（光学工程专业论文）基于小波去噪的生物组织光谱特性研究.pdf

南京航空航天大学硕士学位论文 i 摘 要 光生物技术是生命科学重要的研究方向生物组织作为生物体的一部分必然 携带生物体的许多生命信息对人体组织的光谱学研究和医学检测治疗等相结 合显示了巨大的研究价值和应用前景 结合国内外研究背景和现状本文选取人体血液作为典型的生物组织主要 研究了血液的吸收光谱和荧光光谱将小波分析方法运用到血液光谱信号的去 噪分析之中探索了血液光谱特性和生化指标之间的关系 本文的内容及创新点主要有以下几个方面 1提出了对血液光谱信号的小波处理方法 方法对血液光谱信号进行分解 再逐层细分 采用阈值处理后 得到重构信号 为医学检验与处理提供了新方法 2 运用小波方法对人血清全血的吸收光谱进行了分解和重构重构的光 谱信号取得了明显的去噪效果 3 对比了正常血清和高血脂血清经小波去噪后的光谱信号研究二者之间 的差异由此可以通过检测血清在该谱段的吸收光谱来判断血脂含量是否异常 为医学检验提供了新方法 4 运用小波方法对人血清荧光光谱进行了分解和重构研究了正常血清与 高血脂血清高血糖血清荧光光谱的差异 5 除小波方法外本文另提出一种运用简单原理对光谱信号进行去噪的方 法并编写相应处理程序以吸收光谱信号为例处理结果与前述方法基本一致 研究表明将小波分析方法应用于血液光谱特性的研究 能够对血液光谱信号 进行有效的滤噪显示出许多新信息分解信号也含有许多特征信息研究重构 信号或分解信号的特性与相应生化指标之间的关系可以为医学检验诊断提供 新的检测处理和分析方法 关键词血清吸收光谱荧光光谱去噪小波分析 资助项目 1 国家自然基金基于损伤和神经元自修补的全光学机敏结构研究项目编号 1 0 1 7 2 0 4 3 2 南京航空航天大学科研创新基金项目号 1008-905704 基于小波去噪的生物组织光谱特性研究 ii abstract optical-biology technology is an important research direction in life science. biological tissue as a part of organism carries a lot of information of life. the combination of spectroscopy research on human tissue and medical detection, cure shows the tremendous value and application prospects. combining the research background and current situation in and abroad, the thesis selected human blood as typical biological tissues. in this thesis we mainly research on the absorption spectrum and fluorescence spectrum of blood. apply the wavelet analysis method to denoising and analysis of the blood spectral signal. we study and explore the relationship of blood spectral characteristics and the biochemical index. the content of this thesis mainly concentrated in the following areas: (1) we design the wavelet treatment of blood spectral signal. in this method we decompose the blood spectral signal, further decompose in layers, then using threshold to get reconstructed signal. (2) apply the wavelet method on the decomposing and reconstruction of absorption spectrum of human serum