（光学工程专业论文）单模光纤激光共焦扫描显微成像系统——二维平面扫描和图像采集技术的研究.pdf

硕士学位论文 y 5 7 1 , 4 4 1 摘要 光纤激光共焦扫描显微镜( f o c s m ) 是现代光电技术相结合的新型显微成 像系统。它采用具有柔性的单模光纤取代原激光共焦扫描显微镜( l c s m ) 中的 针孔，作为点光源和点探测器，满足产生共焦条件的要求，从而能够获得出色的 横向和轴向分辨能力，并在焦面上获得很薄的高分辨率光学断层图像，配合计算 机图像处理技术的使用，即可实现细微结构的三维成像。f o c s m 是研究细微结 构的有效技术手段，近年来得到长足的进步和发展，被广泛应用在生物科学、医 学科学、材料科学及微电子学等领域。 本文对单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的成像原理进行了深入的理论 分析；计算研究了探测系统前的光路系统的光能损耗，并设计了p m t 探测器以 及相应的前置放大电路；重点研究设计了由二维扫描驱动电路、扫描畸变校正电 路、数据采集电路、双通道共享存储器电路和e p p 增强型并行接口电路等共同 组成的电子控制系统；设计编写了单片机与p c 机之间e p p 并行接口通信接口的 传输程序，其中包括单片机固件程序、p c 机核心态驱动程序和用户态应用程序。 本文设计研制出的f o c s m 系统的二维扫描驱动、数据采集和传输的电子控 制系统在完成调试之后。已能正常稳定的运行。 关键词：共焦扫描，单模光纤，扫描控制，图像采集 坝l 学位论殳用纸 箱i 负 a b s t r a c t s i n g l e m o d ef i b e r o p t i c a lc o n f o c a ls c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p y ( f o c s m ) i s a n e ws c a n n i n gm i c r o s c o p i c i m a g i n gs y s t e m t h a ti s b a s e do nt h em o d e mo p t i c s t e c h n o l o g ya n de l e c t r o n i c st e c h n o l o g y d u i n g t oa p p l y i n gt h ef i b e ra st h ep o i n ts o l l r c e a n dp o i n td e t e c t o ro fl a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p y ( l c s m ) t om e e tt h e c o n f o c a lc o n d i t i o n ，t h es y s t e mc a r la c h i e v e se x c e l l e n tr e s o l u t i o ni na x i a la n dp l a n a r d i r e c t i o n ，a n dc a na c h i e v e3 - di m a g i n go fm i c r o o r g a n i s mw i t ht h ei m a g ep r o c e s s i n g t e c h n o l o g y i n c o m p u t e r f o c s m i st h ee f f e c t i v em e t h o dt or e s e a r c ht h e m i c r o s t m c t u r ei nb i o l o g y ，w h i c h d e v e l o p e dq u i c k l yi nt h ea p p l i e dd o m a i n s o f b i o l o g y ， m e d i c a l ，p h y s i c a ls t r u c t u r e ，a n dm i c r o e l e c t r o n i c s i nt h i s p a p e r ，t h ei m a g i n gt h e o r i e s o ft h es i n g l e m o d e f i b e r o p t i c a l c o n f o c a l s c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p ya r ea n a l y z e ds y s t e m i c a l l y a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s e sa n d c a l c u l a t i n gi nt h eo p t i c a le n e r g yc o n s u m i n gb e f o r et