（生物学专业论文）蛋白激酶、磷酸酶功能研究.pdf

英文缩写词表 a m p c d n a c p m d n t p s d t t e b e d t a e m b l g c g m r n a o r f p c r p k d s p s d s d s t r i s a m p i c i l l i n c o m p l e m e n t a r yd n a c o u n tp e rm i n u t e d a t ed c t p , d g tp d t t p d i t h i o t h r e i t o l e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e u r o p e a nm o l e c u l a rb i o l o g yl a b o r a t o r y g e n e t i cc o m p u t e rg r o u p m e s s e n g e rr n a o p e nr e a d i n gf r a m e p o t y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r o t e i nk i n a s e d u a l s p e c i f i c i t yp r o t e i np h o s p h a t a s e s h i n e d a l g a m os e q u e n c e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 2 - a l n i n o - 2 一h y d r o x y m e t h y l 一1 ，3 一p r o p a n e d i o l 4 摘要 隽i 疵之爿协五吨 通过大规模c d n a 克隆测序，我们从人胎脑c d n a 文库中克隆 到两千多条全长人类新基因。通过生物信息学分析，我们发现其中 5 4 条含有蛋白激酶或蛋白磷酸酶的保守结构域。在本实验中，我们 以生物信息学的分析结果为提示，对其中8 条基因进行了染色体定 位，研究了其表达谱。随后，我们试图在原核表达体系中诱导表达这 些基因，经过纯化以后，我们用体外实验验证其蛋白激酶蛋白磷酸 酶活性。 综述 生物体的生长发育主要受到遗传信息及环境变化的调节和控制。遗传信息决 定了生物体生长发育的基本模式，而其实现则受控于环境因素的刺激。环境因素 包含了生物体的外界环境和体内环境两个方面。随着人类基因组计划和很多模式 生物基因组测序工作的突破，我们对遗传密码的转录和翻译有了非常深刻的了 解。而环境刺激如何控制着基因表达、细胞增殖、分化和凋亡这一问题，是目前 生物学所面临的巨大挑战。细胞信号转导( s i g n a lt r a n s d u c t i o n ) 所研究的主要内 容，就是细胞感受、转导环境刺激的分子途径及其在生物个体发育过程中如何调 节基因表达和代谢生理反应。细胞信号转导的研究目标，就是要描绘出信息在生 物体内传递的完整的网络图。这就需要我们发现更多的参与细胞信号转导的生物 大分子，并研究其所属的信号途径。细胞信号转导方面的研究进展，为我们最终 破泽基因组这部天书提供了可能。 对细胞信号转导的研究发现，在这一过程中，蛋自的可逆磷酸化是生物体传 递信息的基本方式。可逆磷酸化的过程是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化得以实现 的。本文将就蛋白激酶和蛋白磷酸酶的结构与功能展开详细的探讨，先简单的回 顾一下细胞信号转导的些基本观点和概念。 细胞信号转导 生物体是一个有序的系统。生物体的新陈代谢过程是一个有序的过程，不但 有物质与能量的变化，还有信息流的变化。细胞的增殖、分化和凋亡，是对体内 体外环境信息的应对。这一过程是经由细胞信号转导网络得以实现的。细胞体内 外的信息，以信号的方式刺激细胞，通过细胞信号转导网络，达到调控生物体新 陈代谢、细胞增殖、分化或凋亡的目的 p i t c h e re ta 1 ，1 9 9 8 。可以说，正是因为 有了信号转导网络，生物体才能不断地适应变化着的体内外环境 p a u le ta 1 ，1 9 9 7 ； s c h i n d l e r , d a m e l l ，19 9 5 ；s t a r ke ta 1 ，l9 9 8 】。 细胞信号可以大致分为以下几类 孙大业等，2 0 0 0 3 ： 1 生物大分子的结构信号。