（应用化学专业论文）双子叶植物DNA传感器的制备及其应用研究.pdf

硕士学位论文 摘要 从双子叶植物西瓜和黄豆幼苗中提取d n a 用于制备d n a 电化学传感器，通 过对传感器的电化学特性和分析应用研究，改进传感器的制备方法，提高传感器 的重现性，探讨了提高该传感器用于种属和品种鉴定的可靠性。 1 优化了西瓜d n a 的提取方法，从西瓜幼苗中提取d n a 的最佳条件为：水 浴时间3 0m i n ，1g 西瓜幼苗无水乙醇用量为0 4 0m l ，细胞提取液用量为4 0m l ， p h4 8 的饱和n a o a c 溶液用量为1 3m l ，苯酚氯仿异戊醇用量为样液体积的0 6 倍，氯仿异戊醇用量为样液体积的1 o 倍，异丙醇用量为样液体积的0 8 倍。在此 条件下，d n a 产率约1 2m g g ，a 2 6 0 a 2 8 0 的值在1 7 5 - - 一1 8 1 之间，纯度很高。 2 以羧酸修饰的碳糊电极为基体传感器，制备了西瓜d n a 伏安传感器。优 化了用该传感器检测d n a 的条件，基体传感器的组成为：碳粉o 5 0g ，羧酸0 0 2 4 g ，液体石蜡o 2 8m l ；西瓜s s d n a 在基体传感器表面上固定条件为：表面活化液 中含5 0m m o l l 活化剂l ，8 0m m o l l 活化剂2 ，0 0 2 0m o l l 磷酸氢二钠磷酸二 氢钠缓冲溶液，p h 值为6 2 ，用量为5 5 “l ：西瓜s s d n a 固定液中含8 0i t g m l 变性d n a ，0 0 2 0m o l l 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲溶液，p h 值为6 8 ，用量为 5 0g l 。d n a 杂交分析测定在5 0 含0 0 4 0m o l ln a c i ，5 0m m o l lt r i s ，6 0g m o l l 金属配合物指示剂，p h 值为7 5 的杂交液中进行，杂交反应1 5m i n 。在优化的条 件下，西瓜d n a 伏安传感器的线性范围为0 0 1 0g g m l 0 1 5i t g m l ，最低检测限 为1 1 4n g m l ，相对标准偏差为3 8 ，重现性良好。该传感器可应用于西瓜品种 鉴定和西瓜种子纯度鉴定。 3 以羧酸修饰的碳糊电极为基体传感器，制备了黄豆d n a 伏安传感器，优 化了检测条件。基体传感器的组成为：碳粉o 5 0g ，羧酸0 0 3 2g ，液体石蜡o 3 0m l ； 黄豆s s d n a 在基体传感器表面上固定条件为：表面活化液p h 值为6 4 ，用量为 5 0 “l ；固定液中含1 0i t g m l 变性黄豆s s d n a ，0 0 2 0m o l l 磷酸氢二钠磷酸二氢 钠缓冲溶液，p h 值为6 8 ，用量为5 0 “l ；杂交液中n a c i 浓度为0 0 2 0m o l l ，p h 值为7 2 。杂交反应在6 0 下进行，反应时间为1 5m i n 。在优化的条件下，黄豆 d n a 伏安传感器的线性范围为o 0 5 0g g m l 0 1 5i _ t g m l ，最低检测限为6 1n g m l ， 相对标准偏差为2 1 ，重现性良好。该传感器可应用于黄豆d n a 的定性和定量 分析，有望应用于生物物种鉴定。 关键词：双子叶植物；d n a ；杂交；杂交指示剂；伏安传感器 双子叶植物d n a 传感器的制备及其戍用研究 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , d n aw a se x t r a c t e df r o md i c o t y l e d o n o u ss u c ha sc i t r u l l u sa n d s o y b e a ns e e d l i n gt op r e p a r ed n a b i o s e n s o r s t h ee l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d a n a l y t i c a la p p l i c a t i o no fb i o s e n s o r sw e r es t u d i e dt oi m p r o v et h em e t h o do fb i o s e n s o r s p r e p a r a t i o n ag r e a tn u m b e ro fe x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e p r o d u c i b i l i t y a n ds e l e c t i v i t yo fb i o s e n s o r sw e r ee x c e l l e n t d n ab i o s e n s o r sn o to n l yc a nb eu s e dt o d i s t i n g u i s hd