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纳米增强酶生物传感器的研究中文摘要 中文摘要 生物传感器作为直接或间接检测生物分子、生理或生化过程相关参数的分析 器件，由于具有灵敏度高、选择性好、响应快、操作简便、样品需要量少、可微 型化、价格低廉、可以实现连续在位检测等特点，在生物医学、环境监测、食品 医药工业等领域展现出十分广阔的应用前景。本文将纳米粒子引入酶生物传感器 的制备过程中，主要做了下面两个部分的工作 第一用溶胶凝胶( s o l - g e l ) 包裹纳米金粒子( a u n p ) 和辣根过氧化酶( h r p ) ， 结合纳米技术、溶胶凝胶和自组装技术，既保持了纳米粒子对电极的增敏作用， 又大大延长了电极的使用寿命。系统地研究了p h 、扫速对h r p 酶电极电化学性 能的影响，优化了电极的制备条件，实现了h r p 酶电极对h 2 0 2 的响应，并考察 了电极的稳定性。酶电极电子转移速率常数7 8s ，检测h 2 0 2 线性范围是1 6 p x n o ll 3 2m m o ll ，检测限为0 5l n o ll 。1 ( 信噪比3 ) ，米氏常数1 1m m o ll ， 在4 c 下放置1 0 0 天后对h 2 0 2 的响应仍保持原来的9 2 第二论文利用碳纳米管( c n t ) 制备黄嘌呤氧化酶( x o d ) 电极，制备了 x o d c n t g c 电极，c n t 既是电极材料又作为x o d 与电极电子转移的促进 剂，实现了x o d 与g c 电极的直接电子转移。同时对电极的电化学性能做了探 讨，并研究了对黄嘌呤( x a ) 的检测，电极电子转移速率常数2 0s ，检测线性范围 0 1p m o ll 一1 0i _ t m o ll ，检测限8 0n m o ll 1 ( 信噪比3 ) ，米氏常数o 0 5m m o l l ，在4 c 下放置1 4 天后对h 2 0 2 的响应降低4 为了提高酶电极的稳定性，实验采用s 0 1 g e l 包裹纳米粒子和x o d ，制备了 x o d m c n t s o l - g e l g c 电极，实现了对x a 的响应，电极检测的线性范围o 5 纳米增强酶生物传感器的研究 中文摘要 斗m o ll 1 0p m o ll 一，检测限0 1 5 “m o ll ，米氏常数0 3m m o ll ，稳定性实验 9 0 天后降低5 与x o d c n t g c 电极相比，虽然灵敏度降低为原来的6 3 但 是稳定性大大提高。 关键词：纳米粒子，生物传感器，辣根过氧化酶，黄嘌呤氧化酶， 溶胶凝胶 i i 作者：沈春平 指导老师：狄俊伟 纳米增强酶生物传感器的研究a b s t r a c t r e s e a r c ho ne n z y m eb i o s e n s o r si n c o r p o r a t i n g n a n o p a r t i c l e s a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o ri sq u i t eu n i q u e ，b e c a u s ei tc o m b i n e st h ee n z y m es p e c i f i c i t y w i t ht h es e n s i t i v i t ya n dc o n v e n i e n c eo fe l e c t r o a n a l y t i c a lt e c h n i q u e si nac o m p a c tf o r m t of a c i l i t a t ea n a l y s i s i nt h i sp a p e r , t h en a n o p a r t i c l e sw e r eu s e di nt h ef a b r i c a t i o no f b i o s e n s o r s t 1 1 i st h e s i sc o n c e r n st w or e s e a r c hs e c t i o n s ： f 证s t , ao n e s t e pm e t h o df o rf a b r i c a t i o no fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) b i o s e n s o r w i t ha un a n o p a r t i c l e ( a u n p ) h a sb e e nd e v e l o p e d t h ea u n pa n dh r pw e r e s i m u l t a n e o u s l ye m b e d d e di n s i l i c as o l - g e ln e t w o r ko ng o l de l e c t r o d es b r f a c ei nt h e p r e s e n c eo fc y s t e i n e t