and whole blood. reconstructed spectral signals obviously reduce signal disturbance. (3) by comparing the spectral signal of normal serum and high-fat serum we study the differences between these two. we can determine whether content of fat in serum is abnormal through detection of absorption spectrum of this spectrum segment. this provides a new method for medical detection. (4) apply the wavelet methods on decomposition and reconstruction of human serum fluorescence spectrum. study the differences of fluorescence spectrum between normal serum, high-fat serum, and high-glucose serum. (5) in addition of the wavelet method, this thesis also proposes a method with simple principle to denoise, and finish the corresponded program. using absorption spectrum signal as an example, the results of the new method and previous method are basically the same. the research shows that applying the wavelet analysis method to the study of characteristics of blood spectrum can effectively filter the disturbance of spectral signal, and show a lot of new information. the decomposed signals also contain a lot of features information. study the relationship between the feature of reconstruction signal or decomposition signals and the correspondent biochemical index can provide the new detecting and management for medical diagnosis. key words: serum, absorption spectrum, fluorescence spectrum, denoise, wavelet analysis 南京航空航天大学硕士学位论文 v 图表目录清单 1图目录清单 图 2.1 分子中电子的能级和跃迁示意图.8 图 2.2 具有 n型和型电子的分子的某些电子态示意图.10 图 2.3 小波变换的形象化示意图.13 图 3.1mallat算法分层图解.18 图 3.2 尺度空间和小波空间.18 图 3.3 对各层信号再进一步细分.19 图 3.4 逐层采用不同的细分层数.20 图3.5生物组织光谱信号处理流程 .20 图 3.6 生物组织光谱信号处理过程图示.21 图 3.7 血清吸收光谱的测试光路示意图.22 图 3.8 样品 1 号血清吸收光谱.22 图 3.9 样品 1 号小波分解的各层系数.23 图 3.10 样品 1 号的各层分解信号.23 图 3.11 样品 1 号的各层重构信号.24 图 3.12 1 号血清样品的重构光谱信号.25 图 3.13 1 号样品处理前后信号及去除掉的总噪声信号对比.25 图 3.14 全血样品吸收光谱.26 图 3.15 全血样品吸收光谱信号小波分解各层信号.26 图 3.16 全血样品吸收光谱各层重构信号.27 