（化学工程专业论文）旋转壁式生物反应器内神经干细胞的培养研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 神经干细胞应用于移植治疗人类中枢神经系统退行性疾病及脊髓受损等疾病展示了 光明的前景。同时，它也为药物测试提供了快速、简便、有效的筛选平台。但目前神经 干细胞的来源非常有限，其数量远远不能满足人类研究和应用的需要，因此，体外大规 模获得神经干细胞是一项亟待解决的课题，但当前关于这方面的研究却较少。因此，本 文旨在研究神经干细胞体外悬浮培养的方法，通过对各个培养条件的研究，在保持神经 干细胞特性的同时，达到能够使其在体外快速、高效的扩增目的。 本论文研究应用旋转壁式生物反应器( r w v ) 大规模培养神经干细胞。 首先从孕1 3 1 5 天小鼠的胎鼠前脑部位分离获取神经干细胞，在体外悬浮培养，并 通过显微观察、免疫荧光等方法对其进行干细胞特性检验。结果显示，所获取的神经细 胞能在体外以聚集球形式悬浮生长，分离培养的细胞确为神经干细胞。从而保证了所研 究对象的准确性，并为实验准备了数量充足的神经干细胞。 其次，对旋转壁式生物反应器内神经干细胞的大规模培养作了有关神经干细胞培养 条件及旋转壁式生物反应器培养条件的预实验。以静态培养为基础，根据扩增倍数比较 实验得出较适宜的接种密度- 2 1 0 5 c e l l s m l ；通过观察分析及直径分布统计实验，得到细 胞生长到5 6 天( 神经球尺寸在1 0 0 l m a ) 时是最佳的传代时间。同时，利用血气分析仪 对旋转壁式生物反应器内的氧条件进行分析，对比静态孵箱中的氧培养条件，实验得到 在直接充氧的氧供应方式及0 2 7 3 m l m i n 的培养基灌注率下，旋转壁式生物反应器可为细 胞生长提供适宜的氧环境。并且根据分析及实验得到r w v 的适宜转速为7 - 1 0 r p m 。 最后，在预实验的基础上，将神经干细胞以2 x1 0 5 c e l l s m l 的密度接种到确定好条件 的旋转壁式生物反应器内进行悬浮培养。通过显微观察、c e k - 8 试剂盒、免疫荧光、核型 分析等方法分析细胞的生长状态、增殖能力和干细胞特性，并检测培养过程中营养物质 的代谢情况。同时与静态t - f l a s k 中的培养进行对比研究。结果表明，r w v 中培养的神 经千细胞能以聚集形式悬浮生长，生长的细胞状态良好，干细胞特性及遗传特性良好。 与静态t - f l a s k 中培养相比，r w v 中培养的细胞扩增倍数大于静态培养的细胞，倍增时 间远小于静态培养的细胞，说明r w v 中培养的神经千细胞具有较好的扩增能力和较强 的细胞活性。因此，旋转壁式生物反应器适于建立一种理想的神经干细胞体外培养的三 维体系。 关键词：旋转壁式生物反应器；神经于细胞；大规模培养 旋转壁式生物反应器内神经干细胞的培养研究 t h ec u l t u r eo fn e u r a ls t e mc e l l si nr o t a t i n gw a l lv e s s e lb i o r e a c t o r a b s t r a c t n e u r a ls t e m c e l l s ( n s c s ) ，a st h e r a p e u t i ca g e n t s ，h a v ei m p o r t a n tp o t e n f i a l c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s f o rt h et r e a t m e n to fc e n t r a ln e r v o u s s y s t e m d i s o r d e r ss u c ha sp a r k i n s o n s h u n t i n g t o n s a n dt h e yr e p r e s e n tap o t e n t i a ls o u r c eo fn o n - l r a n s f o r m e dc e l l sf o rd r u gt e s t i n g h o w e v e r , g r e a tq u a n t i t i e so f n s c s a l en e e d e d a n dn o wt h er e s o u r c eo f n s c si sl i m i t e dv e r y m u c h c o n s e q u e n t l yt h e r ei s a l lu r g e n td e m a n dt oe x p a n dt h e s ec e l l s nv i t r o t h ea i mo f t h i s s t u d y i st od e v e l o pb i o r e a c t o r p r o t o c o l sf o r t h e l a r g e - s c a l ee x p a n s i o n o f m a r n m , , d i a nn e u r a ls t e m c e l l s ， i nt h e s t u d y , n s c s w e r ee x p