lt ot e s tv e r ys i t eo ft a r g e tg e n eo g l eb yo n e ，s or e s e a r c h i n gt h ef a c t o r so fa f f e c t i n g s i r n aa c t i v i t yi se s s e n t i a l i nt h i sa r t i c l e , t h er e s e a r c h0 1 1f a c t o r sa f f e c t i n gt h es i r n a a c t i v i t yi sf r o mt w oa s p e c t s ：o ) t h em o t i f so f s i r n a , ( 2 ) t h em o t i f sa n ds e c o n ds t r u c t u r e so f t a r g e tm r n a a f t e rf i g u 面go u tt h e f a c t o r so fa f f e c t i n gs i r n aa c t i v i t y , b a c k - p r o p a g a t i o nn r a ln e t w o r ki sb u i l ta n dt r a i n e du s i n g s o m ep u b l i s e dd a t ao fe x p e r i m e n t s ，t h e nt h en e t w o r ki su s e dt op r e d i c ts i r n a a c t i v i t y a tl a s t t h ei n f o r m a t i o no ft a r g e tm r n as e n e o n ds t r u c t u r ei su s e dt of i l t e rt h eo u t p u t so fb pa n n n e t w o r k t h ec o m p u t e rs i m u l a t i o nr e s u l t ss h o wt h a ti np r e d i c t e da c t i v es i r n a st h e r ea r em o r e t h a n8 0 s i r n a sa l er e a l l ya c t i v e ，s ot h i sm e t h o dc a np r o v i d er e f e r e n c es e r v i c ef o rd e s i g n i n g s i r n a k e yw o r d s ：r n a i s i r n a t a r g e tm r n as e q u e n c ed e s i g n t a r g e ts i t e b a c k - p r o p a g a t i o nn e u r a ln e t w o r 第页 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表和撰写过的研究成果，也不包含为获得国防科学技术大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文题目：! 丛i 燕苤主煦! i 丛! 压到遮让左造盟壹 学位论文作者签名：蕴垄拯日期：砖。g 年月；矿日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解国防科学技术大学有关保留使用学位论文的规定。本人授权国 防科学技术大学可以保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允 许论文被查阅和借阅；可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密学位论文在解密后适用本授权书。) 学位论文题目：坠i 挂盔主鲍! i b 丛庄到遮盐左洼婴究 学位论文作者签名 蕴建。垄 作者指导教师签名： 王玉查 日期：0 2 ：- 6 年1 1 月；o 日 日期：年1 1 月3 一日 国防科学技术大学研究生院学位论文 第一章绪论 1 i 引言 随着人类基因组计划【1 - 2 1 ( h u m a ng c n o mp r o j e c t , h g p ) 第一阶段任务的完成，人类进 入后基因时代。