（生物化学与分子生物学专业论文）氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生产二羟基丙酮研究.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 二羟基丙酮( d i h y d r o x y a c e t o n e ，d h a ) 是最简单的酮糖，具有生物可降 解性和生物相容性。一般d h a 是以二聚体形式存在，在水、乙醇体积比为1 ： 1 5 的溶液中缓慢溶解后变成单体。d h a 单体易溶于水，乙醇，二乙醚和丙酮 中。d h a 及其衍生物在食品、化妆品和医药等诸多领域有着广泛的应用。因此， 微生物发酵生产二羟基丙酮越来越受到重视。 本论文对氧化葡萄糖酸杆菌( g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ) g 5 0 在诱变育种、摇 瓶发酵和l ol 发酵罐发酵生产d h a 等方面进行了较为细致研究，并对发酵液 中的d h a 分离以及与细菌d h a 生产关键酶一甘油脱氢酶( g l y c e r o l d e h y d r o g e n a s e ) 酶学特性进行了初步的探讨。 通过实验对氧化葡萄糖酸杆菌g 5 0 进行紫外线和6 0 c o 射线诱变育种，筛 选出了一株高产d h a 突变菌g u r l 8 6 。传代培养显示鲫【1 8 6 生产性能相对 稳定，产量比出发菌g 5 0 提高5 9 2 。 在d h a 发酵工艺方面，研究了氧化葡萄糖酸杆菌g u r l 8 6 最佳种子培养 条件；采用正交实验确定了影响g u r l 8 6 发酵生产d h a 的各因素，并对众多 因素的效应进行了评价。研究获得的最佳发酵培养基为：甘油1 4 ，酵母膏0 5 ，碳酸钙0 7 。在优化后的培养条件下，摇瓶发酵培养2 天，突变菌g u r l 8 6 液体发酵生产d h a 浓度提高到1 2 4 9 1 0 0 m l 。 1 0 l 发酵罐发酵生产d h a 研究结果：当每分钟通气量为1 ：o 7 5 ，搅拌转 速4 0 0r m i n ，发酵4 4 小时，二羟基丙酮产量达1 3 2 1 0 0 m l 。 实验研究结果表明，活性炭和阳离子型聚丙烯酰胺具有良好的除菌和色素 等杂质的效果，采用3 的活性炭和5 0m g m 3 絮凝剂，在搅拌转速2 0 - - 4 0r m i n 条件下，温度保持6 0 ，处理1 0 m i n ，发酵液可以达到很好处理效果。普通物 理萃取和络合萃取法均不能有效分离二羟基丙酮，在强酸性树脂催化下，通过加 入乙醛与二羟基丙酮发生可逆缩醛反应，然后甲苯同步萃取，可以有效分离溶液 中二羟基丙酮，二羟基丙酮的总收率为8 2 。 通过d e a e - - s e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换层析和s c p h a c r y ls - - 2 0 0 凝胶层 析提纯氧化葡萄糖酸杆菌中的甘油脱氢酶，酶学性质研究结果显示，该酶最适 作用p h 、温度分别为6 和3 0 。 关键词：二羟基丙酮；氧化葡萄糖酸杆菌；诱变；发酵；甘油脱氢酶 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页 a b s t r a c t d i h y d r o x y a c e t o n e ( d h a ) i s t h e s i m p l e s t o fa l lk e t o s e s ，a n di ti s b i o d e g r a d a b l ea n db i o c o m p a t i b l e t h en o r m a lf o r mi sad i m e rw h i c hi ss l o w l y s o l u b l ei no n ep a r tw a t e ra n d1 5p a r t se t h a n 0 1 m f r e s h l yp r e p a r e d i tr e v e r t s r a p i d l yt ot h em o n o m e r i ns o l u t i o n 伯em o n o m e ri sv e r ys o l u b l ei nw a t e r , e t h a n o l , d i e t h y le t h e ra n da c e t o n e d h aa n di t s d e r i v a t i v e sc a nb ea p p l i e di ns e v e r a l i n d u s t r a lf i e l d ss u c ha sf o o d ，c o s m e t i c sa n dm e d i c i n e t h e r e f o r e ，i ti si n t e r e s t e di n h o wt op r o d u c ed h a b ym i c o - o r g a n i s mf e r m e n t a t i o n i nt h i sp a p e r , w es t u d i e dh o wt os c r e e nt h eg l u c o n o b a c t