h ep m td e t e c t i n gs y s t e m ，t h e p m ta n dt h ep r e - a m p l i f i e r ，a n dt h ee l e c t r o n i cs y s t e mt h a tp r o v i d e st h ef u n c t i o n so f s c a n n i n gd r i v i n g ，i m a g ea c q u i s i t i o na n di m a g et r a n s f e r r i n g a r e d e s i g n e d p c i s c o n n e c t e dt om c ub yt h ee n h a n c e dp a r a l l e l p o r t ( e p p ) w i t ht h r e es o f t w a r e p r o g r a m m i n gt h a ti s t h em c u sf i r m w a r ep r o g r a m ，t h ek e r n a lm o d ew d m p r o g r a n a n dt h eu s e rm o d e a p p l i c a t i o np r o g r a m o nt h eb a s i so ft h ef o r m e rr e s e a r c h ，t h eh a r d w a r eo ff o c s mi sd e s i g n e da n dt h e c o r r e s p o n d i n gc i r c u i td e b u g g i n gw o r k i n gi sf i n i s h e d n o wi tc a nw o r kn o r m a l l ya n d s t a b l v k e yw o r d s ：c o n f o c a ls c a n n i n g ，s i n g l e - m o d eo p t i c a lf i b e r , s c a n n i n gc o n t r o l ，i m a g e a c q u i s i t i o n 坝l 学位论立专用纸 第i i _ ! j 南京理工大学研究生学位论文 1绪论 1 1 课题研究背景和国内外发展状况 光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供 人们提取微细结构信息的光学仪器。传统光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效 应的影响，存在分辨率极限：另外一个限制是它的焦深【2 】。这些限制使传统光学 显微镜对具有一定厚度的物体成像很困难，因此对厚样品不可能实现三维成像。 1 9 5 1 年r o b e r t s 和y o u n g 最早提出了扫描显微镜的概念 3 1 。1 9 6 0 年美国人梅 曼发明了红宝石激光器以来，激光以其特有的优越性能对扫描显微镜的发展起到 了极大的推进作用。之后有众多文献对共焦显微术在理论和实践方面的研究工作 进行了报道。1 9 6 1 年，m i s k e y 首次提出共焦扫描显微镜的概念，引起了国内外 学术界和科技工作者的广泛关注和研究。至今，国际上已经召开了九次专题学术 讨论会议，国际工程光学学会( s p i e ) 也以它为主题出版了两次专集。 激光共焦扫描显微镜( l c s m ) 系统由于针孔点源和点探测器的引入，排除了 离焦光线造成的图像模糊，能够在像面上获得高对比度的高倍率放大图像，并且 由于它具有亚微米级的轴向分辨能力，能够实现图像的层析【4 】，建立起一系列不 同高度上的高分辨率光学断层图像，配合计算机图像处理技术的使用，便可实现 细微结构的三维成像【5 7 “。因此，集共焦显微术、激光扫描技术和计算机图像处 理技术于一体的激光共焦扫描显微镜，成为研究细微结构的有效技术手段，并引 起了人们的高度重视。 2 0 世纪8 0 年代和9 0 年代初，德国、美国、日本、英国都投入了大量的人 力和财力进行研究，在理论和实践上都取得了巨大的进展。在理论上，更加全面 地研究了共焦显微镜系统在明场条件下的各种特性，提出了许多改进成像质量、 提高成像分辨率的方案：在应用实践方面，国外已有正式产品投入市场，其中德 国c a r l z e i s s 公司早在1 9 8 2 年就推出商用激光共焦扫描显微镜产品，至今已经推 出第六代产品l s m5 1 0m e t a 型l c s m 。到9 0 年代中期，美国b i o r a d 、德国 l e i c a 、日本尼康以及英国剑桥分子生物实验室陆续推出激光共焦扫描显微镜的 正式产品。这些产品设备档次高、系统庞大，价格大致在2 0 3 0 万美元之间。 国内激光共焦扫描显微技术的起步较晚，但发展较快，浙江大学、中国科学 大学、电子科技大学、华东师范大学、南京理工大学等多所院校均开始对l c s m 投入研究力量，取得一定的进展【2 7 3 i 】。 