h ei m m o b i l i z e dh r p e x h i b i t e dd i r e c te l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r t o w a r dt h er e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e t h eh e t e r o g e n e o u se l e c t r o nt r a n s f e rr a t e c o n s t a n tw a se v a l u a t e dt ob e7 8 s t h eb i o s e n s o rd i s p l a y e da ne x c e l l e n t e l e c t r o c a t a l y t i cr e s p o n s et ot h er e d u c t i o no f h 2 0 2w i t h o u ta n ym e d i a t or t h ec a l i b r a t i o n r a n g eo fh 2 0 2w a sf r o m1 6i m a o ll 1 t o3 2m m o ll 1a n dad e t e c t i o nl i m i to fo 5i m a o l l a tas i g n a l - t o n o i s er a t i oo f 3 t h ek m a p pv a l u eo f h r 2i m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d e s u r f a c ew a sf o u n dt ob e1 1m m o ll t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dh i 曲s e n s i t i v i t y , r a p i d r e s p o n s ea n dl o n g - t e r ms t a b i l i t y s e c o n d ，c a r b o nn a n o m b e ( c n t ) w a su s e di nt h ef a b r i c a t i o no fx a n t h i n eo x i d a s e ( x o d ) b i o s e n s o r x o d c n t g ce l e c t r o d ew a sf a b r i c a t e d t h ei n f l u e n c e so fc n t , p h a n ds c a nr a t et ot h ee l e c t r o d ew e r ed i s c u s s e d t h ex o de x h i b i t e dd i r e c t e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r 、i n lt h ef u n c t i o no fc n t t h eh e t e r o g e n e o u se l e c t r o nt r a n s f e r r a t ec o n s t a n tw a se v a l u a t e dt ob e2 0s 一t h ec a l i b r a t i o nr a n g eo fx a n t h i n ef x a ) w a s f r o mo 1i m o ll 1t o1 0 啪o ll 1a n dad e t e c t i o nl i m i to f8 0n m o ll 1 a ta s i g n a l t o - n o i s er a t i oo f3 t h ek m a p pv a l u eo fx o d i m m o b i l i z e do nt h ec n tw a sf o u n d t ob eo ，0 5m m o ll t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dh i 曲s e n s i t i v i t y , r a p i dr e s p o n s e i tw a s f o u n dt h er e s p o n s ec u r r e n tt ox ad e c r e a s e da b o u t4 a r e rs t o r a g ea t4o cf o r1 4d a y s i no r d e rt o i m p r o v et h es t a b i l i t yo fe n z y m ee l e c t r o d e ，s o l g e lw a sa p p l i e dt o t h e t i i 纳米增强酶生物传感器的研究a b s t t a c t r e s e a r c ho fx o db i o s e n s o r x o d m c n t s o l g e l g cw a sf a b r i c a t e d i tw a sf o u n dt h a t t h er e s p o n s ec u r r e n tt ox ad e c r e a s e da b o u t5 a t t e rs t o r a g ea t4 。