人们研究基因的最终目的是为人类自身服务，随着r n a i ( r n a i n t e r f e r e n c e r n a 干扰) 技术的出现，人们看到了它在治疗遗传病毒性疾病等应用方面的巨 大前景，因此r n a i 技术已经成为基因研究方面的一个热点。本课题正是在这样一个大的 背景下开展的。 为了文章后续部分更好地展开，在第一章绪论中我们将按以下步骤逐步展开： 首先是简要介绍分子生物学的遗传机制，因为r n a 干扰是一种转录后基因沉默技术， 因此了解分子生物学的遗传机制是必要的，它是理解r n a 干扰原理的基础。 然后将介绍r n a 干扰技术的概况，包括概念与起源、原理与机制、生物学功能、应 用前景等，这一部分内容是本论文研究课题的背景。 最后，将在前面介绍的内容所作铺垫的基础上，提出本课题所准备研究和解决的问题， 以及本论文的创新点，并简要介绍本论文的结构。 1 2 分子遗传学机制 1 2 1 中心法则 基因是能够自我复制，永远保存的单位，它的生理功能是以蛋白质的形式表达出来的。 所以d n a 核苷酸序列是遗传信息的储存者，它通过自主复制得以永存，通过转录生成信 使r n a ，进而翻译成蛋白质的过程来控制生命现象，邸贮存在核酸中的遗传信息通过转录， 翻译成为蛋白质，体现为丰富多彩的生物界，这就是生物学中的中心法n ( c c n t r a ld o g m a ) 。 aa 蛋自质 图1 - 1 遗传信息传递的中心法则 该法则表明信息流的方向是由d n a ) r n a 蛋白质。在该信息流中，r n a 病毒 第1 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 及某些动物细胞能以r n a 为模板复制出r n a ，然后再由r n a 直接合成出蛋白质；同时 某些病毒、癌细胞及动物胚胎细胞还可以由r n a 转录出d n a ，即发生反转录( r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n ) 。 1 2 2 遗传密码 d n a 的核苷酸序列是遗传信息的贮存形式，通过转录的方式合成信使r n a ( m c s s a g e r ir n a , m r n a ) 。通常把与m r n a 序列互补的那条d n a 链称为编码链( c o d i n gs t r a n d ) 或正义 链，另一条不被转录只能通过碱基互补合成新的d n a ，称为反义链( a n t i c o d i n gs t r a n d ) 或无 义链。只有m r n a 携带的遗传信息才被用于指导蛋白质的生物合成，即决定蛋白质中氨基 酸排列顺序。实验证明m r n a 上每3 个核营酸翻译成蛋白质链上的一个氨基酸，这3 个核 苷酸被称作遗传密码，也叫三联体密码。 1 2 3m r n a 的转录与加工 ( 1 ) 转录( t r a n s c r i p t i o n ) 活细胞内蛋白质氨基酸排列顺序由d n a 所带的遗传信息控制，d n a 中遗传信息的表 达必须经过中介产物，即转移到m r n a 上，这个过程叫转录。由m r n a 再将这些信息转 移到蛋白质合成系统中，合成蛋白质的过程称为翻译( t r a n s l a t i o n ) 。 m r n a 合成过程需要多种酶催化，从d n a 合成r n a 的酶称r n a 聚合酶( r n a p o l y m e r a s c ) 。真核细胞m r n a 转录需要r n a 聚合酶i i 。d n a 双链分子转录成r n a 的 过程是全保留式的，即转录的结果产生一条单链r n a ，d n a 仍保留原来的双链结构。转 录的第一步是r n a 聚合酶i i 和启动子( p r o m o t o r ) 结合。启动子是d n a 链上的一段特定的 核苷酸序列，转录起点即位于其中。然而r n a 聚合酶本身不能和启动子结合，只有在 另一种称为转录因子的蛋白质与启动子结合后，r n a 聚合酶才能识别并结合到启动子上， 使d n a 分子的双链解开，转录就从此起点开始。解开的d n a 双链中只有一条链可以充当 转录模板的任务，r n a 聚合酶沿着这一条模板链由3 端向5 端移行，一方面使d n a 链陆续解开，同时将和模板d n a 上的核苷酸互补的核苷酸序列连接起来形成5 一 3 的 r n a ，r n a 聚合酶只能在d n a 的3 端连接新的核苷酸，即m r n a 分子按5 一) 3 方向 延长，这就说明了为什么d n a 两条链中只有一条可作为模板。当r n a 聚合酶沿模板链移 行到d n a 上的终点序列后，r n a 聚合酶即停止工作，新合成的r n a 陆续脱离模板d n a 游离于细胞核中。 ( 2 ) 加工 转录出来的r n a 必须经过加工方能变为成熟的m r n a 。