图 3.17 全血样品重构吸收光谱.28 图 3.18 全血重构光谱 200nm220nm段 .28 图 3.19 样品a2 号b3 号的吸收光谱.29 图 3.20 2 号3 号样品血清的重构吸收光谱.30 图 3.21 112 号样品 260nm300nm吸收光谱 .31 图 4.1 荧光光谱的测试系统示意图.33 图 4.2 样品 21 号荧光发射光谱.34 图 4.3 21 号血清样品荧光光谱小波分解各层信号.34 图 4.4 2 1 号血清样品荧光光谱各层重构信号.35 基于小波去噪的生物组织光谱特性研究 vi 图 4.5 样品 21 号荧光发射光谱重构信号.35 图 4.6 样品 21 号去除掉的总噪声信号.36 图 4.7 样品 ab 的荧光光谱.36 图 4.8 样品 cd 的荧光光谱.37 图 4.9 21 号31 号样品荧光光谱.37 图 4.10 光峰强度值和血脂含量关系的三次拟合曲线.38 图 4.11 21 号31 号血清荧光光谱第 4 层高频信号.39 图 4.12 各样品的 5 个峰强度的平均值和血脂浓度关系的三次拟合曲线.41 图 4.13 41 号47 号样品以 350nm 光激发的荧光发射光谱 .42 图 4.14 血糖含量与血清荧光峰强度关系拟合曲线.42 图 5.1 光谱信号去噪程序处理界面.46 2 表目录清单 表 3.1 常用小波函数及其特性.17 表 3.2 去噪后样品光谱的峰位.30 表 4.1 230nm 光激发的血清荧光峰位置 .36 表 4.2 各样品第 4 层高频信号的 5 个峰值大小及其平均值.40 承诺书 本人郑重声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立 进行研究工作所取得的成果 尽我所知除文中已经注明引用的内容 外本学位论文的研究成果不包含任何他人享有著作权的内容 对本 论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体 均已在文中以明 确方式标明 本人授权南京航空航天大学可以有权保留送交论文的复印件 允 许论文被查阅和借阅, 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索可以采用影印缩印或其他复制手段保存论文 作者签名 日 期 南京航空航天大学硕士学位论文 1 第一章 绪论 . 1 研究背景 21 世纪被誉为智人的世纪科学技术的进步促进了 20 世纪的经济发展 人们对生命科学的进步及其实用寄予了厚望目前世界各发达国家均面临出生 率下降人口老龄化倾向日趋严重的问题包括发展中国家均非常关注医疗社 会福利技术的开发 1 生命科学将现代工程技术与生物医学相结合在仪器药剂 制造技术 2 基因技术光生物技术 3 1 3 生物电子技术 1 4 等诸多方面取得的巨 大的发展,产生了深远的影响 1 5 1 6 光生物技术是生命科学重要的研究方向之一 是将现代光学工程技术应用于生物学医学检测与治疗等方面的重要研究领域 也是现在国内外研究的热点之一取得了许多研究成果 1 7 - 2 7 光谱技术作为一种检测方法早在上一个世纪中叶就显示出它惊人的灵敏 度六十年代初激光的出现特别是可调谐激光器的出现和发展给光谱学又赋 予新的生命力 五十年代开始人们发现生物分子具有内生固有的生色团组织中含有多种 荧光物质每个荧光物质存在一定的浓度和特定的吸收光谱和荧光发射光谱组 织荧光光束来自组织中许多荧光物质的组合 人体组织细胞在发生癌变或其它的 病变过程中其生理生化免疫等方面会发生了一系列的变化因为正常组织光谱 峰值与病变组织光谱峰值可能不同 可根据其荧光强度的强弱推测其含量的多少 或者根据吸收光谱的方法可以测定某些成分含量为医学诊断提供依据特别是 近年来很多学者通过光谱诊断技术对生物组织进行了研究如人体组织植物 等采用的光谱方法也很多有的研究还运用光谱技术对疾病进行检测和治疗 取得了一定研究成果 2 8 - 5 0 1 2 血液光谱检测的原理和发展现状 1 2 1 血液光谱检测的原理 5 1 血液作为人体重要的体液能够表征人体许多重要的生命指标提供多种 生理参数因其流向身体各处所以几乎人体内的任何一处病变都或多或少地 在血液中有所反映对血液进行光谱学的检测和研究能够从光谱角度对血液的 生理指标进行测试和分析甚至可以基于光谱分析的方法建立新的血液生理指 基于小波去噪的生物组织光谱特性研究 2 标 