2 0 世纪9 0 年代初，光纤被引入到l c s m 系统中，形成光纤激光共焦扫描显 研究生论立专用纸 第1 矾 南京理工大学研究生学位论文 微系统，并成为显微成像领域中又一前沿性研究课题。光纤激光共焦扫描显微镜 ( f o c s m ) 系统采用柔软的光纤代替l c s m 系统中的针孔作为点光源和点探测器， 它与传统的l c s m 系统有着相同的轴向分辨力；同时，单模光纤的应用使f o c s m 系统具有以下优点【6 】：激光会聚点与光纤输入端的对准即使略有偏差也不会对系 统引入像差，因而系统在安装调试过程中只需大致对准即可；光纤端面的清洗不 需要拆卸及重新对准，光纤端面沾染灰尘的可能性也大大降低【1 。”】，单模光纤分 路器可以替代传统共焦扫描显微系统中的分光镜与相应的机械结构，大大简化了 系统结构；柔软光纤的应用可使激光、信号探测部分实现分布式摆放，从而避免 激光器的振动对扫描部分产生的不良影响，提高了系统的抗干扰能力和可靠性， 这对共焦扫描显微成像技术的实用化有着重要的意义。 目前澳大利亚墨尔本大学利用光纤技术己研制出性能优越、结构紧凑小巧的 f o c s m 。但在国内，只有很少数单位在进行光纤激光共焦扫描显微镜系统的研 究，目前尚未见到有关研制成功f o c s m 原理样机或商用产品的报道。 本课题正是在光纤激光共焦扫描显微镜具有重要的应用前景与需求、以及我 国对开发研制这一高新技术产品的研究工作还很薄弱的背景下提出的，并且得到 了高等学校博士学科点专项科研基金资助项目的支持。 1 2 课题研究的意义、目标和内容 本课题采用理论分析与实验研究相结合的方法对光纤共焦扫描显微成像技 术进行研究。在理论上对传统的共焦扫描显微系统的明场成像机理进行研究和分 析，进而探讨在该显微成像系统中以光纤取代针孔而构成点源和点探测器对系统 成像特性的影响规律；然后分析设计研制相应原理实验系统样机，并进行相关实 验研究，验证理论的分析结果，发现问题，掌握规律。为进一步研制出具有高分 辨率的光纤共焦扫描显微成像系统样机做准备。 1 2 1 课题研究的意义与日标 本课题的研究对于探索与掌握光纤激光共焦扫描显微镜成像分辨率的提高、 系统的抗干扰能力与可靠性的提高、系统结构的简化和实用化等方面的规律具有 着重要的理论意义和实验价值。进而对于开发具有我国自主知识产权的新一代观 察微观结构的单模光纤激光共焦扫描显微镜具有重要的理论价值和应用前景。 本课题的研究目标是探讨f o c s m 系统的原理实验样机设计方案与关键技 术的解决，完成f o c s m 系统的原理实验样机研制。 州究生论史专用纸 第2 虹 南京理工大学研究生学位论文 1 2 2 课题总的研究内容 1 理论分析激光共焦扫描显微系统应用于明场条件下的成像机理； 2 理论分析采用单模光纤代替传统激光共焦扫描显微镜中的针孔作为点光 源和点探测器对系统成像特性的影响因素及规律，对包含单模光纤的整个光路系 统的光能传播损耗进行分析研究，计算分析光路各部分的耦合效率，分析引起光 路耦合损耗的因素和规律，最终确定光路系统的各项关键参数； 3 研究分析实现光纤扫描显微成像原理的各种可能技术方案的利弊，进行 系统总体方案的论证和设计，确定系统原理样机的总体方案与解决关键技术的途 径并进行f o c s m 样机的研制； 4 研究分析光电探测特性，设计高信噪比和低失真的探测放大系统，并完 成相关前置放大调节电路的设计与调试； 5 研究设计实现单模光纤共焦扫描显微成像系统所要求的高精度三维扫描 的技术方案，进行理论分析和实验研究，消除渐晕及扫描畸变的影响； 6 进行二维平面图像处理和三维图像重构的算法研究和软件设计。 1 3 本论文承担的任务 光纤激光共焦扫描显微镜的研制集应用光学、信息光学、共焦显微术、激光 扫描技术和计算机图像处理技术于一体，是典型的高新技术光电仪器的研发。由 于本课题涉及知识面广，技术难度大，本论文承担的工作只能是整个课题项目研 究的一部分，具体任务和研究内容包括： 1 调研、检索和消化国内外有关的资料及文献，了解国内外这一领域的研 究动态，从理论上系统深入地对传统的激光共焦扫描显微镜的明场成像机理进行 研究、比较和分析，探讨在光纤激光共焦扫描显微成像系统中采用单模光纤代替 针孔构成点光源和点探测器对共焦扫描显微成像特性的影响； 2 根据系统的组成与功能要求，具体分析计算光路系统产生的光能信号损 失，确定并完成p m t 探测器的有关参数及其相关前置放大电路的设计调试： 3 重点对二维平面扫描系统进行深入研究，选择确定具体的扫描方案，对高 精度二维扫描和采样系统存在的各种畸变和渐晕影响因素进行详细深入的分析， 针对分析结果，设计带有畸变校正功能的扫描控制及图像采集电子系统：完成光 纤共焦扫描显微成像系统的二维扫描成像装置设计与调试，使该电子系统能实现 高速采样、精确定位、图像处理及与计算机之间的e p p 并口数据传输等功能： 4 完成a t 8 9 c 5 1 单片机与p c 机之间e p p 并1 5 1 通信接口传输程序的软件设 计其中包括单片机固件程序、核心态驱动程序和用户态应用程序。 