（生物学专业论文）hela细胞核仁rrna基因转录和prerrna剪切与超微结构动态关系研究.pdf

摘要 核仁是真核生物很显著的哑细胞结构之一。在细胞合成蛋白质中具有非常重要的作 用一核仁制造了核糖体大小亚单位。核仁主要由f c ( f i b r i l l a rc e n t e r ) 和d f c ( d e n s e f i b r i l l a rc o m p o n e n t ) 以及g c ( g r a n u l a rc o m p o n e n t ) 等超微结构组成，普遍存在于动物细 胞，植物细胞和酵母细胞核中。每个细胞核中核仁的数量从一个到数个不等。核仁在有 丝分裂前期解体并停止转录核糖r r n a ，在有丝分裂末期恢复转录核糖体r r n a 并重新 形成核仁。虽然人们对于核仁的认识已经有很长的历史了，但是人们对于核仁结构和功 能方面的认识仍然有很多不同的意见。其中意见分歧较为明显的是，关于g i ( g o ) 和 g 2 期核仁超微结构f c 和d f c 大小有分歧，关于核仁r d n a 分布以及r r n a 基因转录 位点有不同的意见，关于核仁剪切位点的研究方面也存在分歧。在相关的研究中有时甚 至所取用的材料相同方法也相同，但是结果却不同。对于核仁结构和功能在细胞问期中 各个时期动态变化过程缺乏系统全面的了解可能是产生上述分歧的原因之一。 本实验用h e l a 细胞为实验材料，利用常规电镜、细胞化学方法、免疫电镜技术以 及原位杂交技术对在g l 期、s 期和g 2 期o h e l a 细胞核仁超微结构及其变化，核仁 r d n a 在不同时期分布规律及其变化，各个时期核仁r r n a 基因转录位点及其变化， p r e - r r n a 早期剪切位点及其变化进行了研究。结果显示，h e l a 细胞问期核仁的结构 和功能都经历了高度动态的复杂变化： 1 、通过对经过同步化培养的h e l a 细胞做常规电镜观察显示，h e l a 细胞核仁结构 在细胞问期的各个时期是不同的。g 1 期细胞核中有数个小核仁，每个小核仁含有一个 f c 和d f c 。随后有些小核仁互相融合形成大型核仁。在融合中的核仁内不同f c 之问 也发生了融合过程，形成了比较大型的f c 和d f c 。s 期在大型f c 周围的d f c 发生改 构现象，在f c 和d f c 之间形成一些腔隙，这些腔隙发展成为小型f c 和d f c 。我们把 在g l 期早期形成和出现的f c 和d f c 称为初级f c 和初级d f c ，把在s 期从初级f c 和初级d f c 上形成的f c 和d f c 称为次级f c 和次级d f c 。g 2 期为数众多的小的次级 f c 和d f c 与初级大型f c 和d f c 共同存在于核仁中。 2 、n a m a - u r 染色使核仁中r d n a 的分布走向及其在不同细胞时期的变化得以显 示。在初级f c 中r d n a 纤维密集分布，质地均一，互相之间搅扭缠绕在一起形成一个 比较规范的球形体结构。d f c 中r d n a 纤维分布不均匀，成束的r d n a 纤维放射状分布 于球形体f c 周围，核仁次级f c 和次级d f c 的衍生过程发生在靠近f c 和d f c 中的 d n a 组分中，d f c 中的r d n a 组分随细胞周期的进行不断增多。在核仁外三分之一处 围绕着一层很厚的常规电镜下看不到的由凝聚状态不同的核仁周缘染色质纤维结构。这 种核仁周缘染色质结构参与了核仁形态和位置的维持过程。因为当h e l a 细胞进入到g 2 期末期核仁周缘染色质开始凝聚时，位于核仁周缘的染色质组分逐渐消失，核仁形态也 随之消失。 3 、对h e l a 细胞核仁r r n a 基因转录位点免疫标记结果显示，标记信号出现在f c 和d f c 交界处和d f c 区域。在s 期剐刚形成的次级f c 内部也有一些金颗粒标记信号。 这在某种程度上能够解释为什么在研究核仁转录位点问题上用同样的实验材料和同样 的方法却出现不同的实验结果。 4 、u 3s n o r n a 原位杂交结果显示，金颗粒在各个时期都出现在f c 和d f c 交界处 和d f c 区域以及g c 区域。在f c 中没有金颗粒信号出现。 总之，从我们的实验结果中可以看出，在h e l a 细胞核中，从g l 期经s 期到g 2 期核仁的超微结构和转录功能以及剪切功能发生了一系列动态变化。这种变化不仅体现 在核仁超微结构的衍生过程，也体现在随着这种超微结构变化带来的核仁转录位点的改 变。核仁的转录和剪切活动随着细胞周期的推进逐渐增强。核仁转录位点和剪切位点的 一致说明了核仁中r r n a 基因是呈放射状分布于核仁中的f c 周围。h e l a 细胞核仁在细 胞问期的这种高度动态的变化反映了核仁结构和功能之间存在的相互协调关系。本实验 结果拓展了对于核仁超微结构在细胞问期动态变化的认识，有利于统一关于核仁f c 和 d f c 在不同时期大小变化的争论和关于核糖体基因转录位点研究的不同意见，为进一步 研究核仁结构和功能提供了实验数据。 