e ro x y d a n sm u t a n to f l l i g hy i e l do fd h a , a n di tw a si n v e s t i g a t e dt h a tt h ep r o c e s so fp r o d u c i n gd h ab y s h a k i n gf l a s ka n d1 0lf e n n e n t a t o r t h ep r e l i m i n a r yt e c h n i q u eo fi s o l a t i o no fd h a a n dc h a r a c t e r i s t i c so f g l y c e r o ld e h y d r o g e n a s ew a sr e s e a r c h e d g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ( g 5 0 ) w a sm u t a g e n i z e db yu l t r a v i o l e t r a ya n d 6 0 c o t - i r r a d i a t i o n ah j 【g hy i e l dm u t a n tg u r l 8 6w a si s o l a t e df r o mi r r a d i a t e dm u t a n t c l o n e s t e s t e db ys e v e r a lg e n e r a t i o nc u l t u r e st h ei s o l a t e dm u t a n tb a c i l l u sg u r l 8 6 w a sg e n e t i cs t a b i l i t yo fp r o d u c i n gd h a c o m p a r e dw i l l lt h ed h ay i e l do ft h e o r i g i n a ls t r a i ng 5 0 t h em u t a n tg u r l 8 6 w a si n c r e a s e d5 9 2 i nt h es h a k i n gi n o c u l a t i o nt h ec u l t u r eo fg u r l 8 6f o rf e r m e n ts e e da n d c o n d i t i o n so fs h a k i n gf e r m e n t a t i o nw o r es t u d i e d 髓es i n g l e - f a c t o rd e s i g nw a su s e d t od e t e r m i n et h er a n g e so fe a c hr e l a t e df a c t o r w h i c hm a ye f f e c to nt h ep r o d u c t i v i t y o fd h a , t h e nu s e di tt oe v a l u a t et h ei n f l u e n c eo fr e l a t e df a c t o r so nt h ep r o d u c t i v i t y o f d h a n l er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u mw a sa sf o l l o w ：g l y c e r o l 1 4 ，y e a s te x t r a c to 5 ，c a c 0 30 7 m o r et h a n1 2 4 9o f1 0 0 m lb r o t hw a s p r o d u c e db ym u t a n tg u r l 8 6i n t h eo p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o nf o rs h a k i n g i n c u b a t i o n2d a y s h l1 0lb i o r e a c t o r , t h em a x i m u mc o n c e n t r a t i o no fd h aw o r er e a c h e da t4 0 0 r p mo fa g i t a t i o ns p e e d , 1 ：0 7 5p e rm i n u t eo fa e r a t i o na n d 3 0 c f e r m e n t a t i o n a l t e m p r e t u r ea f t e ri n o c u l a t i n g4 4h s t h ed h a c o n c e n t r a t i o nw a s1 3 2 9o fl o o m l b r o t h n 圮f l o c c u l a t i n ge f f e c to ft h ea c t i v ec a r b o na n da ni o np o l y a c r y l a m i d eo n i m p u r i t ys u c ha sb a c t e r i aa n dp i g m e n t