m r n a 的前体是分子较大的 i m r n a ( h e t e r o g e n e o u sn u c l e a r r n a ，核内不均一r n a ) 。真核细胞中的h n r n a 5 端要连 上一个甲基化的鸟嘌呤，这就是m r n a 的5 端帽子。该帽子有下述功能：( 1 ) 使m r n a 免 遭核酸酶的破坏；( 2 ) 使m r n a 能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质；0 ) 被蛋白质合 成的起始因子所识别，从而促进蛋白质合成。在m r n a 3 端需要加上p o l y ( a ) 序列的尾巴， 其长度因m r n a 种类不同而不同，一般为4 0 - , 2 0 0 个左右的碱基，有两个功能：( 1 ) 它是 第2 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 m r n a 由细胞核进入细胞质所必需的；( 2 ) 提高m r n a 在细胞质中的稳定性。h n r n a 链上 还含有不编码氨基酸的内含子和编码氨基酸的外显子。m r n a 戴上甲基鸟苷“帽子”，加上 p o l y ( a ) 尾巴”，并且在切除内含子后把所有外显子连接起来才能成为成熟的m r n a 图1 2 蛋白质合成过程 1 2 4 翻译 将m r n a 的碱基顺序依次翻译成特定的氨基酸链，这一过程即为翻译。 在翻译的过程中，有两种r n a 分子起到重要作用。蛋白质合成是在细胞内被称为核 糖体的细胞器中进行的。核糖体由蛋白质和被称为核糖体r n a ( r i b o s o m a lr n a , r r n a ) 的 大分子组成，它的功能类似于工厂的装配线，输入m r n a 和另外一种叫转移r n a ( t r a n s f e r r n a , t r n a ) 的分子，输出蛋白质。 实际上，遗传密码的翻译是由t r n a 实现的，它连接密码子和其所编码的氨基酸。每 一个t r n a 分子在一端有一个对特定密码子有高亲和力的构象( c o n f o r m a t i o n ) ，在另一端 有一个容易与该密码子编码的氨基酸结合的构象。当m r n a 穿过核糖体内部时，t r n a 匹 配当前的密码子，即当前位于核糖体内部的m r n a 密码子，与它结合，并带进对应的氨基 酸( 细胞中总是悬浮着大量氨基酸) ，新带进的氨基酸紧靠先前形成的氨基酸链，在合适 的酶催化下加入氨基酸链，然后释放t r n a 。蛋白质按这种一个氨基酸接一个氨基酸的方 式结合形成，直到终止密码子出现，翻译过程结束。 第3 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 1 3 r n a 干扰技术 1 3 1r n a 干扰的概念与起源 1 9 9 5 年康乃尔大学篚 g u o p l 博士在实验中想通过反义r n a 阻断秀丽线虫( c e l e g a n s ) 的 p a r - ，基因表达，同时她还用正y 。r n a 做了一个对照，试图观察到对照试验组基因表达增 强的现象。但结果却发现了反义和正义r n a 都阻断了该基因的表达。g u o 等人一直不能解 释该现象。直到1 9 9 8 年斯坦福大学的f i r e 等1 4 】才发现这是由于g u o 博士在试验中污染了双链 r n a 而引起的他们还证明转录得到的单链r n a 经纯化后注射到线虫体内所引起的基因 阻断作用十分微弱，而经纯化的双链r n a 则能高效特异地阻断相应基因的表达，并证实 这种抑制主要作用于转录之后，他们将此称为r n a 干扰，又称为转录后基因沉默 ( p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) 。r n a i 潜在的作用促使f i r e 和t i m m o n s 继续实 验，将能够表达出与c e l e g a n su r i c - 2 2 基因同源的双链r n a 的细菌喂食线虫，结果线虫表 现出类似u n c - 2 2 缺失的表型 5 1 。 随后人们又陆续在果蝇( d r o s o p h i l a ) 、锥虫( t r y p a n o s o m e s ) 、涡虫( p l a n a r i a ) 、斑马 鱼( z e b r a f i s h ) 、拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 、大小鼠和人体内发现t r n a i 现象m l ，遗传 学研究表明r n a i 是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制，与真核细胞中许多重要 生物学过程密切相关阴。 