（应用化学专业论文）腈水合酶固定化细胞的载体选择及复合固定化的研究.pdf

哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 腈水合酶固定化细胞的载体选择 及复合固定化的研究 摘要 细胞固定化是在酶固定化基础上发展起来的一种高新技术和方法，它既 可以提高生产效率和生产能力，延长生产周期，又易于细胞的分离和回收， 已广泛应用于食品工业、轻化工业、制药工业、发酵工业和三废处理工业。 本文利用细胞固定化技术选择合适载体固定腈水合酶产生菌株r h o d o c o c c u s s p h u s t - 3 催化水合丙烯腈生产丙烯酰胺，以解决现阶段生产中存在的酶活 力损失严重、工艺过程复杂、后处理要求高等问题。 首先，使用海藻酸钠、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖、琼脂等常用载 体固定腈水合酶产生菌r h o d o c o c c u ss p h u s t - 3 ，并对其固定化条件进行优 化。研究发现，五种固定化细胞的相对酶活力分别为6 8 - 3 、6 2 3 、 6 0 。7 、8 2 9 、5 5 5 ，同时发现琼脂不适合固定该菌株，而海藻酸钠、聚 乙烯醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖四种载体固定的细胞则各有优点：海藻酸钠固 定化细胞制备简单球形规则，聚乙烯醇固定化细胞直径最大，聚丙烯酰胺固 定化细胞强度最高，壳聚糖固定化细胞酶活最高，因此可以对四种载体进行 复合使用。 其次，对海藻酸钠载体制备的固定化细胞进行了正交实验和性质测定。 研究发现，各因素对海藻酸钠固定化细胞的影响程度依次为：海藻酸钠浓度 海藻酸钠与菌液体积比 c a c l 2 浓度。此外，海藻酸钠固定化细胞的最佳 固定化时间为6 h ，最适底物丙烯腈浓度为4 0 9 l ，最适水合催化p h 值为 7 0 ，最适水合催化温度为2 8 。 最后，以海藻酸钠作为最基本载体，与聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、壳聚糖 分别复合固定腈水合酶产生菌株。研究发现，三种复合载体制备的固定化细 胞的相对酶活力分别为9 3 1 、9 2 7 、9 7 6 ，其中海藻酸钠一壳聚糖复合 载体最适合固定腈水合酶产生菌r h o d o c o c c u ss p h u s t - 3 水解丙烯腈生产丙 烯酰胺，其固定化方法为：将3 5 海藻酸钠溶液与1g l 腈水合酶菌 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 悬液按体积比2 0 ：1 混合均匀，用注射器平稳滴入4 c a c l 2 溶液中 制成海藻酸钠固定化细胞，再将海藻酸钠固定化细胞置于1 6 壳 聚糖醋酸溶液中覆膜3 0 m i n 即得海藻酸钠一壳聚糖固定化细胞，该法制备 工艺操作简单，原料价格低廉易得，制得的固定化细胞机械强度高，酶活转 化率为9 7 6 ，比传统海藻酸钠固定化细胞提高2 9 - 3 ，同时可以进行1 2 批次连续水合反应。 关键词腈水合酶；固定化载体；海藻酸钠；壳聚糖 i i 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 i m m o b i l i z a t i o nc a r r i e rs e l e c t i o na n d c o m p o s i t e v e c t o rf o rt h en i t r i l eh y d r a t a s ec e l l a b s t r a c t i m m o b i l i z e dc e l lt e c h n o l o g y , w h i c hd e v e l o p e df r o mi m m o b i l i z e de n z y m e t e c h n o l o g y , i st h eb a s i so f ah i 曲a n dn e wt e c h n o l o g ya n dm e t h o d s t h ec e l lc a n i m p r o v ep r o d u c t i o ne f f i c i e n c ya n dc a p a c i t y , e x t e n dt h ep r o d u c t i o nc y c l ea n de a s e o fc e l ls e p a r a t i o na n dr e c o v e r y i ta l s oh a sb e e nw i d e l yu s e di nf o o di n d u s t r y , l i g h tc h e m i c a li n d u s t r y , p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y , t h ef e r m e n t a t i o ni n d u s t r ya n d w a s t et r e a t m e n ti n d u s t r y t h ep a p e ru s e di m m o b i l i z e dc e l lt