i f f e r e n ts p e c i e s ，a l s oc a n b eu s e dt oi d e n t i f yd i f f e r e n tb r e e d so ft h es a m e s p e c i e s 1 t h ec o n d i t i o n sf o re x t r a c t i o no fc i t r u l l u sd n aw e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w i n g ( f o r1gc i t r u l l u ss e e d l i n g ) ：4 0m lo ft h ec e l le x t r a c t i o n s o l u t i o n ，0 4m lo fp u r ee t h a n o l ，1 3m lo fs a t u r a t e dn a o a cs o l u t i o n ( p h4 8 ) ， b a t h i n ga t6 5 f o r3 0m i n ，t h er a t eo ft h ep h e n o l c h l o r o f o r m i s o p e n t a n o ls o l u t i o n ， c h l o r o f o r m i s o - p e n t a n o ls o l u t i o n ，i s o p r o p y la l c o h o lt ot h es a m p l es o l u t i o nw a s0 6 ， 1 0 ，o 8 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ey i e l do fd n aw a s1 2m g ga n dt h e a 2 6 0 a 2 8 0v a l u eo fu l t r a v i o l e ts p e c t r u mw a sb e t w e e n1 7 5a n d1 81w h i c hs h o w e dt h e e x t r a c t e dd n aw a sw i t hh i g hp u r i t y 2 u s i n gc a r b o np a s t ee l e c t r o d e sm o d i f i e dw i t hc a r b o x y l i ca c i da sb a s i cs e n s o r s ， c i t r u l l u sd n ab i o s e n s o r sw e r ep r e p a r e da n dt h ec o n d i t i o n sf o rd n ad e t e c t i o nw e r e o p t i m i z e d t h eb a s i cs e n s o rc o n s i s t e do fo 5 0go fc a r b o np o w d e r , o 0 2 4go f c a r b o x y l i ca c i da n d0 2 8m lo fl i q u i dp a r a f f i n a f t e rp o l i s h e do nas m o o t hm i r r o r , i t s s u r f a c ew a sa d d e dw i t h5 5p lo fa c t i v a t i n gs o l u t i o n ( p h6 2 ) c o n t a i n i n g5 0m m o l l a c t i v a t o r1 ，8 0m m o l la c t i v a t o r2a n d0 0 2 0m o l ln a 2 h p 0 4 - n a h 2 p 0 4 t h e n5 0 l o fs s d n as o l u t i o n ( p h6 8 ) c o n t a i n i n g8 01 t g m lc i t r u l l u ss s d n aa n do 0 2 0m o l l n a 2 h p 0 4 - n a h 2 p 0 4w a sa d d e do n t ot h eb a s i cs e n s o rs u r f a c ef o rs s d n ai m m o b i l i z a t i o n t h ed n ah y b r i d i z a t i o nr e a c t i o na n dt h ed e t e r m i n a t i o no ft h ed n as a m p l e sw a s c a r r i e do u ti nh y b r i d i z a t i o ns o l u t i o n ( p h7 5 ) c o n t a i n i n go 0 4 0m o l ln a c i ，5 0 