si nt h eb r o t hw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r a d d i n g5 0 m go ff l o c c u l a t i n ga g e n ti n t o1 0 0 0lb r o t ha n d3 9o fa c t i v ec a r b o ni n t o 西南交通大学硕士研究生学位论文第l li 页 1 0 0m lb r o t ha n dt h em i x t u r ew a ss t i r r e da t2 0 - - 4 0r p ma t6 0 u cf o r1 0m i l l b y f i l t e r i n gt h ep u r ep r e t r e a t e db r o t hw a sg o t t e n t h er e s u l to fe x t r a c t i o nd h a t e s t s i n d i c a t e dt h a ti td o e sn o te f f e c t i v e l ys e p a r a t ed h a f r o mp r e t r e a t e db r o t hb yt h e m e t h o do fp h y m c ma n dd i s s o l v a n te x t r a c t i o nd o e s h o w e v e r , ap r o c e s sc o u p l i n gt h e r e v e r s i b l er e a c t i o no fd h a w i t ha c e t a l d e h y d ea n das y n c h r o n o u se x t r a c t i o no ft h e p r o d u c tb yt o l u e n ec a nb ee f f e c t i v e l ys e p a r a t e dd h a i nt h ea c i dr e s i nc a t a l y s i s c o n d i t i o n t h ec o l l e c t i o nr a t eo f d h a w a s8 2 g l y c e r o ld e h y d r o g e n a s eo fg l u c o n o b a c t e ro x y d a n aw a sp u r i f i e db yd e a e s e p h a r o s e f a s t f l o w e x c h a n gc h r o m a t o g r a p h y a n d s c p h a c r y l s 2 0 0 c h r o m a t o g r a p h y t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ho ft h ee n z y m ea c t i v i t yw e r e 3 0 a n dp h6r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：d i h y d r o x y a c e t o n e ；g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ；m u t a t i o n ；f e r m e n t a t i o n ； g l y c e r o ld e h y d r o g e n a s e 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 二羟基丙酮及其应用 1 1 1 二羟基丙酮性质 二羟基丙酮( d i h y d r o x y a c e t o n e ，简写d h a ) 又称丙酮醇、1 ，3 - 二羟基丙酮， 外观为白色粉末；具有特殊的臭味；熔点为7 5 8 0 c ( 单体和二聚物的混合物) ， 虽然一般状态下是以二聚体( 1 ，4 - d i o x a n e ) 形式存在的结晶，但是，经溶解或加 热后则变为单体；d h a 可溶于水、乙醇、乙醚和丙酮中。大白鼠急性毒性： l d5 , o 1 6 0 0 0 m g k g 。在市售的商品中，有医用级和化妆品级，各种商品规格见 表1 1 。【1 0 瑚 表1 - 1 二羟基丙酮质量规格 1 1 2 二羟基丙酮应用 二羟基丙酮是一种天然存在的水溶性的酮糖，具有生物可降解性，可食用 且对人体和环境无毒害。近年来广泛用于化妆品，饲料、食品添加剂，化学合 成中间体等。 1 1 2 1 用于化妆品 二羟基丙酮最大特点之一是防晒性极强。利用这一特性，国外已成功开发 了各种保护皮肤效果极佳的化妆液。这种新型化妆液能在皮肤上形成薄膜防止 水分蒸发，这一点与许多传统化妆液差不多；但它在进入皮肤深层之后，还具 有防止紫外线杀伤，起到防止皮肤灼伤的功能。p 4 j 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 1 1 2 2 用于饲料添加剂 日本科技人员经过试验证明，在猪饲料中加入一定量的二羟基丙酮和丙酮 酸盐( 钙盐) 的混合物( 按3 ：l 的重量比配合) ，能减少猪肉的脂肪含量，增加瘦 肉率。 