cf o r9 0d a y s t h e c a l i b r a t i o nr a n g eo f x aw a sf r o m0 5g m o lt o1 0l _ t r n o ll a n dad e t e c t i o nl i m i to f 0 1 5 p a n o ll a tas i g n a l - t o - n o i s er a t i oo f3 t h ek m 叩9v a l u eo f x o dw i t hc n te m b e d d e di n s i l i c as o l g e ln e t w o r ko ng ce l e c t r o d ew a sf o u n dt ob e0 3m m o ll a l t h o u g ht h e s e n s f f i v i t yi sn o ta sg o o da sx o d c n t g ce l e c t r o d e ，t h es t a b i l i t yi sl a r g e l yi m p r o v e d k e yw o r d s ：n a n o p a r t i c l e s ，b i o s e n s o r ，h o r s e r a d i s ho x i d a s e ，x a n t h i n eo x i d a s e ，s o l g e l w r i t t e nb y ：s h e nc h u n p i n g 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：日期：塑! ：! ：罗 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：幽日 导师签名：啦丝丝日 期型生 基 期：嘶留 纳米增强酶生物传感器的研究第一章前言 第一章前言 生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的，也是电化学分析和生物技 术研究最为活跃的领域之- - “。生物传感器由分子识别元件和信号转换器组成，分 子识别元件即是感受器，它由生物活性物质构成，直接和待检测物质接触，具有 分子识别能力，有的还能够放大反应信号。现在识别元件己不仅仅限于生物活性 物质，某些具有模仿生物分子识别功能的化学分子也用于识别元件的构建。信号 转换器则是换能器，它属于电化学或光学检测元件，它可以将生物识别事件转换 为可检测的信号【2 】。当被分析物中特异性的待测物与分子识别元件结合后，其产生 的复合物、光、热等就被信号转换器转变为电信号或光信号等，传送出来并经过 显示处理，以进行分析监测 3 3 。 生物传感器与传统的各种物理传感器和化学传感器的最大区别在于生物传感 器的感受器中含有生命物质，以生物活性单元( 如酶、抗体、核酸、细胞等) 作为敏 感基元，通过各种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将 反应程度用离散或连续的数字电信号表达出来，得出被分析物的信息州。比如用一 定的植物细胞或动物细胞作为感觉器，可以制成各种细胞传感器；用生物组织作 感受器可制成组织传感器，称为组织电极；将一些特定的细胞器从细胞里分离出 来作为感受器，可制成细胞器传感器；将微生物作为感受器可制成生物传感器。 生物传感器具有灵敏度高、准确度高、选择性好、检测限低、价格低廉、稳定性 好、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测等特点，能广泛应用于基础研究、 生物、临床化学和诊断、农业和畜牧兽医、化学分析、军事、过程控制与检测、 环境监控与保护等领域 5 】o 翔米增强酶兰蜘售謦器的研究第一章前言 根据主物活性物质的类别，生物传感器可以分为酶传感器、免疫传感器、d n a 传感器、尝织传感器和微生物传感器等 酶传基嚣是最先被发明出来的，其应用也很广泛，应用酶传感器可以省去提 纯酶的繁杂步骤 6 1 。它也是生物传感器领域中研究最多的一种类型。酶生物传感 器是由一个固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成，它把固化酶和 电化学传枣嚣结合在一起，因而具有独特的优点：( 1 ) 它既有不溶性酶体系的优点， 又具有电亿学电极的高灵敏度；( 2 ) 由于酶的专属反应性，使其具有高的选择性， 能够直接在复杂试样中进行测定。因此，酶电极在生物传感器领域中占有非常重 要的地位，酶电极的基本结构单元是由物质识别元件( 固定化酶膜) 和信号转换器 ( 基体电极) 组成a 当酶膜上发生酶促反应时，产生的电活性物质由基体电极对其响 应。