（麻醉学专业论文）依达拉奉对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响.pdf

录 000 1 ”一”3 血再灌注损伤的影响 ”- ”5 000 5 00e ”13 l5 附表0 ooo00 21 讨论2 2 结论2 5 参考文献j oooo0 2 6 综述氧自由基与肾缺血再灌注损伤2 9 致谢37 个人简历3 8 摘要 血再灌注损伤的影响 要 目的：观察不同剂量依达拉奉预处理和后处理联合对大鼠肾缺血再灌 注损伤的影响，并探讨其机制。 方法：随机将4 0 只雄性w i s t a r 大鼠分为5 组( n _ 8 ) ，假手术组( s 组) ，缺血再灌注组( i 组) ，依达拉奉治疗组l m g k g ( e 1 组) ，依达拉奉治 疗组3 m g k g ( e 3 组) ，依达拉奉治疗组5 m g k g ( e 5 组) 。腹腔注射1 0 水合 氯醛3 m l k g 麻醉后，制备肾脏缺血再灌注损伤模型。开腹后，用无损伤 动脉夹同时夹闭双侧肾蒂，开始计时，肉眼观察肾脏颜色变为暗红色即可 确认肾脏血流阻断，造成双侧肾缺血，缺血模型成功。双侧肾缺血4 5 m i n 后，松开动脉夹，肾脏由暗红色恢复鲜红色即可确认血流恢复，夹闭和开 放肾蒂时腹腔内保留林格液2 0 m l k g 。s 组仅行开腹，游离出双侧肾脏， 分离双侧肾蒂不夹闭，伤口用生理盐水纱布覆盖，暴露4 5 m i n 不作肾缺血 处理；i 组夹闭双侧肾蒂，缺血4 5 m i n 后松开动脉夹；e l 组缺血前和再灌 注即刻经尾静脉注入依达拉奉总量l m g k g ；e 3 组缺血前和再灌注即刻经 尾静脉注入依达拉奉总量3 m g k g ；e 5 组缺血前和再灌注即刻经尾静脉注 入依达拉奉总量5 m g k g 。再灌注6 h ，麻醉后迅速经心脏取血和切取肾标 本，待测。酶法测定血清肌酐( c r ) 水平、苦味酸不除蛋白法测定尿素氮 ( b u n ) 水平；硫代巴比妥酸法( t b a ) 测定肾组织丙二醛( m d a ) 含 量、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶( s o d ) 活性；采用免疫组化( s p ) 法观察肾组织中凋亡蛋白b c l 2 和b a x 的表达，计算蛋白阳性染色指数 ( p o s i t i v ei n d e x ，p i ) ；原位末端脱氧核苷酸转移酶标记( t u n e l ) 法测定肾 组织中凋亡细胞，计算凋亡指数( 甜) ；苏木精伊红( h e ) 染色，在光镜 下观察肾组织病理学变化。 结果- 与s 组比较，缺血再灌注6 h 时i 组、e 1 组、e 3 组、e 5 组 的b u n 、c r 升高，m d a 升高，s o d 降低( p o 0 5 ) ；与i 组比较，e l 组、e 3 组、e 5 组的b u n 、c r 降低，m d a 降低，s o d 升高( 氏o 0 5 ) ： 与e l 组比较，e 3 组、e 5 组的b u n 、c r 降低，m d a 降低，s o d 升高 ( 尸 o 0 5 ) ；与e 3 组比较，e 5 组的b u n 、c r 、m d a 、s o d 值差异无统 中文摘要 计学意义与s 组比较，缺血再灌注6 h 时i 组、e 1 组、e 3 组、e 5 组b c l 2 蛋白p i 值降低，b a x 蛋白p i 值升高，甜值升高，差异有统计学意义 ( 氏o 0 5 ) ，病理学损伤明显；与i 组比较，e 1 组、e 3 组、e 5 组b c l 一2 蛋白p i 值升高，b a x 蛋白p i 值降低，址值降低，差异有统计学意义 ( 氏o 0 5 ) ，光镜下可见肾组织损伤明显减轻；与e 1 组比较，e 3 组、e 5 组b c l 2 蛋白p i 值升高，b a x 蛋白p i 值降低，趟值降低，差异有统计学 意义( p o 0 5 ) ，光镜下肾组织损伤有所减轻；与e 3 组比较，e 5 组b c l 2 蛋白p i 值、b a x 蛋白p i 值、触值差异无统计学意义( 胗o 0 5 ) 。 结论：l 不同剂量的依达拉奉预处理和后处理联合可以减轻肾缺血再 灌注损伤，对肾脏都有保护作用，在1 - 3 m g k g 范围内，随着依达拉奉剂 量增大其对肾脏的保护作用增强，当到达5 m g k g ，其保护作用无明显增 强。 2 依达拉奉可以减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤，减轻肾损害。其主要 机制可能与直接清除氧自由基，减轻脂质过氧化反应，抑制细胞凋亡，改 善肾功能有关。 