斯坦福大学的a n d r e wz f i r e 教授和马萨诸塞州医学院的c r a i gc m e l l o 教授获得2 0 0 6 年诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他们发现了r n a 干扰现象。 1 3 2r n a 干扰的作用机制与原理 通过对r n a i 现象的遗传学与生物化学研究，其作用机制已日渐清晰( 见图l 一3 ) 。初步 认为r n 加主要分为三个阶段。 ( 1 ) 起始阶段 d s r n a ( d o u b l e s t r a n d r n a ，双链r n a ) 进入细胞，r n a i 核酸酶与d s r n a 结合，并 将之降解成2 1 2 3b p 的小片段d s r n a ，这些小片段d s r n a 被称为s i r n a ( s m a l li n t e r f e r e n c e r n a ) 。s i r n a 与r n a i 核酸酶结合成复合物。由于s i r n a 和r n a s em 切割产物的相似性， b e n d ab o s s 等认为在形成s i r n a 的过程中有r n a s eh i 的参与【1 ，b e m s t e i n 和他的同事 发现果蝇中r n a i 的发生与这种酶有关，他们把这种蛋白酶称为d i c e r f 埘。除了含有两个 r n a s em 共有区域外，u i c e r 还含有一个解旋酶区域、一个d s r n a 结合区域和一个p a z 区 域。d i c e r 酶具有高度保守性，在果蝇、烟草、线虫、哺乳动物和神经细胞中发现能够将 相应种属的d s r n a 加工成特定长度的s i r n a 0 3 】。最近，r n a s eh i 接触反应区域结构的阐明 导致了d i c 砌割产生2 2 b p 片段模型的建立。在该模型中，认为r n a y , eh i 以二聚体酶形式起 作用，反向平行的r n a s e 区域产生两个复杂的接触反应中心。 第4 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 一吧= 黔 。一一僦眦 r 兰d r p 燃l l 靶序列识别 ， 7一、 ii 上k l l llimi 以s i r n a 为引物，r d r p 借化合成新的双链r n a 1lil i 。i 嘟 图1 3 r n a i 作用机制 ( 2 ) 效应阶段 复合物中s i r n a 作为模板，其反义链与对应的同源m r n a 结合，有义链解离出来， 同时m r n a 被降解并释放出r n a i 核酸酶，然后重复这一过程，特异性降解下一个对应的 m r n a i x 4 】。在果蝇中，r n a i 通过一种称为r n a 诱导沉默复合物( r n a - i n d u c e ds i l e n c i n g c o m p l e x ，s c l 识别和降解目的m r n a l l 5 1 。z a m 0 1 1 9 和他的同事们最近发现r i s c 在胚胎提 取物中以大约2 5 0 k d a 大小的前体复合物的形式存在，在加入a t p ( 三磷酸腺苷，体内一种 重要高能化合物) 之后被激活形成约1 0 0k d a 大小的能切割m r n a 的复合物【1 6 1 。s i r n a 是双链结构，含有2 个3 端突出碱基和一个5 端磷酸基团，该结构有利于s i r n a 与r i s c 复 合物的结合。 ( 3 ) 扩增和扩散阶段 s i i 圆a 的反义链与目的m r n a 结合后不仅诱导r i s c 对该基因进行降解，而且还激 第5 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 活r d r p ( r n ad e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ，r n a 依赖r n a 聚合酶) 介导的单链r n a 的合成， 产生大量的d s r n a ，这些d s r n a 又被切割成许多s i r n a ，进入下一个r n a i 循环。因此 只要注射很少量的d s r n a ，就能扩增出许多d s r n a ，从而在整个生物体细胞内发生基因沉 默。