e c h n o l o g ya n ds e l e c t s u i t a b l ec a r r i e rt oi m m o b i l i z er d 咖c o c c u ss p h u s i - 3 w h i c hi san i t r i l e h y d r a t a s ep r o d u c i n gs t r a i na n dc a nc a t a l y z ea c r y l o n i t r i l et oa c r y l a m i d e ，t or e s o l v e a tt h i ss t a g eo fp r o d u c t i o nt h a te x i s ti nas e r i o u sl o s so fe n z y m ea c t i v i t y , t h e p r o c e s sc o m p l e x ，p o s t p r o c e s s i n gr e q u i r e m e n t so ft h eh i g h e rq u e s t i o n s f i r s t ，n i t r i l eh y d r a t a s ep r o d u c i n gs t r a i nr h o d o c o c c u ss p h u s t - 3w a s i m m o b i l i z e db ys o d i u ma l g i n a t e ，p o l y v i n y la l c o h o l ，p o l y a c r y l a m i d e ，c h i t o s a na n d a g a r , a n do p t i m i z et h er e a c t i o nc o n d i t i o n s t h es t u d yf o u n dt h er e l a t i v ee n z y m e a c t i v i t yo ft h ef i v ek i n do fi m m o b i l i z ec e l l sw a s6 8 3 ，6 2 3 ，6 0 7 ，8 2 9 a n d 5 5 5 i ta l s of o u n da g a ri sn o ts u i t a b l ef i x e dt h es t r a i n ，b u ts o d i u ma l g i n a t e ， p o l y v i n y la l c o h o l ，p o l y a c r y l a m i d e ，c h i t o s a nh a v et h e i ro w na d v a n t a g e s ：s a i m m o b i l i z e dc e l l sp r e p a r e de a s i l y , p v ai m m o b i l i z e dc e l l se o m p a t e dg o o d ，p a m i m m o b i l i z e dc e l l sh a v et h eh i g h e s t i n t e n s i t y , c ai m m o b i l i z e dc e l l sh a v et h e h i g h e s te n z y m ea c t i v i t y s ot h e yc a nb eu s e dc o m p o s e d s e c o n d ，o r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dt h ed e t e r m i n a t i o nn a t u r ew a su s e do n s ai m m o b i l i z e dc e l l s t h es t u d yf o u n dt h ee x t e n to fi m p a c tw a s ：c o n c e n t r a t i o no f s o d i u m a l g i n a t e v o l u m e r a t i oo fs o d i u m a l g i n a t e a n dn i t r i l e h y d r a t a s e s u s p e n s i o n c o n c e n t r a t i o no fc a c l 2 i ta l s of o u n dt h a tt h eb e s ti m m o b i l i z e dt i m e w a s6h o u r s ，t h eb e s ta c r y l o n i t r i l ec o n c e n t r a t i o nw a s4 0 9 l ，t h eb e s tr e a c t i o np h w a s7 0 ，t h eb e s tr e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 8 。