关键词：依达拉奉；氧自由基；肾脏；缺血再灌注损伤；大鼠 a b s t r a c t o b j e c f i v e ：t oi n v e s t i g a t et h e a n dp o s t c o n d i t i o n i n go fd i f f e r e n t i s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y r e p e r l u s i o nl n lu r v - v， e f f e c to fc o m b i n a t i o no fp r e c o n d i t i o n i n g d o s e so fe d a r a v o n eo nr a tk i d n e y sw i t h m e t h o d s ：f o r t yn o r m a lm a l ew i s t a rr a t sw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t o5 g r o u p s ( n = 8 ) ：s h a m o p e r a t e dg r o u p ( g r o u ps ) ，i s c h e m i a - r e p e r f u s i o ng r o u p ( g r o u p i ) ，g r o u p e 1 ，g r o u pe 3 ，g r o u p e 5 t h er a t sw e r ea n e s t h e t i z e dw i t h i n t r a p e r i t o n e a lc h l o r a lh y d r a t e3 0 0m g k g b i l a t e r a lk i d n e y sw e r ee x p o s e d t h r o u g hm i d l i n ei n c i s i o na n db i l a t e r a lr e n a lp e d i c e l sw e r eo c c l u d e d4 5m i n w i t ha t r a u m a t i cm i n i c l a m pt h e nu n c l a m p e df o r6h r a t sw e r et r e a t db e f o r e a n da f t e ri s c h e m i aw i t he d a r a v o n et o g r o u pel ( 1m g k g ) ，g r o u pe 3 ( 3 m g k g ) ， g r o u pe 5 ( 5 m g k g ) o rs a l i n et og r o u psa n dg r o u pi , a d m i n i s t e r e db yt a i lv e i n i n je c t i o n t h ea n i m a l sw e r ek i l l e df o r6ho fr e p e r f u s i o n b l o o ds a m p l e sw e r e c o l l e c t e df r o mh e a r tf o rd e t e r m i n a t i o no fs e r u mc r e a t i n i n e ( c r ) a n du r e a n i t r o g e n ( b u n ) c o n c e n t r a t i o n s k i d n e ys p e c i m e n sw e r ec o l l e c t e di m m e d i a t e l y f o re d t e r m i n a t i o no fm d al e v e la n ds o d a c t i v i t y , t h ee x p r e s s i o no fb c l 一2a n d b a xb yi m m u n e h i s t o c h e m i s t r ya s s a y t h e a p o p t o s i si nt h en e p h r i d i a lt i s s u e w a sa s s e s s e du s i n gt u n e la n da p o p t o t i ci n d e x ( a i ) w a sc a l c u l a t e d r e s u l t s ：a f t e r i r , t h es e r u mc ra n db u nc o n c e n t r a t i o n s ，t h em d a c o n t e n t s ，t h ee x p r e s s i o no fb a xa n dt h ea 1w e r ea l ls i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d w h i l et h es o d a c t i v i t y , t h ee x p r e s s i o no fb c l 一2w e r es i g i n i f i c a n t l yd e c r e a s e d a sc o m p a r e dt ot h eg r o u ps ( p o 0 5 ) t h ec ra n db u nc o n c e n t r a t i o n s ，t h e m d a c o n t e n t s ，t h ee x p r e s s i o no fb a xa n dt h ea 