（化学工艺专业论文）魔芋葡甘聚糖改性与固定化脲酶应用研究.pdf

硕士论文魔芋葡甘聚糖改性与固定化脲酶应用研究 摘要 本文主要研究了k g m 改性及应用于脲酶固定化。分别研究制备出理海绵状k g m 载体，交联k g m 载体及k g m 海藻酸钙微球载体，分析讨论了固定化前后脲酶酶学性 质的变化。光镜，扫描电镜和f t - i r 红外光谱对载体结构的表征结果为实验提供了理论 支持。实验结果如下： 海绵状载体固定化脲酶，经低温冷冻处理后再进行不溶处理得到的载体呈海绵弹性 状，载体机械强度，固定化酶的储存稳定性及重复使用性有很大的提高；固定化酶对p i - i 更加敏感，在7 5 时活力非常突出；与游离脲酶相比对底物具有更好的亲和力。 交联k g m 固定化脲酶具有很好的储存稳定性，储存在4 。c 冰箱中一个月活力损失 较小，lo 0 9 固定化脲酶装柱连续使用三天( 催化10 0 0 m 1 0 3 m o l l 尿素0 0 5 m o l l p h 7 0 磷酸盐缓冲溶液) 后，保鲜膜密封储存于4 。c 冰箱中，四个月后活力仍保持在4 0 左右。 k g m 海藻酸钙微球载体固定化脲酶活力可高达8 9 u g ；通过改变k g m 、海藻酸钠 溶胶比例、壳聚糖浓度可以调节脲酶缓释的速度以及载体机械强度。此方法制备工艺简 单，条件温和，载体形态规则均一，适合从蛋白质活性药物，酶类到疏水合成药物的包 埋固定，较适于规模生产。 关键词：k g m ，戊二醛，交联，环氧氯丙烷，海藻酸钠，壳聚糖，脲酶固定化 a b s t r a e t硕i ：论文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h em o d i f i c a t i o no fk g ma n da p p l yt h e mi nu r e a s ei m m o b i l i z a t i o nh a v e b e e nr e s e a r c h e d c o n c e n t r a t eo ns p o n g ek g mc a r r i e r , c r o s s - l i n k i n gk g mc a r r i e ra n d k g m a l gm i c r o b a l l o o ns p h e r e b e s i d e st h e s e ，p r o p e r t i e so ft h ef r e ei l l e a s ea n di m m o b i l i z e d u l e a s ew e r ea l s od i s c u s s e d t h ec h a r a c t e r i z a t i o n sb yl i g h tm i c r o s c o p e ，s e ma n df t - i r p r o v i d ea c a d e m i cs u p p o r t s t h ec o n d u c to fl o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n tb e f o r ei n f u s i b i l i t yt r e a t m e n tm a d et h ec a r r i e r s h o wa l la p p e a r a n c eo fs p o n g ea n ds p r i n g i n e s s i t s p r o p e r t i e ss u c h 弱m e r c h a n i ci n t e n s i t y , s t o r a g es t a b i l i t ya n du s i n ga b i l i t ya r ea l li m p r o v e d a n di tb o a s t sah i 曲s e n s i t i v i t yi nt h e c h a n g eo fp ha n dh a sab e t t e rc o m p a t i b i l i t yo ns u b s t r a e t t h ec r o s s - l i n k i n gi m m o b i l i z e dh i e a s ee n j o y sg r e a ts t o r a g es t a b i l i t y , a f t e rs t o r e di n4 0 c f o ra b o u t3 0d a y s ，i t s e n z y m ea c t i v i t ya p p e a r sl i t t e rl o s e w h e nw ei n s t a l l10 0 9i m m o b i l i z e d u r e a s eo ft h i sl ( i n di n t oap i l l a ra n du s ei tt oc a t a l y s eu r e a - p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o