（发育生物学专业论文）hiv1+dna疫苗及免疫途径优化.pdf

一)j，符号说明a m p ：a m p i c i l l i n ，氨苄青霉素a t p ：a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ，腺苷三磷酸b p ：b a s ep a i r ，碱基对c i p ：c a l fi n t e s t i n a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，小牛肠碱性磷酸酶c k ：c o n t r o l ，对照e d n a ：c o m p l e m e n t a r yd n a ，互补d n ad d h 2 0 ：d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r ，重蒸水d e p c ；d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯d m e m ：d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m ，杜尔伯科改良伊格尔培养基( 一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基11 6 4 0 ：d m e m 培养基的改良低血清培养基d m s o ：d i m e t h y ls u l p h o x i d e ，二甲基亚砜d n a ：d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，脱氧核糖核酸d n t p d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t ，脱氧核糖核苷三磷酸d t t - d l d i t h i o t h r e i t o l ，二硫苏糖醇e b ：e d h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭e d t a ：d i s o d i u me t h y l e n d i a m i n e t e t r a c e t a t e ，乙二胺四乙酸h r p ：h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，辣根过氧化物酶i p t g ：i s o p r o p y l t h i o bdg a l a c t o s i d e ，异丙基bd 硫代半乳糖苷k a c ：k a l i u ma c e t a t e ，醋酸钾k a n ：k a n a m y c i n ，卡那霉素l b ：l u r i a b e r t a n im e d i u m ，l b 培养基n a a c ：s o d i u ma c e t a t e ，醋酸钠o d ：o p t i c a ld e n s i t y ，光密度p b s p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e ，磷酸盐缓冲液p b s t p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e + t w e e n ，含0 0 5 t w e e n - 2 0 的l xp b sp c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应r n a ：r i b o n u c l e i ca c i d ，核糖核酸r n a s ea ：r i b o n u c l e a s ea ，核糖核酸酶ap v d f 膜：p o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d em e m b r a n e ，二氟化树脂膜r p m ：r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e ，转分钟s d s ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，十二烷基硫酸钠s p f ：s p e c i f i cp a t h o g e nf r e e ，无特定病原体s t e ：s o d i u mc h l o r i d e ，t r i s c 1 ，e d t ab u f f e r ，氯化钠、t r i s c 1 、e d t a 缓冲液t e ：t r i s c 1 ，e d t ab u f f e r ，t r i s c i 、e d t a 缓冲液t r i s ：t r i s h y d r y x y m e t h yl a m i n o m e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷t w e e n - 2 0 - p o l y o x y e t h e n e - 2 0 - s o r b i t u m ，聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯x g a l ：5 - b r o m o 一4 - c h l o r o 一3 一i n d o l y l - d g a l a c t o s i d e ，5 一溴- 4 一氯一3 一吲哚bd半乳糖苷7i目录摘要1a b s t r a c t 3l 引言“62 材料与方法1 22 1 实验材料1 22 1 1 实验动物一1 22 1 2 细胞和菌株”1 22 1 3 质粒”1 22 1 4p c r 引物”1 22 1 5 包被抗原、酶标二抗和多肽”1 22 1 6 工具酶和主要生化试剂132 1 7 试剂盒”1 42 1 8 细胞培养试剂1 42 1 9 实验仪器142 2 实验方法152 2 1d n a 疫苗载体p d r v l 4 0 的构建152 2 2 单顺反子及双顺反子h i v - 1d n a 疫苗比较研究182 2 3h i v - 1d n a 疫苗免疫原基因修饰研究2 42 2 4 双顺反子h i v - 1d n a 疫苗表达盒排列方向对疫苗免疫原性的影响312 2 5 体内电穿孔在质粒介导的基因转移及d n a 免疫中的应用3 62 2 5 1 体内电穿孔对荧光素酶( 1 u c i f e r a s e ) 体内表达效果影响3 62 2 5 2 体内电穿孔对h i v - 1e n vd n a 疫苗免疫效果影响3 83 实验结果与分析4 13 1d n a 疫苗载体p d r v l 4 0 的构建4 13 。1 1 载体鉴定4 l3 2 单顺反子及双顺反子h i v - 1d n a 疫苗的比较研究4 13 2 1 质粒鉴定4 13 2 2 单顺反子及双顺反子h i v - 1d n a 疫苗免疫小鼠结果4 33 3m v - 1d n a 疫苗免疫原基因修饰研究4 63 3 1 携带跨膜修饰免疫原基因的双顺反子d n a 疫苗质粒的鉴定4 63 3 2 动物实验结果“4 73 4 双顺反子h i v - 1d n a 疫苗表达盒排列方向对疫苗免疫原性的影响5 13 4 1 表达盒逆向排列的双顺反子质粒的鉴定5 13 4 2 动物实验结果”5 23 5 体内电穿孔在质粒介导的基因转移及d n a 免疫中的应用5 53 5 1 体内电穿孔对荧光素酶( 1 u c i f e r a s e ) 体内表达效果影响5 53 5 2 体内电穿孔对h i v - 1e n vd n a 疫苗免疫效果影响5 64 讨论6 05 结j 沧6 4参考文献6 5附蜀专6 8攻读学位期间发表论文情况8 3致谢8 4鼍i山东农业大学硕士学位论文摘要疫苗是预防控制传染病的最有效最经济的手段。d n a 疫苗作为最有发展潜力的新型疫苗策略之一，可以有效的诱导细胞免疫反应及体液免疫反应，同时可以诱导长期免疫记忆。然而，较弱的免疫原性一直是制约d n a 疫苗产业化的瓶颈。本研究综合运用载体改造、基因修饰及质粒投送手段，大幅度提高了h i v - 1d n a 疫苗的免疫原性。本实验室经验表明，疫苗质粒大小超过9 k b 会使生产难度大幅度提高，并使质粒进入细胞的效率显著降低。为了构建多价h i vd n a 疫苗，本课题从d n a 疫苗载体p d r v l l 0 出发，通过删除约2 k b 质粒骨架非必需序列，构建了p d r v l 4 0 质粒载体，并以此为基础构建h i vd n a 疫苗。动物免疫结果表明，与基于p d r v l l 0 的d n a 疫苗相比，p d r v l 4 0 作载体的疫苗所诱导的体液和细胞免疫反应无显著差异。将覆盖h i v - 1 中国流行株c n 5 46 个抗原基因的4 个遗传密码优化的免疫原基因e n v 、p o l 、g a g和t n r ( 编码t a t n e f - r e v 融合蛋白) 分别克隆入p d r v l 4 0 载体，得到4个单顺反子d n a 疫苗质粒p 4 0 e n v 、p 4 0 p o l 、p 4 0 g a g 和p 4 0 - t n r 。为进一步降低疫苗生产和应用成本，从p d r v l 4 0 载体出发，构建2 个双顺反子d n a 疫苗质粒p 4 0 e n v p o l 和p 4 0 一g a g t n r 。将双顺反子疫苗和单顺反子疫苗平行免疫小鼠，结果表明双顺反子d n a 疫苗所诱导的免疫反应与单顺反子d n a 疫苗无显著差异。为了进一步提高双顺反子d n a 疫苗的免疫原性，本课题对p o l 、g a g和t n r 抗原基因进行跨膜修饰，得到表达后锚定于细胞表面的抗原基因，并构建了携带这些基因的双顺反子d n a 疫苗p 4 0 - e n v p o l t m 和p 4 0 g a g t n r t m 。小鼠免疫结果表明，抗原跨膜修饰可以从总体上增强d n a 疫苗诱导的特异性体液和细胞免疫反应。为了研究表达和排列方向对双顺反子d n a 疫苗免疫原性的影响，本课题构建了两个表达盒排列方向相反的双顺反子d n a 疫苗质粒p 4 0 e n v p 0 1 t m t r a n s 和d 4 0 g a g t n r - t m t r a n s 。小鼠免疫结果表明，表达盒排列方向对双顺反子d n a 疫苗所诱导的体液和细胞免疫反应均无影响。其次，本研究应用体内电穿孔技术增强d n a 疫苗的递送效率。