（生物物理学专业论文）耐辐射球菌中reca的调控蛋白研究.pdf

浙江入学博士学位论文耐辐射球菌中r e c a 的调控蛋白砌 究 耐辐射球菌中r e c a 的调控蛋白研究 摘要 本研究是对耐辐射球菌抗辐射机制研究的一部分，耐辐射球菌是迄今为止发现的 最抗辐射的生物之_ ，它可以耐受剂量超过1 5 k g y 的电离辐射而不发生突变，以往 的研究发现耐辐射球菌的抗辐射表型和细胞内有效的损伤d n a 修复有关，r e c a 在 修复过程中扮演着重要角色，破坏r e c a 基因后，耐辐射球菌失去了绝大部分辐射抗 性。基因组测序发现，耐辐射球菌基因组缺乏r e c b 、r e c c 、r e c e 、r e c d r e c o 和r e c t 等参与重组修复的关键基因，r e c a 蛋白究竟以什么方式参与细胞内d n a 损伤修复 还是一个谜。尽管发现p p r l 基因参与了耐辐射球菌r e c a 的表达，但对r e c a 的调节 机制仍然还不了解。本文参照一般细菌r e c a 的调节模式，发现耐辐射球菌编码三个 r c c a 调节蛋白类似物，包括两个l e x a 和一个r e c x ，通过对它们的功能分析，研究 r e c a 的调控机制，对揭开耐辐射球菌的高抗辐射机制有重要启发意义。 l e x a 是r e c a 转录中的一个重要的抑制子。在大多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性 菌中，r e c a 的表达受d n a 损伤的诱导，并激活其辅蛋白酶活性催化l e x a 自裂解， 释放包括r e c a 在内的多种d n a 损伤诱导基因的表达。耐辐射球菌内有两个l e x a 蛋 白同源物，它们都具有l e x a 蛋白结构域，包括d n a 结合结构域，保守的裂解位点 ( a l a - g l y ) 和c 末端的自裂解蛋白酶，可被r e c a 催化进行自裂解反应。n a r u m i 等 的研究认为其中的一个l e x a 同源物( d r a 0 3 4 4 ) 不参与r e c a 基因的诱导表达，这使 得了解另一个l e x a 同源物( d r a 0 0 7 4 ) 的活性对研究r e e a 调控更有意义。本文构建 了基因d r a 0 0 7 4 的突变菌株，通过免疫杂交和启动子活性分析，对比了野生型和突变 体中r e e a 的表达。实验数据表明，l e x a ( d r a 0 0 7 4 ) 同样不参与r e c a 基因的诱导表 达，论证了耐辐射球菌r e c a 的表达不需要l e x a 蛋白。进一步的蛋白质组学分析发 现l e x a ( d r a 0 0 7 4 ) 的功能可能与细胞内的某种代谢有关。 r e c x 是一个调节蛋白；发现于许多细菌中，它的编码基因位于r e c a 的下游，并 且两个基因通常共转录。一般认为r e c x 能够直接下调r e c a 蛋白活性，降低r e c a 过表达对细胞的损伤。和大多数细菌不同，耐辐射球菌的r e c x 同源基因( d r l 3 1 0 ) 位 摘要 于染色体l 上，距离r e c a 基因较远，它的具体功能还未作研究。本文构建了基因d r l 3 1 0 的突变菌株和过表达菌株，细胞水平分析表明耐辐射球菌r e c x 对r e c a 的活性具有 抑制作用；进一步的实验发现，r e c x 不仅可以在蛋白质水平抑制r e c a 蛋白的重组 活性、a t p 酶活性和辅蛋白酶活性，还可以在基因表达水平直接抑制r e c a 的表达， 表现出了双重抑制活性，揭示r e c x 参与了r e c a 表达的负调节机制。 辐射产生的活性氧是造成细胞损伤的重要原因，因此抗氧化机制是细胞抗辐射的 一个重要组成部分，r e c x 的缺失提高了细胞内的抗氧化活性；通过对耐辐射球菌中 重要的抗氧化酶c a t 和s o d 活性的分析，发现r e c x 蛋白不影响c a t 和s o d 蛋白 的活性，而是直接抑制它们的表达。尽管还不清楚r e c x 对抗氧化活性的影响和其调 控r c c a 功能的关系，r c c a ，c a t 和s o d 都参与了耐辐射球菌的辐射损伤诱导反应， 对它们表达的抑制表明r e c x 参与了这一诱导反应，r e c x 表现出了多方面的抑制活 性。 为了进一步了解r e c x 蛋白在耐辐射球菌中的功能，进行了双向电泳分析实验。 通过比较野生型和突变体的电泳图谱以及随后的蛋白点的质谱鉴定，在鉴定出的3 6 种蛋白中，发现r e c x 可以抑制包括r e c a 、s s b 、p p r a 、s o d 等d n a 损伤诱导蛋 白在内的1 2 种蛋白的表达，同时可以提高其他2 3 种蛋白的表达量，他们分别属于基 因转录、蛋白表达、物质转运和代谢，能量转运和代谢等途径。上述结果表明，r e c x 参与了辐射诱导的d n a 损伤反应，r e c x 缺失的情况下，可以释放包括r e c a 在内的 多种d n a 损伤诱导基因的表达、抑制多种细胞内正常的代谢，包括氨基酸，糖类和 脂类代谢，以及能量代谢，似乎与d n a 损伤检测点反应有关。 综上所述，耐辐射球菌的l e x a ( d r a 0 0 7 4 ) 是个调节蛋白，但是不参与r e c a 的 诱导表达：r e c x 作为耐辐射球菌辐射抗性的一个多功能抑制子，参与了r e c a 活性 的调节，在基因组稳定性和辐射诱导的重组修复中起着双重负调节作用。 