（应用化学专业论文）荧光共振能量转移在DNA检测中的应用研究.pdf

荧光共振能量转移在d n a 检测中的应用研究 摘要 d n a 序列的检测与疾病诊断、基因检测密切相关，已经成为研究的热点。随 着纳米粒子在d n a 传感器中的应用，许多光学方法采用纳米粒子用于检测，如： 比色检测、荧光共振能量转移( f r e t ) 、表面等离子体共振分析等。与传统的化 学方法相比，荧光共振能量转移方法有更高的灵敏度和简便性。本文就是研究了 一种新型的纳米荧光共振能量转移体系。 本文以d n a 修饰的1 6 n m 的纳米金粒子作为能量受体、d n a 修饰的巯基丙酸 包裹的c d t e 量子点为能量供体构建荧光共振能量转移体系。通过选择合适粒径 的纳米金粒子和c d t e 量子点，考察了纳米金粒子的吸收光谱与c d t e 量子点的发 射光谱的重叠重度，发现大于9 5 的光谱重叠可以促进荧光共振能量转移的发 生。 采用荧光光谱对探针进行表征，探针的荧光强度较弱，加入目标d n a 后，探 针的双链被打开，c d t e 纳米粒子和纳米金粒子的距离变大，c d t e 发出的荧光不 能被纳米金粒子吸收，荧光强度变大。考察了d n a 链长、供受体比例、p h 值、 放置时间以及不同量目标对探针体系的影响，得出探针合成的最优条件：d n a 链长相隔6 个碱基、c d t e a u = 1 ：5 、p h 值为7 0 、放置时间为2 h 。计算出探针 的淬灭效率为7 4 6 ，f r e t 半径为4 0 7 r i m ，供受体间的距离为3 4 1 r i m 。利用此 荧光共振能量转移体系，根据荧光恢复强度的差别，对d n a 单碱基错配进行了 成功检测。 关键词：d n a ，量子点，金纳米，荧光共振能量转移( f i 也t ) a p p l i c a t i o n o ff l u o r e s c e n c er e a s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) i n d n ad e t e c t i o n a b s t r a c t s e q u e n c e s p e c i f i cd n a d e t e c t i o nh a sb e e nat o p i co fs i g n i f i c a n ti n t e r e s tb e c a u s eo f i t sa p p l i c a t i o ni nt h ed i a g n o s i so fp a t h o g e n i ca n dg e n e t i cd i s e a s e s 【1 - 2 r e c e n t l y ，a v a r i e t yo fo p t i c a lm e t h o d su s i n gn a n o p a r t i c l e sh a v eb e e nd e v e l o p e df o rd n a s e n s i n g s t r a t e g i e s ，s u c ha sc o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n ，f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) ，s u r f a c ep l a s m a nr e s o n a n c ea n a l y s i s c o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a lc h e m i c a l a n a l y s i s ，f r e t - b a s e da n a l y t i c a lm e t h o dh a sh i g h e rs e n s i t i v i t ya n ds i m p l i c i t y i nt h i s p a p e r , an o v e lf r e t - b a s e dn a n o p r o b ew a sp r e s e n t e d t h ep a p e rs h o w e dt h a taf r e tc o m p o s e do f16n mg o l dn a n o p a r t i c l el i n k e dt od n a m o l e c u l e sa n d2 3 姗m p a c a p p e dc d t eq u a n t u md o t sb o u n dt od n a s t r a n d s w e c o n f i r m e dt h eo v e r l a pb e t w e e ne m i s s i o ns p e c t r u mo ft h eq da se n e r g yd o n o ra n dt h e a b s o r p t i o ns p e c t r u mo fg o l dn a n o p a r t i c l e sa se n e r g ya c c e p t o r m o r