我们h i v - id n a 疫苗及免疫途径优化用本实验室保存的携带荧光素酶l u e i f e r a s e 基因的报告质粒p 1 0 l u c 和携带h i v - 1c n 5 4e n v 基因的d n a 疫苗质粒p 1 0 - e n v 通过肌肉注射、肌肉注射后加电穿孔两种不同方法注射小鼠，用i v i s 活体成像系统实时检测l u c i f e r a s e 报告基因在体内的表达情况，用e l i s a 检测h i v - 1e n v 特异的抗体反应，用i f n - , te l i s p o t 检测h i v - 1e n v 特异的t 细胞免疫反应。结果表明体内电穿孔技术可以显著提高l u c i f e r a s e 在小鼠体内的表达水平，增强幅度达3 5 倍。e n v 特异性的免疫结果显示，8 p g 质粒剂量电穿孔途径诱导的体液和细胞免疫应答强于4 0 1 x g 质粒剂量单纯肌肉注射组；体内电穿孔途径免疫2 次与单纯肌肉注射途径免疫3 次诱导的体液和细胞免疫应答水平相当。综合以上两部分的结果，双顺反子d n a 疫苗可以在不牺牲疫苗免疫原性的前提下大幅度减少d n a 疫苗质粒数量和质粒大小；对抗原基因进行跨膜修饰可以显著增强d n a 疫苗诱导的体液和细胞免疫反应；体内电穿孔技术作为一种新的基因投送途径可以显著增强目的基因表达水平及d n a 疫苗免疫原性。关键词：d n a 疫苗；优化设计；双顺反子；体内电穿孔2山东农业大学硕士学位论文t h eo p t i m i z a t i o no fh i v - 1d n av a c c i n ea n di m m u n i z a t i o na p p r o a c h e sa b s t r a c tv a c c i n ei st h em o s te f f i c i e n ta n de c o n o m i c a lm e a s u r ef o rc o n t r o l l i n ga n dp r e v e n t i n gi 疵c 廿o u sd i s e a s e s d n av a c c i n ea so n eo ft h em o s tp o t e n t i a ln e wv a c c i n es t r a t e g i e s ，c o u l dn o to n l yi n d u c ec e l l u l a ra n dh u m o r a lr e s p o n s e se f f i c i e n t l y , b u ta l s oi n d u c el o n g t i m ei m m u n em e m o r y h o w e v e r , t h em o d e s ti m m u n o g e n i c i t yh a sb e e nc o n s i d e r e da st h eb o t t l e - n e c ko fd n av a c c i n ei n d u s t r i a l i z a t i o na 土2 l l lt i m e s as e r i e so fm e a s u r e s ，s u c ha sv e c t o ro p t i m i z a t i o n ,g e n em o d i f i c a t i o na n di nv i v oe l e c t r o p o r a t i o n , w e r ee m p l o y e di nt h i ss t u d y ,w h i c hs i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dt h ei m m u n er e s p o n s e se l i c i t e db yh i v - 1d n av a c c i n e t l l ee x p e r i e n c eo fo u rg r o u ps h o w st h a tt h em a n u f a c t u r ep r o c e s sw o u l db e c o m ec h a l l e n g i n ga n dt h ee f f i c i e n c yo fc e l le n t r yw o u l db er e d u c e dw h e nt h es i z eo ft h ev a c c i n ep l a s m i de x c e e d s9 k b t oc o n s t r u c tm u l t i v a l e n tv a c c i n e ，s t a r t i n gf r o mt h ed n av a c c i n ev e c t o rp d r v i1 0 ，w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dp d r v l 4 0p l a s m i dv e c t o rb yr e m o v i n ga b o u t2 k bo fn o n e s s