试验是将5 6 头体重为8 0 - 8 5 公斤的猪分成两组进行的，其中试验组的饲料 中加入了4 的二羟基丙酮混合物。经喂养2 8 天后屠宰，取右后腿和右背最后 肌肉，绞碎，测定其蛋白质、脂肪、水分和灰分的含量。结果表明，试验组猪 背脂肪的厚度要比对照组低1 2 1 5 。腿肉和背最长肌肉试验组比对照组的脂 肪含量少，蛋白质含量高。没发现混合物对试验组的内脏重量和血液成分有明 显影响，但肝功能检查发现血清中谷氨酸、丙酮酸转氨酶的活性为：试验组比 对照组低1 8 。例 1 1 2 3 用于治疗白斑、白癜风 白斑影响美容时，用遮盖疗法即o 2 5 - - 羟基丙酮酒精溶液涂于患部， 可使其接近正常皮肤。 另外，二羟基丙酮复合液( 含二羟基丙酮2 0 9 ，维生素b2 0 0 m g ，加入二甲 基亚砜1 0 0 m l ) 用于治疗白癜风。治疗时在白癜风白斑处皮下注射盐酸普鲁( 皮 试阴性) ，以皮损处微微隆起为度( 1 次总量不超过1 0 # 1 ) ，然后搽二羟基丙酮复 合液，即在白斑处照射h e - n e 激光( 功率3 2 w 渡长6 3 2 8 a ，光板距白斑距离 1 0c t ) 1 0 m i n ，照射完毕后于治疗处再重搽二羟基丙酮复合液，总有效率为 9 2 5 。 1 1 2 4 用于抗病毒 二羟基丙酮做为中间体在合成相应的衍生物时，可生成具有一定抗病毒活 性的化合物，如抗艾滋病病毒等【6 】。 1 1 2 5 用于二羟基丙酮衍生物的合成 二羟基丙酮分子中含有三种官能团( 两个羟基、一个羰基) ，化学性质活泼， 广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一个重要的化学合成中间体。二 羟基丙酮作为中间体用于有机化学合成衍生物时，可用于羟醛缩合反应制取各 种手性化合物；经生物或化学法还原可得到具有光学活性的仲醇；直接用于光 化学反应中的d i e l s - a l d e r 加成反应制备糖类化合物或经进一步反应用于该类加 成反应：与卡宾发生插入反应；与2 ，2 二烷氧基环丙烷衍生物作用制备内酯； 用于制备一些桥环化合物进而开环得到众多有用的环状化合物【6 l 。 同时二羟基丙酮也是一个重要的多功能试剂，如在工业应用上，能最有效 地还原丁二烯苯乙烯复合物，能有效地催化甲醛到羟醛、羟酮的缩合反应。 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 1 1 2 6d h a 补充对机体代谢的影响 s t a n k o 和a d i b i 等【7 】首先就正常膳食中长期添加二羟基丙酮( d h a ) 和丙 酮酸对鼠机体成分的影响作了研究。结果显示，实验组鼠体重增加明显减少。 尸检发现实验鼠体脂含量比控制组低3 2 ，而两组鼠的蛋白质和水含量没有差 异。当以百分体重( g 1 0 0g ) 表示身体构成时，实验组鼠体脂含量比对照组低而 蛋白质和水含量比对照组高。另外还发现实验鼠粪便热量损失没有增加，机体 代谢率和血甲状腺素水平上升，而脂肪合成速率和血浆胰岛素浓度下降。因此 认为实验组鼠体重的减少可能是由于储存脂类消耗增加，并以热能形式散失所 致。s t a n k o 等【& 吼1 0 】还发现猪接受d h a 和丙酮酸饮食时也发生相似的身体构成 变化。 为了更详细地研究d h a 等这些化合物的抗肥胖作用，c o r t e z 等 1 1 1 就饮食 中分别补充d h a 对遗传性肥胖z u c k e r 鼠的抗肥胖作用进行了研究。结果发现： d h a 处理产生抗肥胖效果。 1 1 2 7d h a 补充有效地促进人类脂肪丢失 s t a n k o 等【1 2 】研究了d h a 补充对食用低热量膳食的肥胖女性的影响：结果 发现：对照组受试者体重和体脂分别平均下降5 6 k g 和3 5 k g ，而d h a 补充组受 试者体重和体脂分别下降6 5 k g 和4 3 k g ；而且，d h a 补充组和对照组的体重和 体脂下降都分别具有统计学上的差异。随后，s t a n k o 等【3 8 1 又对食用低热量膳食 后体重减少的肥胖女性作了研究，他们发现给予高热量且补充有二羟基丙酮膳 食的受试者体重增加速率显著的低于仅给予高热量膳食的受试者，而且两组受 试者机体的蛋白质代谢变化相似。因而s t a n k o 认为二者的混合物可以在低热量 膳食条件下加速体重减少，而在高热量膳食条件下使体重增加和体脂积聚相对 降低。0 0 , 1 1 1 1 2 8d h a 对血浆脂蛋白的影响 g o h e e n 等【”1 首先发现，接受高乙醇并含有d h a 膳食的鼠血浆中甘油三脂 水平比只接受高乙醇膳食组鼠高6 倍，而血浆总胆固醇和磷脂水平不受影响。 他们推测鼠消耗高乙醇膳食时，d h a 的补充可能促进鼠肝脂肪细胞的脂肪氧 化。然而，当鼠服用标准膳食时，d h a 补充对血甘油三脂浓度没有影响1 1 4 j 。 c o r t e z 等【j 】确切发现肥胖z u c k e r 鼠食用补充d h a 的膳食后，血甘油三脂 水平显著增加；但d h a 的补充不影响总胆固醇和高密度脂蛋白( h d l ) 胆固醇， 由此可见，d h a 在促进脂肪氧化的同时，对体内血浆脂蛋白影响不大。 1 1 - 2 9d h a 对有氧耐力的影响 长期d h a 和丙酮酸补充与运动成绩关系的研究仅见到两篇报道【1 4 “”。 