讲究生论殳专甩纸 第3 砸 南京理工大学研究生学位论文 2 光纤共焦明场扫描显微成像原理 随着傅里叶分析方法和线性系统理论在光学系统成像研究中的应用，相应地 产生了光学系统传递函数的理论。传递函数可以定量地描述物体频谱中各个频率 分量经过光学系统的传播情况，因而可以从本质上反映物像之间的关系。 2 1光学成像系统中的传递函数 相干成像系统在满足空间平移不变的条件下，假设物面上扩展物体的复振幅 分布为o ( x ，y ) ，点扩散函数为h ( x ，y ) 是系统的点扩散函数，则物体的像的复振幅 分布等于系统的点扩散函数和物体的几何光学像的复振幅分布的卷积【7 t 即。 g ( x ，y ) = o ( x ，y ) + h ( x ，y ) ( 2 1 ) 设呵g ( x ，y ) 】是g ( x ，y ) 的傅里叶变换，则由式( 2 1 ) 分别取其中的g ( x ，y ) 、 o ( x ，y ) 和h ( x ，y ) 函数的傅里叶变换，并记为： g ( ，( “，v ) 2f g ( x ，) ，) 】儿。g ( x ，y ) e x p 一j 2 万( u x + v y ) a x d y ( 22 ) o c ( “，v ) 2f o ( x ，y ) 2ji 。o ( x ，y ) e x p 一j 2 丌( u x + 1 叫) 舅k 妙( 2 3 ) h ( ( “，v ) = f h ( x ，y ) 】_ 儿。 ( 一y ) e x p 一j 2 n ( u x + v y ) a x d y ( 2 4 ) 其中h ( x ，y ) 的傅里叶变换日。( “，v ) 即称为相干传递函数，利用傅里叶变换的卷积 定理，由式( 2 1 ) 得到： g ( ( “，v ) = d ( ( “，v ) h ( ( “，v ) ( 2 5 ) 式( 2 5 ) 表示相干传递函数日。、( “，v ) 等于像的复振幅分布的频谱和物的复振幅分 布的频谱之比值【8 】i 即系统的成像关系在频率域中比在空间域中简单多了。在空 间域中- 点扩散函数反映系统的成像特性；而在频率域中，则是由传递函数描述 系统的成像特性。 2 2 薄透镜的傅里n - t - 变换性质和成像性质 通过将薄透镜看作一个衍射屏来分析在其焦平面上的衍射花样，当薄透镜被 均匀平面波照明时，可在其后焦面上观察到衍射屏的夫琅和费衍射图样，即薄透 镜可实现透镜瞳函数的傅里叶变换p 川】。 在考虑了透镜的i l 径效应后，透镜的透射函数公式为： f i 】f 究生论文专用纸 第4 页 南京理工犬学研究生学位论文 m 叫圳皿一卜警 眨s ， 式中，p g ，_ y ) 为透镜的瞳函数，k = 2 刀肛为波数，f 为透镜的焦距。 2 2 1 薄透镜在焦平面和离焦面上的衍射模式 u o ( x o ，y o ) 八 u l ( x ，y ) u ：( x 2 ，y 2 ) 、 l2 f 图21薄透镜在焦平面上的衍射模式 将薄透镜看作一个衍射屏来分析在其焦平面上的衍射花样，假定透镜被均匀 平面波照明，则透镜前的光场为：u o ( x o ，) = u o 。由菲涅尔衍射公式【1 0 】可以得 出焦平面z = 厂上的衍射分布为： ：g ，y ：) = 学e x p f 一! 生女掣 j p x , y ) ， 。 、 。 ( 2 7 ) e x p f i k c ( x 2 x + y 2 y ) i a x a y l ， j 由二维傅里叶变换定义【7 】，式( 2 7 ) 中的积分相当于空间频率为m ：x j f t 2 ) 和n = y ：( 刀) 时，对透镜瞳函数p ( x ，y ) 的二维傅里叶变换定义。它的图样是 p ( x ，y ) 的夫琅和费花样，但造成这种衍射图样的原因仍然是菲涅尔衍射。 对于球对称的透镜，其瞳函数仅与半径坐标相关，即：p ( y ) = j d ( r ) ，其中 r = ( x2 + y 2 ) 尼。若p p ) 是一个半径为甜的均匀圆孔函数，则透镜的瞳函数【9 1 可以 写成： 州= l rsd 其他情况 ( 2 8 ) 根据汉克尔变换9 1 的定义，忽略常量，并利用径向光学坐标v 可将式( 27 ) 化简为： 研究生论空专用纸 第5 页 广l j 南京理工大学研究生学位论文 吣一如蜘( - 爿掣 c ：们 式( 2 2 5 ) 中：冬为菲涅尔数，径向光学坐标v 如式( 2 1 0 ) 所示。 ， v 一等渺 焦平面上的强度分布是式( 2 9 ) 的模的平方： ，怍) ：型 2( 2 该强度分布被称为爱里斑【，大约8 0 的入射光能量都集中在中间的亮圆 斑中。这表示由于衍射作用，一束平行光通过薄透镜后在透镜后焦面上并不能成 像为一个理想点，而是一个强度分布如( 2 1 1 ) 式表示的斑点。 倘若观察面不是正好在焦面上，而是在一个离焦的位置。假定离焦距离为 k z ，此时观察面到透镜的距离为z = 厂+ 出。对于一个均匀平面波照明情况下， 观察面上的场分布通过菲涅尔衍射公式给出叽 2 掣肌小x p 鲁 力】，：， e x p ：! _ ( z ：一x ) 2 + ( ：一y ) z ( & 咖 若对于一个圆对称的透镜，则可对式( 2 1 2 ) 进行汉克尔变换，得到： ) = i e x 诬p ( i k f ) e x p f 譬一p ) x e x p l 一害( 翔山阱砌 1 3 上式的变换中不失一般性将u 。