（急诊医学专业论文）hsp70在百草枯诱导的肺部炎症反应中的表达.pdf

一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前言6刖舌o 材料与方法6 实验结果o 0b o 8 讨论1 5 结 仑”1 7 四、本研究创新的自我评价1 8 五、参考文献1 9 六、附录 综述2 2 在学期间科研成绩3 4 致谢3 5 个人简介3 6 删f f f f f 8 0 5 0 中文论著摘要 h s p 7 0 在百草枯诱导的肺部炎症反应中的表达 实验目的 本研究将应用病理h e 染色方法检测百草枯中毒大鼠肺组织病理变化及病理损 伤程度，应用免疫组织化学及w e s t e r nb l o t 方法检测百草枯中毒大鼠肺组织中热 休克蛋白( h s p 7 0 ) 的表达水平。探索百草枯致大鼠急性肺损伤的发生机制，对临 床工作中百草枯中毒患者早期的救治提供有利的线索。 实验方法 7 2 只健康w i s t a r 大鼠随机平均分成3 组，分别腹腔注射生理盐水( a 组) 、 2 0m g k g 百草枯( b 组) 和4 0m g k g 百草枯( c 组) 。各组动物l 、2 、3 、6 、1 2 和2 4h 随机编入6 个观察时点。造模前，各组大鼠禁食1 2h ，不禁水。a 组大鼠 腹腔注射1m 1 生理盐水，b 组和c 组大鼠用生理盐水将p q 稀释至1m 1 腹腔注射 染毒。每组分别于6 个观察时点用1 0 水合氯醛腹腔注射后处死4 只大鼠，留取 肺组织标本，左侧肺组织置于4 多聚甲醛中固定1 2h ，用于h e 染色，免疫组织 化学染色。取右侧肺组织放于- 7 0 。c 冰箱备用，w e s t e r nb l o t 方法测定肺组织中 h s p 7 0 的表达。 实验结果 h e 染色，染毒大鼠肺组织发生急性肺损伤、透明膜的形成和炎性细胞浸润等 急性肺损伤典型的病理改变。免疫组织化学结果，b 组中h s p 7 0 的表达于2h 开 始升高，6h 达到峰值，2 4h 与a 组无差别。c 组中h s p 7 0 的表达于1h 开始升 高，3h 达到峰值，2 4h 与a 组无差别。且c 组2 、3 和1 2h 的表达均显著高于 b 组。w e s t e r nb l o t 结果，b 组大鼠2 、3 、6h 时点h s p t 0 的表达在肺组织中较a 组明显增强，其他时间点与a 组比无明显差异。c 组1 、2 、3 、6 、1 2h 时点h s p 7 0 理损伤却没有显著性差异，提示h s p 7 0 对肺损伤起保护作用。 关键词 百草枯中毒；热休克蛋白7 0 ；肺损伤 2 应 病 英文论著摘要 e x p r e s s i o no fh s p 7 0 i np q - - i n d u c e dp u l m o n a r y i n f l a mma t i o nr e s p o n s e o b j e c t i v e t h i ss t u d yw i l lb ea p p l i e dt od e t e c t p a t h o l o g i c a lh es t a i n i n go fp a r a q u a t p o i s o n i n gi nr a t sw i t hp a t h o l o g i c a lc h a n g e si nl u n gt i s s u ea n dp a t h o l o g i c a ld e g r e eo f i n j u r y , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dw e s t e r nb l o tu s e dt od e t e c tp a r a q u a tp o i s o n i n gi nr a t l u n gt i s s u e h e a ts h o c kp r o t e i n ( h s p 7 0 ) e x p r e s s i o n t o e x p l o r et h ei n c i d e n c eo f p a r a q u a t - i n d u c e da c u t el u n gi n ju r ym e c h a n i s m ，c l i n i c a lw o r ki nt r e a t m e n to fp a r a q u a t p o i s o n i n gp a t i e n t st op r o v i d eaf a v o r a b l ee a r l yc l u e s m e t h o d s 7 2h e a l t h yw i s t a rr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o 3 g r o u p s , r e s p e c t i v e l y , i n t r a p e r i t o n e a li n je c t i