m m o l lt r i sa n d6 0l x m o l lo fh y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o ra t50 t h et i m ef o rd n a h y b r i d i z a t i o nw a s15m i n u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h el i n e a r i t yo fd e t e c t e dc i t r u l l u s s s d n ac o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m0 0 1p g m lt o0 15p g m l ，t h el o w e s td e t e c t i o nl i m i t i s11 4n g m la n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o ni s3 8 t h ed n ab i o s e n s o r sc a nb e u s e dt od i s t i n g u i s hd i f f e r e n tc i t r u l l u sb r e e d sa n di d e n t i f yp u r i t yo ft h em i x e dc i t r u l l u s s e e d s 3 t h es a m em e t h o dw a su s e dt op r e p a r es o y b e a nd n ab i o s e n s o r s t h eo p t i m u m 硕十学位论文 c o n d i t i o n sf o rs o y b e a nd n ab i o s e n s o r sp r e p a r a t i o nw e r ea sf o l l o w i n g ：t h eb a s i c s e n s o rc o n s i s t e do fo 5 0go fc a r b o np o w d e r ，o 0 3 2go fc a r b o x y l i ea c i da n d0 3 0m l o f l i q u i dp a r a f f i na n d5 0 lo ft h ea c t i v a t i n gs o l u t i o n ( p h6 4 ) w a sa d d e d t oa c t i v a t ei t s s u r f a c e t oi m m o b i l es o y b e a ns s d n a ，5 0p lo fs s d n as o l u t i o n ( p h6 8 ) c o n t a i n i n g 10 t g m ls o y b e a ns s d n aa n do 0 2 0m o l ln a 2 h p 0 4 n a h 2 p 0 4w a sa d d e do n t ob a s i c s e n s o rs u r f a c e t h ed n a h y b r i d i z a t i o ns o l u t i o n ( p h7 2 ) c o n t a i n e d0 0 4 0m o l ln a c l ， 5 0m m o l lt r i sa n d6 0t t m o l lo fh y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o ra n dt h eh y b r i d i z a t i o n r e a c t i o nw a sc a r r i e do u ta t6 0 f o r15m i n t h ed n ab i o s e n s o r sc a nb eu s e df o r q u a n t i t a t i v ea n dq u a l i t a t i v ea n a l y s i so fs o y b e a nd n a a n di ti sa l s oh o p e f u lt ou s et h e s e b i o s e n s o r sf o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o na f t e rf u r t h e rr e s e a r c h k e y w o r d s ：d i c o t y l e d o n o u sp l a n t ；d n a ；h y b r i d i z a t i o n ：h y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o r ； v o l t a m m e t r i cs e n s o