a n d e di ns u s p e n s i o ni nr o t a t i n gw a l lv e s s e l b i o r e a c t o r ( r w v 3 i nl a r g es c a l e ， f i r s t l y , n s c sw e r eo b t a i n e df r o mt h ef o r e b r a l no ne m b r y o u l ed a y1 3 1 5m 1 3 1 5 ) k m m o u s e e m b r y o s a n dc u l t u r e di nv i t r o 耵1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s ec e l l se a r l 掣o wi nt h e w a y o f n e u r o s p h e r e sa n de x p r e s s e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f n s c s w e l l t h e nt h es t u d yw a se n s u r e dw i t h p r e c i s ea n de n o u g h n s c s t h r o u g h t h ec u l t u r e s e c o n d l y , t h ep r e e x p e r i m e n t sa b o u tn s c sa n dr w v 黼p e r f o r m e d 耵狞o p t i m a l i n o c u l a t i o no f 2 1 0 3 c e l l s m w a so b t a i n e d t h r o u g h t h ec e m p a r i s o n o f e n l a r g e m e n tm u l t i p l eo f n s c su n d e rd i f f e r e n t i n o c u l a t i o n s p a s s a g i n g t i m ew a sd e t e r m i n e di n5 s t - 6 s t d a y ( t h e n e u r o s p h e r ed i a m e t e ro f1 0 0 岬) a f t e ri n o c u l a t i o nt h r o u g ht h em i c r o s c o p eo b s e r v a t i o na n d n e u r o s p h e r ed i a m e t e ra n a l y s i s m e a n w h i l e ，t h eo x y g e n c o n t e n t si nt h em e d i u mw a s a n a l y z e db y u s i n g t h e b l o o d g a sa n a l y z e r a n dc o m p a r e dw i t ht h ec o n d i t i o n si ni n c u b a t o r t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h e p r o p e ro x y g e n c o n t e n t si nr w vc o u l db er e a l i z e du n d e rt h ed i r e c to x y g e nc o n t a c tw i t h t h em e d i u ma n dt h em e d i ac i r c u l a t e dr a t eo f0 2 7 3 m y m i n a n dt h ea p p r o p r i a t er w v m t a t i i 】g r a t eo f 7 1 0 r p mw 船d e t e r m i n e d t t o u g h t h e a n a l y s i sa n de x p e r i m e n t s f i n a l l y , b a s e do n t h ec o n d i t i o n sa b o v e , n s c sw e r ei n o c u l a t e di n t or w v n s c sc u l t u r e d i nr w vw e r ee v a l u a t e di nt h ea s p e c t so fg r o w t hs t a t ea n da b i l i t yo f p m l f f e m f i o ma n dt h e p r o p e r t yo fs t e mc e h sw a sa s s a y e dw i t ht h em e t h o d so fm i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n , c c k - 8k i t s ， i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n dk a r y e t y p ea n a l y s i s m e a n w h i l et h em e t a b o l i s mo ft h ec e l l sw a sa l s o e x a m i n e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tn s c se a r ls u c c e s s f i a l l yb e e x p a n d e d i ns u s p e n s i o nc u l t u r ei n r w v n s c si nr w v g r e w w e l la n dr e m a i n e dt h e i ra b i l i t yt od i f f e r e n t i a t ei n t oa l lt h r e em a j o r c e l lt y p e so ft h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ( c n s ) - - n e u r e n s ，a s l r o e y t e s ，a n do l i g o d e n d r o c y t e s m o r e o v e r , c o m p a r e dw i t hn s c s c u l t u r e di nt - f l a s k , n s c sc u l t u r e di nr w v d i s p l a ym o r e * 大连理工大学硕士学位论文 e n l a r g e m e n tm u l t i p l ea n d l e s sd o u b l i n gt i m e ，i nc o n c l u s i o n , m t a 血gw a l lv e s s e lb i o r e a c t o ri s 锄 i d e a lt h r e e d i m e n s i o n a ls y s t e mt oc u l t u r en e u r a ls t e mc e l l s k e yw o r d s ：r o t a t i n gw a l lv e s s e lb i o r e a c t o r ；n e u r a ls t e mc e l l ；l a r g e - s c a l ec u l t u r e - 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理工大学 或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：警丝趣日期：泣些：笸：z 量 大连理工大学硕士学位论文 引言 神经干细胞是指具有自我更新能力并且能够分化产生中枢神经系统中所有三种类型 细胞一神经元，星型胶质细胞，少突胶质细胞的一种多潜能干细胞。它移植入脑后可替 代损伤和死亡的神经元，重建神经元回路，并在损伤部位的首端和尾端起中断作用，恢 复损伤的脑功能。同时，神经干细胞还可以通过基因修饰使其表达外源性基因，然后将 其移植到受损部位，使它们分泌大量的治疗性神经营养因子，以防止神经元死亡并促进 神经再生。因此，无论是对脑神经退行性疾病还是对脊髓损伤，均可以通过神经干细胞 移植的方法来重建中枢神经系统。另外它还可以作为神经药物的筛选平台。因此，在神 经系统疾病治疗方面，神经干细胞自发现以来就展示了前所未有的潜能。尽管如此，目 前神经干细胞的来源却非常有限，其数量远远不能满足人类研究和应用的需要，因此开 发体外大规模培养神经干细胞技术就成了人们所热望的研究课题。而应用大容积的生物 反应器技术则是解决这一问题的有效方法。 目前有报道对神经干细胞进行大规模扩增研究的只有加拿大的药物研究小组 ( p h m m a c e u t i c a lp r o d u c t i o nr e s e a r c hf a c i l i t y , p p r f ) 。从1 9 9 8 年，他们陆续报道了有关 的研究结果。在p p i 心的研究中，他们选用传统的s p i n n e rs t i r r e r 反应器对细胞进行扩增 培养。尽管取得了一定的成功，但这种搅拌式生物反应器由于外部机械搅拌装置的存在， 不可避免地对神经干细胞造成很大的机械损伤，而神经干细胞又是一种对环境非常敏感 的细胞。同时，他们选用了永生化的神经千细胞系作为实验细胞进行研究，这有偏于真 实神经干细胞的情况。因此，从这两方面而言，他们所作的研究还有待于进一步的深入， 针对生物反应器的问题，h s i n g e h ij l i n 等人“3 在2 0 0 4 年末中的文献报道，他们选用旋转 壁式生物反应器来培养神经干细胞，但是他们是将神经干细胞接种到胶原支架上，将神 经干细胞和支架一起在旋转壁式生物反应器内培养。研究取得了较好的结果，神经干细 胞能够在胶原内很好的生长。然而，i - i s i n g e l a ij l i n 等人并未对神经干细胞的扩增进行研 究，雨只研究了神经干细胞在反应器内的分化行为。