o no fs a l i n e ( ag r o u p ) ，2 0m g k gp a r a q u a t ( bg r o u p ) a n d4 0m g k gp a r a q u a t ( cg r o u p ) g r o u p so fa n i m a l s ，1 ，2 ，3 ，6 ，1 2a n d2 4hw e r er a n d o m l y i n c o r p o r a t e di n t ot h es i xo b s e r v a t i o np o i n ti nt i m e m o d e l i n gb e f o r e ，t h er a t sf a s t e d12 h ，c a n n o th e l pb u tw a t e r ag r o u po fr a t sw e r ei n j e c t e di n t r a p e r i t o n e a u y1m ln o r m a l s a l i n e ，bg r o u pa n dcg r o u pr a t sw e r ed i l u t e dw i t hs a l i n et op qe x p o s u r et o1m l i n t r a p e r i t o n e a li n je c t i o n e a c hg r o u pw e r eo b s e r v e di n6p o i n tw i t h10 c h l o r a lh y d r a t e i n j e c t e dr a t sw e r es a c r i f i c e da f t e r4 ，s p e c i m e n sf r o mt h el u n gt i s s u e ，t h el e f tl u n gt i s s u e p l a c e di n4 p a r a f o r m a l d e h y d ef i x e d12h ，f o rh es t a i n i n g ，i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g p u ti nt h er i g h tl u n gt i s s u eo b t a i n e d 一7 0 r e f r i g e r a t o rs p a r e ，w e s t e r nb l o to f l u n gt i s s u ew e r em e a s u r e dh s p 7 0e x p r e s s i o n r e s u l t s h es t a i n i n g ：l u n gt i s s u eo c c u r r e di nr a t se x p o s e dt oa c u t el u n gi n j u r y , h y a l i n e 3 m e m b r a n ef o r m a t i o na n di n f l a m m a t o r yc e l li n f i l t r a t i o nt y p i c a lp a t h o l o g i c a lc h a n g e so f a c u t el u n gi n j u r y i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gg r o u pb ，t h ee x p r e s s i o no fh s p 7 0 b e g a nt oi n c r e a s ea t2t l , 6ht or e a c ht h ep e a k ，a n dt h e r ea r en od i f f e r e n c ew i t ht h e g r o u pa a t2 4h g r o u pc ，t h ee x p r e s s i o no fh s p 7 0b e g a nt oi n c r e a s ea t1h ，3h r e a c h e dt h ep e a k ，a n dt h e r ea r en od i f f e r e n c ew i t ht h eg r o u paa t2 4h a n dt h e e x p r e s s i o no f2 , 3a n d12hi ng r o u pc w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ng r o u pb w e s t e r n b l o tr e s u l t s ：t h ee x p r e s s i o no fh s p 7 0i nl u n gt i s s u eo fg r o u pbw e r es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dc o