et h a n9 5 s p e c t r a o v e r l a pb e t w e e nc d t eq d sa n da u n p sp r o m o t e sf l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ( f r e t ) t h en a n o p r o b ew a sc h a r a c t e r i z e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r u m t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fn a n o p r o b ei sm i n i m u m w i t ht h ea d d i t i o no ft a r g e t d n a t h ed i s t a n c eb e t w e e nc d t eq d sa n da u n p sb e c o m e sl a r g e ra n dt h er e c o v e r yo f f l u o r e s c e n c ew a so b s e r v e d t h ea f f e c tf a c t o r so fn a n o p r o b es y s t e ms u c ha sn u c l e o t i d e o v e r h a n g ，t h er a t i oo f c d t et oa u n p s ，p hv a l u e ，r e t a i n i n gt i m ew e r er e s e a r c h e d t h e o p t i m u mc o n d i t i o n so ft h en a n o p r o b ew a so b t a i n e da sf o l l o w s ：6 - n u c l e o t i d eo v e r h a n g ， t h er a t i oo fc d t et oa u n p si s1 ：5 ，p h = 7 0 ，r e t a i n i n gt i m el e s st h a n12 h t h r o u g h a n a l y s i so ft h ed a t ao b t a i n e d ，t h eq u e n c h i n ge f f i c i e n c yr e a c h e d7 4 5 5 ，f r e tr a d i u s i s4 0 7 n ma n dt h ed i s t a n c eb e t w e e nc d t ea n da u n p si s3 41n m a tl a s t ，a c c o r d i n gt o t h ed i f f e r e n c eo ff l u o r e s c e n c er e c o v e r y ，t h en a n o p r o b ew a su s e dt o d e t e c tt h e s i n g l e b a s em u t a n td n a k e y w o r d s ：d n a ，q u a t u md o t s ( q d ) ，g o l dn a n o p a r t i c l e s ，f r e t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得云洼王些太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 一躲虿善 辩醐：节阳枷 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 荔荔墨 导师签名：历p 纱凸彳过 婵嗍：7 列日 辩嗍州引舯日 学位论文的主要创新点 一、采用半导体纳米粒子c d t e 和金纳米粒子代替传统荧光染料分子 作为能量供受体，构建荧光共振能量转移体系。 二、采用c d t e 量子点和金纳米组成的荧光共振能量转移体系，对无 标记的目标d n a 序列进行了检测。 前言 刖吾 随着分子生物学的迅猛发展，新技术不断出现，其技术应用也日益广泛，特 别是快速简便准确地检测基因序列在医学临床检验学、免疫学、生物学等研究领 域中的潜在应用前景已引起国际科学界的广泛关注【1 , 2 1 。对d n a 检测，目前主要 采用聚合酶链式反应( p c r ) 和基因芯片。然而，由于其技术的复杂和昂贵的设 备，使d n a 检测技术的广泛应用受到极大的限制。 基于荧光标记的检测体系近年来在d n a 芯片的应用已经获得认可。许多方 法都采用荧光进行检测，而这些方法主要依赖于d n a 标记的供受体之间的能量 转移1 3 j 。 荧光共振能量转移( f r e t ) 分析法由于其仪器简单、灵敏度高、所需样品量少、 分析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，它己成为一种有效的痕量及超痕量 分析技术。