关键诃：初级f c 和初级d f c ；次级f c 和次级d f c ：核仁周缘染色质； g l 期、s 期和( 3 2 期转录和剪切 i i a b s t r a c t n u e l e o l m1 so n eo ft h ep r o m i n e n tn u c l e a rs t r u c t u r e si ne u k a r y o t i cc e l la n dt h et w o s u b u n i t so fr i b o s o m ea l em a d ei ni t , w h i c ha r et h ef a c t o r i e so fs y n t h e s i z i n gp r o t e i ni nc e l l n u c l e o l a si sm a i n l yc o n s i s t e do ff c ，d f ca n dg ci ti sf o u n di nt h ec e l l so fa n i m a la n dp l a n t a n dy e a s ta n dt h e r ei sm o r et h a no n en u c l c o l u si no n en u c l e u s n u c l e o l u si sd i s m i s s e di n p r o p h a s ea n dr e f o r m e di nt e l e p h a s ei nc e l lc y c l e t h en u c l e o l u sh a sb e e ns t u d i e df o ral o n g t i m eb u tt h e r eh a v eb e e ns t i l lm a n ya r g u m e n t sa b o u tn u c l e o l a rs t r u c t u r e sa n df u n c t i o n o f w l l i c 轧t h e r ew e r ed i f f e r e n tr e s u l t so nt h es i z ea n di t sc h a n g e so ff ca n dd f cd u r i n gg 1 ( g o ) a n dg 2p h a s e s s t i l lt h e r ew e r ed i f f e r e n tr e p o r t sc o n c e r n i n gt h es i t e so f n u c l e o l a r t r a n s c r i p t i o n a n dp r o c e s s i n g t h ed i f f e r e n tr e s u l t sw e r ee v e na p p e a r e di nt h er e s d t so ft h es t u d i e sw i t h s a m em a t e r i a la n dw i t hs a m ew a y s t h er e a s o n so fd i f f e r e n tr e s u l t sc o n c e r n i n gn u c l e o l a r s t r u c t u r ea n di t sf u n c t i o nm i g h tb ei nb e i n gs h o r to fa l l - r o u n da n ds y s t e m a t i cs t u d i e sf o rt h e d y n a m i cc h a n g e sa b o u tn u c l e o l u sd u r i n gi n t e r p h a s e i nt h i ss t u d y , h e l ac e l lw a su s e da sa ne x p e r i m e n tm a t e r i a l b yu s i n gc o n v e n t i o n a l t r a n s m i 豁i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e ，c ”o c h e m i s t f y ，i m m u n o e l e c t r o nm i c r o s c o p et e c h n i q u e sa n d i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，w es t u d i e d t 1 1 eu l t r a s t r u u t u r eo fn u c l e o l u so fh e l ac e l li ng 1 ，sa n d g 2p h a s e sa n di t sc h a n g e s ； t h ed i s t r i b u t i o no fd n ai nt h en u c l c o l u sa n di t sc h a n g e sd u r i n g i n t e r p h a s e ； t h es i t e so fr r n at r a n s c r i p t i o na n di t sc h a n g e s ；| t l l es i t e so fp r e - r r n a p r o c e s s i n ga n di t sc h a n g e si nt h et h r e ep h a s e so fi n t e r p h a s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s t r u c t u r ea n di t sf i m c t i o nu n d e r w e n td y n a m i cc h a n g e sd u r i n gi n t e r p h a s e ： 1 、t h er e s u l t so fu s i n gc o n v e n t i o n a le l e c t r o m i c r o s c o p et e c h n i q u e ss h o w e dt h a ti tw a s d i f f e r e n tf o rt h eu l t r a s t r u c t u r e so fh e l ac e l ld u r i n gi n t e r p h a s e i ng ip h a s e ，t h e r ew e r eaf e w 咖a l ln u e l e o l ib e g u nt of u s ei n t ob i go n ea n dt h e na sd i dt h ef c si nt h eb i gn u c l e o l u sf u s e d s e c - f ca n ds e c - d f cw e r ed e r i v e df r o mt h ep a r t sb e t w e e np r i - f ca n dp r i - d f ci ns p h a s ea n d b o t ho f p r i - f ca n ds e c d f cw e r ec o e x i s t e di nr e t i c u l a t e dn u c l e o l a si ng 2p h a s e t h ep r e s e n t w o r kf i r s t l ys h o w e dt h a tt h e r ew e r eap r o c e s so fs e c - - f ca n ds e e - - d f cd e r i v i n gf r o mp r e - f c a n dp r e - d f c 2 、i nt h er e s u l t so f u s i n gn a m a - u rm e t h o d s ，d n a i nt h e p r e f c w a s w e l l d i s t r i b u t e di nas h a p eo fr i n gf o r m e di ng 1p h a s ea n dd i s m i s s e di ng 2p h a s e d n a w a sn o tw e l l - d i s t r i b u t e di nd f ca n dt h ef i b r e so fr d n aw e r ed i s t r i b u t e di nt h ef o r mo fa w h e e ls p o k en e x tt ot h ee d g eo ft h ef c t h ep r o c e s so fd e r i v a t i o no fs e c f co c c u r r e di n t h ed n ab e t w e e n p r e - f ca n dp r e - d f c w h e nc h r o m a t i nw a sc o n d e n s e di nl a t eo fg 2 ，t h e c h r o m a t i na r o u n dt h en u c l e o l u sw a ss l o w l yd i s m i s s e da n dt h es h a p eo ft h en u c l e o l u sw a s c h a n g e di n t ot h el o s tw i t ht h en u c l e o l u sa s s o c i a t e dc h r o m a t i nb e i n gd i s m i s s e d i t l 3 、1 1 1 e 打a n s c f i p t i o ns i t e so f r d i n aw e r em a r k e di nt h es i t e so f t h ei u n c t u r eb e t w e e nf c a n dd f c 、d f c a n ds e c - f cw a sa l s