从而为疾病的诊断和治疗提供帮助 也对光谱学自身的研究提供有益的促进 正因如此血液的光谱检测与分析已经成为现代光生命科学一个重要的研究方 向 传统的血液检验一般是基于血细胞形态学细胞的结构与功能细胞的代谢 与免疫以及细胞的衰老和消亡等理论的基础上进行检测 传统诊断当发现某种疾 病时很多都已经发展到疾病的中期或晚期早期的疾病则很难被检测出来这 就使疾病治疗的治愈率和生存率大大的降低 提高患者生存率切实可行的办法就 在于早期诊断和治疗 这就为血液病检测的工作者提出了挑战即如何提高早 期疾病的检出率 而光谱技术在血液学检测上的应用则初步显示出它在血液病早 期的鉴别和诊断上的优势 1 2 . 2 血液光谱检测的研究现状 国内外一些研究人员已经开展了对血液的光谱研究工作 5 2 5 3 取得了不少有 益的成果 山西大学降雨强等 5 4 研究人员使用5 3 2 n m 的激光作为激发光源分别测量 了人体正常血液及其各分离成分血浆血小板红细胞的荧光光谱并研究 了正常人及乙肝患者血浆分离液荧光光谱的差异结果显示全血在6 3 0 n m 及 7 1 0 n m 附近出现荧光峰值比较血液各组分的荧光光谱有明显差异由于其他 两种组分红细胞血小板的主要光谱在血浆的光谱上都有所反映说明红细 胞和血小板中发出荧光的物质也存在于血浆中 血浆是血细胞和血小板的生存环 境它们的代谢产物总是排泄在血浆中所以这些发光物很可能包含在血细胞或 血小板的代谢产物中血浆光谱最强且谱线较为丰富所以临床诊断应用时血 浆的荧光光谱更为合适因而血浆的荧光光谱可作为临床诊断依据另外比较 正常人及乙型肝炎患者血浆标本的荧光光谱发现 在其他波段无显著差异的情况 下其7 3 8 n m 处的峰值强度差异却十分明显h b s a g 阳性血浆在该点的荧光强度远 高于正常血浆由此差异可看出发出7 3 8 n m 荧光的物质与乙肝病毒表面抗原的 含量密切相关 所以血浆光谱中7 3 8 n m 处的峰强可作为乙型肝炎病症的光谱诊断 依据之一 南京航空航天大学赵志敏等 1 8 2 3 对血液的吸收光谱和荧光强度以及荧光光 谱等做了研究为疾病诊断提供了有用的实验依据 郭周义郭萍等 5 5 用光声光谱法对正常人白血病缓解急性淋巴细胞白血 病等不同类型的多例血样的全血谱的三个吸收峰进行了对比 并通过全血涂片染 瑞士兰的方法观察了血样中白细胞含量变化在图谱上的反映发现白血病人的 全血谱与正常人的全血谱有显著的差别 结合临床分析讨论了白血病全血谱与病 情程度的关系俞帆等 5 6 采用显微光谱技术得到了正常人及白血病患者的白细 南京航空航天大学硕士学位论文 3 胞在可见光范围的光谱结果显示淋巴细胞和粒细胞的显微光谱各具特征不 同类型的白血病患者的淋巴细胞和粒细胞的显微光谱与正常人的相比也不同 结 果不仅实现了白细胞的显微光谱学的分类而且也为临床医学诊断提供参考 此外t h e m e l i s 等 5 7 运用近红外光谱法对脑部血流进行研究结果表明了方 法的可行性w o o d 等 5 8 以7 8 5 n m 激光激发研究了红血球的共振拉曼光谱在红 血球的振动动力学电子结构等方面提出了新的见解 1 2 血液光谱检测的发展趋势 从前文的论述可以看到血液作为人类重要的体液能够表征人体的多中生 理指标反映机体的疾病光谱检测技术应用于血液的光谱分析和检测技术因为 其原理和技术实践上的多重优势在疾病诊断甚至治疗上具有广泛的应用研究 人员在此领域已经取得了大量的研究成果 随着技术的进步和光谱分析方法以及 理论的深入和完善更多更深入更有效的方法将陆续被采用可以预见更多的 相关理论成果和技术进步会转化到应用实践中 成为疾病诊断和治疗中不可或缺 的力量 生物组织光谱研究存在的问题 用光谱的方法对生物组织进行检测与分析研究虽然具有多种优势然而光 谱仪在其光谱检测时得到的光谱信号往往会含有一定量的噪声 当研究人员试图 从获得的光谱信号分析和提取出有用信息时 一个带有大量噪声的光谱信号将成 为获取结果和提取特征的障碍 并不是所有光谱图在所有谱段都有严重到影响分 析和获取特征的噪声信号 可是在一张光谱图上有一段噪声很严重的区域则是很 常见的事情很多时候由于无法在这个谱段提取特征信息不得不弃去相应的 谱段使之不在研究范围从而使得研究的范围缩小获得的可识别特征也大为 减少 光谱信号的特点决定了对光谱信号的去噪不是简单的平滑光谱信号中细 节信息因其往往能够表征特定样品的特征而不能一概忽略 尤其是可能出现样品 特征峰的谱段更是如此 