蛋白质、多糖和核酸等生物大分子具有复杂 的三维空间结构，这种信号包含在构成它们的亚基的顺序信息之中。以 生物大分子结构为基础的分子识别在细胞中具有独特的功能。 2 物理信号。电、光、磁场等物理因素可以在生物体内器官、组织、细 胞之间或其内起信号分子的作用。最常见的例子就是神经细胞通过传播 膜电位这种物理信号来完成信号传递的过程。 3 化学信号。生物体内有许多化学物质，它们既不是能源物质，也不是 结构成分，其主要功能就是传递信息。这类化学信号又可以分为细胞间 通讯的信号分子和细胞内通讯的信号分子两类。细胞问通讯的信号分子 又被称为第一信使，而细胞内通讯的信号分子则被称为第- - i g 使。 化学信号是最复杂的类信号分子，它们能够引起细胞内的级联反应，主要 是通过一系列蛋白的可逆磷酸化过程，逐级放大信号，最终达到调控细胞生命活 动的目的( 图1 ) 。 环 境 羽 蠹 图1 细胞信号转导主要途径模式图 孙大业等，2 0 0 0 j 棱 第一信使，即负责细胞问通讯的化学信号分子，主要包括了内分泌激素、神 经递质、局部化学介导因子以及气体信号分子四大类。第一信使可以通过与细胞 膜上的受体结合并将其激活，直接、或由第二信使介导、或由g 蛋白介导激活 细胞内的信号转导途径，最终达到调控目的蛋白活性或目的基因表达的目的 m o r g a n ，1 9 9 7 ；o s u g ae ta 1 ，2 0 0 0 。一些脂溶性的第一信使也可以透过细胞膜，直 接怍用于胞内的受体蛋白，达到调控的目的。 由图i 可以看到，化学信号在细胞内的转导，是通过一系列蛋白可逆磷酸化 的过程得以实现的。而这一过程是由细胞内的蛋白激酶和蛋白磷酸酶所催化的。 因此对细胞内众多蛋白激酶和磷酸酶的结构与功能研究，是细胞信号转导研究课 题中的重要组成部分。 以下，我们将对蛋白激酶和磷酸酶的研究作一些回顾。 蛋白的磷酸化和脱磷酸化 蛋白磷酸化反应是指蛋白激酶催化的把a t p 或g t py 位上的磷酸基团转移 到蛋白底物氨基酸残基上的过程。而蛋白磷酸酶则催化这一反应的逆反应。 蛋白的可逆磷酸化在细胞信号转导中占有重要地位。这主要表现在： 1 这种调控方式具有专一应答的特点； 2 酶促反应具有逐级放大信号的优点； 3 此种方式几乎涉及了所有的生理现象； 4 蛋白磷酸化与脱磷酸化可以维持信号的持续性。 先来了解蛋白激酶的研究进展。 蛋白激酶 如前所述，蛋白激酶催化将a t p 或g t py 位上的磷酸基团转移到相应蛋白 底物上的反应。已知的哺乳动物细胞中的蛋白激酶有3 0 0 多种，随着人类基因组 计划的完成，预计人类基因编码了约1 0 0 0 个蛋白激酶基因。一些在模式生物中 得到的数据也为我们提供了一些借鉴。以线虫e l e g a n s ) 为例，通过全面分析线 虫基因所编码的蛋白，发现含有蛋白激酶结构域的占到了总数的2 6 p l o w m a n e ta i ，1 9 9 9 1 ，构成了一个数目庞大的蛋白激酶家族。 虽然蛋白激酶种类很多，但它们在结构上有很大的相似性，特别是其催化部 ：分。图2 是根据蛋白激酶在结构上的相似性，用进化树的形式来表示各类蛋白 激酶之间的关系以及它们在进化中的位置。 p d g 嚣嚣 e g f r夤自激酪j f s r c l c d c 7 图2 各类蛋白激酶及其在进化中的关系 孙大业等，2 0 0 0 蛋白激酶的分类 目前还没有统一的蛋白激酶分类方法，比较通行的分类方法有以下两种： 1 按照底物蛋自被磷酸化的氨基酸残基为标准，蛋白激酶可以分为 丝苏氨酸蛋白激酶，酪氨酸蛋白激酶和双特异性蛋白激酶三大 类； 2 按照蛋白激酶活性是否受调节为标准，蛋白激酶可以分为信使依 赖型和非信使依赖型两类。 在表1 中，我们综合了以上两种分类标准，列举了一些常见的蛋白激酶。 需要指出的是，许多被列入非信使依赖型的蛋白激酶，鉴于其重要的生理作用， 其活性理论上也应该受到严格的调控，也许只是因为我们对其调控方式知之甚 一7 ，才暂时归入非信使依赖型蛋白激酶的行列。至于双特异性蛋白激酶，由于其 数量较少，没有列入表中，将在以后部分中以文字的形式加以讨论。 表1 常见蛋白激酶的归类 名称活性调节物 p k ac a m p p k gc g m p 信使依赖型丝苏血红素依赖型蛋白激酶 血红素 丝 氨酸蛋白激酶c a 2 + c a m 依赖型蛋白激酶c a 2 + ，钙调素 苏 氮p k c c a 2 + ，磷脂 酸 蛋双链r n a 依赖型蛋白激酶d s r n a 白 激 酪蛋白激酶 酶 非信使依赖型丝 组蛋白激酶 苏氨酸蛋白激酶糖原合成酶激酶 视紫红质蛋白激酶 酪 e g f 受体，胰岛素受体，p d g f 氨 受体酪氨酸激酶各种细胞因子 酸受体等等 蛋 白 激 上游酪氨酸蛋白 酶 非受体酪氨酸激酶 s r c ，z a p 7 0 ，j a k ，a b l 等等 激酶 以下我们主要按照第一种分类方法对一些常见的蛋白激酶的结构与功能作 进一步详细阐述。 