1 9 4 8 年，f 6 r s t e r 4 1 对于这种实验现象提出了偶极偶极相互作用产生 能量转移的理论。f r e t 因其对距离的敏感性，广泛地被用于生物大分子结构、 性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。因此，能量转移荧光分析非常适合 于对环境、生物医学科学和临床化学等方面复杂、低含量组分的分析，也是基因 工程中的一种新手段。 而目前荧光共振能量转移方法中供受体对大多采用有机染料，而有机染料在 大多数情况下，由于它们的激发光谱都较窄，所以很难同时激发多种组分，而其 荧光光谱又较宽，分布不对称，给区分不同探针分子的荧光带来困难，因此要同 时检测多种组分较为困难1 3 , 5 j 。尽管对荧光有机分子有很好的生物相溶性，但是 荧光有机分子需要特定的波长激发才能发出荧光，如果要同时检测多种疾病，就 需要用不同波长的光激发，这样就会造成检测体系中能量过多，不利于检测；同 时不同波长激发之问的重叠也会使各个能量给体和受体之间的能量转移变得不 明显，增加数据分析的复杂性【3 6 】。有机染料最严重的缺陷还是光化学稳定性差， 光漂白与光解作用使每个染料探针能够发出的荧光光子平均数量不可能太多，光 解产物又往往会对生物体产生杀伤作用。 无机纳米粒子由于其尺寸依赖独特的物理化学性能，已经成为在生物分子的 检测和标记方面的研究热点 7 q o 。量子点发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可 调，即不同大小的纳米晶体能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光，并具有 较高的量子效率和良好的化学、光学稳定性，其荧光寿命是普通有机染料分子的 1 0 0 倍以上，量子点由于其明显的光学性质，已作为能量供体应用于荧光共振能 前言 量转移研究中【i t - 1 5 。 特别是纳米金，可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，与巯基之间形 成很强的a u - s 共价键，这使得胶态金可与生物活性分子结合，形成的探针可用 于生物体系的检测中，且其高的消光系数、宽的吸收光谱，并对染料分子有有效 的荧光淬灭 1 4 , 16 ，m ，使其在分子生物学领域的研究和应用已成为目前科学家研究 的热点。 由于纳米粒子这种独特的物理化学性质，研究量子点作为能量供体、金纳米 作为能量受体的荧光共振能量体系，将会有很大的应用前景。从而可以取代原有 染料对和单个纳米粒子存在时的分子探针。 2 第章绪论 第一章绪论 1 1 荧光共振能量转移方法的研究现状 所谓荧光共振能量转移是指电子激发能在适当的能量供体和能量受体对之间 的传递。荧光共振能量转移( f r e t ) 分析法由于其仪器简单、灵敏度高、所需样品 量少、分析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，它己成为一种有效的痕量及 超痕量分析技术。1 9 4 8 年，f s r s t e r 4 1 对于这种实验现象提出了偶极偶极相互作 用产生能量转移的理论。据此，s u y e r 和h a u g l a n d 在1 9 6 7 年提出，f r e t 可以 作为光学尺，用以测量1 o 6 0 n m 之间的距离【1 8 l 。f r e t 因其对距离的敏感性， 广泛地被用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。因 此，能量转移荧光分析非常适合于对环境、生物医学科学和i 临床化学等方面复杂、 低含量组分的分析，也是基因工程中的一种新手段。 1 1 1f s r s t e r 能量转移理论 1 1 1 1 基本原理 荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团( 供体 d o n o r ) 的发射光谱与另一个基团( 受体a c c c p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠， 当这两个荧光基团间的距离合适时( 一般小于1 0 n m ) ，就可观察到荧光能量由供 体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团 发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量 从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射性的。给体分 子被激发后，当受体分子与给体分子相距一定距离，且给体和受体的基态及第一 电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的给体将把一部 分或全部能量转移给接受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光 予的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭； 如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红 移，其过程如图卜1 所示。 