如果忽视光谱信号在一系列点的具体特征而做简单的平 滑处理将可能失去宝贵的特征信号甚至迷失检测的目的那样一条美观而 简单的曲线将失去研究的意义 随着光谱检测技术的快速发展 人们渴望获得更多有价值的生物组织光谱检 测结果面对经常可能出现在生物组织光谱信号中的影响分析的噪声如何能去 除它们而又在同时尽可能保留原来光谱信号的细节信息进而对光谱信号进行研 究成为一个急需解决的问题 基于小波去噪的生物组织光谱特性研究 4 小波分析的发展及在光谱分析上的应用 小波分析的发展 小波分析也称为多分辨分析是 2 0世纪 8 0年代开始发展起来的新兴的数 学分支是建立在泛函分析傅立叶分析样条分析与调和分析基础上的新的信 号分析处理工具 5 9 小波分析从一开始发展就与很多学科的实际 应用紧密联系 在一起小波理论的发展一直伴随着实际应用在通信图象处理与分析生物 医学机械优化设计概率统计自动化c t成像机器视觉量子场论等方 面的应用引人注目 6 0 6 2 长期以来傅立叶变换是信号处理的重要数学工具但傅立叶变换只能反映信 号的整体特征 而无法做信号的局部分析 为此 d . g a b o r 于1 9 4 6 年为函数()fx 乘以一个光滑的窗口函数()gx然后再去傅立叶变换这好比在一个区间上 开了一个窗口意图就是反映窗口位置的局部信息事实也的确如此随着窗口 位置的变化对窗口函数()gx进行平移不同位置的局部特征得以反映但 窗口傅立叶变换也存在问题 6 3 1函数窗口选定后 窗口的形状和大小不可变 事实上我们需要在频率不同的位置采用大小不同的窗口2 窗口傅立叶变换 g a b o r 变换得不到正交基小波变换则解决了这些问题小波变换不但可随 频率的高低变化改变窗口形状低频处时间分辨率较低频率分辨率较高高频 处时间分辨率较高频率分辨率较低而且可以得到正交基正是基于以上的 这些优越性小波变换在光谱分析中能够获得广泛的应用 小波变换在光谱分析中的应用 小波变换在红外光谱紫外光谱上的应用 小波变换在红外光谱研究中主要用于滤噪数据压缩提高谱峰分辨率等 方面的研究闵顺耕等 6 4 利用小波变换对 5 2个烟草样品的近红外漫反射光谱进 行滤波处理并用 p l s 法来计算烟草样品的总氮含量结果表明小波变换滤波 后预测集的相对标准偏差由原来的 9 . 2 % 降到 7 . 4 % 此结果优于傅立叶变换和五 点三次平滑田高友等 6 5 提出了新的传递算法w t p d s小波变换分段直接 校正法用于近红外光谱模型传递研究先对原始光谱小波压缩处理然后采用算 法消除不同仪器间压缩数据差异之后加以分析结果显示能够有效的扣除仪器 带来的光谱差异以柴油为实验样品实验数据表明算法可明显改善模型分析 精度与传统分析方法相比有传递和建模变量少速度快光谱校正性能高等 优点b e a t a 等 6 6 将小波变换用于近红外光谱的模式识别光谱数据经用小波变 换处理后较其他方法大大提高了识别效果王洪等 6 7 利用 m a l l a t提出的多分 南京航空航天大学硕士学位论文 5 辨分析和 d a u b e c h i e s构造的正交紧支集小波对聚乙烯薄膜的红外光谱进行压 缩和重建数据压缩至原来的 1 / 5 以下仍能很好的重建原图谱杜文等 6 8 用离 散小波变换的细节信息重构近红外光谱 建立了具有良好转移性能的近红外分析 模型结果表明小波变换在消除干扰信息的同时不引入新的干扰因素并且能 够同时进行扣除基线和滤噪的计算在紫外光谱研究上h o等 6 9 提出用小波方 法压缩紫外可见光谱用于化学和生物化学研究 程翼宇等 7 0 将变尺度小波分解 滤波与特征信息提取相结合提出了一类新的多元光度分析算法小波基主成分 回归p c r w 方法有效地减少主成分向量残留噪声所引起的误差卢小泉等 7 1 将样条小波应用在紫外光谱数据的处理发现峰位误差小 小波变换在生物组织光谱分析中的应用 小波变换在光谱信号分析上的优越性则表明其在生物组织光谱分析上具有 极好的应用前景 秦少平等 7 2 用小波变换的方法研究了小鼠肝纤维化血清的荧光光谱 发现用 m e x h 小波能很好地将荧光光谱的特征提取出来在 5 0 8 5 2 7 5 5 6 5 8 9 和 6 3 3 n m 处得到特征峰 用前 3 个特征峰处的强度与第 4 个特征峰处的比值可将健康与纤 维化的样品区分开来从而对纤维化的诊断有一定的参考作用结果表明小波 变换是处理荧光光谱的一种有效方法王玉田等 7 3 为研究食品中的农药残留提 