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 s t a n k o 等7 1 曾观察到饮食中长期添加d h a 和丙酮酸的鼠尸体总糖元量升高。以 往的研究表明延长性亚极量运动中疲劳的发生总是伴随着糖元排空【1 6 , 1 7 。而提 高肌肉和肝糖元含量的膳食可以提高耐力成绩【1 8 】。因此长期补充d h a 和丙酮 酸对有氧耐力有促进作用。 1 2 二羟基丙酮生产方法 1 2 1 化学生产 二羟基丙酮化学合成方法主要有【19 捌：一溴丙酮酯化醇解法和l ，2 一丙二醇的 氧化或k 2 c r 2 0 7 h 2 s 0 4 氧化法等。前者反应条件温和、合成用生产设备要求低 且简单、产品收率高、产品纯度高，但主原料一溴丙酮的价格导致生产成本过 高是该方法的最大缺点；后者与前者刚好相反，反应条件及设备要求高、需要用 昂贵的金属催化剂、产品收率不高，但原料成本低并可连续化或半连续化生产。 姚日生等【2 2 】利用一氯丙酮酯化醇解法两步反应合成二羟基丙酮，研究了反 应条件对相转移催化酯化以及醇解反应蒸馏过程的影响。研究表明：四乙基溴 化铵是一氯丙酮酯化醇解法反应的良好相转移催化剂。 具体化学生产过程为： ( 1 ) 制备相转移催化合成甲酸丙酮酯：在配有冷凝管、温度计及搅拌器的 三口烧瓶中先后加入无水甲酸钠、一氯丙酮、相转移催化剂，搅拌并于9 0 0 左右 进行酯化反应，反应结束后，加入适量的水搅拌、静置分层，油层即为粗酯。 ( 2 ) 反应蒸馏制备二羟基丙酮：将由粗酯和甲醇一起加入装有玻璃耳环填 充的填料柱及柱顶冷凝管的三口烧瓶中，同时加入烧碱；水浴加热回流醇解反应 后蒸馏，反应生成的甲酸甲酯经填料柱分离不断蒸出，反应停止时分出甲醇即得 粗的二羟基丙酮。 1 2 2 微生物转化法 微生物转化法生产二羟基丙酮( d h a ) 的研究在国外历史悠久，1 8 4 8 1 8 4 9 年b e r t r a n d 发现醋酸杆菌( a c e t o b a c t e r ) 能将甘油转化为d h a 。此后人 们就开始研究甘油的代谢途径及微生物转化甘油生产d h a 的机理【2 ”。到2 0 世纪6 0 7 0 年代，国外已用生物转化法工业化生产了d h a 。 1 2 2 1 生产二羟基丙酮的微生物 微生物凡能够利用甘油，并且具有相应的甘油脱氢酶，就可以转化甘油生 产二羟基丙酮。尤其是醋酸杆菌属的氧化葡萄糖酸杆菌( g l u c o n o b a c t e r 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 o x y d a n s ) ，是适于工业生产的菌种。一般和g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s 相似的菌种 有：a t c c 6 2 1 ( d s m5 0 0 4 9 ，n c i b6 2 1 ，n r r l b 7 2 ) ，d s m2 3 4 3 ( a t c c6 2 1 h , n c i b8 0 3 6 ) ，a t c c9 3 2 4 ( n c t c4 7 3 9 ) ，a t c c2 3 7 7 1 ( n c i b3 7 3 4 ，n c t c3 7 3 4 ) 。 【2 2 l 1 2 2 2 二羟基丙酮在生物体内的代谢途径 二羟基丙酮作为一个生物代谢的中间产物，在生物的代谢中发挥着极其重 要的作用。其代谢途径主要有两条：糖酵解途径和甘油三酸酯合成途径。 ( 1 ) 糖酵解途径( e m p ) 1 2 州 进入糖酵解途径的二羟基丙酮在消耗1 分子a t p 的情况下，被二羟基丙酮 激酶( d i h y d r o x y a c e t o n ek i n a s e ) 磷酸化，生成一分子的磷酸二羟基丙酮。这一 步相当重要，是二羟基丙酮参与生物体内代谢的必要一步。磷酸二羟基丙酮在 磷酸丙糖异构酶( t d o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s e ) 的催化下迅速转化为3 磷酸甘油 醛。3 磷酸甘油醛在有n a d + 和h 3 p 0 4 时，被磷酸甘油醛脱氢酶 ( g l y e e r a l d e h y d e - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ) 所催化，形成1 ，3 - 二磷酸甘油酸。 在m f + 存在下，1 ，3 - 二磷酸甘油酸可被磷酸甘油酸激酶( p h o s p h o g l y e e r a t e k i n a s e ) 所催化，将磷酰基转给a d p 形成了3 磷酸甘油酸和a t p 。同样，在 m 9 2 + 存在下，磷酸甘油酸变位酶可以催化磷酰基从3 磷酸甘油酸的c 3 移至 c 2 ，生成2 磷酸甘油酸。在m 9 2 + 和1 v 1 1 1 2 + 存在下，经烯醇化酶( e n o l a s e ) 催 化，2 一磷酸甘油酸脱水形成磷酸烯醇式丙酮酸。紧接着，在丙酮酸激酶( p y r u v a t e k i n a s e ) 催化下，磷酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸键转移到a d p 上，从而形成 a t p 和烯醇式丙酮酸，此反应需k + 、m 矿或m n 2 + 参加，基本上为不可逆反应。 