1w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e r w h i l et h es o d a c t i v i t y , t h ee x p r e s s i o no f b c l - 2w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e ri n g r o u pe 1 ，e 3a n de 5a sc o m p e r e dw i t hg r o u pi ( p 0 0 5 ) t h e r ew e r en o d i f f e r e n c ei nt h ei n d e x e sa m o n gt h eg r o u pe 3 a n d e 5 c o n c l u s i o n s ：1t h ec o m b i n a t i o no fp r e c o n d i t i o n i n ga n d p o s t c o n d i t i o n i n g 3 英文摘要 o fd i f f e r e n td o s e so fe d a r a v o n ec a n p r o t e c t t h e k i d n e ya g a i n s t i s c h c r f u s i o n f i u r v t h ed o e s t h ee f f e c te n h a n c e i s c h e m i a - r e t e r t u s o n l n j u r yi nr a t sw l t l lt h ec t o e si n c r e a s em e e i i e c te n n a n c e ， b e t w e e nlm g k gt o3 m g & g w h e ni t r e a c h e s 5 m g k g ，t h ee f f e c t n om o r e e n h a n c e 2e d a r a v o n ec a nr e d u c et h er i s ko fr e n a ld y s f u n c t i o na n di n j u r yb y s c a v e n g i n go x y g e nf r e er a d i c a l sa n dr e d u c i n ga p o p t o s i s k e y w o r d s ： e d a r a v o n e ；o x y g e n f r e e r a d i c a l ；k i d n e y ； i s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n ju r y ；r a t 4 人生存率及康复。研究表明肾脏缺血4 0 6 0 m i n 再灌注，损伤为不可逆。 如何预防和减轻肾脏i r i ，保护肾脏功能，一直是临床亟待解决的问题。 肾缺血再灌注损伤过程复杂，涉及氧自由基的形成、白细胞聚集、钙 超载、细胞凋亡等多种病理生理过程【l ，2 】，其中重要原因之一就是氧自由 基的形成【3 】，研究表明清除氧自由基可以在一定程度上增强超氧化物歧化 酶活性，抑制脂质过氧化反应【4 】，抑制细胞凋亡。 目前，实验及临床研究均有使用自由基清除剂抑制缺血再灌注损伤的 报道。依达拉奉是一种作用机理明确的新型自由基清除剂，主要通过提供 电子直接清除羟自由基，抑制自由基的生成及细胞膜脂质过氧化连锁反 应。新近的研究显示，依达拉奉对肝【5 】、肺、小肠【6 】、心脏【7 】及肢体缺血 再灌注损伤有保护作用。因依达拉奉可以使神经细胞在缺血再灌注过程中 损伤减轻，延缓神经元死亡，减轻神经功能障碍，现在已经广泛应用于 急性脑梗塞的治疗【8 ，9 】。但对肾脏的研究甚少，而且对不同剂量依达拉奉 对肾脏的保护作用有何不同尚无定论。 本实验通过建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，探讨不同剂量依达拉奉 预处理和后处理联合对大鼠实验性肾缺血再灌注损伤的影响和作用机制。 从而为临床上选用适当的器官保护方法提供参考，为减轻肾脏损伤，保护 肾功能提供理论依据。 材料与方法 l 实验动物 健康雄性w i s t a r 大鼠4 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ，由河北省实验动物中心 提供。 