r 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：舀巳多乒 日期：z o o s - ，月z 声日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密团，在 三年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期：厶r r 年，f 月z 日 日期：瞄年i t 月彬日 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1d n a 生物传感器概述 1 9 5 3 年w a s t o n 和c r i c k 提出了生物遗传分子脱氧核糖核酸( d n a ) 的双螺旋结 构，建立了生物遗传基因的分子机理，开创了生物学及生命科学在分子水平上研 究的新时代。由于d n a 是构成生物体遗传功能、维持生命各种机能正常运转的基 本单元，如果它在结构上稍有变动、差错、缺失或增多，就可能会导致遗传性状 的改变或各种疾病的出现，所以对核酸的研究已经成为生物化学、遗传学、分子 生物学和细胞生物学等生命科学研究领域的热点，其覆盖面之广、进展之速，为 其他学科所望尘莫及。随着分子生物学和生物技术的发展，特别是人类基因组计 划的实施，d n a 检测技术不断提高，日臻完善，为d n a 传感器的建立提供了可 能。在基因分析技术中，p c r 技术以其简便、快速、灵敏的优势，成为基因诊断 和分析的重要手段。但是p c r 技术存在着急需解决的二大问题：一是不能定量， 二是污染所致的假阳性吃。d n a 传感器的出现使对目的d n a 的测量时间大大缩短， 既可定性又可定量，灵敏度高、选择性好，而且不会产生放射性标记的危险性。 因此，近几年来受到了人们的广泛重视。d n a 传感器与酶、免疫等生物传感器不 同，d n a 分子识别层十分稳定，并且易于合成或再生，能重复使用。这一特性使 得d n a 生物传感器在基因分析领域发挥着重要的作用c 3 1 。 生物传感器是指在传感器的构成中，分子识别元件为具有生物活性的材料， 即生物活性材料膜层与相应的换能器的结合体，能实现对特定化学物质的作用并 产生相应的可检测信息( 如光、电、热、场效应和质量变化等) 的装置1 。d n a 生物 传感器是以d n a 为敏感元件或检测对象的传感器。其研究内容包括以下几个方面： l 特定序列d n a ( 目的基因等) 的检测，一般要借助于d n a 分子杂交方法； 2d n a 的非特异性检测，如d n a 存在与否、含量多少及片段大小等； 3 利用传感器原理来研究d n a 分子的理化特性，女f i d n a 的电化学研究等； 4 利用传感器原理来研究某些药物( 如抗癌药物、致癌剂等) 与d n a 的相互作 用，或是用于诱变剂的筛选与检测等。 因此，除了d n a 检测外，d n a 传感器还可应用于环境监控、药物研究、法 医鉴定及食品分析等众多领域，具有广阔的发展前景。 1 2d n a 生物传感器的分类和原理 d n a 生物传感器和其它的生物传感器一样，包含两部分，即分子识别器件 ( d n a ) 和换能器。识别器件主要用来感知样品中是否含有( 或含有多少) 待测物质， 双子叶植物d n a 传感器的制备及其应用研究 转换器件则将识别器件感知的信号转化为可以观察记录的信号( 如电流大小、频率 变化、荧光和光吸收的强度等) 。在待测物、识别器件以及转换器件之间由一些生 物、化学、生化作用或物理作用过程彼此联系。其设计原理是在电极上固定一条 含有十几到上千个核苷酸的单链d n a ，通过d n a 分子杂交，对另一条含有互补 碱基序列的d n a 进行识别，结合成双链d n a 。杂交反应在敏感元件上直接完成， 换能器能将杂交过程所产生的变化转变成检测信号。根据杂交前后检测信号的变 化量，推断出被检测d n a 的量。按检测信号种类可以分为d n a 光学传感器、d n a 压电生物传感器和d n a 电化学传感器。 1 2 1d n a 光学传感器 d n a 光学传感器包括光纤d n a 传感器、表面等离子体共振( s p r ) d n a 生物传感 器、光波导d n a 传感器、荧光d n a 传感器、拉曼光谱d n a 传感器和光寻电位式d n a 传感器等。 光纤d n a 生物传感器是d n a 传感器中发展最晚、技术最新的一类。光纤d n a 生物传感器的基体传感器为石英光纤，它的作用机理是利用石英表面先接上一连 接物，然后再将s s d n a 或c d n a 连在光纤端面上，与目的基因进行杂交，杂交后的 双链d n a 经生化反应产生的特征光学信号( 荧光、颜色变化等) ，通过光纤探头传递 至光检测器，经光电转换进而测定出杂交分子( 含目的基因) 的量。常用的杂交嵌合 剂是类能与d n a 双链优势结合的物质，如吖啶染料溴化乙锭( e b ) 及其衍生物 等。特别是溴化乙锭，它与d n a 结合后，荧光强度显著增加，并且它与d n a 的双 链区结合是专一的，利用它和各种构象的d n a 结合比率不同所产生的荧光强度的 变化，可以区分各种构象的d n a ，如能区分天然d n a 和变性的d n a ，区分s s d n a 、 c d n a 和超螺旋d n a 。 