e n t i a ls e q u e n c ef r o mt h ep l a s m i db a c k b o n ea n dt h e nc o n s t r u c t e dh d n av a c c i n eb a s e do nt h i sn e wv e c t o r 砀ei m m u n o g e n i c i t yd a t ai nm i c es h o w e dt h a tc o m p a r e dw i t hp d r v l l 0 b a s e dd n av a c c i n e ，t h ev a c c i n eb a s e do np d r v l 4 0i n d u c e dt h es a m el e v e lo fc e l l u l a ra n dh u m o r a li m m u n er e s p o n s e s f o u rc o d o n - o p t i m i z e da n t i g e ng e n ee n v , p o l ，g a ga n dt n r ( e n c o d et a t - n e f - r e vf u s i o np r o t e i n )w h i c hc o v e r s6v i r a lg e n e sf r o mc n 5 4 - ap r e v a l e n th i v - 1s t r a i nc i r c u l a t i n gi nc h i n a ，w e r es u b c l o n e di n t op d r v l 4 0t oo b t a i n4m o n o c i s t r o n i cd n av a c c i n ep l a s m i d sp 4 0 一e n v , p 4 0 - p 0 1 p 4 0 一g a ga n dp 4 0 一t n r t of u r t h e rr e d u c et h ec o s to fv a c c i n ep r o d u c t i o na n da p p l i c a t i o n ，w ec o n s t r u c t e d2b i c i s t r o n i cd n av a c c i n ep l a s m i d sp 4 0 一e n v p o la n dp 4 0 一g a g t n rb a s e do r lp d r v l 4 0v e c t o r ,w h i c hc a r r yt h es a m ei m m u n o g e ng e n e sa st h o s ei nt h em o n o c i s t r o n i c3h i v - 1d n a 疫苗及免疫途径优化p l a s m i d s b a l b cm i c ei m m u n i z e dw i t hb i c i s t r o n i ca n dm o n o c i s t r o n i cv a c c i n ep l a s m i d si np a r a l l e l ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m m u n er e s p o n s e si n d u c e db yb i c i s t r o n i cd n av a c c i n eh a v en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew i t ht h o s ei n d u c e db ym i x t u r e so fm o n o c i s t r o n i cd n av a c c i n ec o n s t r u c t s t of u r t h e re n h a n c et h ei m m u n er e s p o n s e si n d u c e db yt h eb i c i s t r o n i cd n a、v a c c i n e ，w em o d i f i e dt h ea n t i g e ng e n e sp o l ，g a ga n dt n rb ya d d i n ga】m e m b r a n ea n c h o rt ot h ec t e r m i n io f t h e m t h en e wv e r s i o n so fa n t i g e n sa r ep r e d i c t e dt ob el o c a t e da tt h ec e l ls u r f a c ea sm e m b r a n e a n c h o r e dp r o t e i n s im o r e o v e r ,w ec o n s t r u c t e db i c i s t r o n i cd n av a c c i n ep l a s m i d sp 4 0 一e n v p o l t ma n dp 4 0 一g a g t