出用小波变换法对测得的农药荧光光谱进行消噪处理 介绍了一种新的阈值处理 方法软硬阈值折衷法 并将使用该方法进行小波去噪后的荧光光谱图与用传统 模拟低通滤波器去噪后的光谱图进行了比较结果表明经小波去噪后的荧光光 谱图更多地保留了原信号的信息有助于提高系统的检测精度宋开山等 7 4 实测 了不同水肥耦合作用下, 大豆冠层高光谱反射率与叶绿素含量数据采用小波分 析对采集的光谱反射率数据进行了能量系数提取, 并以小波能量系数作为自变量 进行了单变量与多变量回归分析, 对叶绿素含量进行估算 经分析发现, 小波能量 系数回归模型可以进一步提高大豆叶绿素含量的估算水平 邹小波等 7 5 为了提高 苹果近红外光谱糖度预测模型的精度, 利用多尺度小波去噪法对苹果近红外光谱 进行了预处理 应用结果表明, 多尺度小波去噪法滤除了原始光谱中的部分噪声, 但又保留了原光谱中的主要信息应义斌等 7 6 用小波变换滤波技术对 9 0个水果 样品的近红外光谱信号进行了去噪处理, 并结合滤波后重构光谱信号对水果糖度 进行逐步线性回归( s m l r ) 建立其校正模型, 通过 3 4个样品的外部检验对校正模 型精度进行评价研究结果表明使用小波去噪方法有消除原始光谱噪声作用, 提高了品质检测时模型预测精度瞿海斌等 7 7 采集近红外漫反射光谱, 使用多重 散射校正和小波变换对光谱进行预处理后, 应用两种模式识别方法鉴别阿胶真伪, 结果表明近红外光谱和模式识别技术结合可快速准确客观地进行阿胶质量鉴 基于小波去噪的生物组织光谱特性研究 6 别, 可推广到其他中成药的质量鉴别 1 5 本文的主要研究工作及创新点 通过前文可以看到血液作为人类重要的体液能够表征人体的多中生理指 标反映机体的疾病光谱检测技术应用于血液的光谱分析和检测技术因为其原 理和技术实践上的多重优势在疾病诊断甚至治疗上具有广泛的应用随着光谱 检测技术的快速发展人们渴望获得更多有价值的生物组织光谱检测结果小波 分析作为新兴的数学分支和新的信号分析处理工具 在生物组织光谱分析上具有 明显的优越性和极好的应用前景基于此本文做了如下的研究工作 1 检测一定波长范围内血清和全血的吸收光谱以及一定波长光激发下血 清的荧光光谱根据小波分析的基本理论结合血液光谱信号的特点设计对血 液光谱信号进行小波分析和去噪处理的方法 2 运用小波处理方法对血液在一定波长范围内的吸收光谱信号进行小 波分解分析分解后各层高低频信号的特点对原来含有大量噪声的光谱信号进 行小波去噪处理将得到的重构光谱信号与原始信号进行对比分析 3 比较正常血清和高血脂血清吸收光谱经过小波方法去噪后的重构光谱 信号分析其差异 4 运用小波分析方法对血清荧光光谱信号进行小波分解分析其各层 信号的特点对正常血清高血脂血清高血糖血清的荧光光谱信号进行比较 分析其差异 5 除小波方法外探索和尝试自行设计简易的血液光谱信号去噪方法 本文的特色和创新之处有1 将小波分析这一有力的信号分析处理工具运 用到血液吸收光谱和荧光光谱信号的处理和分析之中结合血液光谱信号的特 点选择合适的小波基函数设计了相应的分解和处理细节为光谱信号去噪和 分析提供了新的方法2 对小波处理后的吸收光谱信号显示出来的新的可识别 的信息进行研究分析正常血清与高血脂血清在同一谱段的差异为高血脂的医 疗检测提供新的方法和依据3 注意到小波分解各层高频和低频信号的特点 专门提取血清荧光光谱的第四层高频信号 以该层高频信号中较强的峰值强度作 为指标研究了血清中血脂含量与该指标之间的关系此外还分析了血糖含量 与荧光光谱中峰值强弱的关系为血脂血糖的医学检验和分析提供了新的分析 角度和方法4 除小波方法外本文另提出一种运用简单处理原理对光谱信号 进行去噪的方法并编写相应的处理程序及其界面且对方法收敛性作了证明 本文研究得到了赵志敏教授主持的国家自然基金基于损伤和神经元自修补 的全光学机敏结构研究项目和南京航空航天大学科研创新基金的资助 南京航空航天大学硕士学位论文 7 第二章 光谱分析技术与小波分析的理论基础 2 1 光谱研究的基本理论 光谱技术能够了解物质结构物质成分和它们的含量而且分析灵敏度和精 度都很高光谱方法不仅可以测定如吸收系数散射系数等光学特性参数而且 光谱本身含有组织分子的一些信息如跃迁电子态振动转动信息等光谱一 般分为吸收光谱和荧光光谱以及反射光谱等 2 1 1 吸收光谱的基本理论 吸收光谱包括原子吸收光谱紫外可见光吸收光谱红外吸收光谱拉曼光 谱 其中紫外可见光光谱是一种电子光谱 红外吸收光谱和拉曼光谱是分子光谱 