p i u n n o 等首次设计d n a 光纤传感器用于目的基因检测时选择了石英光纤作为 光学元件，光纤经过活化后，首先在光纤表面共价结合一个终端含有5 o 二对甲 氧基三苯基2 一脱胸腺嘧啶核苷的脂肪长链间隔分子。此亲脂手臂能与光纤表面的 硅烷共价结合，形成合成寡核苷酸链的固相支持物，随后将光纤置入固相d n a 合 成仪中，在光纤表面脂肪酸分子末端的胸腺嘧啶基础上合成含有2 0 个胸腺嘧啶的 寡核苷酸( d t 2 0 ) ，这样探针可直接固定在光纤表面。随后将光纤置于杂交液中，与 其互补序列( 含有2 0 个腺嘌呤的寡核苷酸d a 2 0 ) 进行杂交。完毕后注入溴化乙锭染 色，再用a r 激光器照射，激光荧光用摄像器材和微机进行分析”“，。p i u n n o 认为， 将d n a 探针直接合成在光纤上的优点是：传统杂交所固定的核酸没有方向性，而 直接将d n a 合成于光纤上不仅能知道所连d n a 的方向，而且能控制d n a 长度；杂 交速度比硝酸纤维素膜上杂交快1 0 l0 0 倍；光纤上的亲脂手臂为d n a 的合成和杂 交提供了足够空间，不会影响杂交效率；光纤上d n a 的量可由每个合成循环脱保 2 硕士学位论文 护所释放的三丙基阳离子的量来计算。此法能够检测出8 61 t g l 的核酸，一轮杂交 大约耗时仅为4 6m i n ，传感器的保存期限为3 5 - 月。 f e r g u s o n 等人报道了一个光纤传感器可以同时分析多种d n a 序列。由在尾部固 定有不同寡核苷酸的探针光纤组成一束光纤，固化荧光标记互补的寡核苷酸，其 杂交程度通过荧光强度可以观察 ，。这种方法可快速、灵敏地同时检测多个d n a 序列，对基因表达可以进行分析，是一种可以定量d n a 杂交的微型化的光纤d n a 生物传感器。 光纤d n a 传感器可检测杂交反应后产生的特征光信号，选择性强，易于排除 杂交过程中非特异性吸附的干扰，测定准确；因不采用放射性同位素标记探针， 安全性好。不足之处在于选择的发光反应信号较弱，需要加入嵌合剂来提高检测 灵敏度。 表面等离子体共振( s p r ) 技术通常是将某种单链d n a 分子固定在几十纳米厚 的金属( 金、银等) 膜表面，加入与其互补的单链d n a ，两者的结合将使金属膜与溶 液界面的折射率上升，从而导致共振角度改变。如果固定入射光角度，就能根据 共振角的改变程度对互补的单链d n a 进行定量。这一原理可用于分子杂交的快速 检测。关于s p r d n a 生物传感器的报道很多，主要集中于基因突变的检测、p c r 产物的测定、病毒和其他微生物的检测以及传感器的技术性能等方面的研究。 w a t t s 等用共振镜装置设计了一套d n a 传感器，他们通过链霉亲和素生物素系统将 探针标记在一种光学传感器共振镜上，将其浸入到含有靶核酸的杂交液中，经过 1 5m i n 杂交后检测其共振频率发生的变化，从而推断出被检核酸量馆，。大约每平方 毫米这种传感器表面可以检测到2 6 3p g 核酸，杂交耗时较短( 1 5m i n ) ，传感器可重 复使用，但所需设备较昂贵。牟颖等以人工合成丫干扰素( i n t e r f e r o ng a m m a ，i f n 丫) 寡聚核苷酸片断为探针，用化学法标记生物素探针，利用生物素一亲合素系统相互 作用固定在传感器表面的d n a 探针，使用自制的简易s p r 传感装置实时监测了 d n a 探针的固定过程及d n a 杂交反应的进行。成功应用于i f n 吖寡聚核苷酸的检 测，测定范围为5 0 - - 一4 0 0n g m l ；用于i f n - 丫的聚合酶链反应( p o l y m e rc h a i nr e a c t i o n ， p c r ) 扩增产物检测，测定范围为5 - 4 0n g m l ，同时研究了传感器的稳定性可逆性 及干扰情况阳1 。 b i a n c h i 报道生物传感器技术用于生物特异性反应分析时，表面等离子体共振 能够实时监测不同分子反应1 0 。如果配体是生物素化的单链d n a ，这种技术可以 监测d n a d n a 杂交。杂交步骤要求分子诊断的特异性，因此，这种方法适用于 病毒学。具体做法是将生物素化的h i vi 寡核苷酸探针固定在一个传感片上，和 利用不对称p c r 扩增的单链d n a 进行杂交，采用生物传感器技术和表面等离子 体共振对h i vi 进行实时分子诊断。这个检测过程简单、快速( 3 0m i n ) ，并可以再 生，可以作为实验室工作站自动分析系统，可以用于d n a 的分离、p c r 产物的分 3 双子叶植物d n a 传感器的制备及其应用研究 析等。n i l s s o n 用实时生物特异性作用分析( b i a ) 检测临床样品p c r 产物的突变， 将生物素化的p c r 产物或寡核苷酸探针固化在传感芯片上，全配和错配位置杂交 水平的不同，可应用在人肿瘤p 5 3 抑癌基因外显子6 的p c r 产物的点突变检测中 ，。