nf o r3 d a y si nr u n , t o t a l l yc a t a l y s e10 0 0 m lu r e a - p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n , a n dt h e ns e a l e di tw i t h f i l m ，s t o r e di ti no cf o ra r o u n df o u rm o n t h s ，a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yr e m a i n s4 0 k g m - a l gm i c r o b a l l o o ns p h e r ei m m o b i l i z e du r e a s eb o a s t sg o o de n z y m ea c t i v i t yo v e r 8 9 u g w ec a na d j u s tt h ee n z y m er e l e a s er a t ea n dm e r c h a n i ci n t e n s i t yt h r o u g hc h a n g i n gt h e p r o p o r t i o no fk g m ，a l gs o la n dt h ec o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n t h em e t h o di se a s y - c o n d u c t ， m i l d - c o n d i t i o n ，f i r i n gm a n ys u b s t a n c e s i m m o b i l i z a t i o n f r o ma c t i v e p r o t e i nm e d i c i n e ， e n z y m e t oh y d r o p h o b e ，a n da v a i l a b l ef o rm a s s i v ep r o d u c t i o n k e yw o r d s ：k g m ，g l u t a r a l d e h y d e ，c r o s s - l i n k i n g ，e p i c h l o m h y d r i n ，a l g i n a t e ，c h i t o s a n ， u r e a s ei m m o b i l i z a t i o n n 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学位论 文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布过的 研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的材料。 与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明确的说 明。 研究生签名：粒 矽g 年多月确 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 逮壅 矽g 年6 月镌曰研究生签名：绛丝矽g 年易月镌司 硕士论文魔芋葡甘聚糖改性与固定化脲酶应用研究 第一章前言 1 1 魔芋葡甘聚糖的性质及应用 魔芋( k o n j a e ) 是一种多年生的草本植物块茎，属于天南星科魔芋( a m o r p h o p h a l l u s b l u m e ) 植物，全世界有1 1 5 种【l 】，主要生长在东南亚亚热带地区的山地。在我国分布 十分广泛，主要栽培于西南部及长江中下游一带，资源丰富。魔芋葡甘聚糖是魔芋块茎 的提取物，1 9 8 6 年农业部把魔芋认定为我国重要的特种经济作物之一【2 】。 魔芋葡甘聚糖( k o n j a cg l u c o m a n n a n ，简称k g m ) 是继淀粉和纤维素之后，一种 较丰富的可再生天然高分子资源，具有生物可降解性，k g m 水溶胶具有高粘度、增稠、 凝胶和成膜等多种特性：k g m 是一种优良的膳食纤维，可用于预防和治疗高血压、高 血脂、心血管病等病症，已成为重要的食品添加剂和保健食品原料。在化工、环保及石 油钻探等领域也有重要用途【3 】。目前，对于k g m 的研究大多的集中在其化学结构、共 混效应、膳食营养方面的价值等，研究最为热门的是k g m 成膜特性。除此之外，k g m 在固定化领域作为固定化载体还是有一番作为的。 1 1 1 魔芋葡甘聚糖的化学结构及研究进展 k g m 是以聚集念存在于魔芋球茎异细胞中，其分子间的相互作用力主要是氢键。 