m p a r e d 谢t ha a t2 ，3 ，6ht i m ep o i n t ，t h e r ew e r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t a tt h eo t h e rt i m ep o i n t sw i t hg r o u pa t h ee x p r e s s i o no fl i s p 7 0a t1 ，2 ，3 ，6 ，12ht i m e p o i n ti ng r o u pcs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t hg r o u pa ，t h e nt h ee x p r e s s i o no f h s p 7 0a t2 ，3 ，12ht i m ep o i n ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t hg r o u pb c o n c l u s i o n p a r a q u a t - i n d u c e da c u t el u n gi n ju r yc a n c a u s eb r o n c h i ，b r o n c h i o l e sa n da l v e o l a r e p i t h e l i a lc e l le x p r e s s i o no fl i s p 7 0s t r e s s t h el e v e lo fl u n gi n ju r y f o l l o w e di n c r e a s e d t o x i cd o s e ，a n dt h ee x p r e s s i o no fl i s p 7 0a l s oi n c r e a s e d h o w e v e r ，t h el u n gp a t h o l o g i c a l i n j u r yw a s n o ts i g n i f i c a n td i f f e r e n t c o n s e q u e n t l y , s u g g e s t i n gt h a th s p 7 0p r o t e c t i v e e f f e c ta g a i n s tl u n gi n ju r y k e vw o r d s p a r a q u a tp o i s o n i n g ；h s p - 7 0 ；p u l m o n a r yi n ju r y 4 5 论文 h s p 7 0 在百草枯诱导的肺部炎症反应中的表达 莉看 百草枯( p a r a q u a t ，p q ) 的毒性非常大，有腐蚀性作用，可引起严重的皮肤、 角膜及黏膜灼伤，包括呼吸道及消化道上皮的灼伤。百草枯损伤的主要靶器官是 肺脏，数周后出现不可逆转的肺纤维化n 一3 3 。在中毒早期，肺脏主要表现为急性 肺泡炎症、水肿、充血，进而诱发急性呼吸窘迫综合症( a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s s s y n d r o m e ，a r d s ) ，导致呼吸衰竭，造成p q 中毒患者早期死亡。因此，对p q 中 毒的早期干预是治疗急性p q 中毒患者的主要阶段。 热休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n ，h s p ) 是一族在进化上十分保守的蛋白质，对 于维持细胞的生命十分重要。当机体处于创伤、感染或炎症等应激原刺激时，h s p 的合成起到保护应激结局的作用h 5 3 。h s p 根据其分子量的大小可分为多种类型， 其中h s p 7 0 是最主要的一类。因此，本研究将应用病理h e 染色方法检测百草枯中 毒大鼠肺组织病理变化及病理损伤程度，应用免疫组织化学及w e s t e r nb l o t 方法 检测百草枯中毒大鼠肺组织中热休克蛋白( t t s p 7 0 ) 的表达水平，分析肺组织病理 改变与h s p 7 0 的表达是否存在相关性，探索百草枯致大鼠急性肺损伤的发生机制， 从而为迸一步实现早期减轻肺损伤开拓思路，对临床救治提供有利的线索。 一、实验材料 材料与方法 ( 一) 实验动物 健康w i s t a r 大鼠7 2 只，质量( 1 9 0 _ + 2 0 ) g ，雌雄不限，由中国医科大学动物 中心提供。 6 ( 二) 主要试剂 2 0 百草枯溶液，购于英国捷利康有限公司；h s p 7 0 多克隆抗体和s a b c 免疫组 织化学试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司：d a b 试剂盒、a e c 试剂盒，由 北京中杉金桥生物技术有限公司提供。 ( 三) 主要仪器 ( 1 ) h e i d o l p hd i a x 6 0 0 匀浆器( 德国) ( 2 ) h e r m l ez 3 2 3 k 台式低温超速离心机( 美国) ( 3 ) 台式高速离心机( t g l 一1 6 g 上海生物仪器厂) ( 4 ) 凝胶自动成像仪g d s 8 0 0 0 ( u v p 美国b i o - r a d 公司) ( 5 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳系统( b i o r a d ) ( 6 ) 紫外分光光度计u v - 3 0 0 0 ( 日本岛净公司) ( 7 ) 电泳仪( b i o r a d m o d e l2 5 0 2 5 ，s w e d e n ) ( 8 ) 电泳槽( b i o r a d m i n ip r o t e a n11 t m ，s w d e n ) ( 9 ) 水浴锅( l k b ，w e s tg e r m a n y ) ( 1 0 ) 转膜电泳槽( b i o - r a d ) ( 1 1 ) 石蜡包埋机 ( 1 2 ) 石蜡切片机 ( 1 3 ) 水平摇床 ( 1 4 ) 动物天平 二、试验方法和步骤 ( 一) 实验动物分组与模型的建立 7 2 只大鼠随机分成3 组，每组2 4 只。各组动物按照观察时点1 、2 、3 、6 、1 2 和2 4h 随机分成6 个亚组，每组动物4 只。各组大鼠禁食1 2h ，不禁水。称重后染 毒组( b 、c 组) 给予百草枯2 0m g k g ( b 组) 及4 0m g k g ( c 组) 用生理盐水稀释 至1m l 腹腔注射染毒，对照组( a 组) 给予等量lm 1 生理盐水腹腔注射。 ( 二) 标本的采集 7 于1 、2 、3 、6 、1 2 和2 4h 将4 只大鼠每组分别用1 0 水合氯醛腹腔注射麻 醉，固定于鼠台上，开胸，完整取出双侧肺组织，观察肺组织颜色、质地、有无 出血或梗死灶等大体病理变化。取右侧肺组织放于一7 0 。c 冰箱备用，左侧肺组织置 于4 多聚甲醛中固定。 ( 三) 肺部组织学检查 h e 染色，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、连续切片，脱蜡、脱苯、水化， 苏木素染细胞核、水洗、分化，肉眼观察切片组织呈粉红色，水洗蓝化，伊红染 细胞质、切片由低浓度到高浓度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。根据相 关文献评价损伤程度哺、7 | ，主要参照肺泡内透明膜形成的严重程度和细胞( 炎性细 胞或红细胞) 浸润的程度进行评分，无透明膜形成为0 分，轻度形成为1 分，中度形 成为2 分和重度透明膜形成为3 分：无细胞浸润为0 分、轻度细胞浸润为1 分、中度细 胞浸润为2 分和严重细胞浸润为3 分。 ( 四) 肺组织h s p 7 0 表达的免疫组织化学染色 经4 多聚甲醛固定后的左侧肺脏取相同位置的组织块，进行h s p 7 0 免疫组织化 学染色，按试剂盒说明书操作：石蜡切片脱蜡、水化：p b s 洗三次，各五分钟；加 过氧化物酶阻断液a ，灭活内源性过氧化物酶，室温下孵育1 0 m i n ，p b s 沈三次；抗 原修复；p b s 洗三次，各五分钟；加非免疫性动物血清封闭液，室温下孵育1 0 m i n ， 甩去血清；加一抗4 过夜，p b s 洗三次；加生物素标记的二抗，室温下孵育1 0 m i n ， p b s 洗三次；n s a b c 试剂溶液，室温下孵育2 0 m i n ，p b s 洗三次。 j h d a b 显色，待显 色后自来水冲洗，苏木素复染，脱水，中性树胶封固。免疫组化染色分析结果根 据平均光密度( m o d ) 值评价h s p 7 0 的表达水平。 ( 五) w e s t e r nb l o t 检；1 9 1 j j h s p 7 0 的蛋白表达 取3 组大鼠右侧肺组织，裂解，匀浆，提取蛋白，用分光光度计进行蛋白定量，用 s d s 聚丙烯酰胺凝胶( s d s p a g e ) 分离，转移至固相支持体p v d f 膜上，用蛋白封 闭液封闭后分别孵育一抗、二抗，最后用a e c 显色，计算机扫描，应用图像分析软件 进行分析。以p - a c t i n 蛋白表达为内参，以目的蛋白和b a c t i n 条带密度的比值 表示目的蛋白的相对含量( 灰度值比值= h s p 7 0 灰度值b a c t i n 灰度值) 。 8 ( 六) 统计学分析 所有数据采用s p s s l 3 0 软件进行统计处理，计量资料以均数标准差( 五s ) 表示，采用方差分析。k 0 0 5 表示有显著性差异，有统计学意义。 实验结果 ( 一) 病理变化 a 组肺组织结构清晰，肺泡及毛细血管壁薄，肺泡腔无炎性细胞浸润，偶有少 许红细胞。b 组与c 组可观察到透明膜的形成和炎性细胞浸润等急性肺损伤典型的 病理改变，且b 组与c 组各时点的病理评分均显著高于a 组。c 组2 h 病理损伤显著高 于b 组( p = 0 0 2 8 ) 。见表1 ，图1 。 