研究论文 2 主要实验试剂及材料 2 1s o d 测试盒( 南京建成生物工程研究所) 2 2m d a 测试盒( 南京建成生物工程研究所) 2 3 考马斯亮兰测试盒( 南京建成生物工程研究所) 2 4 蛋白标准品( 南京建成生物工程研究所) 2 5 兔抗鼠b c l 2 多克隆i g g 抗体( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 2 6 兔抗鼠b a x 多克隆i g g 抗体( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 2 7 原位细胞凋亡检测试剂盒( i ns i t uc e l ld e a t hd e t e c t i o nk i t ，p o d ) ( b o e h r i n g e rm a n n h i e m ，德国) 2 8 依达拉奉注射液( 商品名：必存，江苏先声药业有限公司，产品批号： 8 0 0 7 1 0 0 5 ) 2 9 乳酸钠林格注射液( 中国大冢制药有限公司) 2 1 0 生理氯化钠注射液( 外用) ( 中国大冢制药有限公司) 2 1 1 蒸馏水( 河北省人民医院实验室) 2 1 2 磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾等化学试剂( 北京益利 化学有限公司) 3 实验设备及手术器械 3 1s e l e c t r a e 全自动生化分析仪( v i t a l 公司，荷兰) 3 2c i t a d e l2 0 0 0 脱水机( 姗顿公司，英国) 3 3h i s t o c e n t r e z 包埋机( 姗顿公司，英国) 3 4a s 3 2 5 切片机( 姗顿公司，英国) 3 5y t - 6 b 烤片机( 湖北孝亚光电子技术研究所) 3 6y m y - 7 81 b 微波仪( 浙江临安电子器材) 3 7b h s 显微镜( 奥林巴斯公司，日本) 3 8s c 2 7 8 l 冰箱( 青岛海尔集团有限公司) 3 97 5 6 型紫外分光光度仪( 上海) 3 1 0 主要试验器械：剪刀，皮镊，眼科镊，持针器，血管钳，无损伤动 脉夹，缝合针，缝合线。 4 动物模型的制备及实验分组 4 1 动物模型的制备 成年雄性w i s t a r 大鼠肾缺血再灌注损伤模型的制备：大鼠术前禁食 研究论文 1 2 h ，自由饮水。腹腔注射1 0 水合氯醛3 m l k g 麻醉后，将大鼠仰卧位四 肢固定于鼠台上，腹部备皮，7 5 酒精消毒腹部皮肤，暴露手术区域。沿 腹中线剪开腹部皮肤，钝性分离肌肉，打开腹腔。用无菌生理盐水浸湿的 温纱布牵开腹腔脏器，钝性分离肾包膜，显露和游离肾脏，仔细分离肾蒂， 保护输尿管，用无损伤动脉夹同时夹闭双侧肾蒂，开始计时。肉眼观察肾 脏颜色由鲜红色变为暗红色即可确认肾脏血流阻断，造成双侧肾缺血，缺 血模型成功。腹腔保留乳酸钠林格液2 0 m l k g 间断夹闭腹部切口，用盐水 纱布覆盖。缺血4 5 m i n 后，再次打开腹腔，显露肾脏，暴露双侧肾蒂，松 开动脉夹，肾脏由暗红色恢复为鲜红色即可确认肾脏血流恢复，再灌注成 功。同时开始记录再灌注的时间。腹腔内保留乳酸钠林格液2 0 m l k g ，逐层 缝合腹部正中切口。用7 5 酒精消毒后将大鼠放回鼠笼，给予正常饮食。 再灌注6 h 即为肾缺血再灌注损伤模型。 4 2 实验分组 4 0 只体重2 0 0 2 5 0 克的w i s t a r 大鼠随机分为5 组( n - 8 ) 。 假手术组( s 组) ：仅行开腹，游离出双侧肾脏，分离双侧肾蒂，不 夹闭，伤口用生理盐水纱布覆盖，暴露4 5 m i n ，不做肾缺血处理。 缺血再灌注组( i 组) ：方法见模型建立，夹闭双侧肾蒂，缺血4 5 m i n 后放开动脉夹。 依达拉奉l m g k g 治疗组( e 1 组) ：方法见模型建立，缺血前和再灌 注即刻经尾静脉注入依达拉奉总量l m g k g 。 依达拉奉3 m g k g 治疗组( e 3 组) ：方法见模型建立，缺血前和再灌 注即刻经尾静脉注入依达拉奉总量3 m g k g 。 依达拉奉5 m g k g 治疗组( e 5 组) ：方法见模型建立，缺血前和再灌注 即刻经尾静脉注入依达拉奉总量5 m g k g 。 5 标本的处理 再灌注6 h ，麻醉后开胸，经心脏取血迅速处死动物，按要求取材， 待测。 肾组织标本的处理：各组再灌注6 h ，麻醉后经心脏取血迅速处死动 物。在无菌条件下，迅速摘取左肾，装入1 5 m l 离心管，液氮冻存， 待测。后按其重量加生理盐水制成1 0 的组织匀浆，用于检测m d a 和s o d 。取右肾，4 多聚甲醛固定，后依次进行脱水、透明、浸蜡， 研究论文 制成石蜡包块。 血液标本的处理：将血液标本注入离心管，静置3 0 m i n 。3 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，提取血清标本装入1 5 m l 离心管，2 0 。c 冰箱保存，待测。 6 各项指标观察 6 1 血清c r 、b u n 的含量的测定 应用s e l e c t r a e 全自动生化分析仪，酶法测定血清c r 含量，苦味酸 不除蛋白法测定b u n 含量。 6 1 1 血清尿素氮测定一酶偶联速率法 原理：尿素氮在尿素酶催化下，水解生成氨和二氧化碳。氨在酮 戊二酸和还原型辅酶存在下，经谷氨酸脱氢酶( g l d h ) 催化，生成 谷氨酸。同时n a d h 被氧化成n a d ，可在3 4 0 波长处监测吸光度下 降的速率，计算样品中尿素氮的含量。反应式如下： 尿素+ 2 h 2 0 竖2 n h 4 + 。圮0 3 2 。 