在植物中也发现了类似的沉默现象，同时也发现r n a i 不但能渗透到整株植物中，还能 传递到通过嫁接移植的后代植株中【1 7 l 。出现这种现象首先要求有一个细胞间传递信号的系 统，其次要有一个增强信号的机制。最近的研究提出一种称为转移r n a i 的现象，转移r n a i 指的是伴随一个特定基因沉默信号的迁移。例如在线虫中，瞄准3 端转录的r n a i 导致相 应n 瑚a 的沉默和与目的序列具有同源性的s i r n a 的产生，而且与目的基因上游序列互补 的s i r n a 也有产生和积累【l 明。当这些s i r n a 与其它d s r n a 互补时，其它d s r n a 也被抑 制，于是实现了转移。不管是在植物还是线虫中，d s r n a 诱导的基因沉默都需要r a r p 的 参与，它能够增强r n a i 信号1 1 9 】。 1 3 3 编码区r n a i 技术和启动子区r n a i 技术 根据所选用s i g n a 序列的不同，可将r n a i 技术分为编码区r n a i 技术和启动子区r n a i 技术： ( 1 ) 编码区r n 技术。自1 9 9 8 年在线虫中发现r n i 现象以来，以基因编码区为 靶序列的编码区r n a i 技术己用于线虫功能基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡 等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达产生 突变表型，但这种表型变化却不能遗传。这种早期的r n a i 技术可以用于研究与胚胎发育 有关的基因的功能，但由于细胞分裂造成d s r n a 的稀释，使得这种方法在研究成体的基因 功能时有一定的局限性。为弥补早期r n a i 技术的不足，t a v e m a r a k i s 2 0 1 等对r n a i 技术进 行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表 达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的d s r n a ， 从而产生r n a i ，使目的基因沉默。这种改进的r n a i 技术与传统的r n a i 技术相比，具有明 显的优点：首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析；其次d s r n a 可以被诱导产生， r n a i 能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可 能；另外，当用细胞特异性启动子控$ ! j d s r n a 的表达时，可以研究特定基因在不同器官中 的功能。 ( 2 ) 启动子区r n a i 技术。m f m c t t 等证明含有启动子区的d s r n a ；i ! e 植物体内同样 被切割成2 1 2 3 个核苷酸长的片段，这种d s r n a 可使内源相应的d n a 序列甲基化，从而 使启动子失去功能，使其下游基因沉默。由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而 使用编码区r n a i 技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的启动子序列通常比 编码区变化大，采用启动子区r n a i 技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究。这 样综合编码区r n a i 技术和启动子区r n a i 技术的信息即可更全面地了解多基因家族各成 员的功能。 第6 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 1 3 4s i r n a 的获得及d s r n a 的导入方法 越来越多的研究人员开始采用s i r n a j 、分子来抑制特定的哺乳动物基因表达。到目前 为止较为常用的5 种制备s i r n a 的方法包括； ( 1 ) 化学合成，公司订购，比较方便，但是价格贵成本高。 ( 2 ) 通过体外转录可以合成s i r n a ，这种方法的成本相对化学合成法比较低，不足 之处是实验的规模受到限制。 ( 3 ) 长片断d s r n a s 经r n a s ei i i 类酶降解( 例如：d i c e r ，e c o i l r n a s ei i i ) ，这个 方法通常选择2 0 0 1 0 0 0 碱基的靶m r n a 模版，用体外转录的方法制备长片断双链 d s r n a ，然后用r n a s ei i i 或d i e e r ：星体外消化，得到多种s i r n a 混合物，优点在于可以跳 过检测和筛选有效s i r n a 序列的步骤，缺点是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源 或者是密切相关的基因。 ( 4 ) s i r r a 表达载体或者病毒载体在细胞中表达s i r n a ，多数的s i r n a 表达载体依赖 3 种r n a 聚合酶i i i 启动子( p o l1 1 1 ) 中的一种，操纵一段小的发夹s i r n a 在哺乳动物细胞中 的表达。目前已经开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于s i r n a 表达，其优势在于可以 直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。 ( 5 ) p c r 制各的s i r n a 表达框在细胞中表达，s i r n a 表达框架( s i r n ae x p r e s s i o n c a s s e t t e s ，s e c s ) 是一种由p c r 得到的s i r n a 表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无 需事前克隆到载体中，主要缺点是p c r 产物很难转染到细胞中。 d s r n a 的导入方式。在线虫中最常用的是微注射法，该方法最早使用于细菌转化试 验中【2 1 2 2 】，r b e t t e n c o u r t 通过注射d s r n a 到蚕蛹胸部成功地抑制了h e m o l i n 基因的表达 圈。后来又发现将线虫浸泡：f d s r n a 溶液中能得到较好的r n a i 效果网。t i m m o n s 等用能 表达线虫d s r n a 的工程菌西c h e r i c h i ac o l i 喂养线虫后也能使线虫的基因沉默跚。到目前 为止，通过其他方法进行r n a i 得到的表型效果都比直接注射弱。电穿孔也是一种可行的方 法，已经由n 9 0 成功地应用于锥虫的研究【2 5 1 。对于某一特定的生物体，d s r n a 的具体导入 方法依生物体的性质而定，一般使用浸泡的方法比较简单，而对于外壳坚硬的如蚕卵等不 宜进行微注射或浸泡效果不明显的研究对象，可使用喂养能表达特定d s r n a 的工程菌或 病毒的方式。 1 3 5r n a 于扰的生物学功能 r n a i 机制依赖于s i r n a 反义链与靶序列之间严格的碱基配对，所以具有很强的特异 性，研究表明r n a i 机制除了参与转录后对m r n a 的稳定性调节( 即转录后基因沉默) 之外， 还与其他重要的生物学过程有关1 2 6 。 ( 1 ) 通过组蛋白甲基化影响染色质结构 v o l p e t z r l 等利用裂殖酵母( s p o m b o ，发现整合入着丝粒区的转基因表达总被抑制，他 们称此现象为“着丝粒沉默”( c e n tr o m e r i es i l e n c i n g ) ，随后发现着丝粒沉默是由于此区域 核小体组蛋白m 的l y s 9 甲基化后引起染色质凝集所致，并证明与r n a i 相关的基因突变 第7 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 可使组蛋白h 3 甲基化消失，同时使着丝粒沉默现象消除。由此可知，至少在裂殖酵母中， r n 加机制可通过组蛋白甲基化改变染色质结构造成着丝粒区域基因沉默。与此同时 b a r t e l 2 s l 等从裂殖酵母中分离出了一种与着丝粒区序列同源的d 、r n a 分子，将其命名为异 染色质s i r n a ，并推测“着丝粒沉默”是由s i r n a 造成的序列同源区组蛋白甲基化所致，即 在着丝粒区域，d n a 一条链连续表达，而另一条链间断表达，两条链的转录本互补形成 d s r n a ，然后通过r n a i 机制形成s i r n a ，s i r n a 引导甲基转移酶到序列同源的着丝粒区， 使组蛋白甲基化，最终导致染色质结构改变，从而调节基因活性。 ( 2 ) 通过d n a 甲基化在转录水平调节基因表达 对r n a i 相关基因突变体的研究表明r n a i 机制参与细胞编码基因正常转录的调控 鲫，生物体内三种基因沉默机制d n a 甲基化、协同抑制和转座子沉默均与r n a i 有关 p o 。w e s s e n e g g e r 等t 3 1 1 1 9 9 4 年在植物中发现染色体d n a 甲基化依赖于r n a 复制，即依 赖于双链r n a 的存在。