关键词：d r a d i o d u r a n s ，r e c a ，r e c x ，l e x a v 浙 【人学| 尊士学位论文耐辐射球菌中r e c a 的调控蛋f 研究 r e g u l a t o r yp r o t e i n so fr e c a i nd e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s a b s t r a c t t h i ss t u d yi s p a r to fa ne f f o r tt ou n d e r s t a n dt h er a d i o r e s i s t a n tm e c h a n i s mi n d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s d r a 击o d u r a m i sw e l lk n o w na so n eo ft l em o s t r a d i o r e s i s t a n to r g a n i s m sa n ds u r v i v e sa c u t ee x p o s u r e st o1 , - r a yr a d i a t i o nt h a te x c e e d15 k g yw i t h o u tl e t h a l i t yo ri n d u c e dm u t a t i o n i th a sb e e nr e v e a l e dt h a ti t sr e m a r k a b l e r a d i o r e s i s t a n c ei sm a i n l yd u et oi t ss t r o n gd n a r e p a i ra b i l i t y t h i sp r o c e s sw a st h o u g h t t ob er e c a d e p e n d e n tb e c a u s er e c ap r o t e i ne x p r e s s i o ni sd n a d a m a g ei n d u c i b l ea n dd r a d i o d u r a n sl o s tt h er a d i o r e s i s t a n ta b i l i t yg r e a t l ya f t e rt h ed i s r u p t i o no fr e c a h o w e v e r , l i t t l eh a sb e e nk n o w na b o u th o wr e c af u n c t i o n si nr e c o m b i n a t i o np a t h w a y s ，i np a r a l l e l t ow h a th a sb e e nd e s c r i b e di nec o l i ，p a r t l yd u et ol a c ko fr e c b ，c ，e ，j ，oa n dt p r o t e i n sh o m o l o g o u st ot h eo n e si ne c o l i t h er e g u l a t i o no fr e c ai nd r a d i o d u r a n si s s t i l le l u s i v e ，a k h o u 曲p p r i ( o ri r e e ) w a ss u g g e s t e dp l a y i n gac r i t i c a lr o l e i nr e c a i n d u c t i o n f r e q u e n tr e c o m b i n a t i o ne v e n t si n i t i a t e db yt h er e c ai ns t a t i o n a r yg r o w i n g b a c t e r i aa n du n d e rn o n s t r e s s e dc o n d i t i o n sw o u l db ed e l e t e r i o u st ot h eg e n o m e s at i g h t n e g a t i v er e g u l a t o r yc o n t r o lm a yb en e e d e d t w ol e x aa n a l o g s ( d r a 0 3 4 4a n dd r a 0 0 7 4 ) a n d ar e c x ( d r l 3 1 0 ) a n a l o gw e r ef o u n di nd r a d i o d u r a n s w h i c hi n v o l v e di nt h en e g a t i v e r e g u l a t i o no fr e c ai nec o l ia n dm a n yo t h e rb a c t e r i a s t u d i e so nt h e ma r eh e l p f u li n u n d e r s t a n d i n gr e c a r e g u l a t i o na n dr a d i o r e s i s t a n tm e c h a n i s mi nd r a d i o d u r a n s i nec o l i r e c ai si n d u c e db yd n ad a m a g ea sac o - p m t e a s et of a c i l i t a t e s e l f - c l e a v a g eo f t h el e n a t h ec l e a v a g eo fl e x at r i g g e r sd n ad a m a g er e s p o n s eb e c a u s e l e x an o r m a l l yr e p r e s s e sm o s to ft h ed n ad a m a g e - i n d u c i b l eg e n e si n c l