n r - t mw h i c hc o n t a i nt h e s eg e n e s m i c ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t ，g e n e r a l l y , d n av a c c i n e - g e n e r a t e da n t i g e n - s p e c i f i ch u m o r a la n dc e l l u a rr e s p o n s e sc o u l db es i g n i f i c a n t l ye n h a n c e db yg e n em o d i f i c a t i o n sr e l o c a l i z i n ga n t i g e n st ot h ec e l ls u r f a c e t oe x p l o r ew h e t h e rt h ed i r e c t i o no fe x p r e s s i o nc a s s e t t e so nt h eb i c i s t r o n i cp l a s r n i d sh a sa n ye f f e c t so nt h ei n l m u n er e s p o n s e s ，w ec o n s t r u c t e dt w ob i c i s t r o n i cd n av a c c i n ep l a s m i d sp 4 0 - e n v p o l - t m t r a n sa n dp 4 0 一g a g t n r t m - t r a n sw i t ht w oe x p r e s s i o n a lc a s s e t t ep l a c e di no p p o s i t cd i r e c t i o n s m i c ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t , t h ed i r e c t i o no fe x p r e s s i o n a lc a s s e t t eo nb i c i s t r o n i cc o n t r u c t si n f l u e n c en e i t h e rt h eh u m o r a ln o rt h ec e l l u l a ri m m u n er e s p o n s e si n d u c e db yd n av a c c i n a t i o n n e x t ，nv i v oe l e c t r o p o r a t i o nd e l i v e r yw a se m p l o y e dt oe n h a n c et h ec e l le n t r ye f f i c i e n c yo fd n av a c c i n ep l a s m i d s l u c i f e r a s e e x p r e s s i n gp l a s m i dp1 0 - l u cw a sa d m i n i s t e r e di n t r a m u s c u l a r l yt ob a l b cm i c et h r o u g hi n j e c t i o nw i t ho rw i t h o u te l e t r o p o r a t i o n d n av a c c i n ep l a s m i dp1 0 一e n vc a r r y i n gh i v - 1c n 5 4e n vg e n ew a sa d m i n i s t e r e dt om i c et h r o u g ht h et w oa p p r o a c h e sm e n t i o n e da b o v e l u c i f e r a s ee x p r e s s i o nl e v e li nm t t r i n em u s c l ew a sd e t e c t e d、b yi v l si m a g i n gs y s t e m2 4 h ra f t e ri n j e c t i o n e n v s p e c i f i ca n t i b o d yi m l t l u n er e s p o n s e sw e r ed e t e r m i n e db ye l i s a e n v s p e c i f i cc e l l u a ri m m u n er e s p o n s e s1w e r ed e t e r m i n e db yi f n 吖e l i s p o t i tw a ss h o w nt h a tl u c i f e r a s ee x p r e s s i o nl e v e l i nm u r i n e m u s c l ew a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da sm