蛋白激酶的结构和功能 所有的丝苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的氨基酸序列中都含有一段比较保守的 催化结构域，由2 5 0 3 0 0 个氨基酸残基组成 h a n k s ，h u n t e r ，1 9 9 5 。这种催化结 构域有3 方面功能：1 ) a t p 或g t p 的结合和定向，有二价阳离子( m 9 2 + 或m n 2 + ) 参弓形成这一复体；2 ) 底物蛋白质或肽的结合和定向；3 ) 催化a t p 或其它核苷 三磷酸的y 磷酸基团转移到受体丝苏氨酸或酪氨酸的羟基上，虽然催化结构域在 每1 个激酶氨基酸序列中的位置并不固定，但在大部分单亚基的激酶中，它位于 肽链的羧基端，而氨基端往往作为调节区域 e d e l m a ne ta ，1 9 8 7 1 。在多亚基激酶 中，催化结构域覆盖整个激酶氨基酸序列的现象也很普遍。 通过对已有的蛋白激酶进行序列比较以及对切去部分n 端或c 端后的蛋白 激酶的酶活性分析发现，在催化结构域中，有1 2 个亚结构域( 亚结构域i x i ， 其中亚结构域v i 包含v i a 和v i b ) 的氨基酸序列是十分保守的，包含不变或接 近不变的氨基酸残基，它们被一些低保守的氨基酸残基分隔开。这些高保守的结 构域在激酶活性方面起重要作用。h a n k s 和h u n t e r 对3 7 0 种蛋白激酶的氨基酸序 列进行比较，将保守性在9 5 以上的氨基酸残基作为不变或接近不变氨基酸，结 合依赖c a m p 的蛋白激酶a 催化亚基( p k a c a ) 的晶体结构 z h e n g e ta 1 ，1 9 9 3 ， 发现激酶催化结构域折叠成大、小两叶( 1 0 b e ) 状结构，小叶包含亚结构域i i v ， 与核苷三磷酸的锚定和定向有关，大叶包含v i a x i ，与底物的结合和磷酸基团 的转移有关，亚结构域v 则可能是两部分的联接。 下面，我们分别探讨几类不同的蛋白激酶。 p k a ，即受第二信使c a m p 调控的蛋白激酶。随着c a m p 作为第二信使作用 的逐步阐明，一种活性受到c a m p 调控的丝苏氨酸蛋白激酶逐步为人们所认 识。p k a 是最早被发现受第二信使调控的蛋白激酶。迄今为止，p k a 是成员最 少也是最简单的类蛋白激酶，对其的生物化学方面的研究也最透彻。p k a 是 由两个催化亚基和两个调控亚基所组成的4 聚体。其中调控亚基分子量为4 8 k d ， 催化亚基的分子量为4 0 k d 。共发现了3 种催化亚基的同工酶，分别命名为a ，b 和y 。p k a 分布在细胞质与细胞膜上，其所催化的蛋白底物含有由l r r a s * g l 组成的保守序列。 当细胞受到第一信使刺激，位于细胞膜上的a m p 环化酶被激活，在细胞内 大量合成起第二信使作用的c a m p ，后者能与p k a 的调控亚基特异性结合并引 起民构象变化，与催化亚基解离，从而激活了p k a 的蛋白激酶活性。 就目前的研究进展来看，p k a 介导了由c a m p 作为第二信使所引起的绝大 部分细胞生理反应 t a y l o re ta 1 1 9 9 0 3 。 p k c ，受钙离子和磷脂调控的蛋白激酶。p k c 并非单一分子的酶，而是一个 由多种具有不同生物特性的同工酶组成的蛋白质家族。迄今发现p k c 至少有1 2 种同工酶，根据分子结构可将其分为：1 ) 经典型( c p k c ) ，包括p k c a 、p l 、p 2 、 y ，它们对c a ”和二脂酰甘油( d a g ) 依赖；2 ) 新型( n p k c ) ，包括p k c 5 、 n 和0 ，对d a g 依赖但不依赖于c a 2 十；3 ) 非典型p k c ( a p k c ) ，包括札、l 和 e ，对c a 2 + 和d a g 均不依赖。p k c 分子可以分为n 端和c 端两个结构域。位于 n 端的是调节结构域，其主要作用是抑制蛋白激酶的活性，并能与钙离子和磷脂 相互作用：位于c 端的是催化结构域，p k c 的各个同工酶c 端催化结构域的序 列汲其类似( 图3 ) 。用钙离子依赖型蛋白酶处理经典型p k c ，可以得到分子量 约为5 0 k d 的片段，其主要成分是c 端催化结构域，其蛋白激酶活性不再受到钙 离子和磷脂膜的调控。 