n n 4 + q - a 酮戊二酸+ n a d h + 矿竺谷氨酸+ n a d + + h 2 0 实验步骤：按照试剂盒说明书顺序加样，具体实验过程按操作表 如下： 表中各管依次逐管加入已预温的酶试剂，混匀后立即在分光光度 计波长3 4 0 n m 处监测吸光度下降速率，自动计算处a a m i n 计算方法： 测定么i n 一空白么a m i n 尿素氮( m m o l l ) = 一 5 标准么m l n 一至日么a m i n 6 1 2 血清肌酐测定一苦味酸速率法 原理：肌酐的化学速率法测定是根据肌酐与苦味酸反应，生成橘 红色的苦味酸肌酐复合物的反应速率。该反应属拟一级反应动力学。 在碱性反应环境中，样品中的肌酐或干扰物质与苦味酸的反应速率不 同。选择适宜的速率监测时间，避开干扰物质对肌酐与苦味酸反应的 干扰，提高肌酐测定的特异性。 研究论文 按照试剂盒说明书顺序加样，具体实验过程按操作表如下： 计算方法： 肌酐c p m 。l ) = 丢兰 燃，。 6 2 硫代巴比妥酸法测定肾组织中m d a 含量和黄嘌呤氧化酶法测定s o d 活性。 6 2 1m d a 含量测定 测定原理： 机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多 不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。过氧化 脂质降解产物中的丙二醛( m d a ) 可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产 物，在5 3 2 n m 处有最大吸收峰。 操作方法： 按试剂盒要求设标准管、标准空白管、测定管、测定空白管，依次加 入1 0 n m o l m l 标准品、无水乙醇、测试样品、测试样品，各管均加入试剂， 漩涡混匀器混匀，试管口用保险薄膜扎紧，用针头刺一个小孔，9 5 水浴 4 0 分钟，取出后流水冷却，5 3 2 n m 处，l c m 光径，蒸馏水调零，测各管 吸光度值。 计算公式： m d a 含量( n m o l m g p r o t ) = ( 测定管吸光度测定空白管吸光度) ( 标准管吸光度标准空白管吸光度) 标准品浓度( 1 0 n m o l m 1 ) 蛋白含 量( m g p r o t m 1 ) 6 2 2s o d 活性测定 测定原理： 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基( 0 2 一) ，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，可用 采用分光光度法，在波长5 5 0r i m 处比色，测定其吸光度。当被测样品中 研究论文 含s o d 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝 酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值。 操作方法： 按测试盒要求设测定管和对照管，测试管中加入各种反应液和待测组 织匀浆，用旋涡混匀器充分混匀，置3 7 恒温水浴4 0m i n ，加显色剂混 匀，室温放置1 0m i n ，后倒入比色杯中，于波长5 5 0n m 处，蒸馏水调零， 比色，测吸光度值。对照管中不加组织匀浆样本，用同等体积蒸馏水代替， 其他同测定管。 计算公式： 组织匀浆中s o d 活力( u m g p r o t 。1 ) = ( 对照管吸光度- n 定管吸光 度) 对照管吸光度5 0 反应体系的稀释倍数组织中蛋白含量。 6 2 3 考马斯亮兰蛋白含量测定 测定原理： 蛋白质分子具有一n h 3 + 基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋 白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白- n h 3 + 结合，使 溶液变为蓝色，通过测定o d 值，可计算出蛋白含量。 操作方法： 准确称取待测组织的重量，按重量体积比加生理盐水制备成1 0 的 组织匀浆，1 0 0 0 - 3 0 0 0 转分，离心1 0m i n ，然后取组织匀浆上清再用生 理盐水按l ：9 稀释成l 的组织匀浆。按测试盒要求设空白管、标准 管及测定管，测定管中加入待测组织匀浆，标准管中加入等体积0 6 1 5g l 。 标准液，空白管加入等体积蒸馏水，混匀，静置1 0m i n ，倒入比色杯中， 蒸馏水调零，分光光度计于波长5 9 51 1 1 1 3 比色，测各管吸光度值。 计算公式： 蛋白含量( g l ) = ( 测定管o d 值一空白管o d 值) ( 标准管空白 管o d 值一空白管o d 值) 标准管浓度。 6 3 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记( t u n e l ) 法测定肾组织中凋亡细胞 6 3 14 多聚甲醛的配制方法 配方：多聚甲醛2 0 9 ；磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ) 1 8 9 ；磷酸二氢钠 ( n a i l 2 p 0 4 2 h 2 0 ) 1 5 9 ；蒸馏水( d w ) 5 0 0 m l 。 