假定为一个单位的照明，设透镜的离焦瞳函数为： 即，垆竹廊p 愕2 他l 一期 他，。， 贝l j d t , ( 2 1 3 ) 式可知u ：( _ ) 是离焦瞳函数的二维傅立叶变换。对于半径为日的 圆形透镜引入径向光学坐标v 和轴向光学坐标“： v = 等( 办一d w r f a r l 了2 7 9 删n 口( 2 1 5 a ) 研究生论文专用纸 第6 砸 南京理工大学研究生学位论文 。：车。z f 占一土 。车血霎 ( 2 1 5 b ) a l 厂z j z f 2 对于一个均匀的圆形透镜，将( 2 1 5 ) 和( 2 1 6 ) 代入( 2 1 3 ) 式可得u ，作为 离焦量“的函数： 啪= z a - n 唧阱x ，( 羔 州v 丁i u p 2 p ( v p ) p a p ( 6 ) 式中p = 么是对透镜的孔径归一化后的半径坐标。该式给出了焦平面附近的三 维衍射场分布。 当“= 0 时，观察面就在焦平面上，此时的光强分布为： 州u 2 删) 卜2 ) 2 f 半 2 陔式与( 2 1 1 ) 是相同的。 当v = 0 时，沿轴向的强度分布为： 删中如一o ，划2 叫雩 晓 上式表示平行光束通过薄透镜后在不同离焦距离处光轴上的强度分布。 2 2 2 单薄透镜的三维成像公式和三维点扩散函数 光学系统一般是由若干薄透镜组构成，对于单薄透镜成像的研究有助于对整 个光学系统成像的理解。在以后章节中可知，单模光纤共焦明场扫描显微成像系 统是相干成像的。为此，首先讨论单薄透镜的相干成像理论。 i j _ 究生论艾专用纸 u o ( x o y o )u 1 八 u l u i d o d - 图2 2 单薄透镜成像系统结构图 锖7 虹 南京理工大学研究生学位论文 设有一个振幅透过率为0 0 ( x o ，y o ) 的平面物体放在一个正透镜前d 。处，设透镜 的瞳函数为尸( x ，y 。) ，并在透镜后d 。处进行观察，如图2 2 所示。用单色均匀平 面波a 照明物体，图中。面为物平面，单色平面波4 透过物体后的光场分布为： x o ，y o ) = a o ox o ，y o )( 2 1 9 ) 式( 2 1 9 ) 即为物函数。由于光波的传播过程是线性的，则成像系统也可以看成 是线性的。根据线性系统理论，物函数u 。x 。，儿) 可利用d 函数表示为： u ox o , y 。) = j7 u o b j ，y j p g 。一x ：，y 。一y k ；咖j ( 2 2 0 ) 该式表明物i n 数u 。x 。，y 。) 是无数加权占函数的线性组合，其中占函数是构 成物i n 数的基元，而k ，y o ) 是它的权重因子。 物函数经菲涅尔衍射到透镜前表面，上，得到： u ，b ，v 1 ；i e x p ( i k d o ) d o 肌) e x p 怯：妒砧：慨 但2 ” 最后仍然由菲涅尔衍射公式【l o 】，得到在像平面的场分布： ( 一，m ) = 曼掣f 儿：u 。g 。，蜘) p 。，y ) p 怯h 卜料一掣 亿：z ， p f 盖b ，叫2 叱刊2 d x 赢出咖 瓦甲x y 是溥透锐向上的坐标。 引入透镜的横向放大率m ，并定义： m = d ，d 。 r 2 2 3 ) 则式( 2 2 2 ) 又可写成： u，b，y，)=!掣exp2m腩do，tx2+y?)二u。(x。，y。) 岬m x p 陟悟专一卅p 鲁m 心z a ， e x p 一鲁 z ( x 。+ 寺 + 玎y 。+ 茜) 西吒咖。西c 砂 研究生论义专用纸 第81 j 王 堕塞堡三奎兰竺壅圭兰壁堡苎一一 若去+ 吉一专d 是3 - d 空- 解移不变量删可认瓤 n ( x o , y o ；x j , y 1 ) e x p 砺 i k d o ( 1 矿+ m ) e x p 去hy 斗x 怯k j 酬e x 伊梏+ 剖 一躺。+ 韵小剖卜 f 2 ，2 5 ) 根据光强分布和振幅分布的关系，可以把( 2 2 5 ) 式中两次位相因子看作常 数，在讨论成像问题时通常舍去常量部分，可简化振幅点扩散函数得： h x o , y o ；x i , y i ) = 研1 帅y ) 出h y 2 挣剖 ( 2 ：。， p 扣韵小+ 钏螂 由几何光学可知，对应于物点，y 。) 的几何像位置为x 。= 一m x o ，y 。= 一m y o 若以几何点为参考点，则振幅点扩散函数变为： h ( x 。，j ， ；)=巧1两尸xyg ，_ y ) ；吒，j 2 骊儿，_ y ， x e x 。 萼b 2 + y 2 ( 去+ 专一 p h 秘飞) 嗑。 、 一y g ) ”出咖 j j 显然， 是b ，一x 。) 、b 。一y ；) 的函数，因而上式可写成 ( 2 2 7 ) n x , - x g ；y i - y g ) = 去j p b ，y ) e x 一 李b 2 + y 2 ：( 言= - + 击一爿 c ：z s ， p 卜融飞) 咕i h 忡 定义透镜的离焦瞳函数： 咖印m x - 降h y 2 净专一期 研究生论史专斤1 纸 f 2 2 9 1 第9 页 1 i 0 坛 南京理工大学研究生学位论文 并将f = x ，一k ，_ = y ，一y 。