基体电极的作用是使化学信号转变为电信号，从而加以检测，基体电极可采 用碳质电极( 石墨电极、玻碳电极、碳糊电极) 、p t 电极、金电极及相应的修饰电 极川。 当酶电极浸人被测溶液，待测底物进人酶层的内部并参与反应，大部分酶反 应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性物质的 浓度可以通过电位或电流模式进行测定。因此，酶生物传感器可分为电位型和电 流型两类传感器。电位型传感器是指酶电极与参比电极间输出的电位信号，它与 被测物质之间服从能斯特关系。而电流型传感器是以酶促反应所引起的物质量的 变化转变成电流信号输出，输出电流大小直接与底物浓度有关。电流型传感器与 电位型传感器相比较具有更简单、直观的效果，且灵敏度也高。 自1 9 6 2 年c l a r k 8 1 提出设想、1 9 8 7 年u p d i k 和h i c k s 吲首次研制出生物传 2 纳米增强酶生物传感器的研究 第章前言 感器以来，酶生物传感器得到了迅猛发展，主要经历了三个阶段：第一代酶生物 传感器是以氧为中继体的电催化：第二代酶生物传感器是以媒介体修饰剂为基础 的电催化，增加了化学修饰层即电子转移媒介体，目的是为了扩大基体电极可测 化学物质范围及提高测定的灵敏度，基体电极经过修饰后，可以看成是一个改进 了的信号转换器。电子媒介体的作用是能促进电子传递过程，降低工作电位，以 排除其它电活性物质的干扰；第三代酶生物传感器是酶在电极上的直接电化学。 酶直接电化学已成为生物电化学研究的最重要领域之一。酶作为一类典型的 生物大分子和特殊催化剂，在生命过程中扮演着极其重要的角色。在理论上，酶 与电极之间直接电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型，为揭示生物 氧化还原过程的机理奠定了基础：从应用方面而言，酶直接电化学的实现可用于发 展人工心脏用的生物燃料电池。因此，第三代酶生物传感器的研究具有重要意义。 1 1 酶的固定化 由于酶生物传感器最主要的一个元件是固定化的生物敏感膜，因此酶膜的固 定一直是生物传感器研究的关键环节。已有的固定化方法有吸附法、化学交联法、 共价键合法、电化学聚合法、物理包埋法和分子自组装等。 1 1 1 吸附法 此法是通过酶分子极性键、氢键、疏水键的作用，将酶吸附于不溶性载体上。 有报道的载体有多孔玻璃【1 0 】、活性炭【l l 】、氧化铝 1 2 1 等。吸附法具有酶活性中心不 易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失少，但是它有酶与载体相 互作用力弱、易脱落等缺点，若能找到适当的载体，这是很好的固定化酶的方法。 纳米增强酶生物传感器的研究第一章前言 1 i 2 化学交联法 借助于交联剂的作用，使酶分子之间发生共价结合，将酶分子直接与载体共 价结合。最常用的交联试剂为戊二醛，己报道的载体有胶原蛋白膜、肠膜、尼龙 布、透析膜、聚酸胺膜、蚕丝蛋白膜 t 3 - 1 8 】。也可加人少量牛血清蛋白作为辅助剂。 采用蚕丝蛋白膜作为载体进行固化时，由于蚕丝蛋白膜上带有- n h 2 基团，从而 可省去牛血清蛋白，这样交联制成的酶膜薄，底物扩散阻力小，响应快。由于制 备过程涉及的试剂较小，酶失活的可能性小，且键合牢固，寿命长。 1 1 3 共价键合法 共价键合法是酶与载体以共价键结合的固定化方法。归纳起来有两类：一是 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上接上 一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。共价键合法的优点是酶与载体结合牢固， 但是该方法操作复杂，反应条件苛刻，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活 性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，酶活回收率一般为3 0 左右， 甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。据报道的有烷基化法、高碘酸氧化 法、迭氮法、卤化氢法等 1 9 - 2 2 】。 1 1 4 物理包埋法 将酶包埋在凝胶的细微格子里制成固定化酶。常用的凝胶有：聚丙烯酞胺、明 胶、聚乙烯醇、丝素蛋白胶。另外也可将酶包埋在类脂层中。c h i 等将亚甲基绿等 中间体与醇脱氢酶、n a d + 和硅酮混入石墨粉中，直接进行包埋固化，电极表面 也可以不断更新【2 3 瑚】。 纳米增强酶生物传感器的研究第一章前言 溶胶凝胶是一种很好的物理包埋剂，溶胶凝胶玻璃是由诸如硅氧基硅烷或类 似的有机金属烷氧化物( 如异丙氧基钛或异丙氧基铝) ，在常温下分解和缩聚而成的 玻璃状透明物质。整个溶胶一凝胶过程包括下列步骤：混合( 形成溶液) 、凝聚、老 化和干燥。