u d i n gr e c a d r a d i o d u r a n sh a v et w ol e x aa n a l o g sa n dt h ep e p t i d es e q u e n c ea s s a ys h o w e dt h a tp o s s e s s c o n s e r v e dl e x ad o m a i n s ，i n c l u d i n gav a r i a n th e l i x t u m - h e l i xd n a b i n d i n gm o t i fi n n t e r m i n a ld o m a i n ，c o n s e r v e dc l e a v a g es i t e ( a l a g l y ) ，c - t e r m i n a ld o m a i ni n v o l v e di n t h ec l e a v a g er e a c t i o na sap r o t e i n a s e ，a n da u t o c l e a v a g ea c t i v i t yp r o m o t e db yr e c a x a b s t r a c t h o w e v e r ，n a r t m t ie ta 1 p r o v e dt h a tdr a d i o d u r a n sl e x ap r o t e i n ( d r a 0 3 4 4 ) i sn o t i n v o l v e di nr e c ai n d u c t i o nf o l l o w i n gyi r r a d i a t i o n i ti si n t r i g u i n gt of i n dt h ef u n c t i o no f a n o t h e rl e x ap r o t e i n ( d r a 0 0 7 4 ) i nt h er e g u l a t i o no fr e c ai nt h eh i g h l yr a d i o r e s i s t a n t b a c t e r i u m w ec o n s t r u c t e dan u l lm u t a n to fg e n ed r a 0 0 7 4t os t u d yi t sf u n c t i o n r e s u l t so f t h et r a n s c r i p t i o n a la n di m m u n o b l o ta s s a y ss h o w e dt h a tg e n ed r a 0 0 7 4i sn o ti n v o l v e di n r e c ai n d u c t i o n ，i n d i c a t i n gt h a tr e c ae x p r e s s i o nn e e d sn ol e x ai nd r a d i o d u r a n s ，t w o d i m e n s i o n a l ( 2 - d ) g e le l e c t r o p h o r e s i sf u r t h e rc o n f i r m e dt h a tt h eg e n ei si r r e l e v a n t t ot h ed n a r e p a i ri n d u c e db yi o n i z i n gr a d i a t i o n ，b u ti si n v o l v e di no t h e rm e t a b o l i c p r o c e s si nd r a d i o d u r a n s r e c xi sa r e g u l a t o rf o u n d i nm a n yb a c t e r i a i t sc o d i n gr e g i o ni sl o c a t e do nt h es a m e c o d i n gs t r a n dd o w n s t r e a mo fr e c aa n dt h et w og e n e sa r ec o t r a n s c r i b e du s u a l l y i tw a s s u g g e s t e dt h a tr e c xc o u l dr e g u l a t et h ea c t i v i t yo fr e c aa n dr e d u c e st h ee f f e c t so fr e c a o v e r e x p r e s s i o nm o s t l y t h e r ei sa l s oar e c xh o m o l o g u er d r l 3 1 0 ) i ndr a d i o d u r a n s l o c a t e df a ra w a yr e c aa n di t sr o l eh a s h tb e e ns t u d i e dt od a y i nt h i sw o r k ，w ei n a c t i v a t e d a n do v e r e x p r e s s e dr e c xg e n ei nd tr a d i o d u r a n s ，a n df u r t h e ra s s a yr e v e a lt h a td r a d i o d u r a n sr e c xp r o t e i nn o to n l yn e g a t i v e l yr e g u l a t e sr e c ae x p r e s s i o n b u ta l s o i n h i