随后w e s s e n e g g e r 与p e l i s s i e r t 3 2 1 又证实病毒在细胞内复制所形成的 双链r n a 可使宿主染色体上长约3 0 b p 的同源序列甲基化，并发现只要存在序列同源性，双 链r n a 即可使基因发生甲基化。d n a 甲基化后，基因就会失去转录活性，不再起始转录， 导致特定基因沉默。而且这种甲基化状态可以传给子代，使该基因在子代中表达仍然受到 抑制。协同抑制现象指转入的基因可导致细胞内同源基因沉默，p a l b h a d r a 等印j 证实在 果蝇中协同抑制是由于p o l y e o m b 复合体结合到内源基因上所致，p o l y e o m b 由s i r n a 引导 并结合到同源序列附近，使染色质处于非活性状态，抑制其起始转录。另外s i j e n 等【3 4 】发 现在矮牵牛( p e t u m a ) 中若转入基因产生的d s r n a 与靶基因的启动子同源则会导致转录水 平基因沉默( t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，t g s ) ，若与编码区同源则会导致转录后基因沉默 ( p t g s ) ，而且还发现t g s 和p t g s 过程中都有小分子r n a 产生，并且两个过程均伴随 靶序列的d n a 甲基化，最终都可导致基因沉默。 ( 3 ) 在翻译水平调节机体发育 对动植物中r n a i 相关基因突变体的研究表明，r n a i 机制与生物发育过程相关，其 作用机理是r n a i 机制的某些组分通过与p t g s 彼此分离但又密切相关的过程参与对发 育过程的调控。k e t t i n g 等【3 5 】发现单个d i c e r 基因d e r - 1 发生突变的线虫，除了r n a i 机制 缺失外，还产生了一系列表型改变。并且d c r - i 突变体表现出的发育时序的改交与l e t - 7 和 l i n - 4 突变体相似，而l e t - 7 和l i n - 4 编码小分子r n a ，在体内首先合成约7 0 n t 长的r n a 前体，然后在d i c e r 作用下生成约2 2 n t 的小分子r n a ，称为小分子瞬时r n a ( s m a l l t e m p o r a lr n a ，s t r n a ) ，这些小r n a 在线虫的发育过程中参与对m r n a 翻译的调节， 是特定基因的负调控因子，但并不介导m r n a 的降解，而是结合于m r n a 3 非翻译区， 阻止核糖体与m r n a 有效结合，从而抑制翻译的进行p q 。s t r n a 和s i r n a 关系密切， 除了都由d i c e r 加工成熟之外，r n a i 必需的a r g o n a u t e ( a l g - l ，a l g - 2 ) 家族基因也为两种 r n a 行使生物功能所必需【3 刀。研究者认为在r n a i 过程中形成的r i s c 复合物既含有 s i r n a 又含有s t r n a ，此复合物可根据不同情况产生不同效应，它可利用s i r n a 与靶 m r n a 互补介导m r n a 降解，但若s i r n a 与靶序列不能严格配对( 如有单个碱基错配) ， 第8 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 则p t g s 即无法进行，此时复合物又可转而利用s t r n a 抑制核糖体在m r n a 上延伸从而 在翻译水平阻断基因表达，此模型中r i s c 作为一个平台，不同情况下可以募集不同的组 件在其上装配，从而行使不同的功能，但最终均导致特定基因沉默，最近s h a r p l 3 嘲等证实 在哺乳动物培养组织中，s i r n a 确实可通过与m r n a 3 端非翻译区结合而抑制翻译的进行。 ( 4 ) 作为基因组的免疫系统 所有的复杂生物的基因组在长期的进化过程中均面临着病毒等外来核酸序列的侵入， 如人类基因组约有5 4 的序列含有这种入侵留下的遗迹【3 3 1 。那么生物怎样才能使自己的 基因组免受外来核酸分子侵袭而保持结构完整呢? 研究表明r n a i 机制在真核细胞中起 着类似动物免疫系统的作用，充当基因组的防护者。在植物中，r n a i 导致的p t g s 和v i g s 是保护基因组免受病毒入侵的重要机制，在动物中也存在类似的机制。