k g m 是由d 葡萄糖和d 甘露糖以d 1 ，4 糖苷键连接起来的大分子杂多糖，二者比例约 为1 ：1 6 ，据液相色谱测定结果，糖残基每1 9 个就有一个乙酰基以酯的形式与主链相结 合，若以3 8 个糖残基作为一个重复单元，结构简式可表示为【4 】 - ( g m - m - m - m - g - m 好- l 婚m - m 乇m 1 以m g - m g - m - h i - g - m - g g - m m m - m g g - m - m 、一 占 上占 1 1 a c 一占 m g = 葡萄糖残基，m = 甘露糖残基，a c = 乙酰基c h 3 c 0 - ，x _ - 聚合度 图1 1 魔芋葡甘聚糖结构简式 f i 9 1 1t h es t r u c t u r es h o r tf o r mo fk g m 国外对k g m 一级结构和晶型结构研究较多。加藤义和、中岛敏彦、s i m i t hf 和y u i t 等研究结果存在分歧，对k g m 乙酰基数量尚无定论，但已研究了k g m 链构象【5 】， 分析了k g m 的螺旋和晶体结构。日本的前木尾健冶认为在碱的作用下，k g m 上的乙 酰基被脱除，变成裸状，分子间则形成氢键而产生部分结晶作用，以这种结晶为结点形 第一章前言硕扛论文 成了网状结构体即凝胶。 1 1 2 魔芋葡甘聚糖的物理特性 国内对于k g m 的研究集中在其流变性、凝胶性能、乳化性及与其他大分子复配等 方面【6 8 】，如k g m 与其他天然高分子共混复配产生协同增效作用或加入能水解为多羟 基的基团使之形成凝胶【9 , 1 0 。 ( 1 ) 流变性：k g m 是一种中性多糖，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机 溶剂。其水溶液为假塑性流体【l l 】。k g m 水溶胶的表观粘度与剪切速率成反比，并随温 度的上升而逐渐降低，冷却后又重新升高，但不能回升到加热前的水平。水溶胶在8 0 以上较不稳定，于1 2 0 下保温o 5 h 时，粘度约下降5 0 。 ( 2 ) 增稠性：k g m 相对分子质量大、水合能力强和不带电荷等特性决定了其具有 优良的增稠性，并且由于k g m 系非离子型增稠剂，受体系中盐的影响相对很小。 ( 3 ) 凝胶性：k g m 具有独特的胶凝性能，在不同条件下可形成热可逆( 热不稳定) 凝胶和热不可逆( 热稳定) 凝胶。k g m 凝胶的热固特性是k g m 热成型的基础。k g m 凝胶进行透析除碱后仍可保持凝胶结构，这是k g m 薄膜抗水、耐水溶解的原因。 ( 4 ) 水溶性：k g m 易溶于水，可以吸收相当于其自身体积8 0 1 0 0 倍的水。 1 2 魔芋葡甘聚糖在各领域里的应用 1 2 1 医药领域的应用 1 2 1 1 医药保健产品 在医学保健方面，k g m 能够降解血液胆固醇，包括l d l 胆固醇( 低密度脂蛋白胆 固醇) ，使l d l 颗粒变得稀薄，降低危害性。葡甘聚糖还具有降低血糖，增加胰岛素敏 感度，降低血清胆固醇，其降解血脂效果优于其它的膳食纤维，有利于防止和缓解心血 管疾病【1 2 1 。 1 2 1 2 亲和层析载体 k g m 经过含硼氢化钠的n a o h 处理后，用c u 2 + 鳌合来纯化猪血s o d 。此方法的特 点是电泳均一，比活、纯化倍数高，但抗碱性比s e p h a d e x g 2 0 0 稍差【1 3 】。另外，w a k i t a m 1 4 1 、 t o m o d a t 1 5 】用k g m 作为亲和层析载体分别分离凝血因子和胰蛋白酶的报道。 1 2 2 生物材料领域应用 1 2 2 1 缓释胶囊 利用k g m 的成膜性、凝胶性、可食用特性，可将其制作成微胶囊【1 6 】，此应用在食 品加行业中相当普遍。由于其的良好生物相容性，k g m 微胶囊也广泛地应用于药物缓 释方面。张小菊，姜发堂等【1 7 1 实验将k g m 进行羧甲基化改性，其溶解性、抗潮性、成 2 硕士论文 魔芋葡甘聚糖改性与固定化脲酶应用研究 膜性能等有明显地改善，可用作空心胶囊囊材。 1 2 2 2 固定化材料 崔汉钧【1 8 】等将k g m 经不溶性处理和化学修饰活化作固定化载体，用共价键合法固 定化环糊精葡基转移酶( c g t a s e ) 。其中，用表氯醇己二胺戊二醛修饰活化的k g m 载 体固定化效果最好。偶联蛋白质多在2 0 m g g 载体以上，酶活5 0 0 9 0 0 u g 载体之间，最 高可达5 2 m g g 和1 3 0 0 u g 载体。以淀粉为底物连续反应，转化率均在9 0 以上。此方 法制备的固定化酶载酶量高、化学性能机械强度好、载体制备简单、载酶量高、制备工 艺简单、成本低。 1 2 2 3 人工组织工程材料 k g m 广泛用于功能性材料方面，如人工水晶体、手术缝合线、凝胶缓释材料、色 谱填料、凝胶骨架等。这些功能特性可能与k g m 分子形貌、构象及分子大小密切相关 【l9 1 。k g m 溶胶粘度会随着分子量的下降而显著下降，分子中乙酰基团含量与k g m 流 变性有密切关系【2 0 ，2 1 1 。彭世军等冽通过研究表明由魔芋加工而成的生物膜是一种对烧伤 创面疗效好、见效快、无毒副作用的经济实用新型理想敷料。 1 2 3 精细化工产品 由于k g m 具有良好的生物相容性、生物可降解性和吸水性等，加入甘油、防腐剂 可以制成对皮肤好的具有润滑保湿作用的美容化妆产品【2 3 1 。