红外吸收光谱是通过分子对入射红外光的吸收得到分子振动能级的信息 而拉曼 光谱是通过入射光与分子对入射光的散射光之间的频率差别得到所需的信息 紫外及可见吸收光谱是物质在紫外或可见光区吸收一定波长的光 所获得的 吸收光谱是指分子的外层电子或价电子成键电子非键电子和反射电子的 跃迁得到的光谱紫外光区是波长约在 1 0 4 0 0 n m 的光波区它又分为近紫外区 2 0 0 4 0 0 n m 及远紫外区又称真空紫外区 1 0 2 0 0 n m 两个区段可见光区 是波长 4 0 0 8 0 0 n m 的光波区一般仪器的测定波长范围为 2 0 0 8 0 0 n m 区域即 紫外可见光区其中 2 0 0 4 0 0 n m 的近紫外区最为有用 7 8 当用一束波长连续变化的紫外光照射一定浓度的样品时通过紫外可见分 光光度计可以测定样品对各种波长的光的吸光度 0 lg/aii= 0 i 和i 分别为入射 光和透射光的强度吸光度样品的物质的量浓度c液层厚度l c m 和摩尔吸收系数之间的关系满足比尔b e e r 定律 alc= 在整个光谱中强度最大的吸收峰称为最大吸收其相应的波长成为最大吸 收波长用 max 表示最低的峰谷称为最小吸收相应有最小吸收波长 min 最大吸收峰的 值 称为最大吸收的摩尔吸收系数 用 max 表示 max 和 max 值是样品中电子跃迁引起的特征吸收不同样品具有不同的电子结构因此可能 具有不同的 max 和 max 值各峰的位置峰的数量和整个吸收曲线的形状与分 子结构有关其特征也随分子的结构不同而异都可以作为物质检测的依据 7 8 紫外可见吸收光谱决定于分子中电子的结合情况形成单键的 电子形成 重键双键和三键的 电子未共用电子或称非键的 n 电子当分子吸收 一定能量的辐射时就发生相应的能级间的电子跃迁有机物在紫外可见光区域 基于小波去噪的生物组织光谱特性研究 8 内电子跃迁的方式一般有nn四种类型这 些跃迁所需能量的大小关系为 n n如图 2 . 1 所 示为分子中电子的相对能级和跃迁 图 2 . 1 分子中电子的能级和跃迁示意图 1跃迁 这是分子中成键 轨道上的电子吸收辐射后被激发到反 键 轨道上 引起跃迁所需要的能量很大这类跃迁主要发生在真空紫 外区吸收波长小于 1 5 0 n m 2 n跃迁 含有非键电子即 n 电子的杂原子的饱和烃衍生物 都可发生此种跃迁这种跃迁所需能量通常比跃迁小可由 1 5 0 n m 2 0 0 n m 区域内的辐射引起 并且大多数的吸收峰出现在低于 2 0 0 n m 区域内 因此 近紫外光谱仍不易观察到这类跃迁 3 跃迁 不饱和烃共轭烯烃和芳香烃类可发生此类跃迁所需 能量较小吸收波长大多在紫外区 4 n跃迁 在分子中含有孤对电子的原子和 键同时存在时会发 生n跃迁所需能量小吸收波长大于 2 0 0 n m 5 电荷转移跃迁 电荷转移吸收谱带指的是许多无机物例如碱金属卤化 物和某些由两类有机化合物混合而得的分子配合物在外来辐射激发下会强烈 地吸收紫外光或可见光在吸收过程中实际上发生了电子从电子给予体转移到 电子接受体的过程电荷转移可以是离子间离子与分子间以及分子内的转移 6 dd跃迁 这种跃迁产生的吸收光谱又称为配位体场吸收谱吸收 峰一般在可见光区 此外紫外可见吸收光谱还具有下述优点1 灵敏度较高一般可以测定 的浓度下限为 1 0 - 6 m o l l - 1 适用于微量痕量分析2 精密度和准确度高 与其它仪器分析法相比紫外- 可见光谱法的相对误差较小一般为 2 % - 5 % 因 而能满足微量分析对准确度的要求3 应用范围广不但能直接或间接定量测 定几乎所有的无机物质和许多有机物质还可以做官能团鉴定结构分析相对 能量 200 300 400 nm n 南京航空航天大学硕士学位论文 9 分子质量测定配合物组成以及稳定常数酸碱离解常数的测定等4 仪器操 作简单快速测定方法易于推广 2 1 2 荧光光谱的基本理论 2 1 2 1 荧光的产生 根据玻尔兹曼分布分子在室温时基本上处于电子的基态吸收了紫外可 见光后基态电子只能跃迁到单线激发态的各个不同的振动能级跃迁后能量较 大的激发态分子在很短时间内1 0 1 5 s由于分子间的碰撞或分子与晶格间的 相互作用以热能形式或内转换方式消耗部分能量从较高振动能级回到最低振 动能级如果分子不通过热能或内转换形式来消耗能量回到基态而是通过发 射出相应的光量子来释放能量回到基态的各个不同振动能级这时发射的光即 