配制方法： 用天平称2 0 9 多聚甲醛，倒入干净瓶内； 用天平称1 8 9n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，倒入干净瓶内： 用天平称1 5 9n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 备用； 用量筒量5 0 0 m l 蒸馏水也倒入瓶内； 把装有多聚甲醛、n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 和蒸馏水的瓶子放在磁力搅拌器 上，加热搅拌使其完全溶解； 当瓶内固体完全溶解时，加入备好的n a i l 2 p 0 4 2 h 2 0 ，继续加热搅 拌使其完全溶解； 用p h 试纸调整溶液的p h 值至7 2 , - - - , 7 4 ； 将配制好的4 多聚甲醛固定液冷却过滤，瓶上标明名称、配制日 期和浓度，放入4 。c 冰箱中备用。 6 3 2 石蜡包块的制作方法 取材：处死大鼠后立即切取右侧肾脏，用锋利的刀片沿肾脏的冠状 面切成厚度不超过5 m m 的组织块； 固定：将切好的组织块立即放入4 多聚甲醛固定液中，放入4 冰 箱冷藏； 脱水：用不同浓度的乙醇脱水，依次为7 5 乙醇过夜一8 0 乙醇 2 h 一9 5 乙醇1 2 h 一9 5 乙醇1 1 1 5 h 一无水乙醇1 1 5 h 一无水乙醇i l l h ； 透明：二甲苯1 5 0 m i n - - * 二甲苯1 1 4 0 m i m 浸蜡：将透明了的组织放入6 0 温箱浸蜡，石蜡1 1 h _ 石蜡1 1 2 h ； 包埋：将已经浸蜡的组织放入石蜡中，应注意切面朝下，位置方正。 待石蜡全部凝固后推出蜡块，并将组织编号标签封入蜡边，待蜡块凉 后修整； 清洗载玻片：载玻片经硫酸洗液浸泡2 4 h 以上，流水冲洗干净硫酸 洗液，9 5 乙醇浸泡2 4 h 左右，蒸馏水冲洗3 5 次，将载玻片排列整 齐，在烤箱中烤干； 粘合剂处理方法：用纯丙酮1 ：1 5 0 稀释a p e s ，将载玻片进入其中 1 - - - 2 m i n ，取出低温( 3 7 ) 烤干。 6 3 3 实验步骤 将石蜡包块切成厚度约5 u m 的薄片，常规脱蜡入水，经3 h 2 0 2 室温 处理1 0 m i n 消除内源性过氧化物酶，p b s 冲洗3 次，蛋白酶k 消化 研究论文 3 0 m i n ，然后用p b s 冲洗3 次，加入t u n e l 的反应液3 7 孵育7 0 m i n ， 用p b s 冲洗3 次后加入亲和素辣根过氧化物酶( p o d ) ，3 7 湿盒放 置3 0 m i n ，p b s 冲洗3 次，加d a b 试剂显色，苏木素复染，经脱水、透 明、封片后，可于光镜下观察凋亡细胞。 6 3 4t u n e l 法测定结果的判定 光镜下观察凋亡细胞，细胞核呈棕黄色者为阳性细胞，每张切片光镜 下随机选取5 个视野，用1 0 x 4 0 倍光镜计数凋亡细胞，以肾小管上皮 凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞凋亡指 数( a p o p a t i ci n d e x ，a i ) ，触= 阳性细胞数视野所有细胞总数1 0 0 。 6 4 免疫组化( s p ) 法观察肾组织中凋亡相关蛋白b c l 2 和b a x 的表达 6 4 1s p 法免疫组化染色步骤 石蜡切片5 u m 脱蜡至水； 3 甲醇州2 0 2 室温孵育1 0 m i n ，以消除内源性过氧化物酶的活性， 蒸馏水冲洗，p b s 洗5 m i n ； 抗原修复水煮加热法9 8 - - 一9 9 2 0 m i n ； 用1 小牛血清白蛋白封闭游离的结合位点，减少非特异性染色； 滴加稀释配制的一抗，4 冰箱过夜； p b s 洗3 次，每次5 m i n ； 滴加生物素标记的二抗i g g ，3 7 。c 孵育3 0 m i n ； p b s 洗3 次，每次5 m i n ； 显色：p b s4m l ，二甲基联苯胺( d a b ) 5 9 ，h 2 0 25 u l ，显色5 m i n ，在 显微镜下掌握染色程度，自来水冲洗5 次； 苏木精复染l m i n ，水洗，1 盐酸酒精分化，脱水，透明，封固。 6 4 2 免疫组化法测定结果的判定 每次实验均设阳性和阴性对照，阳性对照片由北京中杉金桥生物技术 有限公司提供，阴性对照由1 b s a 代替一抗，结果显示阴性。b c l 2 和b a x 阳性反应结果为细胞胞浆内呈棕黄色染色，不着色者为阴性。 随机选取5 个视野，用1 0 x 4 0 倍光镜计数阳性细胞数，蛋白阳性染色 指数( p o s i t i v ei n d e x ，p i ) 。p i ( ) = 阳性细胞数视野所有细胞总数 1 0 0 。 6 5 苏木素伊红( h e ) 染色光镜下观察肾组织病理学变化 研究论文 h e 染色步骤： 石蜡切片5 u m ； 常规脱蜡至水，依次为二甲苯1 1 5 m i n - - - , - - 甲苯1 1 1 5 m i n - - - , 无水酒精 i _ 无水酒精i i - - - , 9 5 酒精i _ 9 5 酒精1 1 - - - , 8 0 酒精( 脱水各级为 2 - - - ，5 m i n ) _ 水洗； 苏木精染液染色5 m i n ，水洗； 1 盐酸酒精分化片刻，水洗；氨水返蓝，水洗；伊红染色l m i n ， 水洗； 各级乙醇梯度脱水，依次经8 0 酒精一9 5 酒精i _ 9 5 酒精i i _ 无水酒精i 一无水酒精i i ( 各级为2 - - 一3 m i n ) ： 二甲苯透明( 二次) ，共约1 0 m i n ； 常规封片：擦去切片周围多余二甲苯，迅速滴加适量中性树胶， 再加盖玻片封固； 光镜下阅片。 