用k g m 制备的化妆品对皮 肤有较好的保水作用，防止皮肤水分散失以及避免阳光对皮肤直接照射。 1 2 4 环保领域应用 1 2 4 1 生物降解膜 k g m 具有良好的成膜性，但纯k g m 膜耐擦洗，耐水性较差，将k g m 改性后制成 薄膜则有较大改善。将魔芋精粉通过化学改性制成生物降解材料，再与聚乙烯共混，可 研制出聚烯烃树脂复合双降解材料，生产出各种绿色环保产品。由于高分子葡甘聚糖的 引入，可增加材料的湿强度，提高膜中淀粉的添加量，从而提高膜的生物降解性。 1 2 4 2 环保涂料 一般传统型涂料中甲醛的含量往往超标，对人体健康很有害处。k g m 具有高膨胀 性和高粘度使其可以代替涂料，油漆中粘结剂，无毒，无污染，无刺鼻气味，对人体的 健康没有伤害，是一种新型的环保建筑装潢材料。 1 2 4 3 废水处理絮凝剂 k g m 凝胶的缓释作用，可以将包埋在其中的杀菌剂缓缓释放出来，应用于城市废 水的处理。利用改性的魔芋葡甘聚糖，可制得类似“章鱼 结构的高效非离子、阴离子、 阳离子型絮凝剂，可替代有副作用的铝系列与铁系列絮凝剂，用于废水处理和净化。不 3 第一章前言 硕l ：论文 仅克服了金属二次污染，而且能够防止废水管道藻类的生长，完全符合保护水资源，维 护生态环境和人类健康【2 4 】的要求。 1 2 5 食品领域应用 1 2 5 1 可食性食品保鲜膜 尉芹等【2 5 2 刀利用改性k g m 作为保鲜剂保鲜草莓、葡萄、柑橘，取得良好成果。制 成的保鲜膜对果蔬有明显的保鲜作用，膜通透性好、强度大，既可防止水分蒸发，降低 病菌感染机率，又可抑制果蔬的气体交换，减缓呼吸强度，减少营养物质的损耗，保持 原有风味，并且对人体无害，也不污染环境。 1 2 5 2 食品添加剂 美国在1 9 9 6 年出版的美国食品添加剂规范 f c c i v 中，已明确接纳魔芋精粉和 魔芋胶作为食品添加剂。魔芋胶的胶粘性以及其溶液的非牛顿流体特性，促进了浆料的 老化过程。将其增加到面制食品中，其成品膨胀度、柔度、保水保鲜性能都比未增加的 好，赋予食品更好的色、香、味等。在凝胶食品中k g m 大分子建立网络结构，其持水 量为魔芋胶本身重量的3 0 一- 1 5 0 倍，因此可生产果冻【2 8 】。魔芋葡甘聚糖还可制成水晶软 糖【2 9 】、仿生食品【3 0 1 、酸奶【3 1 1 、罐头、果剖3 2 1 、冰淇淋雪糕的冰壳外套等。 1 3 脲酶的特征及应用价值 脲酶( e c 3 5 1 5 ) 又名尿素酶，系统命名为酰胺水解酶( u r e aa m i d o h y d r o l a s e ) ， 是一种含有镍离子的金属酶。其分子量约为1 2 0 0 0 0 - 1 3 0 0 0 0 ，p h 为6 0 - 8 0 时活性最 高。在水存在的条件下，将尿素分解为氨和二氧化碳，最大水解速度为2 0 - - - , 4 0 m m o l 尿素h m g 酶蛋白，1 0 倍于无脲酶催化时此反应的速度【3 3 】。 脲酶( u e a s e ) 是一种来源广泛的植物蛋白酶，从低级微生物( 大多数的细菌、放 线菌、真菌等，已报道的细菌就有2 0 0 多种【3 4 】) 到高等植物( 豆科以及西瓜，西葫芦等 葫芦科植物的种子中含量特别高) 都能分离出脲酶，实际应用主要来源于豆类植物，如 刀豆脲酶、黄豆脲酶等。脲酶结晶首次由s u m n e r 从刀豆粉中提取而得到【3 5 】。目前所用 的脲酶均由刀豆脲酶提取，鉴于国内巨豆来源困难，为了解决脲酶国产化问题，已完成 了从黄豆( g l y c i n e m a x ) 中提取脲酶的技术工艺的研究【3 6 】，并已获得冻干黄豆脲酶制品。 虽然黄豆中脲酶含量较高，但其中蛋白质含量高达3 2 4 0 ，提纯难度较大，且提纯 之后脲酶的活性损失较大。由于本课题所做固定化实验对酶纯度要求不高，所以所用脲 酶为实验室从黄豆中提取的粗提液。 尿素的处理经常出现在工农业生产及科研、医疗卫生等领域，例如尿素废水处理， 血清尿素测定，食品中尿素含量测定等。但是至今为止尿素的测定还没有特效专一的分 析方法。由于脲酶是催化尿素分解的特效专一性水解酶，脲酶目前已作为分析检测尿素 4 硕士论文魔芋葡甘聚糖改性与固定化脲酶应用研究 的专一性试剂，如国家卫生部推荐采用脲酶b e r t h e l o t 法测定血清尿素。 1 4 课题的意义及研究价值 k g m 作为一种优良膳食纤维，可以预防治疗高血压、高血脂、心血管病等，并成 为重要的食品添加剂和保健食品原料。在化工、环保及石油钻探等领域也有重要用途。 近年研究人员采用多种生物学手段( 如酶解等) 、物理学手段( 如共混等) 以及化学手 段( 如交联，酯化等) 对其进行了改性，很好地改善了k g m 成膜性、抗水性，使k g m 具备了作为固定化材料的性能条件，为其在固定化领域应用奠定了基础。 考虑到脲酶催化尿素专一性和在医学检测方面的应用，实验选择脲酶作为固定化 酶。但由于游离酶活力不易保持、难于重复利用、长期贮存，容易变性和失活，反应后 难以分离回收，重复使用等缺点，使其在工业领域的应用受到一定限制。而固定化技术 解决了游离酶的缺点，从而提高酶的工业利用价值，所以工业用酶多为固定化酶。 