代入，则( 2 2 8 ) 变为： 础砌= f 删一卜睁+ 删蛐 b ， 从上式可知透镜的离焦的振幅点扩散函数是其离焦瞳函数的傅立叶变换，由 于式( 2 3 0 ) 可以描述单点成像的三维特性( x ，y 和离焦量) ，称为三维振幅点扩 散函数。 若透镜为圆对称，则可将式( 2 1 5 a ) 和( 2 t s b ) 定义的径向和轴向光学坐标 代入，三维振幅点扩散函数则可写为： 而o ，v ) 一击f r 尸( p ) e x p ( 一m 么n ) 2 巧咖 ( z m ) 2 2 3 单薄透镜的三维相干传递函数 物体可以看作是一系列周期分量的叠加。若能得到系统对物体每个周期分量 所成像的系数，则可以完整的解释成像系统的成像特性。为了能得到这个系数， 可对物函数o ( 产) 进行三维傅里叶变换： d ( 廊) = io ( i ) e x p ( 2 州i 莉) d f ( 2 3 2 ) 相应其傅里叶逆变换给出物体的三维物函数： d ( 尹) = io ( r h ) e x p ( 2 z r i y 而) 西舜 ( 2 3 3 ) 其中历表示空间频率分量，它具有三个分量，分别是横向分量m ，n 和轴向分量s 。 将式( 2 3 3 ) 代入式( 2 1 7 ) 可得： ( 瓦) = l c ( 而) d ( r h ) e x p ( 2 耐弓而) 拥l ( 2 3 4 ) 其中c ( 而) 由式( 2 3 5 ) 给出： c ( 而) = 自( f ) e x p ( 一2 7 r i f 而) 办 ( 2 3 5 ) 由式( 2 3 4 ) 可以看出：乘积形式c ( 而) 和0 ( 而) 表示像场中空间周期分量的 强度，即像场谱。所以c ( 而) 可看成是像场谱与物场谱之比。因此，c ( 厮) 被称为 三维相干传递函数( 3 - dc t f ：3 - d i m e n s i o nc o h e r e n tt r a n s f e rf u n c t i o n ) 【2 5 】。 从式( 2 3 4 ) 看出，像场的特性完全取决于三维相干传递函数，通过给出的 三维相干传递函数就可以得出任何物场所成的像。三维相干传递函数仅和光学威 像系统的结构参数有关，如透镜的瞳函数、像差、探测器的位置等，因此可以认 为三维相干传递函数c ( 而) 能够用于考察成像系统的特性。 究生论义专用纸 南京理工大学研究生学位论文 若考虑半径为a 的圆形薄透镜，它的三维振幅点扩散i n 数为： ( v ，“) = l p ( p ) e x p ( 一5 2 “- ；2 ) l ，。( p v ) 2 z r p d p ( 2 3 6 ) 式( 2 3 6 ) 中： 2 z cd2 z r ”了7 i 2 t 邶m a “ a 。 u ：塾：篓：塾：s i n ：鱼 = 一z _ = 一z一 g o z 将式( 2 3 6 ) 代入( 2 3 5 ) 即得到圆对称的3 一dc t f ： c ( z ，j ) = j ( v , t a ) j o q v ) e x p ( i u s ) v d v d u 式中，= ( m2 + t , 1 2 ) ”2 代表径向空间频率，s 为轴向空间频率。 终可得透镜的三维相干传递函数为： 1 2 c ( t ，s ) = 尸( ，) d 0 一) 式( 2 3 9 ) 已被其在l = s = o 处归一化，式中p ( t ) 定义为： r l p 墨1 p ( p ) = 1 0其他 此时： c ( 1 s + s o ) = p ( 伽( 一l z 其中s 。为轴向空间频率的位移常量，定义为： s o = 1 4 s i n 2 ( d o 2 ) 】 ( 2 3 7 ) ( 23 8 ) 利用式( 2 3 8 ) ，最 ( 2 3 9 ) ( 2 4 0 ) ( 2 4 1 ) ( 2 4 2 ) 式( 2 4 1 ) 表示相干传递函数与光瞳函数形式相似，由于光瞳函数之值在出瞳范 围等于1 ，在出瞳范围之外等于0 ，因此相干传递函数之值也应是如此，即意味 着衍射受限的相干成像系统在频率域内存在一个有限的通频带，物的频谱中在这 个通频带内的全部频率分量可以没有畸变的通过系统成像，而这个通频带外的高 频成分将被系统过滤。把通频带内的最高频率称为截止频率，显然截止频率和通 频带的存在是系统有限出瞳产生的限制的结果。 因此，圆形薄透镜的三维相干传递函数应该是一个球面( e w a l d 球) 【l 】的顶 端，其中的差别是由傍轴近似造成的，如图2 3 所示，其截尾频率，= ，轴向带 窬s = l 2 。 圳究生论文专用纸 南京理工大学研究生学位论文 s 图2 3 薄透镜的三维相干传递函数 可以看出，该单透镜的3 - d c t f 是一个沿轴向位移的抛物面，其回转轴是s 轴，权函数是p ( ，) 。d 代表透镜孔径在物空间的半张角。 