在p h 7 0 时烯醇式丙酮酸分子迅速重排形成丙酮酸，这一步反应不需要酶的参 与。所得到产物丙酮酸继续代谢，有三种去路r 2 3 a 、变为乙酰c o a ：在有氧条件下丙酮酸进入线粒体变成乙酰c o a 参加三 羧酸循环，最后氧化成c 0 2 和h 2 0 。 b 、生成乳酸：在厌氧情况下，丙酮酸接受3 磷酸甘油醛脱氢酶形成的n a d h 上的氢，在乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) 催化下，形成乳酸。 c 、生成乙醇：在酵母菌或其他微生物中，丙酮酸可经丙酮酸脱羧酶( p y r u v a t e d e c a r b o x y l a s e ) 的催化，以焦磷酸硫胺素为辅酶，脱羧变成乙醛，继而在醇脱 氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ) 的催化下，由n a d h 还原形成乙醇。 ( 2 ) 甘油三酸酯合成途径u ” 在高等动、植物组织中可以合成甘油三酸酯。二羟基丙酮经二羟基丙酮激 酶磷酸化后，生成磷酸二羟基丙酮，磷酸二羟基丙酮经扩散作用进入细胞中， 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 在僻磷酸甘油脱氢酶( g l y c e r o lp h o s p h a t ed e h y d r o g c n a s e ) 的作用下，以n a d h 为辅酶，还原为l 磷酸甘油。同样的，若以甘油为起始物，在甘油激酶( g l y c e r o l k i n a s e ) 的作用下，也可生成l 磷酸甘油。l 磐磷酸甘油中的羟基可在磷酸甘 油转酰基酶( g l y c c r o l p h o s p h a t ca c y lt r a n s f c r a s e ) 催化下和脂酰辅酶a 反应生 成溶血磷脂酸( l y s o p h o s p h a t i d i c ) ，随后又与另一分子脂酰辅酶a 结合形成磷 脂酸( p h o s p h a t i d i ca c i d ) 。磷脂酸接着被磷脂酸磷酸酶水解形成甘油二酯，此 中间产物又在甘油二酯转酰基酶催化下与第三个脂酰辅酶a 分子作用生成甘 油三酸酯。这样合成的甘油三酸酯就被贮存到动物肝脏或高等植物细胞组织中。 1 2 2 3 微生物转化甘油生产二羟基丙酮的机理 微生物转化甘油生产二羟基丙酮的机理是利用微生物体内的甘油脱氢酶 ( g l y c e r o ld e h y d r o g c n a s e ) 作用，使甘油分子结构中2 位c 上的羟基进行脱氢 反应，生成二羟基丙酮( d h a ) 。通过甘油在细胞中的代谢途径后，可以了解 甘油是怎样转化成二羟基丙酮的。 第一条代谢途径，甘油不需a t p 也不需辅酶因子n a d ，就可被细胞膜上 的甘油脱氢酶一步直接氧化成二羟基丙酮，这一过程的电子传递链由泛醌、细 胞色素0 和细胞色素o 还原性酶组成，在没有代谢抑制剂存在时，电子从基 质转移到氧，所以氧是电子及还原当量的最终接受体，并且这一电子传递的特 异链被耦合到a d p 氧化磷酸化的过程形成a t p ，所以当细胞中糖酵解途径及 羧酸代谢途径缺乏时，这一过程就是提供细胞生长及其它代谢所需能量的不可 缺少的途径，合成的二羟基丙酮因为是细胞代谢过程中所形成的有毒物质，部 分可被二羟基丙酮激酶作用转变成磷酸二羟基丙酮然后进入磷酸戊糖循环途 径，其它则被完全排出到培养液中。k c n 能抑制甘油脱氢酶、细胞色素( 0 与 c ) 氧化酶的活性，明显地抑s j j - 羟基丙酮的合成，大大降低了氧气消耗，抑 制氧化磷酸化过程，阻碍细胞生长。 第二条代谢途径，甘油进入细胞后，在磷酸激酶作用下磷酸化成甘油一3 - 磷 酸( g l y c e r 0 1 3 p ) ，然后经细胞质内甘油3 磷酸脱氢酶作用转变成磷酸二羟基 丙酮即二羟基丙酮磷酸，然后二羟基丙酮磷酸进入磷酸戊糖循环途径，为细 胞的代谢和生长提供物质和能量。这一过程需a t p ，也需辅酶因子n a d ，在正 常情况下，微生物细胞在以甘油作为唯一碳源培养基上生长时其能量来源主要 是甘油的细胞质代谢。k c n 以及抗霉素a 都能抑制细胞色素c 氧化酶的活 性，对电子传递及还原性辅酶的再生都有影响，但抗霉素a 不参与抑制细胞生 长及二羟基丙酮的合成。所有的去耦合试剂 n a n 3 ，短杆菌肽( g r a m i c i d i n ) ， 2 ，4 一二硝基苯酚( 2 ，4 - d n p ) ) 都强烈抑制甘油的细胞质代谢，抑制细胞生 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 长，促进甘油转化成二羟基丙酮。培养基中有短杆菌肽时，微生物细胞的呼吸 频率加大，二羟基丙酮合成速率提高，但培养液中却有副产物琥珀酸形成，是 琥珀酸脱氢酶还原延胡索酸所致，n a n 3 虽也能加速二羟基丙酮的合成，但却降 低细胞的呼吸活动，同时培养液中也能检测到副产物琥珀酸。在没有抑制剂与 去耦合试剂存在时，甘油既在细胞膜上代谢也在细胞质中代谢，但醋酸杆菌属 细胞生产二羟基丙酮却只有一条途径，那就是通过细胞膜上的甘油脱氢酶作用， 将甘油进一步氧化为二羟基丙酮。 1 2 2 4 影响微生物转化生产二羟基丙酮因素 微生物转化甘油生产二羟基丙酮的水平的提高，主要依赖于菌种选育和发 酵工艺( 培养基和培养条件) 的优化，这两个环节是相辅相成的。