om a r k e di nsp h a s eb yt h ei m m u n o e l e c t r o nm i c r o s c o p y t e c h n i q u e s t h e s er e s u l t sc o u l de x p l a i nw h yt h ed i f f e r e n tr e s u l t sa c h i e v e db yt h es a m e m a t e r i a la n ds a m om e t h o di nd i f f e r e n ts t u d yg r o u p s 4 、a se x h i b i t e do nt h ep h o t o so fu 3s n o r n ah y b r i d i z a t i o ni ns i t u ，t h em a r k e d1 0n n l g o l dg r a i n sw e r ed i s t r i b u t e di nd f c ，g ca n dt h ej u n c t u r eb e t w e e nf ca n dd f c t h es i t e so f f cw e r ed e v o i d e db yg o l dg r a i n i naw o r d , t h e r ew e r ed y n a m i cc h a n g e so ft h eu l t r a s t r u c t u r ea n di t sf u n c t i o ni nh e l a u u c l e o l u s t l l ec h a n g e sw e r en o to n l yi n c l u d e do f n u c l e o l a ru l t r a s t r u c t u r a ld e r i v a t i o nb u ta l s o t h ea l t e r a t i o no ft r a n s c r i p t i o ns i t ei nt h en u e l e o l u s t h ea c t i v i t i e sw e r eg r a d u a l l yi n h a n c e d w i t ht h ep r o g r e s so ft h ec e l l c y c l e t h ei d e n t i c a l b o t ht h es i t eo ft h e t r a n s c r i p t i o na n d p r o c e s s i n gm e a n tt h a tr d n aw a sd i s t r i b u t e di nt h ef o r mo fr a d i o a c t i v ew a yi nt h er e g i o n s a r o u n df c t h ec h a n g e so fh e l an u c l e o l u si ni n t e r p h a s ew e r et h er e f l e c t i o no fh i g h l y d y n a m i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t r u c t u r ea n di t sf u n c t i o n ，t h er e s u l t so fp r e s e n ts t u d yw i l l b eb e n e f i c i a lt ot h eu n d e r s t a n d i n ga b o u tt h ed y n a m i cc h a n g e so fn u c l e o l a rs t r u c t u r ea n di t s f u n c t i o ni n t e r p h a s e a n dt h er e s u l t sw i l lp r o v i d et h ed a t u mf o rt h ef u r t h e rs t u d i e so nb o t h s t r u c t u r ea n df u n c t i o no f n u c l e o l u s k e yw o r d s ：p r i m a r y f ca n dp r i m a r y - d f c ；s e c o n d a r y - f c a n ds e c o n d a r y - d f c ； n u c l e o h i sa s s o c i a t e dc h r o m a t i n ；t r a n s c r i p t i o na n dp r o c e s s i n gi ngt 、sa n dg 2p h a s e s i v y i 0 1 3 1 7 8 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东 北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文作者签名：己犀寸日期：w 。