目前，脲酶的固定化载体材料选择比较广泛：壳聚糖等天然多糖类载体；二氧化硅 等无机吸附类材料；聚乙稀等聚合物载体；以及蚕丝素蛋白、磁性微球等其他新型载体。 综合上述的k g m 、脲酶特性及研究背景隋况，本课题研究k g m 改性及固定化脲 酶应用是有意义且具有理论支持的。因为至今未有人涉足利用k g m 固定化脲酶的先例， 本实验主要是尝试探索研究通过k g m 的改性，将其变成水不溶性；改善载体表面结构， 为酶固定化提供良好的结构条件；在保证固定化酶活力的基础上延长储存稳定性和使用 稳定性，更大程度上满足工业生产的需要。另外，探索制备生物可降解固定化载体，即 通过与其它胶体复配，用于内服药物载体材料或人体器官组织材料。通过比较游离脲酶 和固定化脲酶酶学性质，总结评价各改性载体的优劣。此k g m 载体的合成制备为固定 化脲酶材料提供了新的选择，并为其在其他应用的深入研究方面起一定前导作用，并且 充分利用了我国丰富的魔芋资源。 1 5 魔芋葡甘聚糖在固定化领域里的应用研究 1 5 1k g m 的改性以符合固定化材料的要求 为改善k g m 性能，近年来采用生物学、物理学以及化学手段对其进行了改性。 1 5 1 1k g m 的脱乙酰基改性 k g m 在温和碱性条件下脱掉乙酰基团，脱乙酰后k g m 有利于分子间羟基的氢键 相互交联及成膜性能的改变。张升掣明取适量k g m 在5 0 c 搅拌溶胀一定时间，加 n a 2 c 0 3 调p h ，继续搅拌溶胀一定时间后用玻璃棒均匀地涂于玻璃缸内，在5 0 下烘干 成膜，制得改性膜。制得改性膜具有较好强度，抗水性以及耐洗刷性能。n a 2 c 0 3 能有 效除去k g m 中的乙酰基团，当k g m 溶胶浓度为l ，p h 为1 0 0 ，成膜效果最佳。 5 第一章前言 顾1 ：论文 1 5 1 2k g m 交联改性 k g m 分子中有多个可反应的羟基，可与多种交联剂发生交联反应。k g m 与具有两 个或多个官能团的化学试剂起反应，使k g m 分子羟基间联结在一起，所得的衍生物为 交联k g m 。k g m 交联形式有酰化、酯化和醚化交联等。目前在工业上应用于多糖的交 联剂不多，主要有三偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三氯氧磷以及双官能团的醛类物质。 邹群【3 8 】取纯化魔芋葡甘聚糖2 0 9 ，加入2 5 0 m l 三颈烧瓶中，置3 0 c 恒温水浴中， 加入蒸馏水7 5 m l ，氢氧化钠o 3 9 ，搅拌溶解；加入8 m l 环氧氯丙烷，电动搅拌4 - - 2 0 h ； 反应毕，抽滤，同时以蒸馏水反复洗涤，至滤出液呈中性，收集产物即是交联魔芋葡甘 聚糖水凝胶。 1 5 1 3k g m 酯化改性 将魔芋葡甘聚糖与酸或酸酐等在一定条件下反应，即可生成相应的酯化产物。有关 魔芋葡甘聚糖的酯化改性研究我国进行的比较早，主要有葡甘聚糖与磷酸盐、水杨酸钠、 苯甲酸、马来酸酐、没食子酸、醋酸、黄原酸的酯化改性。 胡慰型3 9 】等研究k g m 马来酸酐酯化和磷酸酯化改性。酯化后的k g m 耐剪切、酸 碱的性能显著提高，特别是乙酰化k g m 具有良好的粘度稳定性、较高的胶液透明度、 很好的粘附纱线特性及高的抗张强度和柔韧性。 1 5 1 4k g m 氧化改性 氧化魔芋葡甘聚糖与k g m 相比，颜色洁白，糊液粘度低且稳定性、透明性和成膜 性好，原理为k g m 经氧化作用而引起解聚，结果产生低粘度分散体并引进羰基和羧基， 使其糊液粘度稳定性增加。采用不同的氧化工艺、氧化剂可制得性能不同的氧化k g m ， 常采用的氧化剂有双氧水、过醋酸、次氯酸钠、高锰酸钾等。影响氧化k g m 因素较多， 例如有：氧化剂的用量、反应温度、p h 值、糊液的浓度等。 1 5 1 5k g m 接枝共聚改性 k g m 分子链上含有大量的羟基，伯羟基、仲羟基等处皆可以作为接枝点，可方便 地与丙烯腈、丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯等单体进行接枝共聚反应，形成接枝共聚魔芋 葡甘聚糖。不同的接枝单体、接枝率、接枝频率，可以制得各种具有独特性能的产品， 可分为吸水性接枝共聚物、热塑性高分子接枝共聚物等。 邓霄等【4 0 】研究结果表明，辐照法魔芋胶接枝丙烯酸的最佳条件是：辐照剂量 5 0 2 k g y 、中和度6 0 、最佳单体与魔芋胶的比( 体积质量比) 5 ：1 ，充氮无氧时，吸水 率达5 4 0 倍，接枝率达7 9 ，温度对接枝率和吸水率几乎没有影响。共聚反应产物内聚 性、硬度和胶粘性随辐射剂量增加而增加，黏度随辐射剂量的增加而降低。 1 5 2k g m 在固定化领域的具体应用实例 陈家任等实验魔芋多糖固定化酿酒酵母，其细胞活力、生长速度、生物量、出芽 6 硕士论文魔芋葡甘聚糖改性与周定化脲酶应用研究 率明显低于自然细胞，而细胞内聚多糖含量、细胞对物质的消耗速度、乙醇生成速度、 乙醇脱氢酶活力均高于自然细胞。说明固定化酿酒酵母细胞处在一种不同于自然细胞的 维持代谢的生理状态。 陈家任，贾成副4 2 1 研究了魔芋多糖载体固定化微生物细胞和酶的方法，以魔芋精粉 为原料，经碱溶胀，煮沸，冷冻泡沫化和不溶性处理，制备各种外形规则的微孔凝胶载 体，并置于苯醌溶液或四氯化钛溶液中经共价修饰后固定微生物细胞和酶。