表l ，p q 诱导急性肺损伤的病理评分( x s ) 1 ) 与a 组比较p ( 0 0 5 ，2 ) 与b 组比较p ( o 0 5 ( 二) h s p 7 0 免疫组织化学染色 a n ：h s p 7 0 散在分布于靠近支气管及细支气管黏膜上皮细胞，肺泡细胞和巨 噬细胞可见散在着色，但染色淡，肺间质细胞和血管内皮基本不着色。b 组：h s p 7 0 强烈表达于支气管、细支气管黏膜上皮细胞及血管内皮细胞，同时可见巨噬细胞 和中性粒细胞表达。伴随时间的延长，支气管、细支气管黏膜上皮细胞及血管内 皮细胞着色逐渐加深，可见巨噬细胞和中性粒细胞表达增强，并可见淋巴细胞的 着色。见表2 ，图2 ，3 。 表2 ，h s p 7 0 在p q 诱导急性肺损伤肺组织免疫组化m o d 值( i s ) 9 1 ) 与a 组比较k o 0 5 ，2 ) 与b 组比较p o 0 5 图2 ，h s p 7 0 在p q 诱导急性肺损伤肺组织免疫组化时间- m o d 值趋势图 ( - - ) w e s t e r nb l o t 分析 w e s t e r nb l o t 检测发现b 组p q 染毒的大鼠2 、3 、6h t s p 7 0 的表达在肺组织中 较a 组明显增强( p 0 0 5 ) ，其他时间点与a 组比无明显差异。c 组1 、2 、3 、6 、 1 2h h s p 7 0 的表达较a 组均明显增强( 尺o 0 5 ) ，2 、3 、1 2h h s p 7 0 的表达较b 组明显 增强( 尺0 0 5 ) 。见表1 ，图4 。 1 0 表3 ，h s p 7 0 在p q 诱导急性肺损伤中的表达w e s t e r nb l o t 灰度值比值( i s ) 1 ) 与a 组比较p o 0 5 ，2 ) 与b 组比较p ( o 0 5 试验图片 1 1 b 组 1 2 1 3 b 组 1 4 一-，_一一一一一hsp705r o u p 一 i - l l _ - i l - l l i - l i - i l l - 一一b a c ti n l h2 h3 h6 h1 2 h2 4 h b r o u p 廿 一- _ - - - - 一, - - i ii l i l l l li - g r o u pc i 一i h ， 图4 ，w e s t e r nb l o t 显示p q 诱导不同时间后的h s p 7 0 的表达 1 5 讨论 一、百草枯诱导急性肺损伤大鼠的动物模型 p q 中毒早期以急性肺损伤表现为主，由于肺微血管通透性增高，肺泡渗出增 多导致肺间质及肺泡水肿、出血、透明膜形成，小血管血栓形成，并伴有肺间质 纤维化。病理改变包括肺泡一型上皮细胞的广泛坏死和基底膜的脱落；肺泡管和 肺泡腔有纤维蛋白和基质蛋白构成的玻璃膜形成；内皮细胞肿胀伴有细胞间基质 增宽；中性粒细胞炎症变现。临床中患者出现表现为呼吸窘迫、频数，咳嗽、咳 痰，发绀，双肺呈现浸润阴影改变。主要以肺顺应性降低，肺内分流增加及通气 血流比例失调为主的病理生理变化。尽管通过积极的治疗，但大部分p q 中毒患者 因a r d s 或多脏器功能障碍综合征( m u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e ，m o d s ) 导 致死亡，即便一部分患者度过急性期，肺组织内逐渐出现不可逆性的肺l 、日j 质纤维 化，最终仍会导致肺功能衰竭。 本实验经腹腔注射百草枯染毒复制急性肺损伤模型，染毒后的大鼠肺脏肿胀， 暗红，可见散在点片状淤斑及出血点。光镜下p q 染毒大鼠的肺组织可见肺泡炎性 改变，肺泡壁及肺间质水肿增厚，肺毛细血管充血，肺泡腔可见大量炎症细胞浸 润及透明膜形成。本实验腹腔染毒复制急性肺损伤动物模型成功。在染毒剂量的 选取中，预实验当中发现，应用4 0 m g k g 及6 0 m g k g 齐u 量染毒大鼠，后者几乎在卜2 h e 部死亡，解剖大鼠腹腔并未发现出血及肠道穿孔。有学者研究发现随3 ，由于血 药浓度) 4 0 m g k g 的p q 中毒患者卜7d 死亡率几乎1 0 0 。因此，在剂量选取中，选择 2 0 m g k g 及4 0 m g k g 齐u 量进行染毒。在观察时间点的选取中，h s p 7 0 蛋白在机体损伤 后表现为早期迅速合成，r i b e i r o 等阳3 应用亚砷酸钠诱导h s r 7 2 表达同样可保护大 鼠败血症时的肺损伤，发现注射亚砷酸钠2 小时后，用w e s t e r nb l o t 分析可在肺中 检测到h s p 7 2 ，h s p 7 2 的表达一直持续蓼j 4 8 , j , 时，至6 0 , j , 时后不能测出。因此，将1 、 2 、3 、6 、1 2 、2 4 h 作为观察时间点。 二、h s p 7 0 对百草枯诱导的急性肺损伤的保护机制 当机体处于创伤、感染及炎症等应激状态时，均可通过基因表达模式的改变导 致h s p 的合成，这一过程称热休克反应( h e a ts h o c kr e s p o n s e s ，h s r ) ，这是机体重 1 6 要的生理反应。h s p 7 0 其分子量为7 0k d a ”o ：，在机体的应激反应中的作用最为显著 瞄3 。