z l1 1 。 学位论文版权使用授权书 者签翥i 、班，r 签嚣星 日 期：丛，j 上1 7 日期：型蔓空釜由 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 引言 一、核仁概述 核仁是真核生物细胞重要的亚细胞功能区域，是细胞进行r k n a 基因转录、p 聪r r n a 剪切加工和核糖体初步形成的场所( 图1 ) 。核仁在细胞的生命活动中发挥着非常重 要的作用，因为细胞代谢所需要的蛋白质都是在核糖体中完成合成过程的。核仁的功能 和核仁的超微结构与核糖体基因的多拷贝特点有直接关系1 2 。在细胞正常新陈代谢中， 鼢淞聚合酶i 催化四种核糖体鼢n 基因中的三种( 1 8s ，5 8s ，2 8s ) 转录过程。编码 上述三种核糖体的基因起以串连重复的方式分布于核仁组织区或者称为核仁组织者。 在每个核仁组织者中这些核糖体基因的数目从数个到数千个不等鸭这种核仁组织者区 被认为是核仁的结构组织基础。在真核生物中，r r n a 基因是迄今为止发现的拷贝数目 最多的基因，并且，绝大多数都被活跃转录。除了r i 拼a 的转录过程外，核糖体的生物 发生还包括很多其他过程：5s 核糖体r i u n a 进入核仁过程，因为5s 核糖体r r n a 是 在核仁外细胞核中被转录的；4 5sp r c r r n a 原始转录子转录后的剪切加工过程1 4 】；核仁 小分子r n a 和相应的伴娘蛋白质进入核仁；核糖体蛋白质进入核仁；核仁中成熟核糖 体的大小亚单位转运至细胞质中形成核糖体，提供蛋自质合成的场所。所有这些过程都 圈lh e l 矗细胞核中的核仁超显徽结构。f c 纤维中心( f i b r j l i a rc e n t e r ) d f c 致密纤维组分( d e n s e f i b r i l l a rc o m p o n e n t ) 。g c 颗粒成分( g r a n o | a rc o m p o n e s t ) 。b a r , lm m 。引自p a v e lh o z k j c s 9 9 4 受到相应的调控。例如，5sr r n a 基因的转录要与4 5s r r n a 基因的转录相互协调。同 时，也要与很多核仁小r n a 分子及核糖体蛋白质分子进行协调。这些过程都要与细胞 代谢对核糖体需要相适应：最后，核仁在有丝分裂过程中还要去组合和重组合。引人瞩 目的是，除了核糖体基因外，迄今为止还没有报道其它活跃转录的基因存在于核仁中1 5 j 。 由于结构致密折光性很强，核仁是早期生物学家观察到的最初少数几个亚细胞结构 之一。m o n t g o m e r y 等1 6 1 观察并记录了核仁大小及数量的变化以及核仁在细胞有丝分裂中 周期性出现与消失过程。1 9 3 1 年h e i t z 掣h 观察核仁中染色体上次级缢痕的数量和长度 与核仁数量和大小直接相关，然后他正确预见到这种染色体上的次级缢痕参与核仁的形 成和功能的维持。这样的工作奠定了我们现在对于核仁的认识的基础。另一位核仁早期 奠基者是m c c l i n t o e k l 8 。她发现位于染色体次级缢痕附近的致密的染色质隆突( k n o b ) 是核仁组织体或元素( n u c l e o l a ro r g a n i z i n gb o d yo re l e m e n t ) ，因为在染色体次级缢痕缺 失时这种致密的染色质隆突( k n o b ) 单独可以形成核仁。现在知道这种k n o b 仅仅是玉 米中的情况，而不是现代意义上的核仁组织者。染色质隆突( k n o b ) 是一些沉默的核仁 基因的组合体，当次级缢痕被移去以后染色质隆突中的一些基因会恢复形成核仁功能。 不过m e c l i n t o e k 提出的核仁组织体( n u c l e o l a r - o r g a n i z i n g b o d y ) 的概念已发展成为核仁 组织区( n u c l e o l a r - o r g a n i z i n gr e g i o n ) ，现已被用于表达含有r d n a 的所有染色体区段。 次级缢痕的长度和核仁大小巍接反映了核仁基因的拷贝数目和活性强度。种间杂和 体来自不同基因型的核仁组织者被组合到一个细胞中，其中的一种基因型核仁组织者的 活性发生改变，这种改变是以次级缢痕的完全缺失表现出来的，这种现象被n a v a s c h i n 等描述为随体缺失( a m p h i p l a s t y ) 【9 l 。现在知道这种现象与核仁组织者的竞争有关。即 与核仁基困的启动子及其上游序列的相对长度竞争与限速转录因子或r n a 聚合酶结合有 关。越强的启动子含有越多的短重复序列，该短重复序列含有与核糖体基因启动予部分 非常相似的片断1 1 0 1 。这些强启动子也含有丰富的非甲基化胞嘧啶l 。 关于核仁组织者与核仁关系最好的一个说明是g o d w a r d 等【1 2 i 提供的。她在水绵中 发现有丝分裂前期核仁组织者明显。