称为荧光产生荧光需要两个基本条件第一是该物质的分子必须具有能吸收激 发光的结构 通常是共轭双键结构 第二是该分子必须具有一定程度的荧光效率 即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值 1 激发过程 每种物质分子中都具有一系列紧密相隔的能级称为电子能级在每一个电 子能级上重叠着一系列靠得很近的振动能级 而在每个振动能级上又有靠得极近 的转动能级当光进入物质以后可以有两种情况发生一种是进入物质后能 量几乎不被吸收另一种是能量被全部吸收或被部分吸收后一种情况下在吸 收光的过程中光能量被转移给物质分子 但是 吸收本身是一种高度专一的现象 即一定结构的分子只吸收一定能量的辐射根据量子理论分子从光波中吸收的 能量必定是以不连续的整份单位的形式发生的这些不连续的微小能量单位称 为量子也就是说频率为的单色光的能量必定是的h 整数倍每个量子的 能量为 hc ehhc = 2 2 式中 h 是 p l a n k 常数 是波数 物质分子吸收光能后便可发生从低能级到较高能级的跃迁这一过程进行 极快所吸收的光子能量等于跃迁所涉及的两个能级的能量差若物质吸收的 光子能量较高则足以引起物质分子中的电子发生能级间的跃迁处于这种激发 状况的分子称为电子激发态分子在能级跃迁过程中电子的自旋状态也有可 能发生变化一般荧光物质对光辐射的吸收和发射都是由该物质分子的价电子 重新排列引起的 基于荧光物质分子的电子结构的理论在考虑荧光物质的荧光时应首先考 基于小波去噪的生物组织光谱特性研究 10 虑n 和 的跃迁如图 2 - 3 所示图中箭头表示电子及其自旋方向 图 2 . 3 具有 n 型和型电子的分子的某些电子态示意图 电子激发态的多重态用 2 s + 1 表示s 为电子自旋量子数的代数和其数值 为 0 或 1 根据 p a u l i 不相容原理在同一轨道上的两个电子自旋要彼此相反 基态分子的电子是自旋成对的自旋总和为 0 s = 0且是反磁性的由于 s = 0 则电子激发态的多重态 2 s + 1 = 1 这种电子自旋都配对的分子的电子能态称为单 重态 用符号s 表示 如果激发态的两个电子自旋是平行的 则 s = 1此时 2 s + 1 = 3 因此这种状况的多重性是 3 称为三重态用符号 t 表示 2 去活过程 分子吸收光辐射后从基态跃迁到激发态的不同振动能级上处于具有较高 能量的激发态的分子是不稳定的它返回到稳定的基态的途径可能以发光的形 式即辐射跃迁失去所吸收的能量或者以无辐射跃迁的形式例如转化为热能 失去能量其中以去活速度最快激发态寿命最短的那种途径占优势荧光的发 射能否被观测到就取决于荧光去活过程的发射速率与无辐射过程的竞争即如 果荧光去活过程比其他去活过程的速率快就可观测到荧光反之在竞争中如 果无辐射过程具有更大的速率常数那么荧光将消失或很弱 7 9 荧光现象只有一些兼有某些结构和环境特性的体系才能发生这些特性可 使无辐射去活过程的速率减慢致使发射过程能与其竞争而占优势荧光的发光 机制以及与发光过程相竞争的许多无辐射过程如振动驰豫内转换系间跨 越等将会削弱荧光的产生这些都是在实验研究中要加以注意的因素 2 1 2 2 荧光光谱的优点及主要参量 荧光分析法具有1 灵敏度高2 选择性强3 取样容易试样需要 量少4 能提供较多的物理参数等优点其给出的信息与测量方式有关可根 据实验目的来选择常用的基本参数有 1 荧光强度与荧光量子产额荧光强度是荧光分析的最基本参量指在一 定仪器条件下所测得的荧光强弱它和光源强弱功率激发与发射波长及 单色器的缝宽样品及其浓度探测器的灵敏度等有关因此实际测得的荧光 强度只是一个相对量作图时可以用任意单位表示一般都用测得的强度和标 南京航空航天大学硕士学位论文 11 准样品在相同测量条件下测得的强度之比来表示 荧光量子产额f l u o r e s c e n c e q u a n t u m y i e l d 也称为荧光效率或量子效率 它表示物质发射荧光的本领指发射光子数与吸收光子数的比值是荧光测定的 基本参数之一在大分子构象的研究中尤为重要若用 代表荧光量子产额则 有 吸收光子数 发射光子数 激发态的分子数 发射荧光的分子数 = 2-3 式中的 值与物质本身性质和溶剂有关对于发强荧光分子比如荧光素其量 子产率在某些情况下将接近于 1 而无明显荧光的化学物质其 值则接近于零 此外 值还与激发波长和温度有关 根据l a m b e r t - b e e r 定律吸收前后的光