菌种选育就是 按照生产要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌株的变 异，再经过筛选获得高产突变株而达到提高发酵水平的目的；而发酵工艺的优 化是改变培养基组成及在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅拌转速等措施， 使微生物的生物合成高产基因型得到充分表达，以提高发酵产量。通过发酵工 艺优化，改进发酵培养基组成和比例，改进发酵条件，创造适合菌体生长和生 物合成的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，达到显著提高发酵产量的目的。 ( 1 ) 菌种选育：为了提高二羟基丙酮的产物浓度，必须筛选耐受高底物浓度 的菌种。本文利用u v 和6 0 c o 射线复合诱变选育氧化葡萄糖酸杆菌g 5 0 ，选育 出一株高产二羟基丙酮菌株耐甘油达到1 4 。 ( 2 ) 发酵工艺优化：为消除底物抑制和产物抑制，除了对培养过程的培养基 配比、装量、接种量等进行优化外，各种培养方式如间歇分批培养、连续培养、 静止细胞等都是获得高产过程的重要手段。 ( 3 ) 提取分离：由于二羟基丙酮含有2 个羟基，它的强亲水性使得物理萃取 和络合萃取等从水溶液中直接对其进行分离非常困难：采用真空浓缩的方法得 到的产物纯度又很低，而采用萃取耦合法则可以解决二羟基丙酮提取问题，同 时操作也相对简单。考虑到双羟基化合物可与醛类发生可逆缩醛反应而将羟基 屏蔽，得到的化合物的亲水性将大大减小，反应的同时可使用普通物理萃取将缩 醛反应的产物分离后，再通过可逆水解得到富集和纯化后的双羟基化合物。 2 2 l 1 2 3 酶法生产 甘油脱氢酶( g l y c e r o ld e h y d r o g e n a s e ，g d i - i ) 主要- 作用是催化甘油生成二羟基 丙酮( d i - i a ) 。根据催化反应中产物和电子受体的不同，g d h 可分为3 种类型： 第一种为依赖n a d + 的g d h ( e c1 1 1 6 ) ，将甘油转化为d h a ，d h a 进一 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 步磷酸化，进入糖酵解途径，作为碳源为微生物生长提供a t p 和n a d h 。这种 g d h 主要存在于各种细菌中，如a e r o b a c t e ra e r o g e n e s 、e s c h e r i c h i a c o h 、b a c i l l u s s u b s t i l i s 和c e l l u l o m o n a s s p 等。 第二种为依赖n a d p + 的g d h ( e c l 1 1 7 2 和e c i 1 1 5 6 ) ，它将甘油氧化为 d h a 或甘油醛，这类g d h 大多存在于霉菌和动物组织中【2 3 】。 第三种为不依赖辅酶位于细胞膜上的g d h ，也可将甘油转化为d h a ，在 醋酸菌中发现存在这类g d h 。 甘油脱氢酶除具有生成d h a 能力外，g d h 在医学诊断分析中也得到广泛 应用，如酶法分析血脂含量。此外，能将甘油转化为二羟基丙酮的主要微生物( 如 醋酸杆菌、柠檬菌属及梭状芽孢杆菌属) 普遍含有第一种g d h ，由于酶具有高 转化性能、副产物少等特点，可将其制为酶制剂用于工业大规模生产，因此， 近年来有关g d h 的研究与开发目益受到重视【2 9 】。 1 3 氧化葡萄糖酸杆菌生产二羟基丙酮研究进展 1 3 1 氧化葡萄糖酸杆菌及其酶系研究现状 氧化葡萄糖酸杆菌( g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ) 是一种专性好氧的g 一菌【捌，属 于醋酸杆菌科似c e t o b a c t e r a c e a e ) 。在麦芽汁琼脂和酵母膏葡萄糖琼脂平板上的 菌落呈圆形，乳白到微黄色，有时中央变褐或周围带黄色。在酵母膏葡萄糖酸 琼脂上生长良好，形成或不形成5 一酮基葡萄糖钙结晶。在含酵母膏、乙醇、c a c 0 3 的琼脂上生长良好，并产生乙酸，溶解c a c 0 3 ，平板上呈透明圆圈。其生长最 适温度2 5 3 0 ，最适p h5 5 6 0 ，在弱碱性培养基中稍有生长。 目前研究发现，氧化葡萄糖酸杆菌含有多种酶类( 见表1 - 2 ”1 ) ，有些酶可 以催化氧化一系列底物。a s a k u r a 及b u c h c r t1 3 2 , 3 3 等学者研究发现，gd 砂出船 中的葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酮酸脱氢酶和醛糖脱氢酶都能够作用于多种化合物， 而且go x y d a n s 中几乎所有的葡萄糖脱氢酶活性及一半的葡萄糖酮酸脱氢酶活 性来源于l 一山梨糖l 一山梨酮脱氢酶。同时大多数的此类酶位于细胞膜上， 只有少数在细胞浆中，因此在催化底物反应的过程中无需底物和产物的透膜运 输，大大的提高了其应用价值。 目前，氧化葡萄糖酸杆菌广泛应用于二羟基丙酮、维生素c 、d 葡糖酸等 工业化生产，具有非常高的工业价值。而深入研究氧化葡萄糖酸杆菌分子特性 及关键酶功能基因，对构建高效的基因工程菌，提高发酵转化率，降低成本， 实现经济效益的大幅提升具有非常重要的意义。