2 - 3 共焦明场显微镜( l c s m ) 成像理论 2 3 1 点探测器反射式l c s m 的的相干成像性质 共焦显微镜( l c s m ) 中的重要组成部分就是放在探测器及光源前的小孔。 为了达到完全共焦的成像方式，小孔的尺寸是越小越好。当小孔是一个点的理想 情况下，共焦明场显微镜( 样品为非荧光物质) 的成像过程是完全相干的，此时 系统表现出很好的光学层析性质，使它可以对具有一定厚度的样品进行三维成 像。 共焦明场显微术在实际应用中有两种方式 图2 4 ( 口) 为透射式共焦扫描显微镜等效原理图 镜装置示意图。 l 2 透射共焦方式和反射共焦方式。 图2 4 ( b ) 为反射式共焦扫描显微 l 研究生论义专用纸 图24 ( a ) 透射式共焦扫描显微镜等效原理图 测 南京理工大学研究生学位论文 图2 4 ( b ) 反射式共焦扫描显微镜装置示惹图 本论文的实验系统的原理方案是采用反射共焦方式，所以本论文着重论述反 射式共焦扫描显微镜的成像理论。图2 4 ( 6 ) 是典型的反射式共焦扫描显微镜的结 构图，它由一个点光源5 、两个透镜( 聚光透镜只和物镜只) 、一个分光镜以及 一个点探测器d 组成。其中只用来在物体上形成一个衍射受限的照明，而只用 来将物体反射回来的微弱光信号收集到点探测器中。 入射光经物镜被聚集到三维物体上，物体上被光斑照明区域的信号经分柬镜 和集光透镜后被收集到点探测器上。如果将物体沿着轴向和横向移动，可实现对 物体的三维逐点扫描，则能得到物体的三维信息，即物体的三维像。 设h ，、h z 分别为物镜l 。和集光镜：的点扩散函数，只( 最，耳) 和p 2 ( 4 ：，耳：) 分 别是物镜厶和集光镜三：的瞳函数，o ( x 。，y 。) 为物体的振幅透过率，则物体之后 的振幅响应函数为： u l ( x o ，y o ；x s ，y n ) = h 】( x o ，y o ) o ( x s x o ，y s y o ) ( 2 4 3 ) 其中： 矗( ，y 。) = f 鼻( 点，确) e x p ik 喜- - l x o + 确蜘) d 卣d 矾 ( 2 4 4 ) 。 2 在接收器平面上的光振幅分布为： u 2 ( b y 2 ；x s , y 沪j 吲蜘m 州y 姒嘶，鲁一y 。) d x 赢 ( 24 5 ) 式( 2 4 5 ) 中m 为系统横向放大率，又接收平面上的空间滤波器针孔为占函数， 并对h ，取反转坐标得： u 2 ( x 2 ，y 2 ；弧，y n ) = i j h l ( ，y o ) 2 ( z o ，y o ) d ( b 一，y n y o ) d x o 咖o ( 2 4 6 ) j j 究生论_ ! = ! = 专用纸 第1 3 页 南京理工大学研究生学位论文 假设图中光源和探测器都具有理想点的特性，即光源强度分布和探测器的空 间滤波孔径函数可以以6 函数表示。根据式( 2 4 6 ) ，探测器上所得到的光强分 布为： ，k ，只) = f f 6 ( x 0 ，儿) 1 e ：，y ：；t ，只】2 d ( 毪，) 氐西a k ：d y ： = jf j p ( ，帕h g + 砩，+ m k ( _ + m ，y + m ，) o k x ，”一y ) 0 r _ 一z ，儿一y k k + m ：z ，儿+ ：x ) x b + m 2 x ，一十m 2 x ) d ( z 2 ，y ! 0 d y 0 d x d y d xd yd x 2 d y ： = jj fn b ，y h g ，y ) p k x ，儿一y ) d k x ，n 一，k 0 ，y 弘：g ，y k 咖d x d y 则光强分布为： ，= j h i h 2o o l 2 ( 2 4 8 ) 式( 2 4 8 ) 表明探测器所探测到的总光场的振幅分布是由样品上不同点所贡献的 振幅的叠加。其中符号“o ”表示卷积运算。 从以上推导可以看出，理想点照明与点探测的共焦明场显微术的成像过程是 完全相干的，共焦扫描显微成像系统是普通扫描光学显微成像系统的一个特例。 它与其他扫描成像系统的不同就在于，点源和点探测器的同时引入使共焦扫描成 像系统的点扩散函数是照明系统和接收系统的点扩散函数的乘积，而不是象串级 系统那样是两点扩散函数的卷积，点扩散函数相乘可以改善系统总的点扩散特 性、增加系统横向和轴向分辨率、增强对背景噪声的滤除，这也是共焦扫描成像 系统的最大优点。 实际中，点光源和点探测器的构成，是在光源( 一般为激光器) 和探测器前 面放置一微米量级的针孔实现。由于针孔并不能完全看成是一个理想的点，而是 一个面积相对比较小的面，所以这种情况下的激光共焦扫描显微成像系统的成像 是部分相干的。 2 , 3 2 点探测器反射式l c s m 的三维相干传递函数 设c 呖) 为点探测情况下共焦显微镜的三维相干传递函数，是三维有效点扩 散函数的三维傅立叶变换。 则由式( 2 4 7 ) 中的点扩散函数形式可得： c ( 而) = 。 