（生物化学与分子生物学专业论文）载脂蛋白ai的抗内毒素作用.pdf

一题垣垡e q 二! i b ! q ! 鲢i i n g g i n ! g b 4 亟鲤i d ! ：型i i y 摘要 本实验采用超速离心法制备人血浆高密度脂蛋白( h i g hd e n s i t y l i p o p r o t e i n ，h d l ) ( d = 1 0 6 3 1 2 1 0g e m 3 ) ，经过乙醇乙醚法脱脂得到 h d l 中载脂蛋白成分( a p o l i p o p r o t e i n so fh d l ，a p o h d l ) ，高效灌注色谱仪阴 离子交换树脂分离a p o h d l 各组分，收集各组分峰，经超滤离心脱盐浓缩后用 s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，s d s - p a g e ) 鉴定得到纯的a p o a i ( a p o li p o p r o t e i na 1 ) 。 分别给小鼠尾静脉注射内毒素( 1i p o p o l y s a c c h a r id e s ，l p s ) 、l p s + a p o a 1 、l p s + a p o a i + 无脂蛋白血浆( 1 i p o p r o t e i nf r e ef r a c t i o n ，l f f ， d l - 2 1 0g e 一) 后连续4 8 小时观察小鼠的死亡率和存活时间。结果表明：注 射l p s + a p o a i 组、l p s + a p o a i + l f f 组小鼠平均存活时间分别为( 4 3 2 0 1 0 1 3 ) h 、( 4 6 8 0 3 7 9 ) h ，均比注射l p s 组( 1 6 2 5 1 7 2 8 ) h 显著性增长 ( p o 0 1 ) 。l p s + a p o a i 组死亡率( 2 0 ，p o 0 5 ) 和l p s + a p o a i + l f f 组 死亡率( 1 0 ，p o 0 1 ) 明显低于l p s 组( 8 0 ) 。以上结果表明：a p o a i 具有抗内毒素的作用：l f f 增强a p o a i 对抗l p s 的作用。另外分别给小鼠尾静 脉注射l p s 、l p s + l f f ，结果l p s 组死亡率和存活时间( 1 0 0 ，6 6 7 2 2 6 h ) 与l p s + l f f 组死亡率和存活时间( 1 0 0 ，6 4 6 3 8 6h ) 无明显差别，说 明l f f 本身并不具备抗内毒素功能。 我们分别用l p s 、l p s + a p o a i 、l p s + a p o a - i + l f f 、l p s + h d l 、 l p s + h d l + l f f 刺激小鼠腹腔巨噬细胞，m 1 u r 法检测l p s 激活巨噬细胞释放的细胞 因子对l 9 2 9 细胞的杀伤作用。实验结果表明a p o a i 显著降低内毒素激活的巨 噬细胞释放的细胞因子造成l - 9 2 9 细胞的死亡率：l p s 组死亡率( 4 3 2 3 7 1 ) 和a p o a i + l p s 组死亡率( 一5 3 5 2 0 7 ) 比较，p o 0 5 。l p s + a p o a i + l f f 组( 一8 9 8 4 8 1 ) 及l p s + h d l + l f f 组( 一1 0 1 5 4 6 5 ) 都有极显著的降 低l - 9 2 9 细胞死亡率作用( p o 0 5 ) ， 说明a p o a i 是h d l 抗内毒素作用的主要承担者，l f f 可以增强a p o a i 的保护 l - 9 2 9 细胞作用。 我们用a p o a i 包被酶标板，研究异硫氰酸荧光素酯标记的内毒素 ( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e l i p o p o l y s a c c h a r i d e ，f i t c l p s ) 对a p o a i 和a p o a i + l f f 的体外结合能力，结果显示a p o a i 和a p o a - i + l f f 组均可体外 结合f i t c 标记的l p s ，a p o a i + l f f 的结合能力( 6 4 4 7 8 0 6 ) 比a p o a - 墅疃q ! b q = ! i d ! 皿! i g g 醛n s 坠血l q l i n ! ：照i i 业 i ( 2 4 3 5 + 3 7 0 ) 更显著( p 1 2 1 0g m 1 ) w e r ei s o l a t e da n dc o l l e c t e db y u l t r a c e n t r i f u g a t i o nt e c h n i q u e s h d lw a sd e l i p i d a t e db yr e g u l a rm e t h o d a p o a 1 w a si s o l a t e df r o mt h ed e l i p i d a t e dh d la p o l i p o p r o t e i n s ( a p o h d l ) u s in ga n i o n e x c h a n g ec o l u m n ( p o r o sh qc o l u m n ) o nb i o - c a dw o r k s t a t i o n p e a k sw e r ec o l l e c t e da n di d e n t i f i e db ys d s p a g e b yt h i sm e t h o d ，w e o b t a i n e dp u r ea p o a i w e i n v e s t i g a t e d i nv i v oe f f e c to fa p o a io nm o u s em o r t a l i t yr a t e a n ds u r v i v a l t i m ea f t e rl p sa d m i n i s t r a t i o n m i c ew e r ei n j e c t e dw i t h l p s 、l p s + a p o a i 、l p s + a p o a i + l f ft h r o u g h t h et a i l v e i n ，r e s p e c t i r e l y ， w ef o u n dt h a tt h em o r t a l i t yi nl p s + a p o a ig r o u p ( 2 0 ) a n di n l p s + a p o a i + l f fg r o u p ( 1 0 ) w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a n t h a ti nl p s g r o u p ( 8 0 ) ( p o 0 5 ，p o o l ，r e s p e c t i v e l y ) a n dt h es u r v i v a l t i m ei n l p s + a p o a ig r o u p ( 4 3 2 0 1 0 + 1 3h ) a n di nl p s + a p o a i + l f fg r o u p ( 4 6 8 0 3 7 9h ) w a ss i g n i f i c a n t l yl o n g e rt h a nt h a t i nl p sg r o u p ( 1 6 2 5 1 7 2 8h ) ( p o 0 1 ) o nt h eo t h e rh a n d ，m i c ew e r ei n j e c t e d w i t hl p s 、l p s + l f ft h r o u g ht h et a i lv e i n ，r e s p e c t i v e l y ，w ef o u n dt h a t t h e r ew e r en od i f f e r e n c eo ft h em o r t a l i t ya n dt h es u r v i v a l t i m e b e t w e e nb o t hg r o u p s w ea l s oi n v e s t i g a t e dp r o t e c t i n gr o l eo f a p o a ia g a i n s t c y t o t o x i c i t yo fl p s a c t i v a t e dm a c r o p h a g e s m i c em a c r o p h a g e sw e r e i n c u b a t e dw i t hl p s 、l p s + a p o a i 、l p s + a p o a i + l f f 、l p s + h d l 、l p s + h d l + l f f r e s p e c t i v e l y m t tw a su s e dt o d e t e c tt h em o r t a l i t yo fl - 9 2 9c e l l s w h i c hw e r ea t t a c k e db yr e e a s e o u to fc y t o k i n e si n l p s a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s i tw a sf o u n dt h a ta p o a 1 s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dl - 9 2 9 c e l1sm o r t a lit yc a u s e db yl p st r e a t m e n t ( l p sv sl p s + a p o a i ，p o 0 5 ) a n dt h i se f f e c tb e c a m ee v e nm o r es i g n i f i c a n tw h e nl f fw a su t 订i z e d ! 世d q = li b ! q ! ! i d g g i 鲢e d 匹q l i b ! 鲤i ! i l y ( l p sv sl p s + a p o a - i + l f f ：l p sv sl p s + h d l + l f f ，p o o l ，r e s p e c t i v e l y ) t h e r ew a sn od i f f e r e n c eb e t w e e nl p s + a p o a i + l f fa n dl p s + h d l + l f f t r e a t m e n ti n d i c a t i n ga p o a ii st h em a i nf a c t o r w ea l s oc a r r i e do u ti nv i t r ob i n d i n gs t u d yt o i n v e s t i g a t et h e b i n d i n gc a p a c i t yo fa p o a - ia n da p o a - i + l f ft of l u o r e s c e n c el a b e l e dl p s ( f i t c l p s ) a n dw ef o u n d b o t h a p o a ia n da p o a i + l f fc o u l db i n dw i t h f i t c l p s ，h o w e v e r ，t h eb i n d i n gc a p a c i t yo fa p o a i + i 。f f t of i t c l p s ( 6 4 4 7 8 0 6 ) w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fa p o a ia l o n e ( 2 4 3 5 3 7 0 ) ( p o 0 1 ) u n d e rt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ew e s a w d i r e c t l yt h eb i n d e df i t c l p so nt h es u r f a c eo fa p o a ic o a t e d p o l y s t y r e n eb e a d m i c ep e r i t o n e a lm a c r o p h a g e s ( m 由) w e r ei n c u b a t e dw i t hl p s + a p o a i 、l p s + a p o a i + l f f a n dl p sr e s p e c t i v e l y m e a s u r et h et n f a c o n c e n t r a t i o nb ye l i s ai ne a c hg r o u pw h i c hw e r es e c r e t e db ym 巾t h e t n f ns e c r e t e db ym 巾i nl p s ( o 2 垤m 1 ) g r o u pw a s1 4 1 8 2p g m l ， t h et n f - a m o u n ti nl p s ( 0 2g g m 1 ) + a p o a i ( 4 0g g m 1 ) g r o