p o l l a r d k n i g h t 利用表面等离子共振传感技术对免疫反应和核酸进行测定，在5 m i n 内，lm m 2 的面积上固定的寡核苷酸探针可以检测到1 0f m o l 的9 7 个碱基的靶 序列m ，。这种检测的优点是可以实时检测杂交的动力学反应，并且不需要标记。 g o t o h 用一种简单的、不需要复杂的d n a 标记的表面等离子体共振技术检测 d n a d n a 反应的动力学参数，检测错配对d n a 杂交动力学的影响。用小于2 0 碱基的人工合成含互补序列或错配碱基的寡核苷酸检测d n a 杂交动力学，发现错 配的数量及其在d n a 中的位置对杂交动力学有重大影响引。另外，传感器技术非 常灵敏，能够检测单碱基错配引起的杂交动力学的变化。研究还表明，涉及d n a 反应的杂交动力学分析对检测双链d n a 上的错配碱基是非常有益的。 光波导d n a 生物传感器c t 钔是在光波导载波片表面上固定s s d n a 探针阵列， 将光波导载波片与另一载波片叠放在一起，中间形成1 7 5 “m 厚，2 5 4c m 宽的通 道。在此通道中含有生物素标记的d n a 和抗生物素硒结合物的溶液与s s d n a 探 针杂交，抗生物素与生物素结合，使硒粒子聚焦在光波导载波片表面s s d n a 探针 的杂交部位上。以灯光经狭缝照射光波导边缘，光线在波导内以全反射方式传播， 在溶液中距波导载波片表面1 0 0 - - - ，3 0 0n m 范围内形成隐失波场，而波导表面聚集 的硒粒子可在隐失波场中产生光散射。利用c c d 相机可记录下散射光信号的图样， 经计算机分析处理，可获得d n a 杂交的图谱。 荧光d n a 传感器是在d n a 探针中或待测靶基因中标记上荧光标记物，也可 在d n a 杂交后加入荧光标记物。通过测定荧光标记物嵌入d n a 双螺旋间所导致 的荧光信号的变化来检测d n a 。荧光检测技术虽不是什么新技术，但激光荧光分 析、时问分辨荧光分析以及共振能量转移荧光分析等技术在d n a 传感器的研究中 发挥了有力作用。s y v a n e n 等利用时间分辨荧光分析技术检测了腺病毒d n a ，检 测限达o 3p g s ，。o k a n o 等利用a r 激光器为光源测定荧光标记d n a ，检出限达到 1 0m m o l l 的水平1 6 1 。 另外一种就是拉曼光谱d n a 传感器。拉曼光谱( r a m a n s p e ct r o s c o p y ) 是化学分 析中一个强有力的工具，因为它需要较昂贵的设备并且敏感性低，所以应用受到 了限制。只从人们发现某种化合物吸附到金属表面可以增强拉曼效率时，这种技 术又赢得了人们的广泛兴趣。用这种技术对基因探针进行标记，就可以得到表面 增强拉曼基因探针( s u r f a c ee n h a n c e dr a m a ng e n ep r o b e s ，s e r gp r o b e s ) 。目的核酸 固定在硝酸纤维素膜上，加入s e r g 探针，过夜杂交后洗去未结合探针，用光纤、 激光器、摄像器材和微机分析拉曼光谱就可以得出结论1 7 。这种技术分析核酸需 要的时间较长( 约1 5h ) ，并且所需设备较昂贵复杂，所以可行性较差。 4 硕十学位论文 总的来看，光学d n a 传感器的重复利用率较高，但由于所需设备仪器都比较 复杂和昂贵，在一定程度上限制了它的应用。 1 2 2d n a 压电生物传感器 利用压电晶体表面微小的压力变化会引起其振动谐振频率改变这一原理，测 量其谐振频率的变化可以测量出晶体表面的压力变化。其频率一质量之间存在如下 关系【i i 】： a f = 2 2 6 x 1 0 。6 a m x f a a 式中a m 为表面质量的改变( g ) ，a f 是由附着质量a m 引起的频率改变，f 为工 作频率( h z ) ，a 是石英晶体电极区的面积( c m 2 ) ，负号表示质量的增加导致频率下 降。 压电晶体d n a 生物传感器是以石英晶体谐振器为换能器，在石英晶体电极区 的表面固定s s d n a 探针，然后浸入含有被测目标s s d n a 分子的溶液中，在溶液 中电极表面的s s d n a 探针与互补系列的目标s s d n a 分子杂交，形成d s d n a ，引 起石英晶体谐振器的振荡频率发生变化，振荡频率随电极表面上的质量增加而减 小，通过检测频率的变化达到测量的目的。这种传感器的灵敏度可以达到亚纳克 级。 f a w c e t t 等首先利用压电传感器发现固定在石英晶体表面的基因杂交后会引起 共振频率的明显变化，并利用晶体振荡频率的变化测定靶核酸量，对核酸的相互 作用也进行了研究，为压电d n a 传感器的发展作出了开创性的工作1 9 。在f a w c e t t 的基础上，日本o k a h a t o 等人采用了一个9m h z 的a t 切割的镀金石英晶体，利用 1 0 个碱基的能与单链的m 1 3 噬菌体d n a 的e c o ri 结合位点互补的脱氧核糖核苷 酸作为探针，研究了由于杂交引起的频率差随时间的变化，获得了满意的结果， 同时研究了不完全互补的靶d n a 的杂交情况2 0 。