随着核仁在分裂前期的解聚过程，蜿蜒伸展的环状 或索状的核仁组织者逐渐变短变粗，直至完全从核仁中收缩回来。同时她也发现在问期 和有丝分裂的早期核仁组织者包埋于核仁中的一种物质里，这种物质明显不同于核仁中 的其他成分，后来证明这种物质是致密纤维组分( d f c ) 1 1 3 o 最初关于核仁功能的证据来自六十年代中期两个试验组他们证明核仁组织者含有 编码核糖体主体部分( 2 8 s 和1 8 s ) 的基因。r i t o s s a & s p i e g e l m a n 等1 1 4 j 用果蝇作材料， 发现核仁组织者数量的变化与核糖体基因数量的变化直接相关。b i m s t i e l 等别饲养无 核仁非洲爪蟾突变体，证明这种爪蟾突变体由于不能合成核糖体r r n a ，也就不能合成 核糖体。 关于核仁及其功能研究的具有里程碑意义的工作是m i l l e r 等完成的活跃转录核糖体 基因的电镜观察( 图2 ) 1 1 6 1 。用一种简单的低渗扩展技术就能看到正在转录的核糖体基 因正在增长的新生转录子，在核糖体基因d n a 主轴上很多r n a 转录酶以及重复的核糖 体基因之间的间隔序列i 】7 1 。这种制备清晰的来自核仁基因的图片给细胞学家提出r 一个 困惑的问题：在完整的核仁中，这种正在转录的我们称为圣诞树的基因是如何排布和如 何转录的? 核仁的结构和功能之间的动态关系怎样? 图2 忸h 的活跃转录r d n a 圣诞树样结构的铺展状态。b a r s ，1i t l n l ( a ) ，0 2m l t l ( 8 ) 引自m i l l e rs c i e n c e ，1 9 6 9 在人类细胞中，r r n a 由所谓的主要r r n a ( 1 8s ，5 8s ，2 8s r r n a ) 和5sr r n a 组成f 1 8 l ，主要r r n a 基因位于5 对近端着丝粒染色体( 1 3 ，1 4 ，1 5 ，2 1 ，2 2 ) 的短臂上， 在有丝分裂中期的染色体上形成了特征性的次级缢痕，也就是所谓的核仁组织者区 n o r 。在每个n o r 区有很多主要r r n a 基因头尾相接的重复排列。但是，各个n o r 中的r r n a 基因拷贝数目是不同的f g l 。人类细胞单倍体基因组中共含有4 0 0 个r r n a 基 因拷贝。在问期细胞核仁中，不同的n o r 之间融合形成一个较大的核仁( 图3 ) 1 2 0 1 。当 然，在绝大多数细胞中核仁数目不仅仅是一个。 每个核糖体基因单位通常含有一个可转录序列和一个非转录间隔序列1 2 1 1 2 2 1 。转录过 程由核仁p o ll 催化，形成一个很长的前r r n a ( p r e - r r n a ) 。这个前体分子除了含有1 8 sr r n a , 5 8sr r n a ，2 8sr r n a 序列外，还含有内部和外部转录间隔序列。在哺乳动物 细胞核仁基因中含有两种重要的序列，上游控制序列和核心启动子序列删。这些序列 能够使转录复合物顺利形成。这些转录复合物除了含有p o li 外还含有上游结合园子 ( u b f ) 嗍、选择性蛋白复合体s l l ( 在鼠细胞中也称为t i f - i b ) 、t a t a 一结合蛋白( t b p ) 、 三种转录激括因子( t a f s ) 、转录起始因子t i f i a 和t i f i c 以及其它因子等。 成熟核糖体r r n a 的生物发生是一个很复杂的过程，与m r n a 前体成熟过程有很 大的不同，它需要非核糖体蛋白的存在和含有大量各种小核仁r n a 的核糖核蛋白质 ( r n p s ) 。在大小核糖体亚基组装蔚通过内切核酸酶和外切核酸酶的作用将非编码序列 切除，在大约有2 0 0 个碱基对中进行假尿嘧啶的生物合成以及甲基化修饰过程，r n a 圈3 人类细施核仁构成模式图。十条不同的染色体含r d n a 部分以l o o p 形式互相融合形成核仁。右侧 是分离出来的棱仁。引白m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e c e l l 3 r d 。d n 。 螺旋酶和r n a 伴娘分子介导的r n p 折叠和改构，g t p a s e s 和a a a a t p a s e 催化的蛋白 质的聚合和解聚合过程旧。在细胞核中合成的5sr r n a 和在细胞质中合成的蛋白质进 入核仁整台进核糖体颗粒接近完成的核糖体亚单位由一种特殊的因子帮助从核仁转运 到细胞质中。有趣的是有人发现在细胞核中也合成蛋白质【2 8 1 。 二、核仁结构及其形成 ( 一) 、核仁超徽结构 最初人们发现电子显微镜切片显示的核仁内部结构没有典型的统一模式。随着电子 显微镜分辨能力的发展，已经能够清楚显示核仁结构伴随其功能发生相应的改变，也能 够看至q 不同类型细胞中核仁的数量、大小甚至结构的相应变化。在植物细胞、动物细胞 和酵母细胞中核仁内部超微结构都有以下凡个部分( 图4 ) 嘲组成： 1 、纤维中心( f i b r i l l a rc e n t e r , f c ) 电子显微镜下可以看到，用常规包埋技术制备的超薄切片，经铀铅染色的核仁中存 在一些电子密度低的区域，r e c h e r 等称这种区域为纤维中心【2 9 1 。