毹a ，w o t 4 0 t y t , “ 区巫亟困| 匝三叵三习 厂_ 、 厂1 削。鲤剑- 兰葳伊二h h 2 n e 二 a t p b t n d l s i t e 一；茂惹：呲洲 一_ 1 产卜1 叫 图3 p k c 的结构 - k i k k a w ae ta 1 ，1 9 8 9 3 在蛋白激酶家族中，p k c 是细胞生长因子信号传导中的一个重要的成分。 它在恶性肿瘤生长中起着重要作用，它和已知的原癌基因在结构和功能上很相似， 而且许多致癌基因产物在p k c 信号传递方面有相同的生物学活性 c a n t l e y ， a u g e r ，1 9 9 1 ；a z z ie ta 1 ，1 9 9 2 。以经典型p k c 为例，p k c 通常是以无活性的形 式存在于胞浆中，调节区与催化区通过假底物序列相互作用并组织底物进入催化 区。当胞外信号通过受体激活磷脂酶c 后，使膜磷脂分解产生i p 3 促使内质网中 c a 一释放而使胞浆c 扩。浓度升高，激活p k c ；d a g 则使p k c 由胞浆转移到胞膜。 实验证明，在生理条件下，p k c 只有与膜结合才具有活性 t a k a ie ta 1 1 9 7 9 。 困 曰 激活的p k c 可使多种蛋白( 如代谢途径中关键酶、离之通道、调控基因表达的 转录因子等) 的丝氨酸、苏氨酸发生磷酸化，从而影响细胞内生物信息的代谢， 在调节细胞代谢、分化、增殖及癌变中具有十分重要的作用 - n i s h i z u k a ，1 9 8 9 。 在对多种癌变组织的p k c 表达状况的研究也支持以上结论 杨新平，夏家辉， 1 9 9 9 1 。比如在对p k c5 种亚型a 、p l 、p 2 、5 在涎腺腺样囊性癌亚细胞水平 的表达研究中发现涎腺腺样囊性癌及肿瘤周围正常组织的胞浆中均可见p k c d 与p k c p 1 、p k c b 2 的表达，与临近正常组织相比，肿瘤组织胞浆中上述3 种p k c 亚型表达明显降低，临近正常组织胞膜中未见p k c c c 的表达，而肿瘤组织的胞 膜中可见p k c 旺表达，即p k c 0 【在肿瘤发生过程中出现膜转移现象 孙长伏等， 1 9 9 9 。p k c a 在膀胱移行细胞癌中的表达也随随病理分级变化呈现规律性改变， 随分化程度降低，胞浆中表达下降，胞膜中表达升高，而膜转位程度逐渐增加。 这些研究结果提示p k c 一0 【表达不仅与膀胱移行细胞癌的发生密切相关，还与膀 胱移行细胞癌的恶性程度相关，表明p k c 在膀胱移行细胞癌发生发展过程中的 重要地位，它或可成为衡量膀胱移行细胞癌分化及患者预后的一个新指标 王钢 等，2 0 0 0 。 现今共发现约1 0 种p k c 抑制剂，它们分别作用于p k c 不同的区域，影响 p k c 的功能。有个另j p k c 抑制剂已经作为临床抗癌药物使用。如血小板活化因子 p a f 醚酯类似物e t 一18 - - o c f 3 ：它与d a g 或磷脂酰丝氨酸竞争性地结合p k c 调 节区而抑帝 j p k c 活力。临床上已用于治疗从正常的骨髓原细胞中清除白血病细胞 k e r ra n dw o r k m a n ，1 9 9 4 。从长远来看，随着对p k c 分子机制的深入了解， 会帮助人们进一步明确对p k c 的抑制和抗肿瘤活性之间的关系。 c a “c a m k ，是受钙离子和钙调素调控的蛋白激酶，它们以聚合体的形式 存在于各种组织中，尤其是在脑组织中i n a i me ta 1 ，1 9 8 5 1 。目前已经克隆到5 条 不同的人c a 2 + c a m k 基因，分别是，1 3 ，p ，y 和6 ，分子量在5 4 - - 6 0 k d 之间， 言们结构上主要的区别是钙调素结合位点之后的可变区段的不同( 图4 ) 。具有 催化活性的结构域位于激酶的n 端，其后是由具有自我抑制功能和钙调素结合 区段组成的调节结构域，而c 末端能够相互作用，形成聚合体。 图4 c a 2 + c a m k 的结构 h a n s o na n ds c h u l m a n ，1 9 9 2 c a 2 + c a m k 的活性受到钙离子和钙调素的调控。当细胞内钙离子浓度较低 的时候，c a 2 + c a m k 的活性很低。这主要是因为其含有具有自我抑制功能的结 构域。当细胞内钙离子浓度增高，c a 2 + c a m 与激酶的钙调素结合区段结合，引 起构象的变化，使得催化活性被激活。