7 统计学处理 采用s p s s l 2 0 软件进行统计学分析，计量资料以均数4 - 标准差( ；士s ) 表示，计量资料先行正态性检验，再行方差齐性检验，组间比较采用单因 素方差分析，p 0 0 5 为差异有统计学意义。 结果 1 肾脏功能的改变，见f i g 1 ，f i g 2 ，t a b l e l 与s 组比较，缺血再灌注6 h i 组、e l 组、e 3 组、e 5 组的b u n 和c r 浓度升高，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ； 与i 组比较，e 1 组、e 3 组、e 5 组b u n 和c r 浓度降低，差异有统 计学意义( p o 0 5 ) ； 与e 1 组比较，e 3 组、e 5 组b u n 和c r 浓度降低，差异有统计学 意义( p o 0 5 ) 2 s o d 活性和m d a 含量的变化，见f i g 3 ，f i g 4 ，t a b l e 2 与s 组比较，缺血再灌注6 h i 组、e 1 组、e 3 组、e 5 组m d a 含量 研究论文 升高，s o d 活力降低，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ；与i 组比较，e 1 组、 e 3 组、e 5 组m d a 含量降低，s o d 活力升高，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ； 与e 1 组比较，e 3 组、e 5 组m d a 含量降低，s o d 活力升高，差异有 统计学意义( p o 0 5 ) 。 3 b c l 2 蛋白和b a x 蛋白蛋白阳性染色指数( p i ) 的变化，见f i g 5 ，t a b l e 3 与s 组比较，缺血再灌注6 h 时i 组、e 1 组、e 3 组、e 5 组b c l 2 蛋白 p i 值降低，b a x 蛋白p i 值升高，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ；与i 组比 较，e 1 组、e 3 组、e 5 组b c l 2 蛋白p i 值升高，b a x 蛋白p i 值降低， 差异有统计学意义( p o 0 5 ) ；与e 1 组比较，e 3 组、e 5 组b c l 2 蛋白 p i 值升高，b a x 蛋白p i 值降低，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 4 肾小管上皮细胞凋亡指数( a j ) 的变化，见f i g 6 ，f i g 1 2 1 6 ，t a b l e 3 与s 组比较，缺血再灌注6 h 时i 组、e 1 组、e 3 组、e 5 组越值增 高，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ；与i 组比较，e l 组、e 3 组、 e 5 组 触值降低，差异有统计学意义( p o 0 5 ) ；与e 1 组比较，e 3 组、e 5 组 触值降低，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。 5 肾组织病理学变化，见f i g 7 1 1 光镜下可见s 组肾小管上皮细胞细胞壁完整，细胞染色均匀，细胞核 圆。i 组肾小管上皮细胞细胞壁不完整，有的细胞脱落至管腔，细胞核固 缩溶解现象明显，胞质内出现较多空泡。e 1 组同i 组比较损伤减轻，但仍 有大量细胞变性坏死，空泡现象仍存在。e 3 组同i 组比较损伤减轻，细胞 较完整，排列整齐，未见明显空泡现象。e 5 组同i 组比较损伤也减轻，大 部分细胞细胞壁完整，排列整齐，仅见个别细胞有空泡变性。 f i g 1c h a n g e s i nc o n c e n t r a t i o no fb u ni nf i v eg r o u p s f i g 2c h a n g e si nc o n c e n t r a t i o no f c ri nf i v eg r o u p s f i g 3c h a n g e si nc o n c e n t r a t i o no fs o d a c t i v i t yi nf i v eg r o u p s 1 5 研究论文 f i g 4c h a n g e si nc o n c e n t r a t i o no f m d al e v e li nf i v eg r o u p s f i g 5c h a n g e si nb c l 一2a n d b a x p r o t e i np ii nf i v eg r o u p s f i g 6c h a n g e si n a ii nf i v eg r o u p s 1 6 f i