f c 只占核仁体积的很 小部分。这种电子密度低的f c 区域经常呈圆形并且几乎不含有r n a p u j 。根据j o r d a n 1 9 8 4 年整理的关于核仁命名会议的内容，纤维中心含有核糖体d n a ( r d n a ) ，r n a 聚 4 合酶】以及核仁组织者蛋白( n o r ) 等几种成分p “。根据电子显微镜形态和其他方面的 标准( 即在有丝分裂中的n o r 和间期的f c 都含有p o li 和u b f ) ，f c 很像n o r ，因 而被认为是n o r 在细胞问期的对应物| 32 1 。在活跃生长的细胞中，例如在培养的正在分 裂的哺乳动物细胞中，每个n o r 中的r r n a 基因要分散开，形成数量较多的f c ，这时， f c 的数量就超过了n o r 的数量p 】。f c 中含有染色质成分，以往的工作表明，在f c 中 可以直接观察到染色质的存在，在动物细胞和低等植物细胞中较少看到在f c 中有染色 质的存在i 。 2 、致密纤维组分( d e n s ef l b r i l l a rc o m p o n e n t , d f c ) 在电镜下观察，d f c 是核仁中电子密度最高的区域。它由密集的纤维构成，通常看 不到颗粒成分。d f c 呈环形或半月形包围f c l 3 4 j 。d f c 在核仁体积中所占比例在动物细 胞和植物细胞之间差别很大。一个典型的功能活跃动物细胞核仁中，d f c 所占比例大约 是1 7 p ，j ，一个典型的功能活跃植物细胞核仁中，d f c 所占比例是5 0 。颗粒组分和 d f c 之间存在一种缓慢的转换过程。 3 、颗粒组分( g r a n u l a rc o m p o n e n t ，g c ) 颗粒是代澍活跃的核仁中的重要结构，由翥径1 5 2 0 n m 的r n p 颗粒组成1 3 “。g c 通常分布在核仁的近边缘部位。一般认为颗粒组分代表着核糖体前体颗粒。在动物细胞 中g c 占核仁大约7 5 的区域1 1 l 。 4 、拨仁液泡( n u c l e o l a rv a c n o | e n v ) 核仁液泡是指在核仁中一些大的腔隙。这些腔隙多少类似球体，是一种含各种内容物 的无膜结构。生物学家们对这个概念的命名很满意f l 。核仁液泡内的成分类似核仁基质， 其内部通常含有松散分布的核糖体前体颗粒，类似物颗粒和纤维成分。 图4 核仁超徽结构f c 纤维中心，d f c 致密纤维组分g 颗粒区，v 核仁液泡，b a r , 0 5m i l l 引自陶伟j c $ 2 0 0 3 5 核仁腔隙( 【n t e r s t i c e s ) 是一个很有用的词，用于描述位于核仁线之间的相对较小 区域【 1 。 5 、核仁俘i 射缸色质州u c l e o l u s - a s s o c i a t e dc h r o m s t i n ，n a c ) 一些集缩染色质总是位于核仁周缘附近，有的集缩染色质还进入到核仁的内部结构 里。因此，核仁伴随染色质由两部分组成：核仁周缘染色质( p e r i n u c l e o l a rc h r o m a t i n ) ， 是指在动物细胞中包围在核仁周缘的染色质；另一部分是核仁内染色质( p e n e t r a t i n g c h r o m a t n ) ，是指那些从核仁周围伸展进入核仁内部的那部分集缩染色质”。 6 、核仁基质( n u c l e o l a rm a t r i x ) 经过抽提后核仁中剩余的部分结构被称为所谓的核仁基质。最初核仁基质是 用于描述核仁内的无定型物质，其中含有致密纤维组分的纤维和颗粒组分的颗粒。位于 核仁纤维中心内的基质蛋白是个很有趣的问题f 1 针，h o z a k 等的实验结果表明1 3 7 j ，纤维中 心紧密地与核仁骨架连接在一起，详细情况有待于进一步研究和探讨。 ( 二) 、核仁结构的形成 核仁的存在需要一种解释，因为原核生物不含有核仁，但原核生物也能完成核仁所 能完成的主要功能。原核生物不含有核仁的原因是因为r r n a 基因拷贝数日少，还是因 为该基因不是串联重复排列不得而知。酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 核仁是目前了 解最详细的核仁之一。酵母细胞核仁位于酵母细胞核中，纤维一颗粒组分是该核仁的主 要结构组分，以新月形分布于细胞核中大约2 5 的区域。很难分辨酵母核仁与细胞核中 其它部分的分界，并且酵母核仁紧紧的贴在细胞核内膜上。类似酵母核仁结构和与细胞 核内膜连接的情况在高等植物细胞核仁进入有丝分裂前解体时常常见到( 3 剐。这些观察结 果自然就产生了这样一个问题，究竟是什么因素维持了核仁正常的形状和所处的位置? 其中原因不能简单的用d n a 是一个到处都连续分布的分子来解释，因为在有些生物物 种孩仁结构完好，它们的核仁是由染色质外的核糖体基因形成的1 3 引。有意思的是，一种 与增殖相关蛋白质p 1 2 0 同源的蛋白质酵母n o p 2 蛋白质过度表达时，会导致核仁 的形成，而且这种形成的核仁不再紧贴在细胞核内膜上，而是象典型的植物细胞核仁那 样呈圆球形位于核质中【4 0 l 。