在混合步骤中，将适当的烷氧化物如四甲基硅烷与水，酸性或碱性催 化剂或溶剂( 甲醇) ，在搅拌或超声下形成溶液，水解导致硅醇官能团的形成；在凝 聚过程中，硅醇基继续反应，形成硅烷聚合物：凝胶的老化即将凝胶浸入液体中 一段时间；在老化过程中，聚合反应继续进行，凝胶的强度增加：在干燥步骤中 溶剂从相互交联的多孔网络中蒸发捧。被固定的试剂一般在形成溶液或凝胶的过 程中加入。在溶胶凝胶玻璃中，试剂被包埋在基质的孔隙中，它们可以在孔隙中 自由地移动或与孔隙内表面的硅醇基团进行某种程度上的相互作用。被测物一般 较敏感试剂半径小，它们可以扩散到孔隙中与试剂反应。另外，溶胶凝胶玻璃的 气孔率高达3 0 ，且表面积很大，所以相当部分的被固定试剂暴露于内孔腔，这 样便可以直接与那里的被测物进行反应。溶胶凝胶有许多优点： ( 1 ) 与许多有机及无机试剂相容，可以用于固定各种试剂： ( 2 ) 从化学、光学、热力学和机械稳定性等性质来讲，它均优于有机高分 子，所以适合在严酷的条件下使用 ( 3 ) 光学透明，这有利于吸光或荧光检测，许多有机高分子在紫外区有吸 收： ( 4 ) 它在低温和温和的化学条件下形成，可以包埋热稳定性和化学稳定性 差的分子( 酶分子) ； ( 5 ) 有的被包埋试剂比其在溶液中寿命长，这是由于固定基质的稳定化作 纳米增强酶生物传感器的研究第一章前言 用及试剂与孔隙内表面的硅醇基团的相互作用 ( 6 ) 含有试剂的溶胶凝胶可以加工成各种形状，或形成薄膜状或块状，或 涂与固体电极表面。 陈晓君等【2 9 】以离子交换法制得硅溶胶膜直接固定酶，简单快捷，d i 等【3 0 】以硅 溶胶凝胶法制备了第三代s o d 生物传感器，不仅实现了s o d 在电极表面的直 接电子转移，而且酶分子在硅溶胶凝胶膜内非常稳定。 1 1 5 电化学聚合法 用电化学聚合方法制备生物传感器通常在中性溶液中。在酶、聚合单体、介 体和辅酶同时存在时，通过恒电位或电位循环扫描法使单体电氧化或还原聚合在 基体电极上。聚合过程中由于吸附或静电作用，酶或介体等其它物质同时嵌人聚 合膜中。在电化学聚合生物传感器中使用的电聚高分子膜有导电的和非导电的两 大类。导电的高分子主要有：聚毗咯、聚邻苯二胺、聚苯酚及其衍生物。金利通【3 1 】 等用聚邻苯二胺固定抗坏血酸氧化酶修饰电极测定抗坏血酸。罗颖华等【3 2 1 用聚毗 咯电化学固定胆固醉氧化酶来测定胆固醇。b a r t l e t t 等【3 3 】聚苯酚及其衍生物固定 g o d 测定葡萄糖，获得了与聚邻苯二胺相似的结果，且聚苯酚的效果比其衍生物 的效果要好。聚合高分子膜还有选择性透过某些物质的功能，所以用电化学聚合 高分子膜固定酶制备生物传感器具有制作简单，响应快速，抗干扰能力强等特点， 为近年发展起来的一种非常有效的新方法。 1 1 6 分子自组装 分子自组装的是利用分子之间自发的相互识别，通过非共价键弱相互作用力 纳米增强酶生物传感器的研究第一章前言 ( 如氢键、范德华力、静电力、疏水作用力、n “堆积作用、阳离子吸附作用) 形成的具有特定排列顺序的分子聚合体。它能维持自组装体系结构的稳定性和完 整性，但也并不是所有分子都能够发生自组装。它的产生需要两个条件：自组装 的动力和导向作用。自组装的动力为分子自组装提供能量，自组装的导向作用是 指分子的空间尺寸和方向要达到重排的要求。分子自组装技术在非线性光学器件、 化学生物传感器、信息存储材料以及生物大分子合成方面有着广泛的应用前景， 故得到格外的重视【3 4 1 。 自组装膜( s a m s ) 是分子通过化学键作用自发吸附在固液或气固界面上，形成 热力学稳定和能量最低的紧密的有序的二维纳米级的超薄膜。通常在成膜分子之 间还存在范德华力的作用，它可以让所形成的膜更加稳定。s a m s 具有以下优点： 原位自发形成、热力学稳定、制作方便简单、对基底材料形状要求低、可人为地 通过合成来设计分子结构和进行分子剪裁。现在自组装成膜体系一般包括包括： ( 1 ) 有机硅烷s i 0 2 、a 1 2 0 3 、玻璃、石英、硅、云母、g e 0 2 或z n s c ； ( 2 ) 烷基硫醇金、银或铜； ( 3 ) 二羟基硫化物、二羟基二硫化物金； ( 4 ) 醇、胺铂： ( 5 ) 羧酸 a 1 2 0 3 、c u o 或a g o 等。 由于金表面硫醇自组装膜的优良性能，人们选取双官能团的含硫化合物先在金 表面形成s a m s ，再利用其另一端的官能团可将蛋白质、酶等固定在金表面获得多 层有序膜，可望用于研究膜中生物分子之间定向的电子转移、能量传递以及生物 化学传感器的设计与制造【3 5 】。以巯基化合物l - 半胱氨酸( c y s t e i n e ， c y s ) 为电子转 纳米增强酶生物传感器的研究第一章前言 移促进剂的研究报道非常多陋37 1 ，因为l 半胱氨酸分子小，很容易与金电极形成 金硫键，自组装效果非常好，在金电极与酶分子之间形成了一座桥梁，促进了电 子的转移。 1 2 纳米技术在生物传感器中的应用 固定化酶时引入纳米颗粒能够增加酶的催化活性，提高电极的响应电流值。 首先，纳米颗粒增强酶在载体表面上的固定作用；其次是定向作用，分子在定向 之后，其功能会有所改善；第三，由于金、铂纳米颗粒具有良好的导电性和宏观 隧道效应，可以作为固定化酶之间、固定化酶与电极之间有效的电子媒介体，从 而使得酶的氧化还原中心与电极闻通过金属颗粒进行电子转移成为可能，酶与电 极间可以近似看作是一种导线来联系的。