第一章绪论 删且 辩捧 5 焉 图1 1 供受体间荧光共振能量转移示意图 荧光能量转移的速率，依赖于给体荧光发射光谱同受体吸收光谱的重叠度、 给体与受体转移偶极的相对方向和给体同受体之间的距离，用f 6 r s t e r 方程式表 示【1 9 1 ： e = 专瞄+ r 。 式中：r 为供受间的距离。 为能量传递达到5 0 的距离，它依赖于供受体双方的光物理性质以 及它们之间的取向，用公式表示为： r = ( 8 7 9 x 1 0 ”j r 2 q 玎- 4 ) 彳 式中p ：和能量供体与受体跃迁相互取向有关的因子 n ：溶剂的折射率 q o ：无受体存在时能量供体的荧光量子产率 j ：光谱的重叠积分 在计算时可认为能量供体与受体间的相互取向是无规则的，此时因子 k 2 = 2 3 。利用这个临界转移距离r o 和实验测得的能量转移效率e 就可测出能量供 体与受体问的距离r 2 0 1 。 1 1 1 2f r e t 能量供受体对的选择 荧光物质要成为f r e t 的能量供受体对( 简称d a 对) ，必须满足以下几个 条件1 4 】： a 供受体要相互比较接近( 1 - 1 0 r i m ) 。 b 供体的发射光谱与受体的吸收光谱要重叠( 如图卜2 ) 。 c 供受体的跃迁偶极距要近乎平行。 只有在这样的条件下，供体的激发光才不会对受体直接产生干扰，可能获得 足够灵敏而准确的结果。 4 雠 9 ，奄舭 晰 第一章绪论 朋叭 w a v e l e n g t h9 - ) 图l - 2 供受体间的光谱重叠示意图 1 1 1 3f r e t 效率的测量 当能量供体被激发后，可通过测定激发态供体寿命的缩短，供体稳态荧光 强度的减弱，受体稳态荧光强度的增强以及荧光偏振的变化来确定e ，但常用的 是寿命测量法和荧光强度测量法两类方法。 激发态的能量供体可以通过辐射与非辐射方式失去能量。当有受体存在 时，多了一条非辐射退激的途径，故激发态能量供体的寿命缩短。使用测荧光寿 命的仪器可以很简单地得到有受体和无受体存在时的d 寿命t ，利用公式p 】 肚丧5 焘r l + k tf i l + k ? 进而算得e 。这一方法的优点是极为准确，但是由于d 的寿命t 为n s 数量级， 对仪器的要求很高，所以此类仪器很昂贵，且不易维修和推广使用。 荧光强度测量方法就是通过分别测量供体在没有受体和有受体时的荧光强 度来计算f r e t 效率。 荧光强度测量法测量简单，对仪器设备要求低，因此是目前使用较为普遍的 测量方法。既可以通过测量供体的荧光强度，也可以通过测量受体的荧光强度来 获得f r e t 效率。当f r e t 发生时，供体荧光减弱，而受体荧光增强，如果能准确 测量受体增加的荧光强度和供体减少的荧光强度，就可以准确测量f r e t 效率。 通过供体荧光强度来获得f r e t 效率的具体测量表达式为b l 】 一 e = 警 得出，其中f d a 为受体存在时供体的荧光强度，f d 为受体不存在时供体的荧光 强度。 虽然荧光强度测量法对仪器设备的要求不高，但是却受到如下问题的困扰： 第一章绪论 ( 1 ) 光谱重叠。为了获得灵敏的f r e t 效应，在选择时通常要求供体的发射光谱 尽量与受体的吸收光谱重叠，这样就会导致供体和受体的发射谱往往大部分重叠 在一起，很难将两者发射的荧光区分开来；( 2 ) f r e t 和非f r e t 分量的重叠，即 激发谱的重叠。供体发射的荧光由两部分组成：激发光直接激发受体产生的非 f r e t 分量和由于f r e t 效率产生的分量完全重叠在一起。( 3 ) 浓度。在许多情况 下，荧光基团浓度的准确定量是非常困难的，因此很难保证不同时刻或者不同区 域荧光强度的同一性。 通过f r e t 测量的距离分布的分辨率大约为l a ，低于此值的距离和分布便不 可分。若供体受体的距离太短或太长( 相对于r ) ，则荧光测量中就丢掉了距离 信息。当平均距离低于f 6 r s t e r 距离时，平均距离可以很好的精确测量。由于f r e t 的时间是纳秒，因此可以测量慢过程。 1 1 2f r e t 分析方法和检测方法的发展 在不断寻找新的荧光物质构成能量供受体体系的同时，f r e t 的检测也出现 了许多新的形式，以满足复杂样品检测的需要。 一些荧光物质具有光漂白的特性，即激发态供体分子按一定几率通过光致过 程分解。应用可以被光漂白的能量受体，如果对它进行破坏将发现供体的发射光 增强，证实原来发生了f r e t 2 “。这种方法适合于检测固定化分子之间的相互距 离。j o v i n 等人就将光漂白技术与荧光显微镜结合起来对活细胞进行单细胞水平 的测定 2 2 1 。 为了研究一些细胞内的生理过程，经常将f r e t 与显微技术结合起来， m u p a m 等人就通过荧光显微镜、电感偶合相机和光谱仪来进行完整细胞中 f r e t 发生的定位，将细胞内的理化反应研究提高到细胞器的水平田】。f r e t 成 像是由数码免疫荧光显微镜和f r e t 相结合的产物，它将荧光显微镜的分辨率提 高到了分子水平( 小于l o n m ) ，可进行单细胞膜的定量测量1 2 1 】。