c t h i r d ，s o d i u ma l g i n a t ew a su s e df o rt h eb a s i cc a r r i e r , p o l y v i n y la l c o h o l ， 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 p o l y a c r y l a m i d ea n dc h i t o s a nw a sm i x e du s e d 1 1 1 es t u d yf o u n dt h er e l a t i v ee n z y m e a c t i v i t yo f t h et h r e ek i n do f m i x e di m m o b i l i z ec e l l sw a s9 3 1 ，9 2 7 a n d9 7 6 r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eb e s tc a r r i e rw a sa l g i n a t e c h i t o s a n ，a n dm e t h o d sw a s ：m i x 3 5 s o d i u ma l g i n a t ea n d1g ln i t r i l eh y d r a t a s es u s p e n s i o nb yv o l u m er a t i oo f 2 0 ：1 ，p u ti n t o4 c a c l 2 ，a n dc ang e ts ai m m o b i l i z e dc e l l s t h e np u tt h ec e l l s i n t o1 6 c h i t o s a n - a c e t i ca c i df o r3 0m i n u t e s a n dg e ta c ai m m o b i l i z e dc e l l s t h i sm e t h o dp r o d u e t e de a s i l y , a n ds t u f fw a sc h e a p a n dt h ec e l l sh a v eh i g h m e c h a n i c a ls t r e n g t h ，a n dr e l a t i v e l ye n z y m ea c t i v i t yw a s9 1 6 ，w h i c hw a s2 3 3 p e r c e n t a g ep o i n t sh i g h e rt h a ns ai m m o b i l i z e dc e l l s a tt h es a m et i m e ，a c a i m m o b i l i z e dc e l l sc a nb eu s e df o r12t i m e s k e y w o r d sn i t r i l eh y d r a t a s e ，i m m o b i l i z a t i o nc a r r i e r , s o d i u ma l g i n a t e ，c h i t o s a n i v 哈尔滨理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：此处所提交的硕士学位论文腈水合酶固定化细胞的载 体选择及复合固定化的研究，是本人在导师指导下，在哈尔滨理工大学攻 读硕士学位期间独立进行研究工作所取得的成果。据本人所知，论文中除已 注明部分外不包含他人己发表或撰写过的研究成果。对本文研究工作做出贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明。本声明的法律结果将完全由 本人承担。 作者签名： 日期函年乃月，日 哈尔滨理工大学硕士学位论文使用授权书 腈水合酶固定化细胞的载体选择及复合固定化的研究系本人在哈尔 滨理工大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的硕士学位论文。本论文的 研究成果归哈尔滨理工大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义 发表。本人完全了解哈尔滨理工大学关于保存、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向有关部门提交论文和电子版本，允许论文被查阅和借阅。本人 授权哈尔滨理工大学可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文，可以公 布论文的全部或部分内容。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用授权书。 不保密四 ( 请在以上相应方框内打) 作者签名：地席同期：坼与月嘭日 导师签名：素镪日期：砷年孑月店日 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 1 1 丙烯酰胺概述 1 1 1 丙烯酰胺的性质 第1 章绪论 丙烯酰胺( 心d 的分子式为h 2 c = c h c o n h 2 ，分子量为7 1 0 9 。丙烯酰胺单 体是白色、无臭的鳞片状或粉状晶体，溶液为无色或微黄色，密度为 1 1 2 2 9 m l ，熔点为8 4 - 8 5 ，沸点为8 7 。