这样就有效地提高了传感器的电流响应 灵敏度。 金纳米粒子( a 心_ p ) 是指直径在1 t 0 0n m 之间的金微粒，它以稳定形式存在 于溶液中。它具有比表面积大，表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高、 吸附能力强等性能。纳米金粒子因为尺寸效应所造成的表面原子配位不足，亏电 子严重，而对于生物大分子有很强的吸附能力，能高效地固定生物大分子，因此它 在设计和制备各种具有特定功能的化学传感器中具有重要意义口引。由于大多数生 物活性酶的氧化还原中心深埋于分子内部，其氧化还原中心与电极表面的距离超 过了电子能以足够速率进行转移的距离，因而很难在电极上实现直接的电子传递。 金纳米颗粒的加入可以作为电子导线，促进酶与电极的电子转移，使得酶的活性 中心与电极之间的直接电子传递成为可能。纳米金溶胶自组装技术已有很多报道， 纳米增强酶生物传感器的研究 第一章前言 这主要是它能使组装表面上的蛋白质、酶保持稳定的生物活性的同时，也使自己 保持稳定。x i a o 等【6 9 】已经成功地用纳米金溶胶固定蛋白质、酶，不仅酶的生物活 性保持完好，而且还构建了过氧化氢及一氧化氮生物传感器。基于金溶胶修饰制 得的葡萄糖传感器响应灵敏度高、快速。在电极表面修饰半胱氨酸，然后通过化 学键的作用将金溶胶吸附在电极表面，制备的测定h 2 0 2 的自组装电极，灵敏度 高，稳定性好。l i u 等【3 9 1 将纳米金粒子用于x o d 的研究制备了 p b p p y ) ( o d a u 吒o l i o i d 传感器，灵敏度高，增敏效果明显。 碳纳米管( c n t ) 是由单层或多层石墨片围绕中心轴按一定的螺旋角卷绕而 成的无缝、中空的“微管”【4 0 。4 ”，根据形成条件的不同，碳纳米管存在多壁碳纳 米管( m w n t s ) 和单壁碳纳米管( s w n t s ) 两种形式。m w n t s 一般由几层到几十 层石墨片同轴卷绕构成，层间间距为0 3 4n n l 左右，其典型的直径和长度分别为 2 3 0n r l l 和0 1 - 5 0i t m s w n t s 由单层石墨片同轴卷绕构成，其侧面由碳原子六 边形排列组成，两端由碳原子的五边形封顶。碳纳米管独特的原子结构使其表现 出金属或半导体特性h 3 1 ，利用这种独特的电子特性，可以将碳纳米管制成电极。 碳纳米管的表面效应，即直径小、表面能高、原子配位不足，使其表面原子活性 高，易与周围的其它物质发生电子传递作用，在电催化和电分析化学领域中具有 广阔的应用前景。可用于显微镜探针针尖、气相传感器、分离检测等，在修饰电 极上的应用尤为广阔。 一般认为，在碳纳米管表面引入一些电活性基团，经过活化才能有较好的电 化学响应。活化的方法一般分为两类：( 1 ) 在制成电极前对碳纳米管进行活化，包括 在气相中用空气或等离子体氧化或用酸( 主要是浓h n 0 3 ) 氧化【4 4 4 射：( 2 ) 制成电 纳米增强酶生物传感器的研究 第一章前言 极后，用电化学方法进行活化，即将碳纳米管电极在一定溶液中( 如磷酸盐缓冲溶 液) 于一定电位范围内循环扫描【4 9 】。经过活化以后，根据所用介质的不同，可以 在碳管表面引入含氧、甚至含硫的基团，一般包括羟基、羰基、羧基、酚类和醌 类化合物等【5 0 1 。这些电活性基团可以催化或促进其他物质的电子传递反应。b r i t t o 等【5 1 】首先将碳纳米管制成电极并用于对神经递质多巴胺的电催化氧化，开辟了碳 纳米管应用的新领域。d a v i s 等 5 2 1 也用类似的方法制作了碳纳米管电极。 1 3 黄嘌呤氧化酶( x o d ) 生物传感器 x o d 是一个复合型的氧化酶，它能够催化黄嘌呤的氧化，机理如下： a + x o d ( f a d h ：) - - a + x o d ( f a d ) + 2 h + x o d ( f a d ) + h x - - x a n t h i n c + x o d ( f a d h 2 ) x a m h i n c + x o d f f a d ) - - u r i ca c i d + x o d ( f a d h z ) 式中a 为电子受体，在修饰电极上即为电极本身。f a d 是黄嘌呤氧化酶的 一个辅酶，i - i x 是次黄嘌呤。黄嘌呤氧化酶不仅可以氧化次黄嘌呤还可以进一步 黄嘌呤。图1 是黄嘌呤和黄嘌呤氧酶的结构。 ：_ 。 ，tj ， 气一，：。， j ， “： c “f ：7 ：， c p h ， ，： 图i 黄嘌呤( a ) 和黄嘌呤氧化酶( b ) 的结构 f i g 1 t h es t r u c t u r eo f x a n t h i n e ( a ) a n dx a n t h i n eo x i d a s e ( b ) 1 0 纳米增强酶生物传感器的研究 第一章前言 由于黄嘌呤是人体内嘌呤核苷酸分解代谢的中间产物，其在人体体液中含量 的变化可充分反映出人体内免疫代谢等机能的状况。因此人体体液中贡嘌呤含量 的测定在医学临床上具要意义，目前在这个领域的研究比较很多。