b i t st h er e c o m b i n a t i o na n dc o p r o t e a s ea c t i v i t i e so f r e c ai nt h es t a t i o n a r yp h a s ec e l l s ， s h o w e dd u a ln e g a t i v er e g u l a t o r ym e c h a n i s m so fr e c xt ot h er e c af u n c t i o n si nd r a d i o d u r a n s u n d e rn o n s t r e s sc o n d i t i o n s r e c xw a sb e n e f i tt ot h es t a b i l i t yo fd r a d i o d u r a n sg e n o m e t l l i sf i n d i n gs h e d sm o r el i g h to nt h er e c ar e g u l a t i o ni nz ) r a d i o d u r a n s r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) s c a v e n g i n gi sa ni m p o r t a n t 。c o n t r i b u t o rt ot h e p r e v e n t i o nm e c h a n i s mb e c a u s et h el e t h a le f f e c to f i ri sk n o w nt ob eo x y g e ne n h a n c e di n t h ep r e s e n c eo fo x y g e nb yt h eg e n e r a t i o no fo x y g e nr a d i c a l sa n dh y d r o g e np e r o x i d et h a t d a m a g ec e l lm e m b r a n e s ，p r o t e i n s ，a n dn u c l e i ca c i d s 1 1 1 ea b s e n c eo f r e c xr e s u l t e di nt h e e l e v a t i o no ft h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e si nd r a d i o d u r a n s ，a n df u r t h e ra s s a y ss h o w e dt h a t r e c xh a sn oe f f e c tt h ee n z y m ea c t i v i t yb u ta n e g a t i v ee f f e c to nt h ee x p r e s s i o no fs o d a n dc a ta l t h o u g hi ti sn o tc l e a rt h a tw h e t h e rr e c xm e d i a t e da n t i o x i d a n tr e g u l a t i o ni s a l li n d i r e c tr e s u l to fr e c xm e d i a t i o no fr e c aa c t i v i t y , r e c a c a n ds o da r ea l l x 浙江人学博十学位论文耐辐射球菌中r e c a 的调控蛋白研究 i n v o l v e di n t ot h es o sr e a c t i o nc a u s e db yi r r a d i a t i o na n dr e c xe x h i b i t sa r e p r e s s o ri nt h e p r o c e s s t of u r t h e rv e r i f yt h ef u n c t i o no fr e c xi nd r a d i o d u r a n s ，w ec o m p a r e dp r o t e o m i c p a t t e m sb e t w e e nw i l dt y p er 1a n dt h em u t a n t 3 6p r o t e i n sw h o s ee x p r e s s i o n sw e r e o b v i o u s l ya l t e r e di nt h em u t a n tw e r ei d e n t i f i e db ym a l d i t o fm a s ss p e c t r am e a s u r e m e n t a n dd a t a b a s es e a r c h r e s u l t ss h o w e dt h a tr e c xc o u l dr e p r e s st h ee x p r e s s i o no f1 2p r o t e i n s ， i n c l u d i n gr e c a ，s s b ，p p r aa n ds o d t h ef o u ra r et h ek n o w nr a d i a t i o ni n d u c e dp r o t e i n ， w h i c hi sc o n s i s t e n tw i t ht h ea b o v er e s u l tt h a tr e c xi si n v o l v e dj nt h er a d i a t i o ni n d u c t i o n ， a tt h es a m