g 8m i c r o p h o t o g r a p ho ft h et i s s u ei nig r o u p ( h es t a i n ，x 4 0 0 ) f i g 9m i c r o p h o t o g r a p ho ft h et i s s u ei ne 1g r o u p ( h es t a i n ，x 4 0 0 ) 1 7 研究论文 f i g 10m i c r o p h o t o g r a p ho f t h et i s s u ei ne 3 9 r o u p ( h es t a i n ，x 4 0 0 ) f i g 11m i c r o p h o t o g r a p ho f t h et i s s u ei ne 5 9 r o u p ( h es t a i n ，x 4 0 0 ) f i g 12a p o p t o s i so fk i d n e y t i s s u ei nsg r o u p ( t u n e l ，x 4 0 0 ) 1 8 f i g 13a p o p t o s i so fk i d n e yt i s s u ei nig r o u p ( t u n e l ，x 4 0 0 ) f i g 1 4 a p o p t o s i so f k i d n e y t i s s u ei ne 1 9 r o u p ( t u n e l ，x 4 0 0 ) f i g 15 a p o p t o s i so fk i d n e yt i s s u ei ne 3 9 r o u p ( t u n e l ，x 4 0 0 ) 1 9 研究论文 t o s i so f k i d n e yt i s s u ei ne 5g r o u p ( t u n e l ，x 4 0 0 ) 2 0 s i e 1 e 3 e 5 6 3 3 士o 3 6 2 7 8 0 士1 2 0 木 2 3 2 5 士1 4 7 木# 1 0 1 5 4 - 0 6 5 术# l o 2 1 士o 3 9 宰# 3 4 8 士2 0 5 1 0 5 6 士3 3 6 木 6 5 4 4 - 3 2 1 ，i c # 4 9 8 士2 6 8 宰# 4 9 8 4 - 4 0 9 木# c o m p a r e dw i t hsg r o u p 拳氏o 0 5 ；c o m p a r e dw i t hig r o u p # p o 0 5 c o m p a r e dw i t he 1g r o u p p 0 0 5 t a b l e2t h ec h a n g ei nc o n c e n t r a t i o no fs o da n dm d ai nh d n e yt i s s u eo f d i f f e r e n tg r o u p so fr a t s ( n = 8 ，x 士s ) g r o u p ss o d ( u m g p r o t )m d a ( u m o l g p r o t ) s1 9 0 4 3 4 - 3 8 51 7 l l - 0 1 3 i1 2 4 9 2 士3 9 6 水2 3 5 士o 1 9 水 e 1 e 3 e 5 1 4 0 5 6 4 - 4 2 3 木# 1 5 6 8 6 4 - 4 5 1 木# 1 5 0 7 8 士8 5 5 术# 2 0 8 士o 1 1 宰# 1 8 8 士o 0 5 水# 1 9 0 士o 0 4 唯# c o m p a r e dw i t hsg r o u p 木尸 o 0 5 ；c o m p a r e dw i t hig r o u p # 尸 o 0 5 c o m p a r e dw i t he 1g r o u p p 0 0 5 t a b l e 3t h er a t i oo fp o s i t i v ei n d e xo fb c l 一2a n db a xa n da p o p t o t i ci n d e xi n k i d n e yt i s s u eo fd i f f e r e n tg r o u p so fr a t s ( ，n = 8 ，x4 - s ) c o m p a r e dw i msg r o u p 幸尸 o 0 5 ；c o m p a r e dw i t hig r o u p # 尸 3 m g k g ) ，其代谢产物也增加，会加重肾脏负担，从而使疗 效不再增强。 综上所述，本实验发现不同剂量依达拉奉通过清除氧自由基可以减轻 肾缺血再灌注损伤。 结论 l不同剂量的依达拉奉预处理和后处理联合可以减轻肾缺血再灌注损 伤，对肾脏都有保护作用，在1 - 3 m g k g 范围内，随着依达拉奉剂量增大 其对肾脏的保护作用增强，当到达5 m g k g ，其保护作用无明显增强。 2 依达拉奉可以减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤，减轻肾损害。其主要机 制可能与直接清除氧自由基，减轻脂质过氧化反应，抑制细胞