1 9 8 8 年m o r r i s o n 首先提出了时间分辨荧光共振能量转移( t i m er e s o l u t i o n f r e t , t r f r e t ) ，t r f i 也t 测定可以得到固定波长的荧光强度一时间曲线和固定时间的荧光发射 光谱，这对于动态的生物体系的检测尤为重要。利用时间分辨f r e t 技术，当 能量供受体之间的距离在激发态供体寿命期间不变且r 0 保持恒定时，供体荧光 强度随时间衰减的动力曲线i ( t ) 与距离分布f ( o 有关。由此从时间分辨f r e t 实 验中记录的i ( t ) 曲线中可以得到f ( r ) 的信息。 运用激发态寿命很长的镧系元素铕、铽等作为荧光标记的能量供体，由于背 景荧光( 自发荧光) 的激发态寿命很短，标记物和背景很容易就能区分开。当供体 染料具有很长的激发态寿命时，能量转移能通过时间分辨( 延迟时间) 以及光谱 6 第一章绪论 分辨( 滤波器) 与受体的荧光区别开来。由于能量转移的发生要求近距离，只有 特异的复合物才能发出长寿命的受体发射光。这样的t r - f r e t 作为一种简单、 快速而灵敏的技术在免疫分析和其它特异的结合分析中都得到了应用1 2 4 2 5 。 在t r - f r e t 的基础上又出现了s p f r e t ( s i n g l e p a i rf r e t ) ，能量供受体都 被标记在同一分子上，通过时间分辨计量一定时间内不同能量传递出现信号数目 并绘制直方图，将单分子的波动以及相应的荧光强度的变动都减到最小，这样可 以将具有不同的能量转移效率e d 亚群区分开，并计算出他们之间的数量比率， 这种方法拓展一步就可以用于研究生物多聚体的组成动力学、d n a 限制性内切 酶酶切反应以及d n a 发夹结构的去折叠等，进一步可以拓展于研究不同条件下 的反应、监测异质体系中每个亚群的动力学。近年，s p f r e t 还用于观察干燥表 面的两个荧光染料之间的距离，用于膜上配体受体的结合以及研究固定蛋白和 溶液中的蛋白和d n a 的相互作用。 1 1 3f r e t 技术的应用 1 1 3 1 研究蛋白的结构和溶液中蛋白蛋白的相互作用 f i 疆t 最为经典和广泛的应用之一就是测量蛋白结构中两个位点的位置和在 液体中它们的聚集及其拓扑结构，f r e t 作为“光谱尺”的用途已经在这方面得 到广泛的应用。蛋白质包含有内源性荧光团( 例如色氨酸和酪氨酸) ，并且它们 可以与外来的荧光团发生共价性结合( 常具有专一性) 2 6 1 。在蛋白质活性部位 微环境的研究中，f r e t 技术可以轻松地分析生物大分子三维结构及特定位点间 的距离1 2 7 】。细胞内c a 2 + 的作用通常是通过与钙调蛋白( c a m ) 的结合实现的。 c a m 的c 末端通过甘氨酸一甘氨酸与肌球蛋白轻链激酶上2 6 个残基( 称为m 1 3 ) 结合，m i y a w a k i l 2 8 】等分别将蓝色荧光蛋白( b f p ) 和绿色荧光蛋白( g f p ) 结合 于c a m 和m 1 3 ，形成b f p c a m 和m 1 3 g f p 。发现c a 2 + 的存在减弱了b f p 的发 射荧光，增强了g f p 的发射荧光，直接证明了c a 2 + 的存在使c a m m 1 3 发生结 构改变，使之更加靠近。 f r e t 也常用于确定蛋白质分子内部特定位点之间的距离，或是直接用来测 量分子的大小。采用稀士荧光探针后由于它的长激发寿命易于与生物的背景荧光 区分开来，以稀土螯合物标记蛋白质成为研究蛋白质构象的一种新途径。王守业 等人提出以铽( i i i ) 及铕( 1 1 1 ) 作为能量受体标记蛋白，由于能量的转移而使蛋白的 内源荧光得到淬灭，当底物与蛋白质结合只改变蛋白质的构象却不影响铽( i i i ) 、 铕( i i i ) 在蛋白质中的结合部位时，则可通过对比蛋白质结合前后能量供受体间距 离的改变观察其构象变化1 2 9 。如对比人血清白蛋白结合苯甲二氮前后其2 1 4 位 t r p 残基与结合铽( i i i ) 间的距离。 7 第一章绪论 1 1 3 2 核酸检测方面的应用 核酸杂交技术与f r e t 相结合，可用于突变检测、同源性分析和核酸定量分析 等方面。在这些检测中，标记在核酸上的能量供受体之间的距离会因探针结合 状态的不同而改变，可通过荧光的变化检测出来。能量供受体可以分别标记在探 针的不同部位，当探针与靶结合后解链或改变构象而使原有的f r e t 消失；还可以 标记在不同探针上，当靶序列存在时同时结合两个探针而发生f r e t 。其中选用篦、 么两种物质作为能量供受体经 a s u k o 等人验证结果严格服从f o r s t e r 方程，很可 能得到广泛的开发应用d o 。 一种新型的基因检测技术分子灯标( m o l e c u l a rb e a c o n ) 就在这一基础 上诞生，它是一种能形成茎环结构的寡核苷酸，两端分别标有f r e t 的能量供体和 受体，茎部是一段长4 1 2 b p 的互补的发夹结构( h a i r p i n ) 。面中间环状结构所包 含的寡核苷酸就是探针的基因识别、配对部分。当探针未与靶序列结合时，它是 正常的茎环结构可以检测到f r e t ：而探针一旦与靶序列结合，茎环结构打开， f r e t 就消失了。