与此模型相吻合，用蛋白酶处理c a 2 + c a m k ，可以得到仅含n 端催化结构域的蛋白片段，其蛋白激酶的活性是不受钙 离子和钙调素调控的。有趣的是，激活了的c a 2 + c a m k 不但能够催化蛋白底物 的磷酸化，也能使其自身磷酸化。自我磷酸化的c a 2 + c a m k 与钙调素有更高的 亲合性，使得二者解离所需的胞内钙离子浓度更低。同时，即便钙调素从c 矿 c a m k 上解离，自我磷酸化后的激酶也不再受到钙离子和钙调素的调控，直至 其被脱磷酸化 h a n s o na n ds c h u l m a n ，19 9 2 1 。 能在体外被c a 2 + c a m k 催化的蛋白底物为数众多，如s y n a p s i n ，核糖体蛋白 s 6 ，g a b a m o d u l i n ，转录因子c r e b 等等。 酪蛋白激酶( c a s e i nk i n a s e ，c k ) 是一种偏爱酸性蛋白底物( 如酪蛋白) 的广泛存在于多种组织和细胞各种膜区室内的蛋白激酶。酪蛋白激酶能使蛋白丝 氧酸苏氨酸位点磷酸化，因而最初被认为属于丝氨酸苏氨酸激酶。但后来又证 实它也能使酪氨酸位点磷酸化，是一种既有丝氨酸苏氨酸激酶又有酪氨酸激酶 活性的双重特异性的激酶，且在序列结构上和特性上有区别于其它蛋白激酶的特 征，因而被命名为酪蛋白激酶( c k ) l e ee ta 1 ，1 9 9 5 】。c k 的活性为组成型，即 活陆大小受自身的亚基或结构域调节，丽不受c a m p 、c g m p 、c a 2 + 等第二信使的 调控。 c k 分为c k l 和c k 2 两个亚类。c k 2 是一种多效的能利用a t p 或g t p 作 为磷酸基团供体的信使非依赖性蛋白激酶，由四亚基0 【a p 2 组成，全酶分子量约 l3 0 k d ，a 与d ，同源性高，但在c 端长度不同，活性无差异，同为保守的催化亚 基；b 为调节亚基。c k 2 与转录调控、细胞增殖、信号传导、发育和肿瘤发生有 关 v a s m a t z i se ta 1 ，1 9 9 5 1 。c k 2 在胚胎细胞和肿瘤细胞中的含量比正常细胞多十 几倍，有作者认为c k 2 是一种原癌基因，过度表达可引起细胞癌变。 c k i 是单体形式的在体内各组织以及在细胞各种膜区室分布广泛的激酶， 是最早发现的的蛋白激酶之一，但对其分布、生化特性和潜在的功能研究仍然有 限。现在已经在哺乳动物中发现了、d 、y 、6 和等五个亚家族。 c k i 基因常有多种剪接形式：如c k l0 【发现另外有c k ic t l 、c k ia 2 和c k i a 3 两种剪接形式，不过有趣的是，c k i 基因的可变剪接部位常发生在c 端如 c k l 7 3 2 和c k i a 2 ，这可能借变化的c 端来调节激酶活性。高等真核生物的c k i 的组织分布较广泛，在细胞内的位置也多有变化，有的在细胞膜，有的在细胞质， 有的在核内，分别在不同的区域催化磷酸化不同的底物行使不同的功能。 虽然c k i 蛋自在一级序列和三维结构上非常类似于其他的s e r t h r 激酶，但 它们有自己的底物特异性。c k i 蛋白的磷酸化识别一致性序列一般在修饰位点的 n 一端为带负电的基团，例如，带有d d d d v a s l p g l r r k 多肤序列的蛋白是c k i 偏爱的底物。c k i 识别修饰的一致序列为s 门吖y ( p ) x i - 2 s t k e n n e l l y , k r e b s ， 1 9 9 1 。 因为有相对广泛的磷酸化识别一致序列，c k i 在体内体外有大量的可以修饰 的蛋白，可修饰受体如胰岛素样生长因子受体、t n f c c 受体、d 肾上腺能受体； 可修饰细胞骨架成分如血影蛋白、神经原纤维、神经细胞粘连分子；可修饰调节 因子如蛋白磷酸水解酶i 、转录因子、糖原合成酶i ：细胞核内成分如r n ap o li i i 、 s v 4 0 大t 抗原、p 5 3 、c r e m ( c a m pr e s p n o s ee l e m e n tm o d u l a t o r ) 都可以作为 c k l 的底物。c k i 在细胞位置分布的广泛性与其底物的复杂性是一致的，c k i 是1 生整个细胞参与了一系列的生理调节过程。 虽然c k 可以催化大量的底物，但对其催化的生理功能了解的并不详尽， | 午移磷酸化的作用只是一种推测。 酪氨酸蛋白激酶( p t l ( ) 催化将a t p y 位的磷酸基团转移到蛋白底物酪氨酸残 基上的反应。