r r n a 基因转录本身不足以形成核仁。在一种酵母细胞突变 体中，由p o l 催化核糖体基因转录，正常核仁结构没有形成】。这个结果不是因为核 仁转录活动是由p o li i 而不是p o li 完成的，可能是因为被转录的核糖体基因不是重复 排列在染色质上，丽是在质粒中。 核仁在细胞周期中经历了解体和重建的过程。在有丝分裂前期解体，有丝分裂末期 重建 4 刨。在前期，不规则形状的g c 首先消失，然后是d f c 消失【4 ”，紧接着各种核仁 蛋白质以一种缀有秩序的方式相继离开核仁f 4 “。有丝分裂中的核仁组织者n o r s 和次级 缢痕在电镜染色方面与纤维中心非常相似。有关核仁转录的些成分t u , n a 聚合酶i ，拓 6 扑异构酶j 和上游结合因子u b f 等在有丝分裂中仍然与n o r s 结合在一起【4 5 】【拍j 1 4 7 j 4 8 o 然而象b 2 3 等其它成分或者存在于染色质周缘或者分散于细胞质中【4 。核仁残体在有丝 分裂中一直存在于细胞质中或与染色质结合在一起，最终在细胞核再形成时解体垆0 j 5 1 1 o 核仁的再形成经常被称为核仁再生 5 2 】。核仁再生分为两个阶段：首先，小的圆形前核仁 体形成( p n b s ) 1 5 3 1 ，p n b s 含有各种蛋白质包括核仁纤维素，b 2 3 以及核仁蛋白。p n b s 不含有核糖体蛋白质s l f 5 4 】或$ 6 t 5 蜘，没有在p n b s 检测到r r n a 。p n b s 的形成不需要转 录活动【绷。其次，如果转录开始，p n b s 就与活跃转录的n o r s 结合形成完全的核仁睁”， 而且，这个过程依赖于由正确的聚合酶催化的转录过程( 图5 ) 1 4 1 o 核仁纤维素存在于 圈5 类细胞棱仁周期。在g 2 m 过渡期r r n a 加工机器离开核仁，部分分布于集缩染色质表面。有 些染色质仍然在插跃转录。在m 期p o li 的活性受到了抑止。在有丝分裂的末期一p o li 的活性再檄活与p n b s 结合到染色质上同时进行。在有丝分裂结柬( m g 1 ) ，核仁区域开始在活跃转录的n o r s 周围再形成，g t 早期数个n o r s 相互融合后形成完整的核仁。引自d a a i m eh e r n a n d e z - v c x d u n , j c s ，2 0 0 2 n 核仁残留体和细胞核基质制备物的核仁残留物中，被认为是核仁纤维索具有结构方面的 作用的证据。核仁纤维素也存在于核仁前体，卫星核仁以及缠绕小体中5 8 1 5 9 1 。u 3 也象 核仁纤维素一样除了分布于核仁外还发现分布于核仁残留体、p n b s 以及缠绕小体中 1 5 1 1 1 5 5 1o 曾有人建议核仁纤维素和u _ 3 与新生的外部转录间隔序列的相互作用对于启动 p n b s 与n o r s 的结合是非常重要豹f s l i ” 1 6 0 】。 最近的发现显示，核仁在有丝分裂结束后的组装受到细胞周期的调控。人们发现在 有丝分裂过程中，c d k l 细胞周期蛋白一b 的活动的确抑止了d 0 1i 的转录活性，该细胞 周期蛋白活性的抑止则释放了这种抑止作用。前棱仁体p n b s 的形成也受到的c d k l 调 控。然而，r r n a 剪切机器的招募则依赖于另外一种细胞周期蛋白c d k 的调控( 图6 ) 6 1 1 1 6 2 1 1 6 3 1t 6 a l 。 圈6 在细胞周期中校仁组装。有丝分裂中r n a 聚台酶i 与n o r s 结合r r n a 加工机器分散于细胞质中， p o l i 受到c d k i - 细胞周期蛋白b 的活动丙抑止t 在有丝分裂束期，c d k l 一细胞周期蛋白一b 的活性被抑止，使p o l i 的活性格以释放井诱导了p n b s 的形成n 引自d a m 6 1 e h e n l o t l d s z 怕d 虬j c s ，2 0 0 2 。 三、核仁在不同条件下超微结构的变化 尽管上述核仁超微结构存在于几乎所有高等真核细胞中，但是实际上这些结构在不 同生理条件下和在细胞周期的不同时期是在不断变化的。 1 、不同生理条件下的核仁结构 哺乳动物细胞核仁超薄结构在透射电镜下可以看到几种典型的变化结构1 6 别：紧凑的 核仁( c o m p a c tn u e l e o l i ) ，网络样核仁( r e t i c u l a t e dn u c l e o l i ) ，散开的核仁以及休眠核仁 ( r e s t i n g n u c l e o l i ) 。相对于每一种核仁的组织形式的变化，反映了处于不同生理条件下细 胞核仁的典型特征。然而，这种分类仅仅表明了核仁的生理状态，是不全面的。因为也 发现有中间状态和非典型结构的存在。紧凑的核仁和网络样核仁存在于活跃转录的细胞 中，散开的核仁和休眠的核仁存在于经过药物处理的细胞和休眠的细胞中。紧凑的核仁 中颗粒成分紧密排列，当然也有一些核仁液泡和核仁腔隙存在【i9 j ，纤维中心被致密纤维 组分包围，这些d f c 不形成网络样结构，纤维中心的大小是不同的。网络样核