由于互补配对的特异性的差别将导致探针和靶序列的杂合体的解 链温度的不同、通过改变温度，检测f r e t 的发生与否可以确定靶序列与探针之间 的同源性的大小) 2 】。 f r e t 还被运用到d n a 结构研究、核酸调控、核酸降解【3 引、寡核苷酸从棱糖体 上的释放的研究等许多方面，通过在核酸的不同部位标记能量供受体对，能 量转移的效率会因核酸结构的改变而改变从而获得与分子构象相关的信息。例如 a s k o k 等人用s p f r e t 技术检测了d n a 发夹结构变性的动力学过程；m e r g n y 【3 5 i 研究 了胱氨酸富集的寡脱氧核苷酸经分子内折叠形成的i i ) n a 结构模井推测f r e t 可用 于揭示多链d n a 的结构的形成。在研究核酸调控中，由于蛋白、核酸的相互作用 将导致核酸变构和活性的改变，据此，l o r e n z 等【3 6 以f r e t 研究了噬菌体h 位及 其结合蛋白宿主整合因子( i n t e r g r a t i o nh o s tf a c t o r ，i h f ) 之间的相互作用。 他们设计了几条双链d n a 底物，在每条单链的5 端分别标记供体和受体荧光染 料，i n f 的二聚体能结合h 位点并使d n a 发生弯曲，双链d n a 的两端靠近从而发生 f r e t 。由于i n f 是结合在d n a 的小沟上的，当小沟关闭时，i n f 结合变弱，这时观 察至u f r e t 的效率由0 4 9 0 0 1 降n o 3 7 0 o l 。这样的f r e t 和模型技术已有足够 高的分辨率来区别核酸蛋白质复合物在生物关系中的微妙变化。m a t s u m o t o 等人 1 3 6 也用这样的方法筛选与h i v - it a rr n a 特异结合的分子，快速地获得了大量的 结果。 f r e t 核酸杂交分析的原理很简单：当分别带有d 、a 标记物的核酸探针单链杂 交时，给体、受体之间的距离发生变化，就会引起荧光强度的变化。探针的设计 有以下几种模式：( a ) 在核酸双链探针的每条单链5 端进行标记，但只适用于碱基 第一章绪论 数在6 2 0 之间的较短的寡聚核苷酸链；( b ) 当链较长时，一条单链标记5 端，其互 补链标记3 端；( c ) 将核酸双链探针中的一条链截断，在生成的两条短链相邻端进 行标记：( d ) 作为更加简便的标记方法，只需要在一条链的一端进行共价标记，而 使用嵌入式加入另一种荧光分子作为另一标记。但这种方法不能确定d 、a 间距离， 因为不知嵌入的荧光分子的位置与数量。 s i x o u 等人 3 7 以f r e t 技术首次做到了对细胞内核酸杂交反应的研究，他们以 上述( b ) 方式标记了含2 8 个碱基的寡聚核苷酸单链及其互补链，并将二者的杂交 物注入活细胞中，观察其降解反应，发现注入细胞的寡聚核苷酸可以与胞浆中及 核内非同源的互补链杂交。 f r e t 也可以用于核酸的定量分析。如在5 和3 端分别标记的d n a 杂交双链中 加入不同量未标记互补链，分别测出能量转移效率e ，以e 对加入的未标物量做工 作曲线，用于未知量的测定。m o r r i s o n 等人 3 8 1 以荧光素标记寡聚核苷酸单链5 端作为d ，罗丹明标记其互补链3 端作为a ，形成一对探针，可测出6 p m o l 的靶d n a 分子。 1 1 3 3 糖类研究方面的应用 复杂的低聚糖是许多糖蛋白的重要组成要素，它作为细胞表面的接收器，常 与蛋白发生特效的相互作用，如血凝素结合对细胞膜上糖蛋白受体的形成很重 要。研究显示f r e t 较核磁共振是更有价值的检测溶液中低聚糖构造的研究方 法1 3 9 。在这一研究中，f r e t 直接在h p l c 上定量测定，是为数不多的能够检 测异源分子构造的实验技术之一。 在糖类的结构分析中也有f r e t 的运用。y o u n g 等人t 4 0 f r e t 证实了加 入n a o h 能使3 螺旋1 3b d 葡聚糖部分打开并使其活性上升。 1 1 3 4 测定无机离子方面的应用 有研究证明通过氰脲酰氯将荧光胺( 供体) 和铬黑t ( 受体) 分别固定在聚 乙烯醇的两个羟基上，用它作为试剂。在氨缓冲液中，由于铬黑t 的吸收光谱 与荧光胺的荧光光谱重叠度小，不发生荧光能量转移，溶液呈现荧光；加入镁离 子后，镁同铬黑t 形成络合物，发生能量转移，导致荧光熄灭，其程度与镁离 子浓度成正比，此方法将灵敏度提高1 0 倍以上f 4 l l 。还有报道研究在表面活性剂 存在下，队r 一吖啶黄荧光能量转移体系通过f e ( i i ) 与体系中p a r 络合，导致 吖啶黄荧光熄灭来测定铁，方法具有很高的灵敏度【4 2 】。此方法还用于其它无机 离子的测定1 4 3 , 4 4 1 。 1 1 3 5 免疫分析的应用 免疫分析是目前疾病检测的一项重要手段，现有的免疫检测方法分为固相免 9 第一章绪论 疫法和液相免疫法。放射免疫检测法( r 认) 和酶免疫检测法( e i a ) 是固相免 疫法中应用最广的方法，但其自身具有操作复杂、存在较大误差等不足。而液相 法具有无固相参与、反应速度较快、操作也相应简单等特点，其中均相荧光免疫 测定( h f i a ) 应用最广。f r e t 作为一种最简便的均相分析方法，不仅适用于小 分子( 如半抗原) ，而且适用于大分子( 如蛋白质) 。 