c ( 2 m m h g ) 、1 2 5 ( 2 5 m m h g ) ，聚合 热为- 5 2 5 k j m o l ，溶于水、乙醇、丙酮、乙醚和氯仿，微溶于甲苯，不溶于苯 和庚烷。2 5 的溶解度在水中为2 1 5 5 9 m e ，在丙酮中为0 6 3 1 9 m e 。丙烯酰 胺具有双键和酰胺基双重活性基团，因而化学性质活泼，可发生加成反应、聚 合反应等化学反应【l , 2 1 。丙烯酰胺对人体有神经毒性和潜在致癌性，可以通过皮 肤粘膜、消化道、呼吸道和胎盘进入人体，分布于体液中。2 0 0 2 年首次发现在 高温油炸后的富含碳水化合物的食品中存在，引起了世界各国研究者的广泛关 注。国际癌研究组织已将丙烯酰胺列入2 b 组“可能对人体致癌的物质 。其聚 合物无毒【3 巧】。 1 1 2 丙烯酰胺的用途及市场前景 1 1 2 1 丙烯酰胺的用途丙烯酰胺是一大类单体的母体化合物，它的应用主要 有以下三方面： 第一，大量用于制造水溶性聚合物聚丙烯酰胺( p a m ) 类共聚物。我国 目前9 0 丙烯酰胺单体用于生产聚丙烯酰胺类共聚物。 第二，少量用于使亲油性聚合物形成透水的亲水中心，以增加粘合力，增 加树脂的软化点和抗溶剂性。 第三，少部分用作乙烯基聚合物的交联剂。 1 1 2 2 聚丙烯酰胺的用途由上可知丙烯酰胺主要是用于聚丙烯酰胺及其系列 产品的生产，其下游产品聚丙烯酰胺系列产品是一种用途极广的“百业助 剂”，主要具有以下用途： 1 在石油工业的应用聚丙烯酰胺的增稠、絮凝和对流体流变性的调节作 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 用，在钻井、堵水、酸化、压裂、洗井、固井、减阻、防垢及二次采油、三次 采油中都有广泛的应用。特别是随着世界石油资源日益紧张，提高采油率的新 技高分子量聚合物驱油技术得到广泛的应用。按增产一桶原油约需聚合物 0 4 5 1 3 5 k g 计，聚合物驱油每年需丙烯酰胺为5 5 1 0 5 万吨( 增产1 亿吨 年) 。这也是目前国内丙烯酰胺的主要需求。 2 在水处理中的应用聚丙烯酰胺作为水处理剂，主要用作絮凝剂和污泥脱 水剂。许多化工生产都要进行溶液澄清和过滤，加入聚丙烯酰胺能提高澄清或 过滤的速度和效率。 3 在造纸工业中的应用聚丙烯酰胺用作造纸助剂，因它的分子量及所带电 荷不同而用途不同。分子量在1 0 0 0 1 0 0 0 0 的p a m 用作分散剂：分子量在5 0 万1 0 0 万的用作干增强剂；在1 0 0 万- 2 5 0 0 万的用作助留剂、助滤剂、分散 剂、水处理剂等。聚丙烯酰胺与其它造纸化学品相比，其特点是用量少，效果 显著。 除此之外，聚丙烯酰胺还广泛应用于洗煤、冶金、采矿、食品、纺织等领 域1 1 6 ，7 】。由于聚丙烯酰胺在以上各领域的市场潜力日趋凸现，特别是环保产业 的逐步兴起，将会对聚丙烯酰胺有更大的需求，必定会需求更多的丙烯酰胺单 体，故丙烯酰胺行业有着广阔的开拓前景，这个领域的发展也将大有作为。然 而目前我国丙烯酰胺很大程度上有赖于进口，国内产量远不能满足各行业的需 要，特别是不能满足高纯度聚丙烯酰胺的需求，故此产品的进一步开发将显示 出更为广阔的市场前景【8 1 。 1 1 3 丙烯酰胺生产技术回顾 丙烯酰胺( c h 2 = c h c o n h 2 ) 是由丙烯腈( c h 2 = c h c = n ) 水解制备的，由于丙 烯腈有c - n 和c = c 两个不饱和键，因此在不同的条件下水解时，可能生成丙 烯酰胺或3 羟基丙腈。目前，按所使用的催化剂的不同，工业上用丙烯腈生产 丙烯酰胺的方法主要有硫酸水合法、金属催化法、生物催化法三种【9 】。 1 1 3 1 硫酸水合法1 9 世纪末，丙烯酰氯与氨首次合成出丙烯酰胺。1 9 5 4 年， 美国c y a n a m i d 公司首先采用丙烯腈硫酸水合法实现了工业化生产，并被各国 广泛应用。在此后的近二十年中此法一直是丙烯酰胺的唯一工业化生产方法。 该法首先将硫酸水合物加到搪玻璃反应锅中，在搅拌情况下将丙烯腈慢慢 加入，加热到1 0 0 左右，丙烯腈即自行水解生成丙烯酰胺硫酸盐。然后用氨 中和反应产物，在4 0 5 0 析出硫酸铵，经过滤分离出副产物硫酸铵。再将反 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 应物冷却形成丙烯酰胺结晶，经分离、干燥得到结晶单体。 c h 2 = c h c - n + h 2 s 0 4 h 2 01 h 2 = c h c o n h 2 h 2 s 0 4 + 1 30 k j m o l 硫酸水合法投资大，丙烯腈单耗高，并产生大量硫酸盐和硫酸废液污染环 境。从2 0 世纪6 0 年代开始，美国日本等国积极研制开发无公害的工艺路线， 硫酸水合法已逐渐被淘汰。 1 1 3 2 金属催化法催化水合法的催化剂为活化的舢一c u 合金，它的特点是 使丙烯腈选择性地转化为丙烯酰胺，而不会水合成丙烯酸。 9 c h 2 = c h - c m n + h 2 0 旦型缉c h 2 = c h - 凸州2 目前，国内生产丙烯酰胺主要采用的是铜催化水合法，根据工艺过程不同 可分为固定床催化水合法和悬浮床催化水合法 1 0 a h 。铜催化剂具有选择性好、 活性高、性能稳定、寿命长、催化反应效率高等优点。但是其反应条件需要在 高温高压下进行，对设备和能耗有较高的要求。并且由于反应物丙烯腈和铜催 化剂的残留，使生产的丙烯酰胺难以合成高分子量的聚丙烯酰胺。