除此，再未有神经千细胞在生物反 应器内大规模培养的研究报道。 因此，基于目前的研究成果、现状及意义，我们从e 1 3 1 5 天的昆明种孕小鼠的胚胎 前脑部位获取神经干细胞作为研究对象，将其接种入新型旋转壁式生物反应器内进行体 外培养，研究生物反应器各项参数对神经干细胞生长的影响，以及神经干细胞在其内的 生长行为、生长规律及细胞特性等，最终为神经干细胞的体外大规模培养提供实验基础 和理论指导。 旋转壁式生物反应器内神经干细胞的培养研究 1 文献综述 1 1 神经干细胞 1 1 1 千细胞定义及分类 干细胞嘲( s t e mc e l l ) ，是机体内存在的一类特殊细胞，是一种既有自我更新的能力 又具有多向分化潜能的原始未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的原祖细胞。在合适 的条件或给予合适的信号下，它可以分化生成为属于特定组织的、具有特征性形态和特 殊功能的细胞，如肌细胞，神经细胞，血红细胞等体细胞。 干细胞不同于一般的体细胞，在于它的独特性：1 ) 具有无限分裂，增殖和自我更新 能力，普通的体细胞是不能够自我复制的；2 ) 它是未分化的或非定向的，即它不具有属 于特定组织的功能，如肌肉收缩，神经传递，氧气运输等，并可长期保持这种特性：3 ) 它具有多分化潜能，在合适的条件下或受到合适的信号启动，可诱导分化为具有特定功 能的、定向的子代细胞。 干细胞按其发育阶段分可分为胚胎干细胞( e s c ) 和成体干细胞( a s c ) ，如造血干细 胞、骨髓间充质于细胞、神经干细胞、肌肉千细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞和视网 膜干细胞等是成体干细胞。胚胎干细胞来自于胚胎早期发育期间囊胚泡内的内细胞团， 它的特点是具有发育全能性，理论上可以诱导分化为机体中所有的细胞类型。成体干细 胞是存在于分化组织中的未分化( 非定向) 细胞，它能够自我更新并且能够分化形成属 于该组织的具有特殊功能的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中，目前发现 成体干细胞的组织器官主要有：骨髓，血液，眼角膜，视网膜，大脑，骨髂肌，牙髓， 肝脏，皮肤，胃肠道内层，胰腺等。 按分化潜能的大小，干细胞可分为三种类型：类是全能干细胞，它具有形成完整个 体的分化潜能，如胚胎干细胞；另一类是多能干细胞，它具有分出多种组织细胞的潜能， 但却失去了发育成完整个体的能力，受到一定的限制，如骨髓中的多能造血干细胞；还 有一种是单能干细胞，这类细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型细胞分化，如上 皮组织基底层的干细胞和肌肉中的成肌细胞是单能干细胞。 1 1 2 神经干细胞定义 神经干细胞( n e u r a ls t e mc e l l s ，n s c s ) ，根据m c k a y 咖，1 9 9 7 年在s c i e n c e 上发 表的文章，是指具有自我更新能力并且能够分化产生三种中枢神经组织细胞一神经元， 星型胶质细胞，少突胶质细胞的种于细胞。 大连理工大学硕士学位论文 经典的神经系统理论认为：哺乳动物中枢神经系统内的神经细胞是终末分化的细胞， 其再生和迁移的机制都已关闭，神经系统受损后部分功能的恢复主要是由神经突触的可 塑性和神经功能的代偿性决定的，并非产生了新的神经细胞。也就是说哺乳动物中枢神 经系统从根本上缺乏结构的重塑性。因此一旦造成病变，神经功能的缺失将是不可逆的。 但是上世纪八十年代，神经干细胞的发现打破了这一传统理论，并为神经系统疾病的治 疗开辟了崭新的光明道路。 1 9 6 0 年开始，人们采用了氚标记胸腺嘧啶核苷酸法，以及后来的逆转录病毒介导基 因转移方法证实了成年哺乳动物中枢神经系统存在着分裂细胞。1 9 9 2 年，r e y n o l d s 和 w e i s s 旧首次从成年小鼠纹状体分离出神经前体细胞，并用含表皮生长因子( e g f ) 的无血 清培养基在体外实现了细胞的悬浮聚球生长。随后r e y n o l d s 和w e i s s 0 1 对该细胞进行了 克隆和群体分析，结果表明分离出的细胞具有哺乳动物神经干细胞的特性，能在体外不 断的分裂增殖，而且具有多种分化潜能，可以诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突 胶质细胞。此后，又有很多实验分别证明了包括人在内的哺乳类动物的胎脑和成脑中均 存在多潜能神经细胞，使人们对神经干细胞的存在确认无疑。哺乳动物成年脑组织内多 潜能的干细胞的发现，是对哺乳动物中枢神经系统不能再生的长期看法的第一次的突破。 它为重建受损的神经系统组织、治疗以帕金森症为代表的神经退行性疾病带来了可能， 是上世纪最后十几年在神经生物学领域内的最重要进展之一。 1 2 神经干细胞来源及位置 研究表明，神经干细胞广泛存在于哺乳动物胚胎脑内中枢神经系统组织中。 w i l l i a m s “等通过基因工程法，用重组反转录病毒把l a c z 结构基因导入来自胚胎大鼠大 脑皮层的前体细胞，作为细胞标记。然后通过免疫组化的方法检测l a c z 病毒编码的细菌 源性b 一半乳糖苷酶，以得到前体细胞的增殖情况。