实验发现3 ，在p q 中毒的大鼠肺组织中，肺内皮和上皮细胞膜受损，血管通透 性增加，膜脂质氧化物和多形核白细胞浸润，并随服毒量增大，多形核白细胞浸润 加重。h s p 7 0 主要表达于支气管及细支气管黏膜上皮细胞，肺泡细胞和巨噬细胞中， 并伴随炎症的加重h s p 7 0 的表达也随即增强，证明炎症反应的加重可能诱导h s p 7 0 的表达盯3 。这可能是因为炎性介质导致细胞内蛋白质结构损伤时，损伤的蛋白质 与h s p 发生结合，向核内移位从而促进h s p 的转录合成。有研究表明，h s r 可降低炎 症反应引起的大鼠急性肺损伤的死亡率并减轻炎症反应导致的器官损伤n 0 1 。 s i n g l e t o n 等3 利用基因敲除发现删除了l i s p 乃馑因的大鼠冈急件肺损伤以及而后 发生的败血症所导致的死亡率明显升高。因此，可以通过增加对h s p t 0 的诱导，减 轻肺组织损伤，对早期中毒的治疗可能起到关键作用。 p q 中毒所致肺损伤主用通过氧化应激反应产生大量的超氧负离子以及细胞 n a d p h 的氧化作用、脂质过氧化反应引发组织损伤n2 i ，h s p 7 0 可促进超氧化物歧化 酶和过氧化氢酶的合成和修复，升高细胞内抗氧化的水平以对抗大量的氧自由基 作用n 3 1 4 1 ，消除超氧负离子毒性。另外，p q 所致的炎性反应特征表现为肺内皮和 上皮细胞膜受损，血管通透性增加，膜脂质氧化物和多形核白细胞浸润，并随服毒 量增大，多形核白细胞浸润加重n 引，加重肺组织损伤。近些年来，对炎症介质的 研究发现一族比较重要的蛋白质，其中核转录因子( n f 1 出) 是调节许多与免疫功 能和炎症有关的基因表达的启动子，在机体生理和病理条件下，发挥重要的功能。 现己表明n f 1 cb 的功能涉及到免疫反应、胸腺发育、胚胎发生、炎症和急性反应、 细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染和其他多种病理过程。h s p 7 0 可抑制与核转录因子 ( n f 出) 结合在细胞质中的抑制物i k b 的磷酸化与降解，通过抑制n f k b 的转录激 活以及向细胞核中的易位达到抑制n f k b 的活性n 引。近来的研究也证实，h s p 7 0 主 要是通过维持1 1 ( b 的稳定来抑制n f k b 的活性n 7 ，1 8 3 。并且，h s p 7 0 增加抗炎细胞因子 白细胞介素1 0 的表达，也起到抗炎作用 1 9 o 另外，细胞凋亡增加是急性肺损伤的 发病机制之一，信号级联反应是细胞凋亡的主要效应器啪1 ，h s p 7 0 可通过阻止激活 信号级联反应的上游和下游通路抑制细胞凋亡从而减轻急性肺损伤。h s p 7 0 还具有 “分子伴侣”的作用，其基本功能为帮助新生蛋白质的正确折叠、移位、维持和 1 7 受损蛋白质的修复、移除、降解。有学者提出在炎症早期，通过热处理或谷氨酰 胺乜卜2 们等方法促进h s p 7 0 的保护作用，提高细胞的耐受性乜扪，可以抑制肺组织的 炎症反应。 三、h s p t o 在百草枯诱导的肺损伤中的表达 实验观察，在肺组织的病理变化中，肺泡炎性病变程度随着时间逐渐加重，b 、 c 组的损伤呈现逐渐加重的趋势。在p q 染毒剂量增大后，c 组2h 病理评分显著高于 b 组( p o 0 5 ) 。在免疫组化表达中，可见h s p 7 0 主要表达于支 气管及细支气管黏膜上皮细胞，肺泡细胞和巨噬细胞中，并伴随炎症的加重h s p 7 0 的表达也随即增强( 图3 ，4 ) ，从时间- m o d 值曲线图发现，c 组每个观察时点的h s p 7 0 均高于b 组，证明炎症反应的加重可能诱导h s p 7 0 的表达。从曲线图的变化趋势看， h s p 7 0 的表达由lh 开始逐渐升高，b 组在6h 达到峰值，c 组在3h 达到峰值，而后 表达逐渐减少。2 4h 左右降低至a 组水平。从1 、2 、3 、1 2h 观察时点看，c 组中h s p 7 0 的表达显著高于b 组( p ( o 0 5 ) ，h s p 7 0 表达的上升期说明较大剂量染毒后肺组织 中h s p 7 0 的表达显著增强，c 组中h s p 7 0 的表达峰值早于b 组出现，同样提示肺损伤 的加重诱导h s p 7 0 的表达进一步增强( 图3 、4 ) 。然而随着炎症反应逐渐加重，肺 组织h s p 7 0 的表达出现下降，说明当炎症反应加重时( 图1 ) 细胞内环境失衡，应 激反应的负效应陆续显现，h s p 表达开始减少，细胞结构破坏，直至细胞坏死。在 3 、6 、1 2h - - 个时点b 组与c 组的病理评分没有显著差异( 表1 ) ，说明h s p 7 0 的表 达增强对肺组织的发挥了保护作用。而2 4h 观察点b 组与c 组的病理评分仍然没有 显著差异，可能在炎症发展过程中，机体继续启动了其他的应激反应机制，抑制 p q 对肺组织的进一步损害。利用w e s t e r n b l o t 检测方法对肺组织中h s p 7 0 蛋白进行 测定，观察至o h s p 7 0 的表达情况基本与上述表述相同，同样证实p q 诱导大鼠急性肺 损伤增强了h s p 7 0 的表达，并且h s p 7 0 的表达提高了机体对肺内细胞的保护作用。 