et i m e ，a b s e n c eo fr e c xd e b a s e dt h eo t h e r2 4p r o t e i n sw h i c ha r eb e l o n gt o t r a n s c r i p t i o n ，i n o r g a n i ci o nt r a n s p o r ta n dm e t a b o l i s m ，e n e r g yp r o d u c t i o na n dc o n v e r s i o n ， a m i n oa c i dt r a n s p o r ta n dm e t a b o l i s m ，c a r b o h y d r a t et r a n s p o r ta n dm e t a b o l i s m ，a n dl i p i d m e t a b o l i s m t h i sf i n d i n gs u g g e s t e dt h a tr e c ki sr e l a t e dt od n ad a m a g ec h e c k r o i n t c o n t r 0 1 b a s e do na b o v er e s u l t s ，w ec o n c l u d et h a td r a d i o d u r a n sl e x aa n a l o g ( d i n 0 0 7 4 ) i sa r e g u l a t o r yp r o t e i nt h a ti si r r e l e v a n tt or e c ai n d u c t i o n ，a n dr e c xa c t s a s ap l e i o t r o p i c r e p r e s s o ri nt h er a d i o r e s i s t a n c eo fd r a d i o d u r a n s ，i n v o l v e di nr e c ar e g u l a t i o n ，s h o w e d d u a l n e g a t i v er e g u l a t o r ym e c h a n i s m st o t h er e c af u n c t i o n si ng e n o m es t a b i l i t ya n d r a d i a t i o n i n d u c e dr e c o m b i n a t i o n r e p a i r k e yw o r d s ：d r a d i o d u r a n s ，r e c a ，r e c x ，l e x a x 国家重点基础研究发展计划( 课题编号：2 0 0 4 c b 7 1 9 6 0 4 ) 、 国家自然科学基金重点项目( 批准号：3 0 3 3 0 0 2 0 ) 和国家杰 出青年基金( 批准号：3 0 4 2 5 0 3 8 ) 资助 t h i sw o r kw a ss u p p o s e db yag r a n tf r o mt h en a t i o n a l b a s i cr e s e a r c hp r o g r a mo fc h i n a ( 2 0 0 4c b19 6 0 4 ) ，ag r a n tf o r d i s t i n g u i s h e dy o u n gs c i e n t i s to fc h i n a ( 3 0 4 2 5 0 3 8 ) ，a n dak e y p r o j e c tf r o mt h en a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( 3 0 3 3 0 0 2 0 ) 致谢 首先非常感谢我的导师华跃进教授在我三年学习生涯中给予的关心与帮助。 论文的选题、实验的设计、实验操作以及论文的写作、校对等每个环节无不凝聚 着导师的心血与智慧。导师严谨的治学态度、渊博的学识、敏锐的洞察力、高尚 的人格、平易近人的作风、忘我的工作精神以及对科学执着的追求，这一切永远 激励我奋发前进，使我受益终生。值此毕业之际，对导师三年来的精心指导和谆 谆教诲表示衷心的感谢! 在学习和实验过程中，得到了所里其他许多老师、同学和朋友的无私帮助和 关怀。感谢徐步进教授、傅俊杰教授、凌备备教授、崔海瑞教授、史建君教授、 郭江峰副教授、汪志平副教授等对我的指导和关心；特别感谢本所田兵、曹学诚、 高冠军、许镇坚、郑智国、吴媛嫒、刘丽丽、刘庆龙、周祥胜、周风莲、刘艳辉、 杨灵勇、林军、陈仲仲、黄丽芬、许光治、应南娇、张春潮、陈熙、徐强等同学 在学习与工作方面给予的大力支持；另外，我的实验工作还得到了王晓博士、王 华新博士、应盛华博士、金维正博士、沈炳辉博士、刘仁博士、李勇博士、许文 平博士、李佳博士、周波博士等老师、同学和朋友的热情帮助与指导。在此，对 所有关心、支持和帮助过我的老师同学和朋友表示衷心的感谢。 另外特别感谢我的家人，在我的求学过程中给予的无私奉献和关心，使我得 以顺利完成学业，感谢亲人们的巨大精神鼓励与支持! 最后，谨向参加本论文评阅、答辩的各位专家致以最真诚的感谢 盛多红 2 0 0 5 年二月于杭州华家池 j 堑堡查兰堕堂垡堕奎塑堑壁堕垦! ! 