因此，从2 0 世纪7 0 年代中期起，用微生物法成产丙烯酰胺的技术开始得到重视。 1 1 3 3 微生物法微生物法是目前具有国际先进水平的新技术新方法，又称生 化法。该方法是利用生物技术培养出一种菌种，这种菌株能在适应环境下利用 自身细胞蛋白酶把丙烯腈水合成丙烯酰胺而获得生存能量。丙烯腈的微生物分 解反应为： c h 2 = c h c - n 一c h 2 _ c h c o n h 2 一c h 2 = c h c o o h 1 9 7 3 年，法国研究者g a l z y 及其研究组发现了一种能催化丙烯腈水合停留 在丙烯酰胺的微生物b r e v b a c t e r i u mr 3 1 2 ，从而开始了用微生物生产丙烯酰胺 的研究。与传统化学法相比，微生物法具有选择性高、收率高、反应在常温常 压下进行、副产物极少、产品质量高以及可生产多种高分子量聚丙烯酰胺等特 点 1 2 - 1 4 】。因此，微生物法从诞生起就引起全世界的广泛关注，英、美、法、前 苏联及南韩、芬兰等国纷纷开展研究，都试图用微生物法改造本国的丙烯酰胺 生产装置。其中日本、前苏联处于技术领先地位。 我国从1 9 8 4 年开始微生物法丙烯酰胺的研究工作，于1 9 9 4 年实现投产。 1 9 9 4 年江苏如臬化肥厂利用原化工部生物化学工程研究中心技术成果建立了第 一套1 0 0 0 吨年微生物法生产丙烯酰胺装置。近年胜利油田长安聚合物有限公 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 司、北京市恒聚油田化学剂有限公司先后建成3 万吨年微生物法丙烯酰胺和 超高分子量聚丙烯酰胺装置，其丙烯腈转化率、丙烯腈单耗、工业发酵产酶能 力等均超过目前国际先进水平。现如今国内一共有十多家丙烯酰胺生产企业， 全部采用微生物法，总产能约3 5 万吨年，2 0 0 4 年实际总产量将近2 0 万吨。 主要生产企业是北京市恒聚油田化学剂有限公司、中国石油大庆炼化分公司、 东营胜利油田聚合物有限公司、爱森( 中国) 絮凝剂有限公司、山东淄博张店东 方化学股份有限公司、安徽天润化学工业股份有限公司、河南焦作多生多化工 有限公司、江西昌九生物化工股份有限公司、盘锦兴建助剂有限公司等1 1 5 , 1 6 】。 与国外大规模生产相比，我国的丙烯酰胺生产还比较落后，与我们的需求 还不相适应，正要建立新的生产装置，因此在这方面有比较大的发展优势。 1 2 腈水合酶研究简介 生物催化制取丙烯酰胺为近年发展起来的绿色化学工艺，并在我国得到推 广和发展。该方法具有反应条件温和、转化率高、选择性高、产品质量高且无 污染等优点。而用于此反应的催化剂就是腈水合酶( n i t f i l eh y d r a t a s e ) 。 1 2 1 腈水合酶的种类及分布 腈化合物一般属于高毒性化合物，然而一些微生物能利用此类化合物作为 它们生长所必需的碳源和氮源，能将腈类化合物水解为酰胺类或羧酸类化合 物。目前已知能产生腈水合酶的微生物有红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒 状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、短杆菌等，如r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u sj i ， c o r y n e b a c t e r i u mp s e u d o d i p h t e r i u m z b b - 41 ，r h o d o c o c c u s s p n - 7 7 4 ， r h o d o c o c c u ss p y h 3 3 ，a l c a l i g e n e sf a e c a l 捃a t c c8 7 5 0 ，a l c a l i g e n e sf a e c a l i s j m 3 ，p s e u d o m o n a sc h l o r a p h 西b 2 3 ，r h o d o c o c c u ss p n - 7 71 ，p s e u d o n o c a r d a t h e r m o p h i l aj c m 3 0 9 5 ，b r e v i t e r i u mc h1 ，b e c i l l u s s p b r 4 4 9 ，b r e c t e r i u m s p c h l ，b r e c t e r i u ms p c h 2 ，b r e v i b a c t e r i u mi m p e r i a l 括c b s 4 8 9 - 7 4 ，b r e v i t e r i u m r 3 1 2 等，由此可见产腈水合酶菌的分布是相当广泛的 1 7 - 2 2 】。 虽然产腈水合酶菌的种类不同，但所有产腈水合酶菌却有一共同点酶 的活性部位都螯合有金属离子作为辅助因子。按其所含的金属离子的不同，可 将其分为两类：钴型腈水合酶和铁型腈水合酶。