实验方法包括两种：竞争法和夹心法【4 5 】。在夹心法中能量供受体分别标记 针对同一抗原的抗体形成d a b l 和a - a b 2 ，加入抗原后形成的抗原抗体复合 物有可能是( d a 1 ) a g 。( a a b 2 ) 的形式，由于它把能量供受体拉近。通过检测 f r e t 的发生就证实了免疫反应的发生。而在竞争法中，能量供受体分别标记一 对抗原抗体中的一种，例如形成d - a g 和a a b 的形式，它们可因免疫反应而聚 集在一起，发生f r e t ，当待测样品中存在相应的未标记的抗原或抗体时，就可 能与已标记的抗原或抗体竞争，发生取代而生成无f r e t 的免疫复合物。该体系 已用来检测蛋白质和半抗原分子( 例如吗啡) h 6 】。 u l l m a n 等人【4 7 】分别使用竞争法和夹心法，以荧光素为d ，罗丹明为a ，对 吗啡及其抗体间的反应进行研究，发现此方法对吗啡的检测限为1 0 0 p m o l l - 1 。 k u b i t s c h e c k 等人 4 8 】则通过标记半抗原与抗体之问的能量转移，测得一系列抗原 一抗体对的亲和常数。 此后，对均相免疫测定进一步改进。u c d a 等人1 4 9 , 5 0 】提出了开放三明治荧光 免疫测定( o p c n s a n d w i c hf l u o r o i m m u n o a s s a y ) ，通过这种方法检测了鸡蛋溶菌酶 ( i e l ) 及其抗体h y h e l - 1 0 的可变区之间的特异性结合。 引入镧系元素后，b l o m b e r g 等人用t b 作为荧光标记物进行均相荧光免疫测 定，他们用时间分辨荧光测定法将t b 的长寿命荧光与生物材料的背景荧光区分 开，以t b 为能量供体，罗丹明为能量受体对抗原或抗体进行标记，检测因免疫 反应造成的f r e t 现象的变化，发现它的灵敏度只比异相免疫反应略低，但具有 高速和简单的优点，更适用于要求高效的分析中。 1 1 3 6 荧光能量转移p h 传感器 v i n i t am i s r a 等人【5 1 1 将吖啶黄作为能量给予体，罗丹明6 g 作为能量接受体， 在水溶液中将此体系作为p h 传感器，研究证明该体系能够应用于p h 在1 4 1 2 的很宽范围内，精确度达到o 0 1 p h 。还有人将杂氧花青作为给体，双十八烷基 二硫代氨基甲酸盐作为受体，固定在单分子层l b 膜上，作为基于荧光能量转移 的金属离子荧光光纤传感器【5 2 1 。 1 1 3 7 荧光能量转移显微镜方法 随着数字成像技术的实用性和联用商业化的计算机硬件和软件的发展，人们 t 0 第一章绪论 对荧光能量转移显微镜方法的关注迅速增加。运用荧光能量转移显微镜方法能够 快速、容易对位于图象中1 0 6 个点的荧光进行同时测量。在过去的几年中，不断 增加的相关文章证明了荧光能量转移显微镜方法在生物工艺方面应用的持续发 展。在一篇关于荧光显微镜的文章中，收录了关于荧光能量转移显微镜的简短地 调查【5 3 1 。 1 2 量子点的荧光共振能量转移在生物分析中的应用 1 2 1 量子点发展概况 量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 又可称为半导体纳米晶体( s e m i c o n d u c t o r n a n o c r y s t a l ) ，是一种由i i 一族或i v 族元素组成的纳米颗粒，目前研究较多的 是c d x ( x = s ，s e ，t e ) ，粒径尺寸在l - 1 0 0n m 之间。 相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，这样就减 少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光 谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，以最大限度地避 免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区 任一波长的光，也就是说它可以吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且 保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。 1 2 2 量子点共振能量转移应用于蛋白特异性结合的检测 较早用量子点的共振能量转移原理，进行蛋白蛋白特异性结合研究的是 w a n g 等人l ，他们用发射光谱为6 1 l n m 、5 5 5n l i l 的红、绿量子点分别标记牛血清白 蛋白( b s a ) 和抗牛血清白蛋白抗体( i g g ) ，当二者形成免疫复合物时，b s a 上的红色量子点荧光增强，i g g 上的绿色量子点荧光相应减弱，这是因为抗原、 抗体彼此结合，将两种量子点拉得足够近，使其发生偶极一偶极相互作用。这时 尺寸较小的绿色量子点的激发态能量转移给了尺寸较大的红色量子点激发态，& 口 发生了共振能量转移。当加入未标记量子点的b s a 时，它就会与q d b s a 发生竞争， 将o d - e s a 从免疫复合物上取代下来，阻止了共振能量转移的发生，这时红色量子 点荧光强度降下来，而绿色量子点荧光强度又恢复原样。 