在食品分析 方面，次黄嘌呤的检测可以确定鱼肉的新鲜度。鱼死后。鱼肉中a t p 按以下顺序分 解：a t p a d p a m p i m p h x r h x 尿酸。其中，a t p 为三磷酸腺苷，a d p 为二磷酸腺苷，a m p 为一磷酸腺苷，i m p 为肌苷酸，h x r 为肌苷，h x 为次黄 嘌呤。在上述降解反应中，由肌苷到次黄嘌呤或由次黄嘌呤到尿酸的反应决定了 整个反应的速率，因此在新鲜度检测上x o d 的研究也比较多【州。 将x o d 用于传感器研究报道不多，主要有以下几个方面： ( 1 ) 直接混合型，这一类传感器大多利用酶和粉末状物质或者胶体物质结合， 如k i r 9 6 z 掣5 5 1 将x o d 与碳微粒混合，填充入玻璃管中制得x o d g c p e 电极； n i u 掣5 6 1 将x o d 以s e l g o l 方法固定于石墨粉中；c a r s o l 5 7 1 的x o d 印刷电极； s t r e d a n s k y 掣5 8 1x o d 石墨粉混合测定茶碱。虽然这类传感器可重复使用并且灵 敏度高，但是一般很难进行理论研究，大多只停留在检测这一表面。 ( 2 ) 表面固定型，这一类传感器将酶固定于电极表面，如p e i 等 s 9 l 以化学交 联法制得x o d c u p t c l 6 g c 电极对x a 、h x 均有响应，检测线性范围各自是0 6 “m 0 2m m 和0 5p m 0 2m m ，对x a 电极表观米氏常数1 1 lm m 但是电极 稳定性较差，寿命只有1 周：胡胜水等【6 0 】直接电化学聚合酶，制得x o d 微电极， 电极稳定性不佳：穆绍林等【6 1 】以电化学方法将x o d 固定于聚苯胺中，检测限2 “m ，电极稳定性4 0 天后降到6 5 ，稳定性差；x u e 等 6 2 1 也x o d 电聚合于聚吡咯 层制得x o d p p e 传感器，灵敏度不高；h u 【6 3 】等在石墨电极上将x o d 以电化 纳米增强酶生物传感器的研究 第一章前言 学方法固定于聚苯胺中，线性范围1p m 0 4m m ，检测限o 8i t m ，电极寿命1 4 天。灵敏度和寿命是这一类电极的缺点，没有两者具佳的报道。 ( 3 ) 纳米增强表面固定型，纳米粒子由于其独特的结构，能很好的作为电子 转移的促进剂，近年来也慢慢用于x o d 传感器的研究，比较多的是金纳米粒子 的报道，如z h a o 等【删制得的x o d a u n p g c 电极：a g 试等 6 5 】制得的 x o d a u n p c p e 电极；l i u 等 3 9 】的p b p p y x o d a u c 0 1 1 0 i d 传感器。c n t 用于 x o d 传感器的报道不多，林丽等惭】使用化学交联和n a i l o n 膜法制得 x o d m w n t 电极，灵敏度高，但是响应时间长2 0 3 0s 这一类传感器灵敏度 较高，是近年来研究的热门方向。 纳米增强酶生物传感器的研究第二章研究目的、对象及实施步骤 第二章研究目的、对象及实施步骤 2 1 研究目的 酶生物传感器发展异常迅速，以其专一、灵敏、快速、价廉等优点越来越b 人瞩目，在生物、临床化学和诊断、农业和畜牧兽医、化学分析、军事、过程控 制与检测、环境监控与保护等领域都有广泛的应用。目前已成为分析科学中的前 沿课题，酶的固定化一直是其研究的热门，因为传感器很多性能都取决于此。本 论文研究的目的在于将纳米技术应用于酶生物传感器的研究。为酶生物传感器的 实际应用做了进一步铺垫。 2 2 研究对象 本论文引入纳米粒子研究制备生物传感器酶。主要分以下三步 第一一步法制备h r p 酶传感器，综合自组装法、纳米技术和溶胶凝胶法 在制备生物传感器方面的诸多优点，在保持纳米金粒子对h r f 电极的增敏作用同 时有提高电极的稳定性，系统地探讨h r p 传感器的电化学行为，考察酶电极的稳 定性，并研究酶电极对h 2 0 2 的响应。既保证纳米粒子的增敏效应，又提高电极 的稳定性。 第二论文优化制备x o d m c n t g c 电极，c n t 既是电极的材料又作为酶 与电极之间的电子促进剂。研究x o d 在g c 电极上的直接电子转移，考察酶电 极的稳定性，实现酶电极对x a 的响应，利用c n t 来提高x o d 酶电极的灵敏 度。 纳米增强酶生物传感器的研究第二章研究目的、对象及实旌步骤 第三由于s o l g e l 具有生物相容性，能够提高酶电极的稳定性，实验在x o d 酶电极中引入s o l g e l ，制备x o d m c n t s 0 1 g e l g c 电极，实现对x a 的响应利 用s o l g e l 和纳米粒子的综合效应，得到符合要求的x o d 生物传感器。 2 2 研究实施的步骤 本论文分为三个阶段，分别如下： 1 h r p a u n p c y s s o l - g e l a u 电极、x o d m c n t g c 电极和x o d m c n t s o i - g e l g c 电极三种酶电极的制备。 