i t o 等观察了溶液酸碱度对d n a 连接的影响，发现在酸性或碱性条件下，d n a 探针连在电极上的量最多，而在中 性溶液中，d n a 杂交效果最好。还发现将双链d n a 连在电极上之后加热变性成 单链，比单链d n a 直接连在电极上杂交的d n a 量多。他们认为出现这种差异可 能是由于连在电极上的单链d n a 所产生的杂交空间位阻比双链d n a 大所致洲2 1 。 一般来说，电极上d n a 探针量与杂交d n a 量之比仅为1 0 0 ：1 。n i i k u r a 等用生物 素亲合素的固定化方法，将模板和引物固定在2 7h z 的镀金的压电石英晶体电极 上，在电极上直接进行p c r 反应，可以在液相直接定量检测p c r 的每一步反应1 2 2 。 c a m p b e l l 等研制的一种压电晶体传感器是利用晶体表面质量变化原理构建的，这 种传感器是a t 切割、9m h z 压电晶体构成。含有核酸探针的叠氮基化合物固化在 晶体表面，也就是用含有p o l y a 的叠氮基物质包被晶体，检测p o l y u 杂交，杂交 在液体中完成，频率的测定在干燥状态下完成2 3 。这个系统的优点是可将多个探 双子叶植物d n a 传感器的制备及其应用研究 针固化在晶体上，可以重复使用，且不需要标记。还有一类压电晶体d n a 生物传 感器是根据压电晶体的声学特性来设计的比如：副。厚度剪切模式声波传感器( t h i c k n e s s s h e a rm o d ea c o u s t i cw a v es e n s o r ) 也是一种9m h z 、a t 切割的压电晶体，经处理后 将一段寡核苷酸固定在传感器表面，含有互补序列的杂交液流经传感器表面，在 声波衰减长度区域内，系列共振频率的变化与杂交时d n a 依赖的粘度变化存在着 一定的关系【2 引。根据声学网分析( a c o u s t i cn e tw o r ka n a l y s i s ) 就可以推算出被检物的 量。s u 等又将这种技术推广应用到d n a 连接抗癌药物浓度的测量，结果表明检 测药物浓度可达1 0 。7m o l l 比卯。 压电d n a 传感器对检测特定d n a 序列是一种新的有效方法，在基因检测中 能发挥重要作用。这种d n a 传感器与其他类型的d n a 传感器相比，不需要标记， 且检测器体积小，便于携带，仪器及使用材料价格便宜，使用方便，商品化后易 于推广。其不足之处是难以排除非特异性吸附的干扰，检测灵敏度还需进一步提 高。 1 2 3d n a 电化学传感器 、电化学d n a 传感器主要由表面固定了s s d n a 探针的基体电极( 如金电极、玻 碳电极和碳糊电极等) 和检测用的电化学杂交指示剂( 即标识物) 两部分构成( 图 1 1 ) 。s s d n a 片段长度范围一般从十几个碱基到几十个碱基直至上千个不等，通常 采用人工合成的短链寡聚脱氧核苷酸，其碱基序列与样品中的靶序列互补。在适 当的温度、p h 和离子强度条件下，固定在电极上的s s d n a 与杂交缓冲溶液中的 靶基因发生选择性杂交反应。如果样品中含有完全互补的d n a 片段则在电极表面 形成d s d n a ，从而引起电极上电流值的变化，利用微分脉冲或循环伏安法可检测 出d s d n a 杂交信号。 ： m 9 1 l k 1 1 l - - r i i - l - - m 4 b i l r l l i r i d i , a t i o , , , i a c l , e 1 t i nm p e o l i 虻k h 繇 7 图1 1 电化学d n a 传感器的原理示意图 这类传感器依靠生物体内物质问特有的亲合力，可快速而直接获取复杂体系 组成信息，具有选择性好、种类多、测试费用低及适合联机化的优点，又有电分 析化学的不破坏测试体系、不受颜色影响和简便的特点，能广泛应用于医疗、工 业生产、环境监测等领域。电化学d n a 传感器是近几年来迅速发展起来的种全 新的生物传感器。 6 硕十学位论文 电化学d n a 传感器属于核酸修饰电极( n a m e ) 中的一种。与核酸修饰电极 一样，根据基体电极的类型不同，可以将其分为以下两大类：第一类为d n a 修饰 汞电极，主要是悬汞电极( h m d e ) ，早期主要是采用d n a 修饰汞电极。由于汞电 极易得到新鲜、重现的电极表面，能方便地修饰d n a 。f o j t a 以悬汞电极为基体， 根据超螺旋d n a 、线性d n a 和变性d n a 三者电化学信号的差异，用吸附转移溶 出伏安法对低于斗g 级的三种d n a 进行了检测吃引。但汞呈液态且有毒性，一定程 度上限制了其使用，故不宜作为传感器或检测器的电极材料。第二类为d n a 修饰 固体电极，包括金电极、玻碳电极( g c e ) 、碳糊电极( c p e ) 、裂解石墨电极( p g e ) 、 定向裂解石墨电极( h o p g e ) 、碳条电极( c s e ) 等。