本实验通过免疫组织化学染色、w e s t e r nb l o t 法发现p q 中毒诱导急性肺损伤 大鼠的肺泡上皮细胞及肺内毛细血管内皮细胞的h s p 7 0 表达均高于a 组且在增大中 1 8 毒剂量后h s p 7 0 表达增强，提示h s p 7 0 可能参与了p q 中毒所致肺损伤后的保护作用， 对今后治疗p q 中毒提供了可靠的依据，并为研究p q 中毒导致肺组织损伤的机制拓 展了思路。 结论耋口己 1 、p q 腹腔染毒可引起大鼠急性肺损伤。 2 、p q 腹腔染毒后，可引起大鼠肺组织d p h s p 7 0 表达明显增强。 3 、h s p 7 0 的诱导表达减轻肺组织的病理损伤程度，但具体作用机制尚不完全 明确，需要进一步研究。 1 9 2 0 。为 参考文献 1y a m a s h i t am ，y a m a s h i t am ，a n d oy al o n g t e r mf o l l o wu po fl u n gf u n c t i o n i ns u r v i v o r so fp a r a q u a tp o i s o n i n g h u me x pt o x i c o l ，2 0 0 0 ，19 ( 2 ) ：9 9 10 3 2s a t o m iy ，s a k a g u c h ikk a s a h a r ay ，e ta 1 n o v e la n de x t e n s i v ea s p e c t so f p a r q u a t i n d u c e dp u l m o n a r yf i b r o g e n e s i s ：c o m p a r a t i v ea n dt i m e - c o u r s em i c r o a r r a y a n a l y s e si nf i b r o g e n i ca n dn o n - f i b r o g e n i cr a t s jt o x i c o ls c i ，2 0 0 7 ，3 2 ( 5 ) ， 5 2 9 5 5 3 3 n e r l i c l ia g ，n e r l i c hm l ，l a n g e ri ，a r e l e a s eo fa m i n o - t e r m i n a lp r o c o l l a g e n p e p t i d e si np a r a q u a t i n d u c e da c u t ep u l m o n a r yf i b r o s i s e x pm o lp a t h 0 1 19 8 4 ： 4 0 ( 3 ) ：3 1 1 - 3 1 9 4 m o r t a ze ，r e d e g e l df a ，n i j k a m pf p ，e ta 1 a c e t y l s a l i c y l i ca c i d - i n d u c e dr e l e a s e o fh s p 7 0f r o mm a s tc e l l sr e s u l t si nc e l la c t i v a t i o nt h r o u g ht l rp a t h w a y e x p h e m a t o l ，2 0 0 6 ，3 4 ( 1 ) ：8 - 1 8 5 w a n gx p ，q i uf r ，l i ug z , e ta 1 c o e l a t i o nb e t w e e nc l i n i c o p a t h o l o g ya n d e x p r e s s i o no fh e a ts h o c kp r o t e i n7 0a n dg l u c o s e - r e g u l a l e dp r o t e i n9 4i nh u m a n c o l o n i ca d e n o c a r c i n o m a w o r l djg a s t r o e n t e r o l ，2 0 0 5 ，11 ( 7 ) ：10 5 6 10 5 9 6k a os j ，w a n gd ，y e hd y ，e ta 1 s t a t i ci n f l a t i o na t t e n u a t e si s c h e m i a r e p e r f u s i o n i n j u r yi n a l li s o l a t e dr a tl u n gi ns i t u c h e s t 2 0 0 4 ，1 2 6 ( 2 ) ：5 5 2 - 5 5 8 7c h e nh i ，y e hd y ，l i o uh l ，e ta 1 i n s u l i na t t e n u a t e se n d o t o x i n - i n d