l ( 彳i i ) 2 ( i + m f 2 ) e x p ( 一2 删i 一威) 方 ( 2 4 9 ) i j | _ 究生论j ：c = 专用纸 第14 负 堕蔓里三查兰堡塞竺兰堡堡苎 一 若l c s m 系统中物镜和收集透镜都具有圆形光瞳，则鼻( z ，y ，z ) = p l ( r ，= ) ， 只( x ，y ，z ) = p 2 ( r ，z ) 。其中，r = ( x 2 + y 2 ) 1 ”。将式( 2 4 4 ) 代入式( 2 4 9 ) ，并考 虑圆对称性，可得： c ( 聊，h ，s ) = 广c ( m ，”，z ) e x p ( 一2 z c z s ) a z ( 2 5 0 ) 其中c ( m ，h ，z ) 为二维离焦相干传递函数，并由式( 2 5 1 ) 给出【”： c ( m ，n ，z ) 2e x p ( - 2 i k z ) p l ( 2 d 2 ，m i2 z ) o p 2 ( 2 d 2 1 , z - m 2 z z ) r 1s 1 、 e x p ( 2 z r i m ，( x ，m + y ，”) ) ) 其中f ( m 2 + n 2 ) ”代表径向空间频率，以上，式( 2 4 9 ) 是三维相干传递函数 的通用形式，而式( 2 5 1 ) 仅对使用圆形透镜适用。 如果物镜和收集透镜都没有像差，且半径都为a ，并且假定探测器位置没有 偏移，此时式( 2 8 0 ) 变为： c ，( f ，”) = k ，e x p ( - 2 括。甜) 鼻( f ， ) p ( ，“) ( 2 5 2 ) 由式( 2 5 2 ) 中，k r 是反射方式中的归一化常量，弓( f ，“) ：p ( ，) e x p ( 娑) 。 z 其中e ( 1 ) 是物镜的瞳函数，在反射式共焦系统中，信号的收集是沿着物光的反方 向进行的，因此物镜和收集透镜的离焦量是相同的，即有式( 2 5 3 ) 。 县( f ，“) = 墨【f ，) ( 2 5 3 ) 将只( f ，“) 和b ( z ，“) 代入式( 2 5 2 ) ，并对c r 【f ，“) 在“上做傅立叶变换可得： ，2i2 c ，( f ，j ) = ， p q ) a ( s + s o 一之0 圆 ( o a ( s + j o 一寻) ( 2 5 4 ) 上 式( 2 5 4 ) 是两个完全相同因子的卷积，其中每个因子都是单透镜的三维相干传 递函数。因此，反射式共焦显微镜的三维相干传递函数是传统相干显微镜三维相 干传递函数的自卷积，可表为图2 5 。 席席 研宄生论立专用纸第15 页 南京理工大学研究生学位论文 式( 2 5 4 ) 可以写为： “如) = k ，6 ( s + 2 s o ) k r 2 s p ( t ) 6 ( s 一妥) 。p q ) 6 ( s 一姜) 】 ( 2 5 5 ) c ，( ，s ) 一寻) o一 ) 】 ( 2 由式( 2 5 5 ) 可以看出，系统三维相干传递函数沿轴向位移了2 s 。对式( 25 5 ) 经过数学计算可以解得如下系统三维相干传递函数的具体表达式： c ，( ，s ) = 1 ， i l2 s 1 一m 一三2 )4 、7 扣n 拯1 _ f ( 1 扣， 1 5 6 ) 其中，s = s + s o 。可以看出，c ，( ，j ) 的非零区域为f2 4 s7 1 ，即式( 25 6 ) 沿着s 方向有一个常量的空间频率位移： 1 5 。2 2 s i n2 ( a o 2 ) ( 25 7 ) 经过作者利用m a t l a b 软件对式( 2 5 6 ) 进行编程模拟仿真后，得到如图 2 6 所示的点光源和点探测器的反射式l c s m 系统的3 - dc t f 三维示意图。 图2 6 ( d ) 反射式l c s m 系统整个坐标系内的3 d c t f 的三维示意图 肼究生论史专用纸 堕室望三查兰竺窒竺兰竺堡壅 图26 ( 6 1 反射式l c s m 系统坐标系第一象限内的3 - dc t f 的三维示意图 图2 6 ( d ) 图为反射式l c s m 系统整个坐标系内的3 dc t f 的三维示意图， 图2 6 ( b ) 为反射式l c s m 系统坐标系第一象限内的3 一dc t f 的三维示意图。三 维的坐标轴意义分别表示为径向空间频率f 、带有s 方向2 s 。偏移的轴向空间频 率s + 2 s o 、三维相干传递函数c ，( f ，s ) 。 由于空间频率位移常量的影响，使得3 一dc t f 在l s o s 0 的区域为0 ， c ，( ，s ) 仅在f 2 4 s 1 区域不为0 ，在该区域中，它的横向截尾频率为2 ，而轴 向带宽为1 ，说明系统的相干成像带宽是单透镜的2 倍。从图2 6 中，还可以看 出，该系统3 一dc t f 在轴上的截面c ，( ，= 0 , s ) 是方形的，表示该系统的轴向分辨 率较高，可以滤除大部分背景噪声，具备很好的层析成像能力。 2 3 3 横向和轴向分辨率 对于反射式l c s m ，透镜厶和e ：为同一透镜，因而对点物在理想情况下 其像平面光强分布为 ： 型盟 4 u ( 2 5 8 ) 比较式( 2 5 8 ) 和普通显微镜光强分布函数2 ，9 1 知，若物镜相同时，共焦系统 的光强分布是普通显微镜光强分布函数的平方，其半高宽要比