当前，氧化葡萄糖酸杆菌酶学 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 研究重点主要集中在氧化甘油合成二羟基丙酮、氧化d 山梨醇，l 广山梨糖和 d 一葡萄糖合成维生素c 前体等具有工业价值的代谢途径中的有关酶裂3 4 1 。 表1 - 2 各种go x y d a n s 菌株酶学特性及分布位置 近几年，日本科学家对氧化葡糖酸杆菌中数十种关键酶基因进行了克隆和 测序，并分别在大肠杆菌、醋酸杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌中得到了表达，构建 了几株有发展前景的基因工程菌【划。 1 3 2 发酵底物 1 3 2 1 碳源、氮源 g l u c o n o b a c t e rd n 妇邶转化甘油往往分初级、次级两次发酵。初级发酵是培 养足量的菌体用于次级发酵来转化甘油生产二羟基丙酮。g l u c o n o b a c t e r o x y d a n s 利用的碳源是单糖或者食糖精，尤其是山梨醇，甘露糖醇，果糖或者 葡萄糖，食糖精，其中山梨醇发酵效果最好，但工业利用价值不高。在纯粹的 菌体生长阶段即初级发酵阶段，要尽量避免甘油作为一个能量来源和碳源，可 以防止二羟基丙酮的形成。因为二羟基丙酮产物的存在会抑制菌体的生长，影 响次级发酵生产二羟基丙酮。培养基中的糖源的含量可以在5 0 3 0 0 e 扎之间， 最适的量在1 0 0 - 1 5 0 9 l 之间 3 5 - 4 1 l 。 初级培养阶段的培养基出于特定的目的要有酵母膏作为复杂的氮源，然而， 其它已知的氮源，诸如氨基酸、玉米提取液或者富含氨基酸的酵母提取物，都 能做为氮源用于发酵生产。大量实验结果显示酵母膏的含量在1 - l o e c t , 之间， 最适宜在3 - 6 9 l 之间。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 0 页 1 3 2 2 甘油初始量 在微生物的转化甘油合成二羟基丙酮整个过程中，一个决定性的角色是： 甘油的初始量和二羟基丙酮的产量。因为如果该混合物在发酵液中占据较大的 浓度的话，就会影响菌体的生长和再利用菌体的生产性能( c l a r e te ta 1 c u r r e n t m i c r o b i 0 1 1 9 9 2 ，2 5 ( 3 ) ：1 4 9 ) 。在生产过程中，由于甘油初始量越高，积累的二羟 基丙酮越高，使得菌体繁殖蒙受不可逆转的破坏，因此，在经过大约2 0 到3 0 个小时的一段生产时期之后，他们就没有生长的能力，或者生长能力受到很大 程度的限制，而必须从实际的生产过程中消除。所以甘油的初始量一般不能过 高，不然会使菌种无法正常转化甘油生产二羟基丙酮。发酵液中集中转化甘油 的量一般为5 2 0 ，不进行补料发酵。 1 3 3 发酵工艺 g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s 转化甘油生产二羟基丙酮的p h 适宜范围大约在 3 8 4 8 之间，而4 0 - 4 5 之间更适宜。p n 的调节通常是由一种钙氧化物来解决， 而且低浓度钙离子的存在，例如以碳酸钙的形式，促进甘油脱氢酶转化甘油生 产二羟基丙酮。钙离子的浓度在1 - 5 9 l 之间较好。 发酵温度在2 8 3 4 范围内，最适的是3 0 - 3 2 。发酵中用一般是直接通入 空气或者氧气【2 2 3 邸7 ，4 2 】。 总之，细菌g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s 培养基中常用的诸如葡萄糖，山梨醇， 酵母膏，玉米提取物在微生物合成二羟基丙酮的期间浓度在1 一1 5 之间，p r i 在5 点和7 点之间变化。平均起来g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s 一次培养生产二羟基 丙酮为1 0 1 5 0 9 l ，培养时间为2 0 h - 1 5 0 h 。这些均依赖于发酵类型( 发酵过程和 发酵类型) 。 1 3 4 发酵产物提取 国内外报道有关二羟基丙酮发酵产物提取方法有：直接浓缩结晶，溶剂萃 取、膜分离等。 文献 4 3 】中利用直接浓缩结晶法，在2 l 发酵溶液中加入2 2 9 碳酸钡，搅拌 1 5 m i n 后，使整个反应体系通过助滤剂( 如活性炭、阳离子树脂等) 除去所有 的菌体、色素和蛋白质等杂质，最后再通过强阳离子交换树脂收集洗脱液，在 真空下直接浓缩结晶后得到1 7 6 9d h a 产物。但由于要反复洗脱，生产周期过 长。 文献【4 4 】中是通过溶剂萃取法分离二羟基丙酮，在发酵液中加入阳离子酰 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 l 页 胺，考虑到双羟基化合物可与醛类发生可逆缩醛反应而将羟基屏蔽，得到的化合 物的亲水性大大降低反应的同时可使用普通物理萃取将缩醛反应的产物分离 后，再通过可逆水解得到富集和纯化后的双羟基化合物，最后通过膜分离反应器 l o o 减压分离，蒸干后得到二羟基丙酮结晶。 冯屏等利用膜生物反应器( m b r ) 连续发酵制取二羟基丙酮【4 5 】，通过膜的选 择性滤过作用。及时引出产物，使菌体和产物d h a 随时实现分离，