结果显示这种处于神经发育期间， 大脑皮层的前体细胞具有分化成神经元和少突胶质细胞的潜能。1 9 9 4 年d a v i s 哪等从大 鼠胚脑皮层分离、培养出神经干细胞。随后，研究者们分别从鼠类胎脑海马、皮层、室 管膜、嗅球以及中脑等脑区分离、培养出神经干细胞。1 9 9 9 年v e s c o v i 咖从人胚胎大脑 分离出了神经干细胞。 哺乳动物成年脑内也显示出拥有未分化的、可有丝分裂的活跃前体或干细胞，它们 存在于成年大脑中的一些特定区域。1 9 9 2 年，r e y n o l d s 嘲等，首次从成年小鼠纹状体分 离出神经前体细胞，其在体外可分化增殖成神经元和胶质细胞。m o r s h e a d 衄等对成年小 鼠脑进行了在体和离体研究，免疫双标染色显示室管膜区和室管膜下区均有单独呈 旋转壁式生物反应器内神经干细胞的培养研究 n e s t j n 阳性的细胞，体外培养能分裂增殖形成神经球。c h i a s s o n “”等用微解剖方法证明 神经于细胞主要存在于室管膜下区。而j o h a n s s o n “。等的实验表明神经干细胞主要存在 于室管膜区。p a l m e r o ”研究发现大鼠成脑的海马状体内存在着具有高度可塑性的神经前 体细胞。e r i k s s o n “”等用类似方法从成年人脑中的海马状体分离出神经干细胞。其后， 研究者发现嗅球、海马及大脑皮层均存在具有自我更新能力和多分化潜能的细胞。现在 已有报道，成年鼠的纹状体、海马齿状回、嗅球、脊髓等处，及成年人的嗅球、侧脑室 壁、海马等部位都培养出了神经千细胞或神经前体细胞。 1 3 神经干细胞的生物学特性 神经干细胞有其独特的生物学特性，这包括以下几点： 1 3 1 自我更新 在干细胞体外培养实验中发现神经干细胞在丝裂原信号的刺激下能维持相当长的时 间。6 r i c i t “。报道b f g f 依赖性神经干细胞经传代5 0 代后仍具有干细胞特性。g f e 维系 的神经干细胞也能在丝裂原信号的刺激下不断增殖，并维持干细胞的特性。已用于维系 干细胞特性的丝裂原信号主要包括表皮生长因子( e g f ) 和碱性成纤维细胞生长因子 ( b f g f ) 1 e o 在永生性神经干细胞系中，增殖和自我更新的能力更为突出，不使用丝裂 原信号也能维持干细胞属性。 1 3 2 多向分化潜能 无论是哪种丝裂原依赖的神经干细胞还是永生性神经干细胞均能在体外分化为三种 主要神经系细胞。分化后使用免疫组化可以显示有大量神经元标记物、星型胶质细胞标 记物、少突胶质细胞标记物的存在，同时亦可见到t h 、5 一h r 阳性细胞。电生理实验证明 了古氨酸、y 一氨基丁酸和乙酰氨碱等神经递质的存在。 1 3 3 对称分裂和不对称分裂 通常人们把不对称分裂看作是干细胞的一个属性，但在神经干细胞则是例外。神经 干细胞的分裂方式既有不对称分裂，也有对称分裂。在对称分裂情况下产生的两个子代 细胞可以均是干细胞，也可以产生一个干细胞和个祖细胞( 即将分化的细胞) 或两个 均为祖细胞。而在不对称分裂的情况下，则产生一个干细胞和个祖细胞。这样既能维 持干细胞的自我更新又能不断产生祖细胞以补充分化的祖细胞。对称分裂方式便于一些 因子调控干细胞的祖细胞的相对比例，而不对称分裂中干细胞则保持相对稳定。总之， 神经干细胞既能够通过对称分裂以扩增它们的数量，也能够通过非对称分裂进行自我更 新和产生向不同细胞类型分化的祖细胞。 大连理工大学硕士学位论文 1 3 4 神经干细胞的可塑性 可塑性是指一个成体组织的干细胞产生其它组织分化的细胞类型。 在中枢神经系统内，神经干细胞表现出产生几乎专一的神经细胞，但观察中可以发 现，它的发展潜能要比预期的更广阔。实际上，培养的神经干细胞能生成神经元，星型 胶质细胞和少突胶质细胞，因此称为多潜能细胞。神经干细胞的可塑性及对环境信号的 依赖可进一步通过移植和体内调控，补充研究得到证实。比如，海马趾处的神经千细胞 在海马间的移植可产生海马区中的神经细胞类型。如果同样的海马干细胞移植到s v z 区， 这些干细胞就会生成“z 区的细胞类型而不是海马区的。而且，当神经于细胞移植进入 没有神经形成的区域，神经干细胞就会专一的形成胶质细胞。 在中枢神经系统外，可塑性是指超越脑区的塑性。r o s s c u ac r a h i o ”报道中枢神经细胞 可诱导生成骨髓前体细胞和骨髓基质细胞等其它类型细胞。同样，神经干细胞也可以从 造血细胞，肌细胞，肝细胞，肾细胞，肺细胞及肠细胞等其它类型细胞得到。 1 4 神经干细胞的鉴定 神经干细胞由于很难在形态学上定义，显微镜下无法将干细胞与其它细胞清楚区分。 所以目前鉴定神经干细胞主要通过两种办法：依靠千细胞表面的特异性抗原标记物对其 进行识别：或是通过体外培养并结合克隆分析及免疫细胞化学技术，来验证细胞是否具 有向多种神经细胞分化的潜能，来最终判断其是否为干细胞。 1 4 1 神经干细胞的标记物 s a k a k i b a r as o o 等报道，目前已发现的神经干细胞表面的特异性标记物有巢蛋白 ( n e s t i n ) 、波形蛋白、m u s a s h i 等。巢蛋白是纤维骨架蛋白家族成员之一，属于第 类中间丝蛋白。它的表达起始于神经胚形成时，当神经细胞的迁移基本完成后，n e s t i n 的 表达量下降，并随着神经干细胞的分化完成而停止表达“”。