u c ha s3 5f o l d s4山东农业大学硕士学位论文t h r o u g h nv i v oe l e t r o p o r a t i o n t h ei m m u n er e s p o n s e si n d u c e db ye l e c t r o d e l i v e r e dp1 0 一e n va t8 1 x gd o s a g ew e r eb e t t e rt h a nt h o s ei n d u c e db ys i m p l ei n t r a m u s c l a ri n j e c t i o nw i t h4 0 昭o fp l a s m i dd n a o nt h eo t h e rh a n d ，2i n j e c t i o n sf o l l o w e db ye l e c t r o p o r a t i o ne l i c i t e dc o m p a r a b l el e v e lo fh u m o r a la n dc e l l u l a ri m m u n er e s p o n s e sw i t ht h o s ei n d u c e db y3i n j e c t i o n sw i t h o u te l e c 仃o p o r a t i o n i ns u m m a r y , b i c i s t r o n i cd n av a c c i n ec o u l dr e d u c en u m b e ra n ds i z eo fd n av a c c i n ec o n s t r u c t ss u b s t a n t i a l l yw i t h o u tc o m p r o m i s i n gt h e i ri m m u n o g e n i c i t y h t t m o r a la n dc e l l u l a rr e s p o n s e si n d u c e db yd n av a c c i n a t i o nc o u l db ee n h a n c e ds i g n i f i c a n t l yb yg e n em o d i f i c a t i o n st or e l o c a l i z et h ea n t i g e n st oc e l ls u r f a c ea st r a n s m e n b r a n ep r o t e i n s a san e wg e n ed e l i v e r e da p p r o a c h ，nv i v oe l e c t r o p o r a t i o nc o u l de n h a n c eb o t ht h eg e n ee x p r e s s i o na n dt h ei m m u n er e s p o n s e sm e d i a t e db yp l a s m i dd n ai nm i c e 。k e yw o r d s ：d n av a c c i n e ；o p t i m i z a t i o n ；b i c i s t r o n i c ；伽v i v oe l e c t r o p o r a t i o n5h i v - id n a 疫苗及免疫途径优化1 引言传染病严重威胁着人类的健康。人类文明进步的历史就是一部与各种传染病不断斗争并且不断取得胜利的历史。二十世纪人类在预防和控制传染病等方面取得了巨大的成就，但是艾滋病、疟疾、肺结核等重大传染病仍未得到有效控制，埃博拉出血热、禽流感、s a r s 等新发传染病仍不断出现，同时生物恐怖袭击的阴影也使人类健康面临全新的挑战。，众多历史经验告诉我们，疫苗是预防和控制传染病最有效也是最经济的武器，对保护人类生命健康做出了巨大贡献。早在2 0 世纪7 0 年代人类便使用疫苗成功的消灭了曾肆虐全世界的烈性传染病一天花，现如今又基本在全球范围内消灭了脊髓灰质炎，并有效控制了麻疹的传播和扩散，因而应用疫苗来控制传染性疾病是人类历史上最伟大的成就之一( 褚嘉佑，2 0 0 2 ) 。但目前已研制成功的疫苗绝大多数属于传统的减毒和灭活疫苗。尽管这些传统疫苗在某些疾病的预防甚至消灭过程中起到了决定性作用，但对于另外一些传染疾病( 如艾滋病、疟疾、肺结核等) ，由于安全性或者效果的原因，传统疫苗策略却不能有效发挥作用。以h i v 为例，由于这种逆转录病毒的前病毒能够整合进入宿主染色体，并以前病毒形式潜伏感染，同时又具备极高的突变能力，因此发展减毒活疫苗的风险很大，而灭活疫苗由于灭活失败而导致接种感染的可能性以及其生产过程对生物安全的极高要求成为制约其应用的关键因素。2 0 世纪9 0 年代初，d n a 疫苗作为人类战胜传染病的一种新型武器登上历史舞台。d n a 疫苗本质是编码目的抗原的质粒d n a ，注射入动物体内可以在宿主体内表达相应的抗原蛋白，从而刺激机体产生特异性体液和细胞免疫应答( t a n gd c ，1 9 9 2 ；d o n n e l l yj j ，1 9 9 7 ) 。