2 酶电极的电化学行为研究 用循环伏安法研究三种酶电极的电化学行为及p h 、扫速的影响，优化电极 的制备条件，通过对比分析各组分和制备方法对酶电极灵敏度、稳定性的影响。 3 酶电极对底物的响应 将酶电极用于检测各自的对应底物，根据响应电流和底物浓度，得出电极表 面酶反应的动力学参数。 1 4 纳米增强酶生物传感器的研究 第三章实验部分 3 1 仪器 第三章实验部分 c h i 6 6 0 a 电化学工作站( 上海，辰华仪器有限公司) 三电极系统为：饱和甘汞电极作参比电极；p t 电极作辅助电极：酶电极作工 作电极； 超高速离一t l , 机( 1 2 0 0 0r r a i n ) ( 三广贸易株式会社) 超声波洗涤槽( 昆山超声波仪器厂) p h s 3 3 c 型p h 计( 上海雷磁仪器厂) 。 3 2 试剂 辣根过氧化物酶( h r p ) ，r z - 3 ，活力 2 5 0u m g ，购于上海化学试剂公司 ( 中国上海) ； 黄嘌呤a n t l 】i n e ，分子量1 5 2 1 1 ，c s h 科4 0 z ) ，f a c r oc h e m i c a l ，h o n g k o n g ； 黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n eo x i d a s e ) ，s i g m a ，e c l 1 3 2 2 ，5u n i t g r a d e1 ：f r o m b u t t e r m i l k ： l 半胱氨酸( c 3 h 7 0 2 n s ) ，购于国药集团化学试剂有限公司( 中国上海) ： 金溶胶( a u - n p ) ，苏州大学物理化学实验室提供，粒径为3 0n t tg 单壁碳纳米管( s c n t ) ，深圳纳米港公司： 多壁碳纳米管( m c n t ) ，深圳纳米港公司： 硅酸钠( n a 2 s i o y 9 h 2 0 ，a r 级) ，江苏太仓光耀试剂厂； 纳米增强酶生物传感器的研究 第三章实验部分 高纯氧化铝粉，上海试剂厂进口分装 聚乙烯醇( p v a ) ， 平均聚合度为2 4 0 0 2 5 0 0 上海试剂厂进口分装 n a 3 p 0 4 - k z h p 0 4 的缓冲溶液( p b s ) 实验用水为二次蒸馏水； 其他试剂如盐酸，硫酸，乙醇，氢氧化钠，n - n 二甲基甲酰胺( d m f ) 等均 为分析纯。 3 3 实验步骤 3 3 1 电极的预处理 金电极( 直径为3 衄实验室自制) 用2 0 0 0 目的细砂纸湿磨电极，0 3i t m 的三氧化二铝粉抛光，随后依次用无水乙醇、亚沸水超声洗涤5 分钟，最后将电 极放在0 0 5 m o l l d 的硫酸底液中，在0 2 1 3 v 的电位范围内，以0 2 vs 。的 扫描速度进行电化学预处理，至稳定的循环伏安曲线( 通常为1 0 分钟) ，备用。 玻碳电极依次用0 3i t m 和o 11 t m 三氧化二铝粉抛光后，无水乙醇和亚沸水 超声洗涤5 分钟，电极自然风干，备用。 3 3 2h r p i a u n p i c y s l a u 电极的制备 预处理后的金电极，亚沸水清洗，在1 0m m o ll - 1 的除氧l 半胱氨酸溶液中常 温下浸泡4 小时，取出，用亚沸水淋洗，除掉物理吸附l 半胱氨酸，在4 c 下放 入金溶胶中浸泡5 小时，取出，用亚沸水淋洗，最后放入3 5 m g m l “的h r p 溶 液中，4 c 下放置6 小时后得到自组装h r p 酶电极。 纳米增强酶生物传感器的研究第三章实验部分 3 3 3 h r p a u n p c y s s o l - g e i a u 电极的制备 将n a 2 s i 0 3 - 9h 2 0 置于烘箱里，调节温度到1 2 0 c ，放置约1 2 小时，得 n a 2 s i o y 3h 2 0 ，完全冷却后用3t o o ll 1 的盐酸溶液调节比重到l 3 8 过滤后得 到澄清的膜数为3 3 的水玻璃溶液。取出l m l 用水1 ：1 稀释，再经过磺酸基型 阳离子交换柱后，得到p h 为1 5 的硅溶胶，备用。 将预处理后的金电极浸入每毫升含有0 4 0m l 硅溶胶、0 2 5m l h r p ( 3 5 m g m l 。1 ) 、o 1 5m ll - 半胱氨酸( 1 0 r n m o ll 1 ) 、0 0 5m l p v a ( o 2 5 ) 、o 1 5m l 金溶胶 的均匀混合液中取出，氮气保护状态下在室温中放置6 小时，即得h r p 酶电极。 将碳纳米管在浓硝酸中浸泡1 0 小时后，1 0 0 浓硝酸回流5 6 小时。再将 得到的悬浊液离心分离、烘干，得到粉末状开管硝基化的碳纳米管。取1m g 分散 至3 m l 的n ，n 二甲基甲酰胺( d m f ) 中，备用。 取6 血碳纳米管悬浊液滴加于预处理后的玻碳电极表面，红外灯烘干，再取 0 6 u m l 。1 的x o d 溶液6u l 滴在电极表面，室温下放置干燥4 5 小时。 3 4 5 x o d c n t s o l - g e l g c 电极的制备 将6g l 碳纳米管悬浊液滴加于预处理后的玻碳电极表面，红外灯烘干，取