n e s t i n 作为早期原始神经细 胞的标志物，已被广泛用于神经干细胞的鉴定。随着不同组织系统的发育研究进展，人 们逐渐认识到n e s t i n 在其它系统的发育组织中也得到一定程度的表达，如发育中的平 滑肌细胞和牙釉质细胞等，但是在神经系统发育过程中n e s t i n 的表达只局限在神经干细 胞阶段。此外，波形蛋白的表达也比较早，起始于神经迁移完成时分化完成后波形蛋 白的表达下降，因此波形蛋白也被一些学者作为神经祖细胞的标记物。m u s a s h i 是一种 r n a 结合蛋白，在神经发育的过程中被表达，并可调控神经干细胞发育方向嘲。 旋转壁式生物反应器内神经干细胞的培养研究 此外，u c h i d an 乜1 1 等人报道了其它一些神经干细胞标记物c d l 3 3 + 、c d 3 4 一、c d 4 5 7 等。 从扩增的c d l 3 3 + 、c d 3 4 一、c d 4 5 一的细胞中分离出的单个细胞仍能培养出神经球，并能分 化为神经元和胶质细胞。 1 4 2 神经干细胞的特性鉴定 神经干细胞的鉴定也可以通过在体外检验其基本特性，自我更新和多分化潜能来 完成。即将干细胞在体外培养并连续传代，外诱导分化后，结合细胞克隆技术及免疫 细胞化学技术证明神经干细胞的未分化性、自我更新能力和多向分化潜能喊”。一般 来说，对于针对特定组织的干细胞的最终检测就是通过动物模型验证干细胞是否能完 全重建该组织。但是这种方法对于大多数干细胞来说是非常困难的，尤其是神经干细 胞，这似乎是不可能的。所以大多数情况下，干细胞必须在体外检验其特性，包括其 增殖，自我更新，分化产生大量的子代的能力。 1 5 神经干细胞的体外培养 神经干细胞的体外培养是利用无血清限定性培养基在促细胞分裂剂的作用下使 干细胞分裂增殖的一种新技术，很多人对此进行了研究，但仍在探索完善中。目前对 神经干细胞的培养主要有两种方式：单层培养和神经球悬浮培养，两种培养方式各有 利弊。 单层培养是将培养瓶表面包被上特殊的物质，使神经干细胞贴在培养瓶表面进行 生长繁殖。培养瓶可以用p o r n 或p o r n l a m i n i n ，p d l 或p l l 包被。很多研究表明， 神经干细胞的贴壁培养会诱导其分化。g r i t t i 等嘲在分离培养成年小鼠的纹状体多 潜能神经千细胞时发现，细胞在悬浮培养条件下可产生n e s t i n 阳性细胞球，但接种 到包被有多聚左旋鸟氨酸的玻璃盖玻片上就发现细胞分化为星型胶质细胞、少突胶质 细胞及神经元。c h a l m e r s - r e d m a n “”等也报道称，用悬浮培养法培养来自6 - 8 周人胚 中的神经前体细胞球，被接种到包被有多聚左旋鸟氨酸的培养板后，可诱导神经前体 细胞分化。 悬浮培养是指神经干细胞会在悬浮条件下分裂，然后集合成小的球状细胞集合体 ( 神经球) ，这些神经球是干细胞和祖细胞的混合体。这种培养方法最初是由 r e y n o l d s 和w e i s s 用d m e m f 1 2 ( 1 ：1 ) 培养基添加e g f 培养出了神经干细胞而 奠定的。目前大多数研究采用神经干细胞的体外悬浮培养。悬浮聚球培养方式可以很 好的支持千细胞的增殖并同时保持其特性。同时悬浮培养的方式也为以后实现干细胞 在生物反应器中的大规模扩增提供了便利。但神经球方式培养干细胞也有其不利的方 大连理工大学硕士学位论文 面。首先，球内的细胞形态很难通过视觉直接观察到，而且抗体很难进入到球内，这 就会抑制免疫细胞出现或靠近神经球的表面。因此，无法决定神经球内细胞的本质特 性。其次，如果神经球较大的话，在神经球内的细胞就会由于缺乏生存所必需的营养 而死亡，那么随着培养时间和传代次数的增长，获得的细胞量将会减少。另外，神经 球培养使得一些生物化学测试很难进行，比如，测定细胞表面具体结合位点数的配合 基结合法，细胞分裂比率的测定，用3 h _ 胸腺嘧啶脱氧核苷确定生长因子有丝分裂效 果的生长测试等。但这些都可以通过一定的手段得以缓解和控制。 1 6 神经干细胞的应用 脑、脊髓损伤及神经系统退行性等疾病一直是困扰人类健康的一大类疾病。当前， 仅在北美患有神经系统疾病的就有3 0 0 0 万。目前对这类疾病主要采用药物治疗，但这 种疗法只是在一定程度上缓解症状，减轻病人痛苦，并没能彻底治愈这类疾病。面且哺 乳动物中枢神经系统有很小的自我修复能力，因此使得这类疾病更加难以治疗。然而幸 运的是，1 9 9 2 年，r e y n o l d s 和w e i s s 在小鼠脑中发现了神经前体细胞，并且随后相继 在人脑不同部位也发现了神经干细胞。神经干细胞的发现就为人类治疗这类疾病带来了 新的思路和光明的未来。因为从动物至人类的胚胎干细胞再至人脑的神经干细胞的不断 深入研究，使人们进一步认识到神经干细胞是一种终身具有自我更新能力的细胞。它在 胚胎期和成年哺乳动物的中枢神经组织中皆可分离出来其子细胞能分化产生神经系统 的各类细胞。移植后能在宿主的神经组织中良好地生存、整合及分化。不仅如此，神经 干细胞来源于神经组织，在撤出有丝分裂原信号后分化为神经系细胞，不再具有过渡增 殖能力，因此移植后不具有致癌性。由于神经干细胞的这些特性，使得神经干细胞在很 多方面都显示了潜在的应用价值。 