如m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a 中 的腈水合酶含有锌，r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u sn 7 7 1 、p s e u d o m o n a sc h l o r o r a p h i s b 2 3 和r h o d o c o c c u sr 3 1 2 中的腈水合酶都含有被羟硫基螫合的f e 3 十，而 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u sj 1 和p s e u d o m o n a sp u t i d a18 6 6 8 中的腈水合酶包含有 非类咕啉钴。其中最常见的辅助因子是非血红素铁( n o n h e m e i r o n ) 和非类咕啉 钻( n o n c o r f i n i o d c o b f l t ) ，分别称为铁型和钴型腈水合酶 2 3 - 2 6 1 。 1 2 2 腈水合酶的结构特点 产腈水合酶菌的代谢具有多样性，但所有腈水合酶均为胞内酶。腈水合酶 的产生取决于培养基中的碳源、氮源、金属离子及酶表达所需诱导剂等。如需 将腈转化为酰胺时，可在培养基中添加脂肪族腈作为诱导剂以诱导腈水合酶的 表达；当需要羧酸时，可在培养基中添加芳香族腈以诱导水解酶的表达。 依据分子量可将腈水合酶分为高分子量腈水合酶( h - n h a s e ) 和低分子量腈水 合酶( l - n h a s e ) 。菌株r h o d o c o c c u s r h o d o c h r o u sj 1 可同时产生h n h a s e ( 5 2 0 k d a ) t 2 7 1 和l - n h a s e ( 1 3 0 k d a ) t 2 s - 3 们。虽然这两种酶都可催化腈水解， 但它们的亚单位、生物合成调节及基因表达差异甚大，因而呈现出不同的物理 化学特性和底物专一性，如h - n h a s e 对脂肪族腈有较好的专一性，而l - n h a s e 对芳香族脂有极高的转化性。 钴型腈水合酶与铁型腈水合酶具有相似性，用x 射线衍射分析腈水合酶亚 单位的结构，显示出金属离子为辅助因子，其中金属离子钴与2 个n 原子和3 个s 原子形成5 价配位键，n 原子来自主链上的酰胺基团，s 原子来自酶蛋白 中的半胱氨酸硫醇盐，酶分子中的吡咯喹啉锟为氧化还原反应的辅酶，如图1 1 所示 3 1 - 3 3 】。 图1 1 腈水合酶的反应历程 f i g 1 - 1t h er e a c t i o nc o u r s eo fn i t r i l eh y d r a t a s e 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 1 2 3 腈水合酶的反应机理 丙烯腈的水合反应的终产物为丙烯酸，反应机理如图1 2 所示。 图1 2 腈水合酶的反应机理 f i g 1 2t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo fn i t r i l eh y d r a t a s e = a + n h l h 目前工业上使用的产腈水合酶菌是一种酰胺酶和腈水解酶突变菌株，这从 根本上解决了酰胺酶和腈水解酶引起的副产物丙烯酸的生成，使产物丙烯酰胺 得到积累，转化液中产物浓度最高可达6 0 0 9 l t 州。 下面以一钴型腈水合酶为例描述催化反应历程，如图1 3 所示。 c 0 p h 靠： i + o h 卜。、广h b 斗 、厂一 r c 三三n c o 缈 r 一筻m 也n hh b r 一船 r e 一岂一n h c o 争 o hh o h 弋b ，b l r e = = = 零n l 图1 3 腈水合酶的反应历程 f i g 1 - 3t h er e a c t i o nc o u r s eo fn i t r i l eh y d r a t a s e 腈水合酶中的钴离子起到l e w i s 酸的作用 3 5 - 3 7 1 。首先，钴离子与腈及周围 的水分子结合，激活腈基中的三键，并在辅酶p q q 的共同作用下发生水合反 彳_ 乙 璺 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 应。一腈基靠近o h 。( 或者一个与金属离子形成共价键的水分子) ，然后，o h 。或 者水分子( 象广义上的碱一样被活化) 攻击腈基中的碳负离子，形成一个亚酰胺 ( g - c ( o h ) n h ) ，最后，亚酰胺异构化生成酰胺，正是由于这种独特的催化机 理，使腈水合酶能有效地催化腈类化合物的水解。 1 2 4 腈水合酶的热稳性 在酶的研究及应用中，温度是一个重要的影响因素。这主要是因为酶蛋白 受热变性，进而使酶的三维结构发生变化，从而使酶活降低或者完全失活。对 于腈水合酶来说，一般表现为热不稳定性。各种腈水合酶酶活与温度的关系见 表1 1 【3 8 】。 表1 1 腈水合酶的最适反应温度及其耐热性 t a b l el - 1t h ep e r f e c tr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt h eh e a t - r e s i s t i n gp r o p e r t i e so f n h a s e 腈水合酶最适温度( )耐热性 p s e u d o d i p h t e r i t i c u mz b b - 4 20-27 b a c i l l u ss p b r 4 4 955+ b r e v i b a c t e r i u ms p c h1 3 0 q - b a c i l l u sp a l l i d u sd a c 5 230+ r h o c h o c o c c u ss p n - 7 7 43 5 + p s e u d o m o n e sc h l o r o r a p h 括b - 2 3 海藻酸钠与菌液体积比 c a c l 2 浓度。 