自1 9 9 6 年美国f d a 宣布批准首例艾滋病d n a 疫苗进行人体实验至今，己有近百种针对艾滋病、乙肝、疟疾、流感、埃博拉、疱疹、癌症及自身免疫等疾病的预防性或治疗用d n a 疫苗进入了临床试验阶段( l i um a ，2 0 0 5 ) 。2 0 0 5 年两种动物d n a疫苗获准上市销售o m p ：l l w w w a h n o v a r t i s c o m d o c s m e d i a m e d i a 2 0 r e l e a s e 2 0 一2 0 a p e x 6k l 】i - _山东农业大学硕士学位论文2 0 1 h n 2 0 j u l y 2 019 _ 0 5 p d f h t t p ：w w w w y e t h c o m n e w s p r e s s e d _ a n d _ r e l e a s e d p r 0 7 19 2 0 0 5 0 9 0 7 5 2 a s p ? a r c h i v e = 2 0 0 5 ) ，标志着d n a 疫苗进入了产业化应用阶段。同传统疫苗和蛋白亚单位疫苗相比，d n a 疫苗具有诸多独特优点( d o n n e l l yj j ，2 0 0 5 ) ，比如d n a 疫苗编码的抗原在细胞内表达，可以模拟病毒感染后的抗原合成和加工提呈过程，有利于诱导t h l 型免疫反应，具备一些减毒活疫苗的优点；而且在安全性方面，它不携带完整病毒基因组序列，不可能因为病毒的毒力回升或者灭活失败而导致疫苗致病病例，也不含传统疫苗制剂普遍含有的血清或培养基等外源成分；同时从疫苗生产成本来看，d n a 疫苗发酵和纯化等一些生产工艺简便，大规模的制备成本低，冻干后的d n a 疫苗制品存储要求简单，存储期长，不需冷链；另外，d n a 疫苗研制周期短，便于对抗原变异作出十分快速的反应；此外，d n a 疫苗外源基因容量较大，容易发展为多价疫苗；d n a 疫苗与活载体疫苗相比，载体本身并无免疫原性，可进行多次免疫，且副作用比活载体疫苗小的多，同时疫苗构建策略更加简单灵活。上述特点使d n a 疫苗成为了新型疫苗策略的中坚力量，被国际疫苗界称为继传统疫苗和蛋白亚单位疫苗之后的“第三代”疫苗。对于一种新生事物，人们都有一个逐步加深认识的过程，d n a 疫苗也是如此。首先，作为一种革命性的疫苗形式，安全性问题自然受到较多关注。如上所述，尽管d n a 疫苗具备许多其他类型疫苗特别是传统疫苗所不具备的安全性优势，如不会存在由于灭活失败导致的疫苗病例、不形成感染性的活病原、不携带感染性外源因子和培养基成分、纯度高等，然而，在d n a 疫苗发展的早期，对于d n a 疫苗的安全性存在诸如注射d n a疫苗是否会导致或加重自身免疫病理( k l i n m a nd m ，1 9 9 7 ) 、注射d n a 疫苗是否会诱导抗d n a 和抗自身蛋白的抗体( l et e 2 0 0 0 ) 、d n a 疫苗整合到宿主染色体的几率和后果( l e d w i t hb j ，2 0 0 0 ) 、d n a 疫苗在体内的分布和代谢动力学( k i mb m ，2 0 0 3 ) 等。随着d n a 疫苗临床前研究以及临床试验数据的积累，这些担心逐渐被排除，人们对d n a 疫苗的安全性也有了更科学的认识，d n a 疫苗作为有史以来最安全的疫苗之一的特性也逐步被人们所认同。7h i v - 1d n a 疫苗及免疫途径优化d n a 疫苗的安全性已经毋庸质疑，那么接下来的一个主要问题便是d n a 疫苗的有效性。在d n a 疫苗发展的初期，以小鼠为模型的实验结果十分令人欣慰( h u y g e nk ，19 9 6 ；s h i v e rj w , 19 9 6 ；h s us c ，19 9 8 ；h o f f m a ns l ，1 9 9 4 ) ，d n a 疫苗有效的诱导了免疫反应并起到了保护性作用，展现了良好的应用前景。不过在接下来开展的一系列大型动物实验和人体临床试验中，d n a 疫苗的表现有些“令人失望”( l i um a ，2 0 0 5 ；g r a h a mb s ，2 0 0 2 ) ，这也是2 0 0 5 年之前d n a 疫苗虽历经十余年的发展却没有实现产业化的根本原因所在。同时由于通过肌肉直接注射的裸d n a 的免疫原性不高，因此只能不断加大d n a 疫苗使用剂量，且往往需要三次以上的免疫。即便如此，d n a 疫苗仍然主要是作为初始免疫组分与其他疫苗联合使用。加之d n a 疫苗的生产和使用成本居高不下，使d n a 疫苗的应用受到很大限制。到目前为止，能否大幅提高d n a 疫苗的免疫原性仍是决定d n a 疫苗命运的关键因素。要有效提高d n a 疫苗的免疫原性，就得首先了解d n a 疫苗在体内诱导免疫反应的机理。d n a 疫苗从进入机体开始到诱导免疫反应大致包括以下几个阶段：1 、质粒d n a 进入宿主细胞；2 、目的抗原基因在细胞内的表达；3 、表达后的抗原蛋白在抗原呈递细胞中加工，并在共刺激分子协助下进行抗原的提呈；4 、在一些细胞因子的协助下，效应细胞和免疫记忆细胞开始形成并且发挥作用。从免疫信息流角度分析，以上几个阶段实际上就是d n a 疫苗所携带的免疫遗传信息进入细胞、导出细胞并呈递给免疫系统的过程。