1 6 1 神经干细胞移植 中枢神经系统疾病中有很多是因为某种特定的脑细胞发生退行性死亡，导致一些重 要的神经递质、蛋白质因子或某些重要结构的匮乏所致“。例如，神经系统退行性疾病 中发病率较高的帕金森氏综合症，主要就是因为多巴胺能神经元的退化、死亡，导致多 巴胺的水平下降所致。 基于此，人们在成功地培养了神经干细胞之后，就利用它直接进行移植治疗，或利 用病毒载体，携带目的基因，导入神经干细胞，将筛选得到的体外高效表达目的基因的 克隆进行移植。这种新的细胞治疗方法具有以下优点：a 神经千细胞在脑中能根据其周 围微环境的诱导而分裂，分化成相应的细胞类型，其形态和功能与附近的宿主细胞非常 旋转壁式生物反应器内神经干细胞的培养研究 类似。即使是将基因转入原癌基因而永生化的神经干细胞植入脑后也未长出肿瘤”“。b 中枢神经系统具备特殊的结构血脑屏障，这使得淋巴细胞很难进入，因此不同个体 之间，甚至是不同物种之间的神经干细胞移植，都几乎没有排异反应，大大拓宽了神经 干细胞的来源。c 神经干细胞可以在体外根据不同需要导入相应的外源基因，成为一神 广普的细胞载体。总之，神经干细胞已具备了成为理想神经移植供体的一些条件，它作 为移植无疑己大大优越于目前的脑组织移植，无论从理论上还是实践上都展示了宽广的 前景。 1 6 2 神经干细胞的基因治疗 很多有治疗作用的大分子物质如神经生长因子、脑源性生长因子等都不能通过血脑 屏障，使部分c n s 疾病的治疗受到了一定的限制，基因治疗为此开辟了新途径。将编码 特定神经递质或蛋白质因子的基因转导入细胞或病毒载体，如纤维母细胞、星型胶质细 胞、单纯疱疹病毒、腺病毒等以治疗中枢神经系统疾病已为人们所熟悉。用神经干细胞 系作载体，有许多其它载体所没有的优点。例如，具有分化能力，即移植后可以分化成 神经元或胶质细胞；还可以整合到宿主脑组织中并向周围组织扩散；具有更好的组织相 容性等。九十年代以来已有很多实验证明神经干细胞移植后可以较长时间地存活，并受 局部微环境的影响分化为与移植部位相适应的神经元和胶质细胞。而且发现部分分化产 生的神经元可以与宿主脑组织的神经纤维建立突触联系，目前转导的基因有各种报告基 因、神经营养因子基因、递质合成酶基因和代谢酶基因等。其中比较突出的例子是逆转 录病毒介导的p 葡萄糖醛酸酶基因转染神经干细胞治疗艘s 小鼠的实验，将转染后表 达b 一葡萄糖醛酸酶的神经干细胞注入患有h 鹏的新生腻瞄内，结果发现治疗组小鼠能 顺利长大成熟，其行为和神经功能均正常，而非治疗对照小鼠在成熟前均死亡，病理分 析发现移植的细胞已经弥散到全脑。预示着神经于细胞基因治疗将有广阔的发展前景。 最近，在以神经干细胞为载体的脑肿瘤基因治疗上也取得了进展。众所周知，由于 脑肿瘤在解剖部位上的特殊性及恶性肿瘤本身广泛侵润正常组织的特性，常使有效的切 除、放疗或化疗束手无策。以往有人用以成纤维细胞为载体的逆转录病毒介导的基因疗 法治疗脑胶质瘤，其缺点是存活时间短和不容易到达浸润到脑实质内的瘤细胞，导致感 染病毒的细胞数有限，影响疗效。神经干细b 黾可以在脑组织中沿自质迁移并稳定地植入 脑组织，克服了肿瘤基因治疗中的上述不足。b e n e d e t t i 等嘲将表达i l _ 4 的基因转导到 c 5 7 b l 6 j 小鼠原代神经祖细胞，然后将这些细胞注入已建立的胶质母细胞瘤模型中，结 果导致大多数带瘤小鼠的存活。将永生化的来源于s d 大鼠的神经祖细胞移植给c 6 胶质 大连理工大学硕士学位论文 母细胞瘤也获得了相类似的结果。磁共振成像证实大肿瘤渐进性缩小、消失，而且在注 射1 2 周后仍能探测到5 - 嗅尿嘧啶标记的祖细胞。 1 6 3 神经干细胞的其它应用 神经于细胞具有稳定的生物性状，建系以后可以获得均一的遗传背景，决定其还可 以作为神经系统疾病的药物筛选平台。从正常脑组织分离获得的神经干细胞系用于筛选 药物具有组织和种属特异性；利用神经干细胞的多向分化潜能，可以进一步筛选出控制 和促进神经干细胞向终末细胞分化的药物。b j o r n s o n 等州还利用神经干细胞的去分化和 转分化特性，成功实施了接受亚致死量照射毁髓处理小鼠的神经干细胞移植及随后的造 血重建。 自体干细胞的分化诱导。由于正常成年个体侧脑室室管膜下区、纹状体等地方都存 在神经干细胞，这些干细胞在正常情况下处于静息状态，如能将其在体内诱导分化以替 代上述疾病中缺乏的神经细胞，则将为神经干细胞的应用提供更为广阔的前景“。嘲。目 前尽管尚不能诱导神经干细胞完全分化为某种特异神经元，但随着人们对神经干细胞发 育机制认识的不断加深和新的细胞因子、化学信号的不断发现，必将推动上述研究的进 一步深入。总之，神经干细胞无论在基础研究还是在临床应用方面均具有十分诱人的研 究价值。 1 6 4 神经干细胞应用面临的问题 干细胞的研究和开发应用从分离、培养、鉴定干细胞开始，最终又归结到对干细胞 的繁殖建系、扩增乃至加工成为可供临床应用的生物工程材料。尽管神经干细胞有重要 的应用价值，但目前对神经干细胞的应用大多是来自胚胎，这便引起很多道德伦理问题。 而且来自于胚胎的神经干细胞量远远不能满足干细胞的科研和临床应用。因此，体外大 规模扩增神经干细胞便成为干细胞研究中一个亟待解决的课题。当需要大量的细胞时， 仅仅增加培养瓶的数量不仅效率低，花费大，耗费人力，而且还很容易造成细胞的污染。 因此，利用生物反应器体外大规模培养神经干细胞就成为解决这一问题的有效方法。 