3 3 海藻酸钠包埋法的固定化时间 对海藻酸钠固定化细胞的最佳固定化时间进行测定的结果如表3 3 所示。 表3 3 固定化时间对酶活力的影响 t a b l e3 - 3e f f e c to f t i m eo nr e l a t i v e l ye n z y m ea c t i v i t y 固定化时间q ) 机械强度相对酶活( 呦 1 + 6 0 6 2 + 6 1 1 4 + 6 1 9 6 + 6 2 7 8 + 5 8 3 1 0 + 5 1 - 3 1 2+497 从表3 3 中可以看出，固定化时间越长，固定化细胞的机械性能越好，但 6 h 后，固定化时间对固定化细胞机械性能的影响开始变得不明显，部分酶开始 失活，表现为相对酶活下降。因此最终确定最佳固定化时间为6 h 。 3 4 海藻酸钠固定化细胞的水合催化条件 3 4 1 底物丙烯腈浓度 在水合反应中，丙烯腈是反应底物。由于腈水合酶的活性中心含有s h ， 它易被巯基试剂掩蔽，而使活性降低，因此作为反应物的丙烯腈浓度过高或过 低都会影响催化反应速度。丙烯腈是一种有毒的物质，其浓度过高对菌体有 害，可能会造成酶的失活。但同时丙烯腈是一种反应物，在动力学的研究中， 反应物浓度的增加，有利于反应速率的增加。这两者构成了一种矛盾，有必要 对丙烯腈的浓度对酶活的影响进行研究。不同底物浓度对酶活力的影响结果如 图3 1 所示。 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 图3 - 1 丙烯腈浓度对酶活的影响 f i g 3 - 1e f f e c to ft h ea c r y l o n i t r i l ec o n c e n t r a t i o no nt h ee n z y m ea c t i v i t y 由图3 1 可知，当丙烯腈浓度低于4 0 l 时，相对酶活随着丙烯腈的增加 而增大，呈线性增长；当其浓度低于4 0 9 l 时，酶活力随着丙烯腈加入量的增 加而下降。这证明了丙烯腈对所产腈水合酶有一定的毒性，高浓度丙烯腈将降 低酶的活性。因此，体系中合理的丙烯腈浓度既能使反应获得较高的酶活力， 同时也能够保证酶活性的稳定，故在反应体系中采用4 0 9 l 丙烯腈作为其最佳 加入量。 3 4 2o l d 值 氢离子浓度对酶的影响很大，在稀酸或稀碱条件下，它直接或间接影响固 定化细胞的催化活性，同时在一定的酸或碱的条件下会使固定化细胞变性失 活。在p h 值分别为5 、5 5 、6 、6 5 、7 、7 5 、8 、8 5 、9 的0 1 m o l l i r i s 磷酸 缓冲体系中对海藻酸钠固定化细胞的酶活力进行测定，结果如图3 2 所示。 从图3 2 中可以看出，p h 在低于6 5 时，相对酶活随p h 的升高而逐渐增大， 在6 5 到7 5 区间内酶活变化平缓，当p h 超过7 5 时酶活开始迅速下降，这表 明p h 7 0 的反应体系有利于酶的高效表达，从而获得较高的酶活。因此确定水 合反应体系的最佳p h 值为7 0 。 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 3 4 3 温度 5 5 566 577 588 59 p h 值 图3 - 2p n 值对酶活力的影响 f i g 3 - 2e f f e c to fp no i lt h ee n z y m ea c t i v i t y 温度对酶活力的影响主要有两方面：一是在一定范围内随着温度的升高细 胞活性增强，酶活力提高；二是随着温度的升高细胞逐渐变性而失去活性。海 藻酸钠固定化细胞的最适反应温度就是这两方面相互影响的结果。在反应温度 分别为1 2 、1 6 、2 0 、2 4 c 、2 8 。c 、3 4 、3 6 、4 0 c 时，海藻酸钠固定 化细胞的酶活力变化曲线如图3 3 所示。 1 21 62 02 42 83 23 64 0 温度( ) 图3 3 温度对酶活力的影响 f i g 3 - 3e f f e c to f t h et e m p e r a t u r eo nt h ee n z y m ea c t i v i t y 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 从图3 3 中可以看出，当温度低于2 8 。c 时，温度的升高有利于酶活的提 高。当温度高于2 8 * ( 2 时，随着温度的升高酶活下降明显，这主要是酶在高温下 失活造成的。因此确定水合反应体系的最佳温度为2 8 1 2 。 3 5 本章小结 1 海藻酸钠包埋法的正交实验结果表明各因素影响程度依次为：海藻酸钠 浓度 海藻酸钠与菌液体积比 c a c l 2 浓度。 2 海藻酸钠包埋法的最佳固定化时间为6 h 。 3 海藻酸钠包埋法的最适底物丙烯腈浓度为4 0 9 l ，最适水合催化p h 值 为7 o ，最适水合催化温度为2 8 。 