按其在细胞内的定位来分，可以划分为受体酪氨酸激酶和非受体酪 氨酸激酶两大类。受体酪氨酸激酶是穿膜的糖蛋白，它们与胞外对应的配体特异 性结合，通过自我磷酸化激活，随后磷酸化其下游的信号蛋白分子，起到信号跨 膜传导的作用。受体酪氨酸激酶能激活细胞内多条信号通道，引起细胞的分化、 增埴、运动和代谢改变。受体酪氨酸激酶包括了我们所熟知的胰岛素受体和许多 生氏因子受体( e g f , p d g f , n g f 等等) 。除了受体酪氨酸激酶，细胞内还存在 着大量非受体酪氨酸激酶，如s r c ，j a k s ，a b l 等等。非受体酪氨酸激酶构成了由 受体酪氨酸激酶或其他一些细胞膜受体所介导的跨膜信号通路的中间部分 g i l m a n ，l9 8 7 。 受体酪氨酸激酶由三部分构成：能够与相应的配体结合的胞外区，一个由0 【 螺旋构成的穿膜区和具有酪氨酸激酶催化活性的胞内区( 图5 ) 。除胰岛素受体 和m e t 家族成员外，绝大部分受体酪氨酸激酶由一条多肽链组成。在没有与配 体结合的情况下，它们都以单体的形式存在。 图5 受体酪氨酸激酶的结构 h u b b a r de ta 1 2 0 0 0 受体酪氨酸激酶的膜外区结构复杂，含有一些球状蛋白类似的结构域。相反， 膜内区的结构则相对简单，由近膜区、催化结构域和c 末端构成( 图5 ) 。 非受体酪氨酸激酶没有位于细胞膜外的配体结合区和跨膜结构。大多数的非 受体酪氨酸激酶分布在细胞质内，其他一些通过蛋白n 端的修饰结合在细胞膜 上。在非受体酪氨酸激酶的结构中，除了激酶结构域，还包含了许多其他结构域， 其主要作用是参与蛋白相互之间、蛋白与脂类之问和蛋白与d n a 之间的相互识 别与作用( 图6 ) 。 图6 非受体酪氨酸激酶的结构 h u b b a r de ta 1 ，2 0 0 0 受体酪氨酸激酶的激活并启动信号传导通路有两个步骤组成：其固有催化活 性的激活以及与下游信号蛋白结合位点的构建。对于大部分受体酪氨酸激酶而 言，这两个步骤都是由配体结合所引起的受体聚合和自我磷酸化得以实现的 f a n t le ta 1 ，1 9 9 3 。通常情况下，位于激酶催化结构域中的酪氨酸残基的自我磷 酸化，使得激酶本身的活性得以激活；而膜内区其它位点的酪氨酸残基的磷酸化， 则参与构建与下游信号蛋白分子相互作用的位点。 迄今为止，所有已经发现的受体酪氨酸激酶在其催化结构域中含有1 至3 个酪氨酸残基。研究表明，这些酪氨酸残基的磷酸化，对于激酶活性的激活起着 至关重要的作用。 而膜内区其它位点的酪氨酸残基的磷酸化，为含有能与磷酸化的酪氨酸残基 相互作用的结构域的下游蛋白提供了作用位点，使之能与被激活的受体酪氨酸激 晦作用并接受其催化的反应。s h 2 ，s h 3 和p t b 都是常见的能与磷酸化的酪氨 酸饯基相互作用的结构域。 由于自我磷酸化发生在与配体结合及受体聚合之后，理论上自我磷酸化的过 程可以发生在两个受体之间，也可以发生在一个受体分子内部。最近的研究表明， 自我磷酸化两个受体分子互相催化的结果。 与受体酪氨酸激酶相类似，非受体酪氨酸激酶的激活也是由活性中心的酪氨 酸饯基被磷酸化引起的 y e he ta 1 ，2 0 0 0 】。以研究较为透彻的s r c 为例作简单说明。 如图6 所示，s r c 的n 端经修饰后锚定在细胞膜上，整个结构中含有一个s h 2 结构域，一个s h 3 结构域，一个酪氨酸激酶结构域和较短的c 末端。s r c 分子中 含有两个重要的酪氨酸残基，其磷酸化水平对于激酶的活性起重要的调节作用。 其中，位于c 末端的t y r 5 2 7 能够被其它酪氨酸激酶磷酸化，使得s r c 激酶活性 被抑制。另个调控位点是位于激酶结构域中的t y r 4 1 6 ，其磷酸化使得激酶的 活性被激活。研究表明，s r c 分子中的s h 2 和s h 3 结构域，能够与含有磷酸化 的酪氨酸残基的蛋白相互作用，并抑制s r c 的激酶活性。 双特异性蛋白激酶 除了我们在上面列举的一些丝苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶以外，还 存在着一类蛋白激酶，它们能够同时催化s e t 、t l l r 和t y r 的磷酸化。这类蛋白 激酶被称为双特异性蛋白激酶 p a u le ta 1 ，1 9 9 7 1 。 双特异性蛋白激酶的发现是与我们对m a p 激酶信号通路的认识密不可分的 c o b b ，1 9 9 9 。研究发现，许多生长因子和细胞因子刺激细胞以后，通过激活g 蛋白偶联受体，将信号转入细胞，最终激活一类被称为m a p k 的s e 饥h 激酶 l o p e z i l a s a c a ，1 9 9 8 】，调控相关基因的表达 l e ee ta 1 ，2 0 0 0 。