特点是载体 无毒、来源方便、价格便宜、载体制备工艺简单、外形规则而有弹性、机械强度好、化 学稳定性好、耐压耐高温、固定化的过程简单，效果好。 p e r o l sc 等【4 3 】人用k g m 冷溶胶包埋水解蛋白酶。将魔芋溶解后加热发生脱乙酰反 应形成凝胶，然后将凝胶放入冰浴中4 h 形成冷凝胶。4 0 m l 酶魔芋溶液迅速倒入装有菜 油的烧杯中，在7 0 0 r m i n 转速下搅拌1 5 m i n ，将油包水微乳液相分散。接着加入9 0 的 热菜油，可得魔芋凝胶，在5 0 反应2 0 m i n 后冷水浴冷却到2 0 。将油包水微乳液悬 浮物用蒸馏水冲洗，得到固定化酶的凝胶。结果表明，蛋白酶b 5 0 0 大约保持了5 0 的 水解蛋白活性，损失很少，非常适合实际生产。 岳蔚然【删实验出一种卡拉胶魔芋多糖复配胶固定化微生物载体，以及该载体在制 备核苷三磷酸如腺苷三磷酸( a t p ) 、鸟苷三磷酸( g t p ) 、胞苷三磷酸( c t p ) 和尿 苷三磷酸( u t p ) 等生产过程中的应用。魔芋多糖复配胶固定化微生物不仅具有明胶戊 二醛固定化微生物的特点，而且能避免单独使用卡拉胶的缺点。具有固定化微强度高、 弹性好、不易破碎、有利于长期反复使用、不易被微生物分解、底物转化率高和产品纯 度高等优点。 c h e na n dz h a n g 【4 5 】研究使用角叉胶和魔芋葡甘聚糖对细胞进行包埋。包埋材料由 4 0 - 9 0 角叉胶和6 0 1 0 k g m 组成，将上述材料在高于8 0 的温度下溶解于水中， 冷却后加入需要包埋的细胞，搅拌，滴加到2 3 的k c l 溶液中。用这种方法还可以对 e s c h e r i c h i ac o l i ，酵母，b i f i d u s 细菌等进行包埋操作。 w a n ga n dh e 4 6 1 报道一种海藻盐，魔芋葡甘聚糖和壳聚糖的混合凝胶小珠可以用来 作控制药物释放的载体。红外光谱的检测发现，加入k g m 后在a l g 和k g m 之间存在 着微弱的氢键和静电作用。 许秀真等【4 7 】总结利用k g m 凝胶包埋杀菌剂，由于k g m 凝胶具有缓释作用可以将 包埋在其中杀菌剂缓缓地释放出来，从而可以处理城市污水。同时还可以利用k g m 的 絮凝作用对污水进行沉淀，减轻目前水处理中存在的困难，淡水资源的压力。 n u s s i n o v i t c h t 4 8 】发明出一种包含热稳定的水状胶质膜的热稳定小珠。这种膜可以包 埋酶、细胞、生物制剂、医药制剂或其混合物液体。魔芋葡甘聚糖在这里被用作水状胶 质。这种胶囊产品可以包住液体并且在温度范围为2 0 到9 0 的范围内不会裂开。 7 第一章前言硕士论文 1 6 脲酶固定化载体及其固定化方法的研究现状 1 6 1 固定化的研究 1 6 1 1 固定化的方法 固定化酶技术是2 0 世纪6 0 年代发展起来的，即是指利用物理吸附或化学结合法将 自由酶固定到载体上以提高酶的操作稳定性，并且可以反复回收利用酶。目前其应用已 经遍及工业、医学、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发等诸多方面。依据酶的 性质及用途，可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法四种。由物理吸附法获得的 固定化酶重复使用次数不高，应用受到限制，而通常使用的交联法或共价键合法在解决 酶的稳定性，保持酶催化活性方面还存在许多困难。 1 6 1 2 固定化载体材料的性能要求 要使生产出来的固定化酶有很高价值，载体的选择尤其重要，虽然现在人们还没有 找到一种非常适合的材料作为酶的固定化载体，但是已经归纳总结出相关的性能条件， 以便于我们在选择时作为参考【4 0 ，5 们。 ( 1 ) 功能基团一般来说，载体材料带有能与酶发生反应的官能团，如带有o h 、 c o o h 、c h o 等反应性的基团，可以大大的提高载体材料与酶之间的结合力，同时还 可以提高固定化酶的操作性和稳定性； ( 2 ) 渗透性和比表面积应选择具有大的比表面积和多孔的结构的载体，这样结构 的载体材料可以与酶相交联，提高固定化率； ( 3 ) 水溶性一般来说载体材料要求不溶于水，这可以防止酶失活受到污染； ( 4 ) 机械刚性及稳定性由于固定化酶最大的一个特点是要重复使用，这就要求 载体材料的机械刚性和稳定性都非常的好； ( 5 ) 对微生物的抵抗性在长时间使用中，载体材料必须要防止微生物的降解作 用，对微生物抵抗性好的载体可以长时间使用； ( 6 ) 粒径大小一般来说，材料的粒径越小，其比表面积就越大，与自由酶固定 化程度就越高，固定化率也就越高。 ( 7 ) 重复使用性此性能越高，产品生产成本的成本则可以大大降低。 ( 8 ) 安全性载体材料的选择应符合安全的条件，在此基础上，尽可能地选择天 然，无毒性的，符合现在环境保护的材料作为载体材料。考虑到这一点，天然多糖资源 则成为了首选。 此外，还要求载体材料的经济性、来源丰富等，以便能够在工业中进行大批量的 生产使用。 