w i l l a r d 5 5 l 等人的工作中，将四甲基罗丹明( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) 标记的链霉亲和素( s t r e p t a v i d i n ) 与生物素化的b s a 特异性结合，用量子点标记 b s a ，这样就形成了以量子点作为能量供体，有机荧光物质t m r 作为能量受体的共 振能量转移体系，可以对生物素与链霉亲和素的结合进行检测。以4 0 0 n m 的光进 第一章绪论 行激发，对于量子点来说有很高的激发效率，而对于t m r 来说则几乎不被激发， 当以这个波长对连接体进行激发时，由于发生了共振能量转移，t m r 荧光强度显 著增强。 1 2 3 量子点的共振能量转移在d n a 生物传感器中的应用 除了用于免疫分析和其他特异性结合分析外，应用共振能量转移原理，量子 点在生物传感器方面的研究更是方兴未艾，在这些传感器中都是以量子点作为能 量供体，以有机荧光染料作为能量受体。c l a p p 靳】等人将人工改造的并且保持结 合能力的麦芽糖结合蛋白( m a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i n ，m b p ) 与量子点不可逆静 电结合，花青染料( c y a n i n ed y e s ) 共价结合到m b p 上，形成q d m b p c y 3 。在 连接到量子点上的m b p 保持一定数目的情况下，增加m b p c y 3 时，量子点荧光强 度随之减弱，c y 3 荧光强度相应增加，也就是说包围在量子点周围的能量受体越 多，光谱重叠越好，能量转移效率越高，在连接到量子点上的m b p - c y 3 数目一定 的情况下对q d 5 1 0 n m 、q d 5 3 0 n m 、q d 5 5 5 n m 三种量子点的能量转移效率进行比较， 得到q d 5 5 5n m 能量转移效率最高，也就是说该量子点的发射光谱与c y 3 吸收光 谱重叠程度最佳。 m e d i n t z 5 7 1 等人应用麦芽糖结合蛋白作为生物识别物质，设计了浓度型麦芽 糖传感器。为了提高与量子点结合能力，将组氨酸五聚体片断与麦芽糖结合蛋白 的碳端相连，形成m b p 一5 h i s ，它的生物活性仍然保持不变，并可以稳定地结合到 量子点上。这样，通过控制实验条件，一个量子点周围可以结合固定数目的m b p ， 该实验用的比例是1 ：1 0 ，形成了一个量子产率固定的传感器模型。他们同时制备 了共价的6 一环糊精( bc y c l o d e x t r i n ，b - c d ) ，用来结合m b p 上的糖类结合位 点，与麦芽糖形成一个竞争作用。当糖类结合位点被b - c d q s y 9 ( q s y 9 是一种荧 光淬灭物质f 5 8 1 ) 占据时，就形成了单供体一多受体的共振能量转移模型。由于m b p 的糖类结合位点与b 一环糊精和麦芽糖有相似的亲和性能，这样，加入麦芽糖就 会很容易地取代b - c d - q s y 9 的位置，体系的量子产率即荧光强度便会随着麦芽糖 浓度的增加而增加。 但是，相对于有机荧光染料和金属螫合物，量子点的物理尺寸较大，增大了 供体和受体问的距离，从而限制了共振能量转移效率。为了消除这一影响，c y 3 被插入供、受体之间，作为能量转移的桥梁，两步能量转移糖类传感器被设计出 来。 j o o n gh k 等人【5 9 i 研究了量子点在分子灯塔探针中取代传统有机染料在d n a 检测中的应用，其设计的分子灯塔探针检测d n a 过程如图所示。量子点由于其尺 寸可调，可以合成不同粒径的量子点使其光谱重叠最大，文中量子点与d a b c y l 1 2 第一章绪论 的光谱重叠达到9 0 ，有利于荧光共振能量转移的发生。通过比较分析 o r g a n i c m b s 和q d m b s 两种探针形式3 d 图，发现量子点的f o r s t e r 半径较小， 但其淬灭效率略低于前者，这是由于量子点与d a b c y l 的空间距离太大导致的。 在今后的实验中，通过采用比较好的提纯分离方法可以提高其效率。量子点其最 大优势就是稳定好，在十分钟的激发状态下，染料的荧光降低1 5 而量子点基本 不变。当当加入完全互补的目标后其荧光恢复，而完全不互补的目标基本没有变 化。并且量子点恢复6 倍( 染料为1 0 倍) ，尽管低于染料但是量子点的稳定性、 持续时间长、独特的光学性能等都是我们所必需的，本文为量子点在同时检测多 种d n a 以及在药物、基因学方面的应用提供了参考。 d j z h o u 等人咖1 设计了一种将z n s 包裹的量子点连接在有染料标记的d n a 链上。a l e x a5 9 4 荧光团受体标记的双链d n a 通过巯基与c d s e z n s 量子点连接， d n a 可以用来减少他们的距离，提高f r e t 效率。并不像传统的q d 一蛋白质的共轭 体，在此体系中供受体的量是对应的，只有相应增加供受体的量，才能提高f r e t 效率。而本文在很低的供受体比例下，可以达到很高的f r e t 效率( 8 8 ) 。这种 方法为制备高灵敏度的