丽m a p k 的激活， 需要同时磷酸化t * p y * 、t * g y * 或t * e y * 保守序列中的酪氨酸和苏氨酸。这一 过程，就是由双特异性蛋白激酶催化的。对m a p k 信号通路的研究，是近期细 胞信号转导研究的一个重点方向，我们限于篇幅，就不详细展开了。 以上我们详细的介绍了蛋白激酶的结构与功能。下面，我们将就蛋白磷酸酶 的结构与功能展开探讨。 蛋白磷酸酶 蛋白磷酸酶催化的反应是蛋白激酶所催化反应的逆反应，也就是将磷酸化的 蛋白底物脱磷酸化的过程。正因为生物体是一个有序的系统，有正向调控，就必 然有反向调控，两者之间的平衡，才能确保生理活动的有序性。有学者用中国传 统的阴阳学说来形容蛋白激酶和蛋白磷酸酶之间的关系，是十分形象的。 蛋白磷酸酶的分类也与蛋白激酶的分类方法类似，以其作用底物的氨基酸残 基为标准，可以将蛋白磷酸酶分为两大类：丝苏氨酸蛋白磷酸酶和酪氨酸蛋白 磷酸酶。 丝苏氨酸蛋白磷酸酶 根据底物特异性、抑制物的敏感程度以及对不同离子的需求，可以把丝苏 氨酸蛋白磷酸酶分成4 类( 表2 ) 。 表2 丝苏氨酸蛋白磷酸酶l c o h e n ，1 9 8 9 p p 1 是糖代谢中的一个关键酶，在细胞内存在多种类型，其催化亚基是分 子最为3 8 k d 左右的肽链，是该酶的基本结构，它可以和其他的蛋白质组分或调 节、哐基组合成全酶。p p _ l 是已知的蛋白磷酸酶中唯一受两种蛋白抑制因子1 和2 抑制的酶。 在p p 一1 参与的生理过程中，以其参与的糖代谢最为重要。由于它可以作用 于磷酸化酶激酶、磷酸化酶和糖原合成酶，与c a m p ，p k a 等共同构成细胞内 糖原代谢的调节网络，而在功能上表现出与p k a 作用相抗拮的生理效应，目1 1 - n 制糖原的代谢分解加速糖原的合成过程。最近的研究表明，p p 一1 参与的生理过 程相当广泛，如细胞运输、肌肉收缩、蛋白质的合成、细胞核的功能调节以及细 胞分裂等等。 p p 一2 a 全酶是由一个约3 6 k d 的催化亚基和一个6 5 k d 的调节亚基组成的二 聚体，而这个二聚体往往又与其它蛋白形成更大的复合体。调节亚基及其结合的 其它蛋白组份与p p ，2 a 的活性调节、底物特异性及其在细胞内的分布有关。p p - 2 a 参与的生理过程也很广泛，如代谢调节、转录调节和细胞周期调控等等。 p p 2 b 是由6 1 k d 的催化亚基和1 6 k d 的调节亚基组成的异聚体，其活性依 赖于钙离子并可被钙调素进一步激活。p p 2 b 和p i c a 在c a ”和c a m p 两个信号 系统中具有重要作用，p p 2 b 能通过钙离子信号系统减弱c a m p 的作用。p p 一2 b 还参与了t 细胞激活的基因表达过程。 p p 2 c 是分子量为4 3 - - 4 8 k d 之间的蛋白质，其活性需要镁离子激活。对 p p 2 c 的生理作用知之甚少。 酪氨酸蛋白磷酸酶 酪氨酸蛋白磷酸酶是一种在上世纪8 0 年代才被发现的磷酸酶。对已经初步 完成的人类基因组进行序列分析，发现了1 1 2 个酪氨酸蛋白磷酸酶基因 i n t e r n a t i o n a lh u m a ng e n o m es e q u e n c i n gc o n s o r t i u m ，2 0 0 1 ，在其催化结构域中 含有r ( h v ) c ( x ) ，r ( s t ) 组成的保守序列。酪氨酸蛋白激酶可以被分成三个亚类： 酪氨酸特异性蛋白磷酸酶、双特异性蛋白磷酸酶和低分子量磷酸酶 z h a n gz y 2 0 0 1 ( 图7 ) 。其中，酪氨酸特异性蛋白磷酸酶又分为胞内和跨膜受体型两类。 这两类酪氨酸蛋白磷酸酶在分子量和细胞定位上有很大的区别，但其共同点是他 们在催化结构域中的氨基酸序列。这一保守序列由2 4 0 个氨基酸构成，内含 h c x a g x x r ( s t ) g 序列。一般受体型酪氨酸蛋白磷酸酶有两个催化域，其不同 类型的胞外结构往往不同；胞内型酪氨酸蛋白磷酸酶只有一个催化域，并常常含 2 0 有信号肽序列f w a l t o n ，d i x o n ，l9 9 3 。 双特异性磷酸酶能催化s e r t h r 和t y r 的脱磷酸化。正如我们在探讨双特异 性激酶时谈到的一样，双特异性磷酸酶的功能也是与m a p k 信号通路密切相关 的。m a p k 的激活需要由双特异性蛋白激酶磷酸化其苏氨酸和酪氨酸残基，而 其失活则需要由双特异性磷酸酶催化的则两个氨基酸残基的脱磷酸化。 