硕士论文魔芋葡甘聚糖改性与固定化脲酶应用研究 1 6 2 常用脲酶固定化载体材料 1 6 2 1 壳聚糖及衍生物作为载体 甲壳质是节肢动物，如虾、蟹及昆虫等外壳的重要组成部分，学名为p ( 1 ，4 ) 2 乙酰 氨基2 脱氧d 葡萄糖，来源非常广泛，储量仅次于纤维素。壳聚糖是甲壳质n 脱乙酰 基的产物，是一种天然直链状氨基多糖，结构是有许多- n h 2 ，o h 等反应基团，对蛋白 质具有较高的亲和性，提供了易与脲酶共价相联的活性位点，又可以络合金属离子使脲 酶免受抑制。且无毒、生物可降解，价格低廉易得，倍受青睐。 马晓莉1 5 l j 等研究利用壳聚糖包埋脲酶，将1 0 9 壳聚糖溶解于1 0 0 m 1 0 8 醋酸溶液 中，静置过夜，涂于有机玻璃板上后水平放在烘箱6 0 过夜烘干。将脲酶溶解于p h 5 3 的磷酸盐缓冲溶液中，配置成l m g m l 的酶溶液。将制得薄膜浸于其中冰箱放置过夜， 便完成了包埋的工作。 f i l i zk a r a 5 2 】等实验用壳聚糖海藻盐聚合电解质复合物及聚乙烯和k - 角叉胶穿插聚 合网络( 口n s ) 来包埋刀豆脲酶。此种薄膜与其他材料相比有明显的优势，主要是操作 简单、成本低、包埋产率高、机械稳定性好。包埋后脲酶稳定性有所增强。贮存7 0 天 后壳聚糖海藻盐聚合电解质固定化脲酶的活性保持4 8 。 梁足培【5 3 】将壳聚糖醋酸溶液滴入三聚磷酸钠溶液中制成的壳聚糖微球，在微波辐 射下，与戊二醛交联反应引入醛基，制得含悬挂醛基的交联壳聚糖球。以此为载体，制 备固定化脲酶的最优条件为q ( g a ) = 1 ，m ( e ) ：m ( c b ) ：o 0 1 ，固定化时间为2 4 h ，固定化 所用溶液的p h 为6 5 ，所得固定化脲酶比活为1 0 8 3 u g ，固定化脲酶的稳定性良好。 1 6 2 2 明胶作为载体 明胶是从动物外皮，软骨等中提取出来的一种粘性胶状物质，具有很好的生物兼容 性以及较高的黏度。明胶的来源取料广泛，制备技术成熟，并且已经广泛地作为添加剂 用于食品工业。利用明胶作为固定化的载体具有一定优势。 梁足培【驯提出了一种简单而且有效的脲酶固定方法，将脲酶明胶液涂布在塑料板 上干燥成膜。然后用戊二醛交联，所得的固定化脲酶的机械强度和稳定性高，固定化脲 酶的酶活力回收率高，而且脲酶的性能得以改善。该固定化脲酶可在人工肾、临床诊断、 尿素废水处理方面获得应用。通过这种方法获得的固定化脲酶活力可以达到6 0 7 u g 载 体，酶活力收率为6 6 1 ：重复使用2 0 次后酶活力仅损失1 5 。 1 6 2 3 氨基多糖作为载体 氨基多糖作为固定化载体具有高蛋白质亲和性，分子中有许多反应基团，可被广泛 地进行化学改性；具有生物相容性好，安全无毒，廉价易得优点等，且由于氨基多糖对 金属离子的螯和作用，制得的固定化酶活性不会受到溶液中c u 2 十，c d 2 + ，n i 2 + 等离子的 干扰和抑制，是一种非常具有潜力的固定化材料。有关氨基多糖作为载体固定化酶来生 9 第一章前言 硕士论文 产药物和降解生物大分子的研究已经有了一些成果及相关的报告。其中酶分子通过共价 结合于氨基多糖及其磁性衍生物的研究已用于胰酶、葡萄糖、氧化酶、纤维素酶、青霉 素酰化酶等酶的固定化【珏5 7 1 。安富荣等【5 8 】制备了含有顺铂的戊二醛氨基多糖微球，并测 试了药物缓释作用与氨基多糖含量的关系，r e m u n a n l o p e z 等研制了新型的氨基多糖 纤维素多孑l 微粒用于药物控释【5 9 1 。另外，将生物大分子固定于氨基多糖膜上应用于生物 传感器也是研究与应用开发的热点。如v i l a 等采用氨基多糖微粒研究黏膜蛋白转运，发 现该材料具有良好的生物可降解性唧】。近年来除有以氨基多糖为载体制作生物传感器用 于测定葡萄糖、乳酸【6 l 】、乙酸【6 2 】和尿素的报道外，因氨基多糖本身无毒性，并有良好的 生物可降解性，制作的生物传感器还被用于血样的检测【6 3 1 。 彭虹旎畔】等通过实验得出：氨基多糖在三聚磷酸钠溶液交联形成微球，氨基多糖浓 度越大、分子量越大形成微球的机械强度越好。将大小分子量氨基多糖以质量比1 5 混 合，既可保持微球有良好的机械稳定性，同时大量的小分子氨基多糖可以保证载体与脲 酶能够高效吸附。从微球的形态上，光滑表面氨基多糖微球载体表面光滑：多孔微球载 体具有蜂窝状结构。 1 6 2 4 纤维素及其衍生物作为载体 纤维素是最丰富的天然有机物，是固定化酶的优良载体。日本用d e a e 纤维素载体 吸附固定葡萄糖异构酶，用于生产高果糖浆。d o w 公司生产的空心纤维为酶固定化专 用载体，由醋酸纤维素和其它纤维素构成的载体已规模应用于葡萄糖异构酶，伐半乳糖 苷酶和转化酶的固定化上【6 5 】。 f a h m y 等【6 6 】以腈尿酰氯- - 7 , 氨乙基纤维素醚为载体固定化脲酶，该固定化脲酶活力 收率为7 2 ，k m 值是游离酶的3 8 倍；最适反应p h 值为7 5 ，和游离酶相同；最适反 应温度为6 5 ；其热稳定性提高，在9 0 下加热1 5 m i n 仍保留1 8 的活性，而同等条 件下游离酶已全部失活；另外，其抗离子毒性增强。 王巨梅【6 7 】提出用交联和包埋结合技术制备出湿保活期达两年之久的纤维素固定化 脲酶。