除了可以抵御外来 病毒入侵外，r n a i 还可以控制基因组自身的寄生物一转座因子的活动，在许多生物中， r n a i 机制通过使转座因子或重复序列区域异染色质化，大大抑制了转座子和重复序列之 间的同源重组对基因组可能造成的破坏。正是由于r n a i 机制的存在，才使生物基因组在 长期的进化过程中能够保持结构的完整性和遗传的连续性。 1 3 6r n a 干扰的应用前景 ( 1 ) 研究功能基因组 虽然r n a i 的作用机制并未完全弄清，但是有很多的分子生物学家认为r n a i 是研究功 能基因组的一个非常有用的工具。因为r n a i 尸, 被用来研究并搞清楚了包括果蝇、线虫和一 些植物的基因的功能。通过向线虫体内注射d s r n a ，给线虫饲喂能表达d s r n a 的细菌，甚 至是把线虫浸泡在含有d s r n a 溶液中来研究r n a i ，都可以高效而方便地找出突变表型。 最近研究者甚至找到了更便利的方法，即通过增强内源的r n a 发夹状结构的表达，诱导 稳定的具有序列特异性的的沉默现象从而可以建立持续缺失某种功能表型的细胞系，为生 化分析提供大量的沉默细胞，同时对某种表型进行长时间的观察评价也成为可能。预计不 久的将来，很多类型的培养细胞都能生长在“r n a i 芯片”s j r n a 的点阵上面，可以记 录基因组中每个基因被抑制表达以后的表型，以及多个基因被渐次抑制后的综合表型，从 而可以知晓基因的功能及他们之间的相互作用。总之，r n a i 将在后基因组时代为解决疾 病机理和鉴定候选药物靶向的关键问题一基因功能鉴定中发挥其简捷高效的特点而为人 类服务。 ( 2 ) 在发育生物学以及核移植中的应用 为了研究胚胎在早期发育过程中的事件，通常人们想的是去除特定基因的表达，如果 能在特定的时间里把胚胎细胞中的人们感兴趣的基因的功能去除后人们将会得到很有价 值的信息。在这种情况下因为“基因敲除”取消了基因在整个胚胎发育过程中的功能，所 以就不再适用；另外，如果一个基因在不同的时间和位点被重复利用来指导发育过程的话， 利用基因敲除其功能人们将不篚了解该基因在不同发育阶段所起的作用。而r n a i 因为只 是对转录后的基因起抑制作用，因此克服了上述不足，显示了其在分析早期胚胎发育过程 第9 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 中的天然优势。当d i c e r 的同系物s i n l c a r p e lf a c t o r y 发生突变时，动物个体将发生 严重的发育缺陷【3 9 】，表明r n a i 路径在某种意义上能够调控与发育有关的基因的表达。 r n a i 路径是如何和哪些发育路径相互交叉相互作用，还不是太清楚。最近的资料表明， 在生产单短暂r n a ( s i n g l et e m p o r a r yr n a ，s t r n a ) 时要d i c c 一删，s t r n a 可以抑制靶 m r n a 的翻译，同时包含p a z 和p i p w 结构域的p p d 蛋白在干细胞、卵子发生、组织分化 发育中都起着重要的作用。以上资料表明，d i c e r 及其同系物在动物的发育过程中确实比 较关键。一个受精卵或动物的体细胞中具有相同的基因信息，所以能分化成各种不同类型 的细胞，是由于不同基因表达的结果。在细胞分化过程中，由于新的基因产物不断产生， 加入到原来的胞质成分中改变胞质成分，从而使核内基因表达状态不断受到调整，使胚胎 细胞逐步决定不断分化。 ( 3 ) 基因治疗 r n a i 的靶位识别是一个有着高度序列特异性的过程。由s i 砌q a 到靶链，互补的靶位识 别具有专一性，3 端突出中的倒数第二个核苷酸影响靶m r n a 的裂解，一旦错配，将会使 r n a i 的作用降低2 - 4 倍，相对而言，s i r n a 的5 端和3 对错配有一定的允许性，但是与 靶m r n a 的断裂位点相对的s i r n a 中央的核苷酸是决定特异性非常重要的因素，即便有 一个核苷酸错配，实验过程中就不能检测到r n 灿现象，说明s i r n a 双链能够辨别基因靶位 的突变或多态性等位基 圈( p o l y m o r p h i ca l l e l e s ) ，对将来的治疗发展非常有利。现在还不知 道以r n a i 机制抵抗病毒或者动物病毒基因编码的蛋白对r n a i 是否起抑制作用，但了解 r n a i 系统的作用机制，以及其与动物病毒的相互作用是建立以r n a i 为基础的人类疾病基 因治疗中的重要一环。 1 4 课题研究的主要内容及贡献 在r n a 干扰的实验或应用中，主要包括的流程如下： 丽 丽网 q # i 根据m r n a 或蛋囱i 序列j_ 序强jo；干扰4；质残留鼙确定选用