我们现在已经克隆到9 个哺乳动物的双特异性磷酸酶基因。它们很明显的表 现出组织表达特异一目d c a m p se ta l ，2 0 0 0 。双特异性磷酸酶的催化结构域位于分 子结构中的c 端，不同的蛋自在这一部分有很高的同源性。n 端的同源度较低， 这决定了其底物特异性。 酪氨酸蛋白磷酸酶可以被钒离子、钼离子抑制，其活性也不依赖于钙离子、 镁离子和锰离子 y a r d e n ，u l l r i c h ，1 9 8 8 1 。目前我们对酪氨酸蛋白磷酸酶的认识还 很少，有迹象表明，酪氨酸蛋白磷酸酶能够与酪氨酸蛋白激酶的作用相抗拮，起 到抑制细胞增殖的作用。 图7 酪氨酸蛋白磷酸酶的结构 z h a n gz y ，2 0 0 1 a ，酪氨酸特异性磷酸酶；b ，双特异性磷酸酶和低分子量磷酸酶。 材料和方法 生物信息学工具 n c b i ( g e n b a n k d b e s t ,u n i g e n e 及其他相关链接) h t t p ：w w wn c b in l m n i h g o v g d b 数据库( g e n o m ed a t a b a s e ) ：h t t p ：h w w w g d b o r g e m b l 数据库：h t t p ：h w w w e m b lo r g v e c t o rn t l 软件包：美国i n f o r m a x 公司 g c g 所带数据库：g e n b a n k r e l e a s e 1 1 0 0 ( 1 2 1 9 9 8 ) e m b l ( a b r i d g e d ) r e l e a s e 5 80 ( 0 3 1 9 9 8 ) p i r - p r o t e i n 5 9 0 ( 12 19 9 8 ) s w i s s - p r o t 3 7 0 ( 1 2 1 9 9 8 ) s p t r e m b l 9 0 ( 01 19 9 9 ) p r o s i t e15 0 ( 0 7 1 9 9 8 ) r e s t r i c t i o ne n z y m e s ( r e b a s e ) ( 0 1 1 9 9 9 ) 主要仪器设备 a b l 3 7 7 型d n a 自动序列分析仪，美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司产品 g e n e a m p2 4 0 0p c r 仪，美国p e r k i ne l m e r 公司产品 g e n e a m p9 6 0 0p c r 仪，美国p e r k i ne l m e r 公司产品 n e o c o o l 冷冻真空干燥箱，日本y a m a r o 公司产品 s i g m a9 6 孑l 板离心机，f r 一2 0 0 ，美国s i g m a 公司产品 e p p e n d o r f5 4 1 5 c 台式高速离心机，德国e p p e n d o r f 公司产品 h e t t i c he b a l 2 r 台式高速冷冻离心机，德国h e t t i c h 公司产品 h i t a c h ih i m a cc r 2 1 型高速冷冻离心机，日本h i t a c h i 公司产品 g e n e q u a n ti i 型紫外分光光度计，p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 u h r o s p e c4 0 0u v v i s i b l es p e c t r o p h o t o m e t e r ，p h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 m i l l i 一0a c a d e m i c 超纯水仪，美国m i l l i p o r e 公司产品 s c s 2 4 型温控摇床，上海市离心机械研究所产品 s d j 超净工作台，上海淀山湖净化设备厂产品 s h 一6 5 0 型微波炉，上海申华微波炉厂产品 3 0 0 型电子天平，美国d e v e n 仪器公司产品 s h z 一2 2 型水浴恒温振荡器，江苏太仓医疗器械厂产品 p y x d h s 型隔水式电热培养箱，上海跃进医疗器械厂产品 d y - 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