垒塑塑丝壅旦堕塞 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) a m p 印 c a t c h a p s d e a e d e p c c f u c o g s d n a d t t d m d s b e b e d l i a g v h e p e s a m p i c i l l i n b a s i cp a i r c a t a l a s e 3 - ( c y c l o h e x y l a m i n o ) - 1 一p r o p a n e s u l f o n i ca c i d d i e t h y l a m i n o e t h y l d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e c o l o n y - f o r m i n gu n i t s c l u s t e r so f o r t h o l o g o u sg r o u p s d e o x y r i b o n u c l e i ea c i d d i t h i o t h r e i t o l 2 - d e o x y n u c l e o s i d e 一5 - t r i p h o s p h a t e d o u b l es t r a n d e db r e a k e t h i d u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i c g r a y n 一2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e _ n 2 e t h a n e s u l f o n i ca c i d h o u r h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t i s o p r o p y l - 1 3 一d - t h i o g a l a c t o s i d e i o n i z i n gr a d i a t i o n k a n a m y c i n j 【i l o b a s e k i l od a l t o n k i l o g r a y 氨苄青霉素 碱基对 过氧化氢酶 3 - ( 环己胺) i 丙磺酸 二乙胺基乙基 焦碳酸二乙酯 菌落形成数 直系同源群 脱氧核糖核酸 二硫苏糖醇 脱氧核苷三磷酸 双链断裂 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 戈瑞 n - 2 - 羟乙基哌嚷_ n 2 乙磺酸 小时 同源重组 固定p h 梯度 异丙基- b _ d 硫代半乳糖营 离子辐射 卡那霉素 千碱基对 千道尔顿 干戈瑞 r g h 吼 可 h m删矿瑕勋曲姆 缩写词 m l n m o p s m w n h e j o n p g p c r p m f p m s f r p m r t _ p c r s d s s d s p a g e s s a s s b t 觚 t b e t e m e d 砸s u v x - g a l m i n u t e 3 一n n m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c a c i d m o l e c u l a rw e i g h t n o n h o m o l o g o u se n dj o i n i n g o - n i t r o p h e n y l b - d g a l a c t o p y r a n o s i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t p h e n y lm e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e r e v o l u t i o np e rm i n u t e r e v e r s e t r a n s c 邱t i o n - p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n s o d i u md o e l e c y ls u l f a t e s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s s i n g l e s t r a n da n n e a l i n g s i n g l e s t r a n db i n d i n gp r o t e i n t r i s - h c i a c e t i ca c i d ，e d t a b u f f e r t r i s h c i b r o i ca c i d ，e d t a b u f f e r n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h y l a m i n o u l t r a v i o l e t 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 i n d o l y l b e t a - d g a l a c t o p y r a n o s i d e t w o - d i m e n s i o n a le t e c t r o p h o r e s i s 分钟 3 ( n 吗啉代) 丙磺酸 分子量 非同源末端连接 o 硝基苯基一b d 吡喃半乳糖 苷 多聚酶链反应 肽质量指纹图谱 苯甲基磺酰氟 辑每分钟 反转录多聚酶链反应 十二烷基硫酸钠 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝胶电泳 单链末端退火 单链结合蛋白 t r i s h c i ，乙酸，e d t a 缓冲 液 r r i s h c i ，硼酸，e d t a 缓冲液 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 紫外线 5 一溴- 4 一氯一3 一吲哚一b d 一半乳 糖苷 双向凝胶电泳 浙江火学博士学位论文耐辐射球菌中r e c a 的调控蚩白研究 氨基酸简写符号 单字母符号三字母符号英文中文 浙江火学博十学位论文耐辐射球菌中r e c a 的调控蛋白研究 引言 1 耐辐射球菌 耐辐射球菌( d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ，d r ) 是1 9 5 6 年由美国科学家a n d e r s o n 等在o r e g o n 首次从辐射灭菌后变质的肉类罐头中分离出来 1 】。