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 第4 章海藻酸钠复合载体制备固定化细胞 4 1 材料和方法 4 1 1 菌种和培养基 菌种：腈水合酶产生菌株r h o d o c o c c u ss p h u s t - 3 由哈尔滨理工大学微生 物实验室分离筛选并保藏。 斜面培养基( g l ) ：丙烯腈2 ，葡萄糖2 0 ，酵母粉5 ，n a c l1 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 ，k e h p 0 40 5 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，琼脂1 5 ，p h7 0 发酵培养基( g l ) ：葡萄2 0 ，酵母粉1 0 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，k 2 h p 0 40 5 ， k h 2 p 0 40 5 ，酪氨酸0 2 ，c o c l 2 6 h 2 00 0 8 m m o l l ，p h7 0 4 1 2 固定化细胞的制备 4 1 2 1 海藻酸钠一聚乙烯醇( s a p v a ) 联合固定法分别将2 、3 、 4 、5 、6 、7 、8 、9 、lo 、1l 、12 聚乙烯醇溶液与 3 5 海藻酸钠溶液、1g l 腈水合酶菌悬液按体积比1 0 ：2 0 ：1 混合， 加入1 0 9 l 、3 0 9 l 、4 0 9 l 、5 0 9 l 、6 0 9 l 、8 0 9 l 、10 0 9 l 、 1 2 0 9 l 的硅藻土和5 9 l 、1 0 9 l 、1 5 9 l 、2 0 9 l 、2 5 9 l 、3 0 9 l 的活 性炭，搅拌均匀，用医用注射器平稳滴入含4 c a c l 2 的饱和硼酸溶液 成圆球状，4 固化6 h ，滤出小球，用蒸馏水反复洗涤后置于浓度为 0 5 、1 、1 5 、2 、3 、4 、6 、8 的戊二醛溶液中交联2 0 分钟，即得s a p v a 固定化细胞小球。 4 1 2 2 海藻酸钠一聚丙烯酰胺( s a p a m ) 联合固定法分别将3 5 海藻酸 钠溶液与1 、2 、4 、6 、7 、8 、9 、1o 聚丙烯酰胺溶 液、1g l 腈水合酶菌悬液按体积比2 0 ：0 5 ：1 、2 0 ：1 ：1 、2 0 ：1 5 ：1 、 2 0 ：2 ：1 、2 0 ：3 ：1 、2 0 ：4 ：1 、2 0 ：5 ：1 混合均匀，用医用注射器平稳滴入 4 c a c l 2 溶液成圆球状，4 固化6 h ，滤出小球，用蒸馏水反复洗涤后置 于浓度为0 5 、1 、2 、3 、4 、6 的戊二醛溶液中交联2 0 分 钟，即得s a - - p a m 固定化细胞小球。 - 3 4 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 4 1 2 3 海藻酸钠一壳聚糖( a c a ) 联合固定法将海藻酸钠固定化细胞置于 0 2 、o 4 、0 8 、1 2 、1 6 、2 、2 4 壳聚糖醋酸溶液( 醋酸体积分 数为2 ) 中覆膜l o m i n 、2 0 m i n 、2 5 m i n 、3 0 m i n 、3 5 m i n 、4 0 m i n 、5 0 m i n 、 6 0 m i n ，滤出小球，用蒸馏水反复洗涤，即得a c a 固定化细胞小球。 4 2 海藻酸钠复合固定化细胞的条件优化 4 2 1 海藻酸钠一聚乙烯醇( s a p v a ) 联合固定法 海藻酸钠作为一种成球助剂，能够有效克服聚乙烯醇包埋法成球难的缺 点，同时还可以改善聚乙烯醇凝胶的传质效果唧1 ，从而提高固定化细胞的酶活 和强度。因此本节将在海藻酸钠包埋法的基础上，添加聚乙烯醇制成海藻酸钠 一聚乙烯醇凝胶对腈水合酶产生菌株进行细胞固定化研究。 4 2 1 1 聚乙烯醇浓度对酶活力的影响在3 5 海藻酸钠与l g l 菌悬液中分别 加入浓度为2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、11 的聚 乙烯醇，对酶活力的影响如图4 1 所示。 p v a 浓度( ) 图4 ip v a 浓度对酶活的影响 f i g 4 - 1e f f e c to fc o n c e n t r a t i o no fp v a o ne n z y m ea c t i v i t y 由图4 1 可知，当聚乙烯醇浓度为7 时，体系的最高相对酶活为8 2 3 。 继续增大聚乙烯醇浓度，其酶活反而呈下降趋势，这可能是由于聚乙烯醇本身 的高粘度导致酶的释放更加困难，从而导致酶活降低。 4 2 1 2 添加剂硅藻土和活性炭对酶活力的影响为了进一步提高酶活力，在 3 5 海藻酸钠、7 聚乙烯醇、含4 c a c l 2 的饱和硼酸体系中，分别加入添加 剂硅藻土10 9 l 、30 9 l 、4 0 9 l 、5 0 9 l 、6 0 9 l 、8 0 9 l 、10 0 9 l 、 哈尔滨理工大学工学硕士学位论文 1 2 0 9 l 和活性炭5 9 l 、1 0 9 l 、1 5 9 l 、2 0 9 l 、2 5 9 l 、3 0 9 l ，对酶活 力的影响如图4 2 、图4 3 所示。 硅藻土加入量( g l ) 图4 2 硅藻土加入量对酶活的影响 f i g 4 - 2e f f e c to fc o n c e n t r a