与用单一的方法制备的固定化脲酶相比，稳定性提高十倍多，大大地提高了脲酶 重复利用率。 1 6 2 5 淀粉衍生物作为载体 n g u y e na r t hd u n g 等【6 8 】将丙烯酰胺接枝共聚到淀粉上，后将脲酶固定到共聚后的淀 粉上。结果显示淀粉根据交联的浓度不同，吸附脲酶的量也有所不同。该固定化脲酶活 力收率最高可达7 0 ，重复使用多次仍保持较高的活力。 1 6 3 常用无机吸附脲酶固定化载体材料 用无机吸附剂将酶吸附于载体表面是酶固定化技术中最早采用的一种方法。无机吸 附类载体对脲酶进行固定化靠的是酶与载体之间的氢键作用力范德华力和静电引力来 1 0 硕：i ：论文魔芋葡甘聚糖改性与同定化脲酶应用研究 固定的。载体吸附的酶量多少，载体与酶结合的牢固程度和固定化后酶活力的保持状态 均与所选择载体的性质相关【6 9 1 。此种固定化的优点为反应条件比较温和，固定化过程对 酶的影响较小，缺点在于由于酶与载体之间靠物理方法进行结合，结合稳定性会差点， 当外界条件改变时，酶易从载体上解吸，导致酶泄漏流失。 g o d j e v a r g o v ae 7 0 】研究了将脲酶固定化到无定型s i 0 2 上，用金属螯合法将脲酶固定化 在硅胶和硫化硅上，将硫化硅载体用t i 4 + 和v 5 + 活化，硅胶用t i 4 + 活化，分别在1 1 0 * c 和5 5 0 下干燥，研究不同活化剂和干燥温度对固定化脲酶性质的影响，并研究了固定 化脲酶的热稳定性、最适反应p h 值和最适反应温度等。结果表明：在1 1 0 干燥、用 t i 4 + 活化的硫化硅载体固定化脲酶的活性较高，性质和游离酶接近；固定化脲酶最适反 应p h 值和最适反应温度为5 8 和3 0 ，和游离酶相近；在5 0 下加热9 0 m i n 后，游离 酶已完全失活，而固定化脲酶仍保留初始活力的4 0 。多孔硅具有非均质超微结晶结构， 表面积较大，可由单体结晶硅直接合成，且生物稳定性较高，无毒，这些特性使其成为 酶固定化的理想载体。 m a i a 掣7 l 】尝试了用在蒸汽相染色腐蚀来诱导反应的方法制出一种新型p s 薄膜。用 此方法制备薄膜仅需要5 分钟，可以制出p 型和n 型具有高低不同的电阻系数的酶作用 底物，只需要少数的仪器和较低的成本。在对固定化酶的系列指标进行测试后，可以发 现此技术为生物传感器及生物反应器的发展提供了良好的基础，降低了生产费用，延长 了使用寿命。在4 c 下贮存3 9 0 天后，固定化的脲酶仍然保持了7 5 的活力。 1 6 4 常用聚合物脲酶载体材料 1 6 4 1 聚乙烯基类薄膜载体 r a h u ls i n g h a l 7 2 】将脲酶在聚乙烯单层薄膜和硬脂酸共混物的水气界面上进行包埋。 利用l b 膜沉淀技术将单层薄膜制成表面覆盖一层铟锡氧化物的玻璃盘。通过f t i r 和 u v 可见分光光度计来确定固定化后酶的性质，发现在温度2 5 5 04 c ，p h 为6 5 8 5 之间 稳定，比游离脲酶的稳定性要好。用这种方法制备的固定化酶尿素传感器。 f i l i zk u r a l a y 【7 3 】采用了一种新的固定化材料固定脲酶制成新型尿素生物传感器，将 酶固定化在聚乙烯块上此种生物传感器与其他生物传感器相比具有以下的好处：准备 简单、合理的长时间稳定性、快速反应应答( 6 0 s ) 以及比相关文献研究报道的电极线 性范围。 s e v d a l i n at u r m a n o v a 等【7 4 】利用在聚乙烯酸低密度聚乙烯的基础上通过辐射接枝共 聚制备共聚物作为适当的薄膜载体。当丙烯酸接枝共聚度为6 4 2 时最适合脲酶的固定 化，固定化脲酶具有较高的相对活度8 0 3 2 ，和较多的结合蛋白6 0 1 m g c m 2 。 1 6 4 2 尼龙薄膜载体 将聚合物改性后用于固定化的材料已经越来越多的被用到，经适当改性后的聚合物 第一章前言 硕士论文 薄膜可以更好的与酶结合。但目前用缩水甘油基异丁烯酸盐( g m a ) 接枝共聚膜作用 固定化载体的研究还是比较少的。t e k e 等【7 5 】就尝试着准备g m a 接枝共聚的6 层尼龙膜， 将脲酶固定在上面。甲醇作为接枝共聚媒介时的效果与其他溶剂( 如：乙醇，氯仿) 效 果要好；引发剂的量影响接枝共聚度，在b p 浓度为8 x 1 0 3 到5 x 1 0 。2 m l v l 之间，接枝共 聚度随着b p 浓度的增加而提高，b p 浓度继续增加则接枝共聚度会下降，最佳的b p 浓 度为5 x 1 0 m m ；当g m a 的浓度达到i o m 是接枝共聚参数达到最大值；最佳酶液浓度 为1 0 m g m l ，高于这个水平是，虽然固定于薄膜上的酶量增加了，但是酶的活力并没有 增加。 a n i t a 等【7 6 】脲酶通过戊二醛的作用共价地接到部分水解的尼龙管上。固定化脲酶的 最高活性点在温度为6 5 ，p h 为6 5 时得到，而游离脲酶的最适温度为2 5 。与游离 脲酶相比固定化脲酶显示出好的热稳定性。在4 下存放6 0 天后活力保持7 6 ，反复 使用5 次后活力保持7 8 。 1 6 4 3 聚胺类载体 聚苯胺可由苯胺经氧化聚合作用形成，十分方便，并且由于它在某些有机溶剂中的 稳定性，可被制成非常稳定，可塑的凝胶体。l