u c e da c u t el u n g i n j u r yi nc o n s c i o u sr a t s c r i tc a r em e d ，2 0 0 6 ，3 4 ( 3 ) ：7 5 8 - 7 6 4 8 田英平，邱泽武百草枯中毒的救治中国实用内科杂志，2 0 0 7 ，2 7 ( 1 5 ) ：1 1 6 6 - 1 1 6 8 9r i b e i r os p ，v i l l a rj ，d o w n e yg p ，e ta 1 s o d i u ma r s e n i t ei n d u c e sh e a ts h o c k p r o t e i n - 7 2k i l o d a l t o ne x p r e s s i o ni nt h el u n g sa n dp r o t e c t sr a t sa g a i n s ts e p s i s c r i t c a r em e d ，l9 9 4 ，2 2 ( 6 ) ：9 2 2 9 2 9 10w e l c hw j m a m m a l i a ns t r e s s r e s p o n s e ：c e l lp h y s i o l o g y ，s t r u c t u r e f u n c t i o no f s t r e s sp r o t e i n s ，a n di m p l i c a t i o n sf o rm e d i c i n ea n dd i s e a s e p h y s i o lr e v ，19 9 2 ， 7 2 ( 4 ) ：1 0 6 3 - 1 0 8 1 2 1 11 w h e e l e rd s ，w o n gh r h e a ts h o c kr e s p o n s ea n da c u t el u n gi n ju r y f r e er a d i c b i o lm e d 2 0 0 7 ，4 2 ( 1 ) ：1 - 1 4 12s u n t r e sz e r o l eo fa n t i o x i d a n t si np a r a q u a tt o x i c i t y t o x i c o l o g y ，2 0 0 2 ，18 0 ( 1 ) ： 6 5 7 7 13 w o n gh r ，f i n d e rj d ，w a s s e r l o o sk ，e ta 1 e x p r e s s i o no fi n o si nc u l t u r e dr a t p u l m o n a r ya r t e r ys m o o t hm u s c l ec e l l si si n h i b i t e db yt h eh e a ts h o c kr e s p o n s e a m jp h y s i o l19 9 5 ，2 6 9 ( 6p t1 ) ：l 8 4 3 - 8 4 8 14 w o n gh r ，m a n n i xr j ，r u s n a kj m ，e ta 1 t h eh e a ts h o c kr e s p o n s ea t t e n u a t e s l i p o p o l y s a c c h a r i d e - m e d i a t e da p o p t o s i s i nc u l t u r e d s h e e pp u l m o n a r ya r t e r y e n d o t h e l i a lc e l l s a mjr e s p i rc e l lm o lb i o l19 9 6 ；15 ( 6 ) ：7 4 5 - 7 51 15v e n k a t e s a nn p u l m o n a r yp r o t e c t i v ee f f e c t so fc u r i u m i na g a i n s tp a r a q u a tt o x i c i t y l i f es c i ，2 0 0 0 ，6 6 ( 2 ) ：p l 21 8 16 s i n g l e t o nk d ，w i s c h m e y e rp e e f f e c t so fh s p 7 0 1 3g e n ek n o c k o u to na c u t e r e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m ea n dt h ei n f l a m m a t o r yr e s p o n s ef o l l o w i n gs e p s i s a m jp h y s i o ll u n gc e l lm o lp h y s i o l2 0 0 6 ，2 9 0 ( 5 ) ：l 9 5 6 - l 9 61 17 k i n gt a ，g h a