因此，只有使外源基因有效导入细胞进行高效表达，同时又可以使整个抗感染免疫系统被高效激活，d n a 疫苗的免疫原性才能得到大幅度的提高。本研究从载体优化改造、基因修饰两个层面对表达h i v 中国株c n 5 4e n v 、p o l 、g a g 、t n r 抗原的d n a 疫苗进行了系统的优化，期望在改善免疫原性的同时尽量降低生产成本。具体研究内容大致分为以下几个步骤：1 、为了实现多价疫苗策略并尽可能减少疫苗质粒的数量，通过删除质粒载体骨架的非必需序列成功构建了紧凑的双顺反子疫苗质粒；2 、对h i v - 1p o l 、g a g 、t n r 蛋白基因序列进行加工修饰，使其以跨膜形式表达，比较它们与天然h i v 蛋白基因序列免疫应答的强弱；3 、在双顺反子d n a8山东农业大学硕士学位论文疫苗中探讨了两个表达盒的排列方向对d n a 疫苗质粒免疫原性的影响。本研究所使用的出发载体p d r v l l o 是本实验室在美国国立卫生研究院( n i h ) 构建的专、_ i k d n a 疫苗载体p v r c 2 0 0 0 基础上改造而来。该载体的特征是携带7 2 b p 的s v 4 0 增强子元件，具有细胞核定位信号n l s 和激活转录的双重功能，可以使外源基因在体内肌肉细胞的表达水平比单独使用c m v 增强子启动子提高2 0 倍左右( h o h l f e l d1 l 1 9 9 4 ；y o k o y a m am ，1 9 9 7 ) ，已获中国发明专利授权( 携带s v 4 0 增强子元件的d n a 疫苗载体，专利号z l2 0 0 4 1 0 0 2 8 2 8 0 3 ) 。基于p d r v l l 0 而发展的我国第一代自主知识产权的h i vd n a 疫苗目前己完成i 期临床试验，表现了优异的人体安全性及良好的免疫原性。为了发展新一代多价h i vd n a 疫苗，本课题决定采用双顺反子质粒设计方案，提出了在不降低免疫原性的同时最大限度压缩质粒d n a 数量和大小的设计目标。本研究在p d r v l l 0 基础上删除非编码的载体骨架得到t p d r v l l 0 载体，使载体大小由原来的5 k b 缩小为3 k b ，大大增加了外源基因的容量。同时动物实验结果显示，删除非编码序列对d n a疫苗的免疫原性并无影响，这无疑为双顺反子d n a 疫苗的优化设计创造了条件。同时，除了载体因素之外，d n a 疫苗所诱导的免疫反应强度和类型还受其所表达的抗原在宿主细胞的不同定位所影响( f y n n a ne f ，1 9 9 3 ) ，这对其产生的保护效果具有重要意义。本实验室前期研究曾成功地对h i v 1g a g 蛋白进行分泌和跨膜基因修饰，增强了携带该基因的d n a 疫苗的免疫原性( 发明专利授权，跨膜型和分泌型h i vg a g 抗原编码基因及包含其的艾滋病疫苗，专利号z l 0 3 1 5 8 5 3 8 8 ) 。本课题所设计的多价h i v 1d n a 疫苗选用的h i v 1 的e n v 、p o l 、g a g 、t n r 抗原基因经过了改造并根据哺乳动物密码子进行了优化。除了h i v 1e n vg p l 4 5 5 m 本身是跨膜表达的蛋白以外，我们对其他几种基因进行修饰，使相应蛋白分别以跨膜形式进行表达。把修饰后的抗原基因克隆入双表达盒载体，并和携带天然基因的双表达盒质粒共同免疫b a l b c 小鼠比较免疫反应强度和免疫反应类型的差别。动物实验结果显示，改变抗原表达后的细胞定位，对d n a 疫苗诱导的免疫反应强度产生了显著影响。与野生型基因相比，将h i v 1 抗原基因导入跨膜表达途径可以显著增强h i v 1d n a 疫苗诱导的特异性体液和细胞免疫9h i v - id n a 疫苗及免疫途径优化反应。关于双顺反子d n a 疫苗重基因表达盒的排列方向对d n a 疫苗免疫原性的影响很少有相关报道，本研究构建了基因表达框方向相反的双表达盒质粒，与顺式双顺反子质粒共同免疫b a l b c 小鼠比较免疫反应强度和免疫反应类型的差别。动物实验结果显示，改变基因表达盒的排列方向，对于d n a 疫苗质粒的免疫原性并无显著影响。同时，质粒递送效率是决定d n a 疫苗免疫原性的至关重要的因素。目前，最被普遍接受和广泛采用的免疫接种方式是直接进行肌肉注射，同时绝大多数d n a 疫苗的临床试验也是应用这种方式。但相关研究显示，直接肌肉注射d n a ，导入机体细胞的效率太低，即使吸收效率相对较高的骨骼肌，同样也只有很少量的肌纤维可以摄取微量的质粒d n a ，其他绝大多数质粒d n a 都在细胞外被降解，从而导致质粒用量大，免疫应答水平低。为了增强质粒进入机体宿主细胞的效率，越来越多的递送方式在d n a 疫苗的给药途径中进行了尝试，其中包括电穿孔导入( m a t h i e s e ni ，1 9 9 9 ) 、基因枪导入( h a r tr , 2 0 0 0 ) 、微针注射( m i k s z t aj a ，2 0 0 2 ) 、超声导入( m i t r a g o t r is ，19 9 5 ) 、脂质体导入( g r e g o r i a d i sg19 9 7 ) 、微颗粒和纳米颗粒导入( c u iz ，2 0 0 3 ) 和病毒样颗粒导入( t a k a m u r as , 2 0 0 4 ) 等方法。通过应用这几类递送方