碳电极直到近几年与电位溶出分 析( p s a ) 技术结合后，才成为d n a 的另一种重要基体电极，在高效液相色谱 ( h p l c ) 、毛细管区域电泳( c z e ) 、流动注射分析( f i a ) 等流动系统的检测器或各种 传感器方面有很大的实用价值。近期对于电化学生物传感器的研究中，使用各类 碳电极的实例较多吃钆，。例如w a n g 等用d n a 修饰碳糊电极来检测环境污染中的 主要成分之一一各类芳香胺类化合物，胺基在苯环不同位置的取代会引起响应值 的巨大变化，灵敏度因此得以提高，检测限可以达到1 0 一m o l le ：g l 。孙星炎等研究 了在不同致突变剂的作用下，以石墨电极为基体电极，特定碱基序列的d n a 在电 极表面能否杂交及杂交程度的差异，探讨了d n a 突变情况及可能的突变机理。 但是，以碳电极为基体电极的传感器有两个缺点1 3 2 1 ：第一，d n a 探针通过磷酸基 团沿主链化学吸附在碳电极表面，探针由于结合点过多而降低了杂交活性。而在 理想体系中，探针与表面结合后所有相应碱基都应该能与待检测的d n a 发生反 应。第二，在应用杂交指示剂进行表征时，许多嵌入剂川不仅与杂交态的双链d n a 结合而且与d n a 主链中的磷酸基团通过静电反应发生吸附( 即发生非特异性吸 附) 。这些现象都降低了d n a 传感器的灵敏度。金电极作为基体电极虽然早已用 于电化学研究，但d n a 修饰金电极的应用远不如碳电极普遍。w a n g 在对一种与 人类免疫缺陷病毒i 型( h i vi ) 相关的短d n a 序列进行测定时( 以c p e 和c s e 为 基体电极) 甚至提到了若用金圆盘电极进行d n a 膜的组装，以用于杂交测定，其信 噪比与碳糊电极相比有所降低，且探针组装时间过长( 大约2d ) b 。但是如果不是 将d n a 分子直接固定在金电极表面，而是利用巯醇衍生物能很强地吸附在金表 面，采取自组装巯醇单分子膜技术，在分子水平修饰电极，使电极表面功能化， 就可以在一定程度上缩短探针组装时间。所谓自组装单分子膜( s a m ) 是指基于分子 的自组作用，在固体表面上自然地形成高度有序的单分子层。产生这种效果的原 因是由于巯基与基体材料的强烈化学结合和聚亚甲基链的定向排列。在金表面， 巯基被氧化而形成硫金化合键，a u s 之间的结合力很强，保证了这种吸附的选择 性，而且不会被水和有机溶剂溶解洗脱。许多研究者都认为只有当d n a 通过5 或3 端与电极表面固定时才能得到高的杂交率”别。在自组装硫醇单分子膜中，d n a 7 双子叶植物d n a 传感器的制备及其应用矽f 究 通过修饰在5 或3 端的巯基与金表面结合，故恰恰满足了这一要求。另外，s a m 对酸、碱和离子渗透都有较强的抵抗能力，在超低温、超高真空( u h v ) 条件下也能 保持稳定 3 3 1 。这一技术结合了化学吸附的稳定性和l b 膜的有序性，通过变化头基、 尾基以及链的类型和长度，可以控制和改变单层的结构和性质，通过选择适当的尾 基可以赋予s a m 外表面以特定的性质并可为进一步组装提供活性结合点。 h a s h i m o r o 等将一个2 0 聚体的核苷酸一端修饰上s h ，再通过s h 在金表面进行探 针修饰( 探针组装时间为1 2h ) ，检测了p v m 6 2 3 的p a r ti 片断上的致癌基因v - m y c ， 检测范围在1 0 1 0 。1 3g m u 3 2 ，。h e r u e 等报道了用5 端带有巯己基的s s d n a ( 5 一 h s 一( c h 2 ) 6 一c a c g a c g t t g t a a a a c g a c g g c c a g 一3 ) 固定在清洗过的金电极 上，探针固定时间可以进一步缩短，仅需要1 2 0m i n 就可达到最佳固定效果”引。 p e t e r l i n z t 3 5j 也做了类似报道。与上述将s h 直接修饰在d n a 上的方法不同，陆琪等 在对d n a 修饰电极的研究系列中指出，由于s h 修饰的d n a 难以合成，且需要 分离提纯，操作繁琐，加之巯基化合物结合d n a 后体积大幅度增加，在金表面自组 装比较困难，故采用先进行s h 化合物自组装，得到自组装单分子层( s a m ) ，再在 s a m 上共价键合或吸附固定d n a 的方法制备d n a 修饰电极，并对所得到的d n a 修饰电极进行了电化学和谱学表征门副。值得一提的是，h e r e u 在进行互补d n a 的 杂交之前，将经过探针组装之后的金电极暴露于1 0m o l l 的巯己醇中保持1h ， 从而使金表面被巯己醇饱和，有效避免了以后的步骤中杂交d n a 及指示剂的非特 异性吸附( 图2 ) 您引。 “) 金表面经i l i s - c 5 1 i h a 固定后的示意图 o ) 金表面经k s - s s d i i a 固定并经藩饱和后的示意图 图1 2 金表面经自组装后的表面状态示意图 刘盛辉等报道了用氨基乙硫醇在金电极表面形成自组装单分子膜，然后用水 溶性的碳化二亚氨作为偶联活化剂，使s s d n a 的5 末端磷酸基与电极表面