当时命名为 m i c r o c o c c u s ，后改为d e i n o c o c c u s ，其家族成员都具有对抗由电离辐射、紫外线等 因素引起的致死和致突变效应 2 5 。因此，自从耐辐射球菌被发现以来，倍受微生 物学家、放射生物学家和肿瘤研究人员的重视。 1 1 细胞结构 耐辐射球菌中的砒菌株是研究中最常用的一个菌株【6 ，圆形菌落，直径在1 21 1 1 y l 之间，能产生粉红色色素，好氧，在缺氧条件下，耐辐射球菌几乎不能生长。单克隆 的菌苔呈凸状，表面光滑，在指数生长期，约9 0 的细菌呈二联体存在，随着细胞 分裂，生长后期形成四叠体，在稳定期，绝大多数细菌呈四叠体【7 9 】。耐辐射球菌最 适生长温度是3 0 ，在3 7 时生长速度最快。当温度低于4 c 或高于4 5 时，细胞 停止生长。研究发现它具有易于染色体转化和质粒转移的能力，是研究抗辐射遗传特 性和高效的d n a 损伤修复的好材料 1 0 1 1 】，1 9 9 9 年r 1 的基因组测序完成 1 2 】。 图1 耐辐射球菌的细胞形态。 f i g 1c e l l u l a rm o r p h o l o g yo f ) r a d i o d u r a n s 引言 耐辐射球菌有一个不寻常的细胞壁结构，虽然它的细胞壁成分和一般的革兰氏 阴性细菌相似，但是由于它的肽聚糖层比较厚，难以脱色，因此实际革兰氏染色呈 阳性【1 2 。耐辐射球菌的细胞壁可以划分为一个1 4 到2 0 n l n 的肽聚糖层和一个未 知的分层结构，在电镜下，至少可以分为六层，最里面一层是细胞膜，紧挨着细 胞膜是含有肽聚糖的细胞壁，细胞壁上有很多孔，也称为多孔层，壁上的这些孔对 细胞有重要的生理学意义。第三层是可以分成无数的细小的区域( 分区层) ，第四 层是外膜，第五层是电子致密区；第六层由规则排列的六角形的蛋白亚单位组成( s 层，或六角排列的中间体层) ，也有一些耐辐射球菌外面还有一层厚的多糖外膜。但 是在细胞分裂时，只有细胞质膜和肽聚糖层参与形成细胞间隔断，其他的各层仅作 为外鞘，在分裂的子细胞分离时，包绕在子细胞外面 1 3 ，1 4 。q u i n t e l a 等人用质谱 研究了耐辐射球菌s a r k 菌株的纽胞壁肽聚糖层的化学结构 1 4 1 。结果表明耐辐射 球菌的细胞壁结构和a 3 p 分类是一致的。嗜热菌( t h e r m u st h e r m o p h i l u s ) h b 8 的 细胞壁也是属于a 3 p 型的化学分类，并且它的肽聚糖也是由同样的单体组成，说明 这两种菌在进化上有比较近的关系。 细胞外膜和细胞质膜在脂类组成上一样，但没有发现其他菌中普遍存在的脂多 糖。耐辐射球细胞壁的脂肪酸组成也是与众不同，它既不含有羟基脂肪酸、类脂a 以及庚糖，也不含有多不饱和脂肪酸、环丙基和分支脂肪酸，而含有一个由 1 5 ，1 6 一，1 7 一，以及1 8 一碳饱和或单不饱和脂肪酸组成的混合物【1 3 】。和其他细菌另一 个明显的不同是缺乏磷脂，耐辐射球细胞膜的脂类中，4 3 是含有烷基胺的磷酸甘 油酯，至于烷基胺起什么作用，现在还不清楚。这些脂类可能起源于同一个前体， 即一种新的磷酸甘油酯烷基胺，通过半乳糖或葡萄糖糖基化这种前体形成了耐辐射 球菌独有的磷酸甘油脂，目前含有葡萄糖胺的脂类在其他菌中也有发现，特别是嗜 热菌属。 1 2 基因组结构 1 9 9 9 年w h i t e 等对耐辐射球菌的r l 菌株进行了全基因组测序 1 2 】，确定整个 基因组由4 个环状分子组成：染色体i 2 , 6 4 8 ，6 3 8 b p ，染色体i i ( 4 1 2 ，3 4 8b p ) ，大质粒 浙江人。产博十学位论文耐辐射球菌中r e c a 的调控蚩白研究 ( 1 7 7 ，4 6 6 b p ) ，和一个小质粒( 4 5 ，7 0 4b p ) ，总共3 2 8 4 1 5 6 b p ，平均g + c 含量6 6 6 ， 和复制有关的基因主要位于染色体i 和i i ，比如d n a a 和d n a n 在染色体i 上， p a r a 在染色体i i 上。 整个基因组有3 1 8 7 开放阅读框( o p e nr e a f l i n gf r a m e s ，o r f s ) ，平均大小约 9 3 7b p ，覆盖了整个基因组的9 1 。在3 18 7 个阅读框中，有2 1 8 5o r f s ( 6 9 ) 可 在当前的数据库中找到匹配序列，其中的1 6 7 4 个的生物学功能可以推测出来， 5 t 1 个是未知蛋白；其他的1 0 0 2 个o r f s 在数据库中找不到匹配序列。采用 p s i - b l a s t 对耐辐射球菌基因进行基因家族分类总共1 6 6 5 ( 5 2 ) 基因可以划分 为9 5 家族，其中两个最大的家族是p 噜噗核苷酸结合蛋白和h t h 家族，分别有1 2 0 个基因和7 2 个基因。 表1 耐辐射基因组中预测的基因编码序列。 t a b l e1p r e d ! e t e dp r o t e i ne n d i n gr e g i o ns e q u e n c e so f t b e d r a d i o d u r a n sg e n o m e m o l e c u l ew i t had a t a b a s em a t c h i d e n t i f i e dp u t a t i v e