1 7 动物细胞的大规模培养技术 细胞或组织培养是指将细胞或组织从机体内取出，模拟体内的生长条件，使其在 体外持续生长和增殖的状态，并使细胞呈现其来源组织的特性。目前的培养条件下还 不能在体外长期维持组织的结构和功能不变，随着培养时间的延长，特别是反复传代， 很容易使细胞发生变化而出现淡化现象，趋向于单一类型的细胞；另一方面，细胞培 养也不意味着细胞彼此是完全独立的，体外培养的细胞之间仍是互相影响、互相作用 旋转壁式生物反应器内神经干细胞的培养研究 的，仍呈现一定的组织特性，所以组织培养和细胞培养间并无严格区别。随着2 0 世 纪7 0 年代细胞生物学和分子生物学的相互渗透，细胞培养技术结合分予克隆技术更 加广泛的应用于生物医药产业，细胞培养技术同时也成为生物工程产品从实验室的研 究阶段到产业化生产的关键环节。 1 7 1 大规模动物细胞培养的原理 体外培养的细胞按其生长方式的不同可分为黏附生长型和悬浮生长型两大类。两类 细胞有不同的大规模培养系统。对于悬浮生长的细胞，细菌培养的发酵设备经过简单的 改造便可适用。这种设备节省空间，内部条件均一且能严格控制，细胞放大培养方式相 对简单，非常适合于大规模培养。但黏附依赖型细胞只有在底物上才能生长，并且在一 些情况下，细胞只有在黏附生长方式下才能相对高水平的表达目的蛋白。由于黏附细胞 难以扩大培养，目前己发展了多种适合黏附细胞生长的替代培养系统。 对黏附细胞常采用两种大规模的培养方法。一种是在保持相同细胞密度的前提下只 是简单的增加细胞的培养体积。一种是通过培养基灌注技术，1 0 - 1 0 0 倍的增加细胞密度。 在一些培养系统中，细胞的培养密度可超过1 0 8 个l ，但在这种情况下由于营养条件和 代谢废物在培养基中存在着浓度梯度，使得这种方法在培养体积上有一定限制，但通过 将细胞固定在多孔载体中可克服这一限制因素。通过一些特殊的灌注设备可使细胞在超 过正常细胞培养密度( 1 1 0 7 - 3 1o t ) 1 0 2 0 倍的条件下，在1 0 0 - 5 0 0 l 的培养体积中培 养细胞。 细胞生长环境中最容易控制的环境因素是p h 和氧气。在高密度、大规模细胞培养中 主要的限制因素是氧气浓度。小规模细胞培养中常用表面通气的方法，随着培养基体积 和深度的增加表面通气已远远不能满足需要。通过搅拌的方法，向培养基中添加空气和 氧气的混合物是一种非常有效的加氧方式。但动物细胞于细菌相比，动物细胞较脆弱， 只能采用缓慢搅拌的方法，而这往往容易导致培养基中供氧的不足。为解决这一问题， 大多数培养系统要使用多种供氧方式。 在大规模培养中还需要考虑的是，污染的风险增大、细胞培养一旦失败则损失较大。 另外，合适接种量且良好生长状态的种子细胞不易准备，收集1 0 8 个处于良好生理状态 的细胞并重新接种较容易，而准备1 0 1 0 的接种量的细胞则需要很长时间准备，并且需要 将细胞在不利的生长条件下储存一段时间。细胞大规模培养的一个重要原则是细胞培养 过程和培养系统尽量简单，所需材料和设备易于准备，而不能一味追求大规模。要确保 最初接种的细胞处于良好的生理状态，尽量减少微生物污染的风险。 大连理工大学硕士学位论文 1 7 2 细胞体外培养的条件 1 7 2 f 1 培养细胞生长的条件 动物细胞在体外培养的基本条件，是尽量提供与体内生活条件相接近的培养环境。 培养环境至少包括以下6 个因素：( 1 ) 所有与细胞接触的设备、器材、溶液等，都必须 保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染；( 2 ) 必须有充足的营养供应，绝对不能含有 有害的物质，甚至极微量有害离子；( 3 ) 保证有适量的氧气供应；( 4 ) 及时清除细胞 代谢产生的有害物质；( 5 ) 有良好的适于细胞生存的外界环境，包括渗透压、离子浓度、 d h 等；( 6 ) 及时转种，保持合适的细胞密度。 1 7 2 2 体外培养细胞的营养要求 体外培养的细胞需要一些基本的营养物质，包括氨基酸、碳水化合物、维生素及一 些无机离子。 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，不同种类的细胞对氨基酸有不同的要求。细胞所 能利用的氨基酸是l 型同分异构体。体外培养细胞时有1 2 种氨基酸细胞自身不能合成， 必须通过培养基供给，这1 2 种氨基酸被称为必须氨基酸，包括异亮氨酸、亮氨酸、胱氨 酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。 几乎所有的动物细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质， 有时谷氨酰胺作为能源被细胞利用。 维生素是维持细胞生长的生物活性物质，它们在细胞中大多形成酶的辅酶，对细胞 代谢有很大影响，其中烟酰胺、叶酸、核黄素、氰钴素、胆碱、生物素、吡哆醇和维生 素c 等，是细胞培养所必需的。 碳水化合物是细胞生命活动所需能量的最终来源，也是细胞合成蛋白质和核酸的碳 源，主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和乙酸钠等。 无机盐是细胞的重要组成成分之一，参与细胞的代谢活动和调节细胞的渗透压，除 钠、钾、镁、钙、磷、氮、氯等基本的无机离子外，还包括铁、铜、锌、钴、锰、硒等 微量金属离子。 许多