u pa n d l p s ( 0 2 扯g m 1 ) + a p o a i ( 4 0f g m 1 ) + l f f ( 1 0 0l i g m 1 ) g r o u pw e r e9 1 3 6 p g m l ，6 9 0 9p g m 1r e s p e c t i v e l y ：w ef i x e dt h e c o n c e n t r a t i o no fl p s a n dl f f w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fa p o a 1w a s1 0 0 垤m l ，t h et n f q a m o u n ti nl p s + a p o a - i g r o u pa n dl p s + a p o a - 1 + l f fg r o u pw e r e8 4 5 5 p g m l 、6 2 7 3p g m lr e s p e c t i v e l y ：w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fa p o a - 1 w a s3 0 0 腿m l ，t h et n f aa m o u n ti nl p s + a p o a ig r o u pa n dl p s + a p o a i + l f fg r o u pw e r e5 2 7 3p g m l 、4 9 5 5p g m lr e s p e c t i v e l y f r o mt h e s e r e s u l t s w ef o u n dt h a tt h ea p o a ic o u l dr e d u c et h ea m o u n t o ft n f - a w h i c hw a sr e l e a s e db yl p sa c t i v e d i 巾，a n dt h ee f f e c tw a si nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t1 ) a p o a - ih a st h ea b i l i t yt ob i n d w i t ha n dp r o t e c ta g a i n s tl p s ，a p o a - ii st h em a j o rc o n t r i b u t o rf o rh d l a n t i - e n d o t o x i nf u n c t i o n l f fe n h a n c e st h ee f f e c to fa p o a i ：2 ) a p o a - i c o u l db i n dl p sd i r e c t l y ：3 ) t h e r em a yb et w ok i n d so fl p sb i n d i n g s i t ea tl e a s t ，o n ei sp o s s i b l yl i p i db i n d i n gd o m a i no fh y d r o p h o b i c r e g i o n si na p o a ia m p h i p a t h i c q h e l i xs t r u c t u r eb yw h i c ha p o a - ib i n d s l p s ( 1 i p i da ) d i r e c t l y a n o t h e ro n e i sl b pb i n d i n gs i t ei na p o a - i ， b yw h i c ha p o a 1b i n d sl p si n d i r e c t l y 4 一 基q 瞳q ! d q = l ! 世! i p g 鹊i n ig b 4 世鲤i i q ! i i y k e yw o r d s ： a p o i p o p r o t e i n i ：1 i p o p 0 1 y s a c c h a r i d e ( l p s ) ： f i t c 1 i p o p 0 1 y s a c c h a r i d e ( f i t c l p s ) ：l - 9 2 9c e l l s m a c r o p h a g e s ： 坠瞳蜓e 堂= li n 独1 2 9 ! i 她盥i n g d 4 鲢q ! i b ! q i g i 址 日u吾 内毒素( e n d o t o x i n ) 是革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖 ( p o p o l y s a c c b a r d e ，l p s ) 成分，只有当细菌死亡裂解或用人工方法裂解细 菌后才释放出来。各种细菌内毒素的成分基本相同，都由0 特异性多糖、非特 异性核心多糖和脂质a 三部分组成，其中脂质a 是一种特殊的糖磷脂，是内毒 素的主要毒性成分“1 。各类广谱、高效的抗生素可以诱导细菌释放内毒素，如 近年来开发的三代头孢类抗生素，杀死细菌的同时释放大量内毒素，造成严重 的内毒素血症。革兰氏阴性菌引起的脓毒血症目前仍是临床上主要的死亡原因 之一。 图1 ：革兰阴性细菌模式图 内毒素较稳定，耐热，加热1 0 0 。c1 小时不被破坏，必须加热1 6 0 2 4 小时，或用强碱、强酸、强氧化剂加温煮沸3 0 分钟才被灭活。内毒素抗原性 弱，不能用甲醛脱毒成为类毒索。将内毒素注入机体可产生针对其中多糖抗原 的相应抗体，但此抗体无中和内毒索的毒性作用。各种革兰阴性菌的脂质a 化 学成分和结构虽有差异，但很相似，无种属特异性，不同细菌的内毒素所致症 状和病理变化大致相同。内毒素主要生物活性为“3 ：发热反应。内毒素的致 6 热作用主要是通过刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i s f a c t o r ，t n f ) 、自细胞介素一1 ( i n t e r l e u k i n 1 ，i l 1 ) 作用于丘脑体温调节中枢 引起。白细胞反应。人和动物注入内毒素后，血循环中的中性粒细胞数骤 降，伴以黏度增加，1 - 2 小时后中性粒细胞数又显著增多。数量减少与粒细胞 移动并黏附至组织毛细血管床有关，增多与l p s 诱生的中性粒细胞释放因子 ( n e u t r o p h i lr e l e a s i n gf a c t o r ) 刺激骨髓释放中性粒细胞进入血液有关。但 伤寒杆菌内毒素例外，始终使血循环中的白细胞数减少，其机制尚不清楚。 内毒素休克与内毒素血症。内毒素可作用于血小板、白细胞、补体系统、激肽 系统等血管活性介质释放使小血管收缩和舒张功能紊乱，导致微循环障碍。严 重时者形成以微循环衰竭和低血压为特征的内毒素休克。弥漫性血管内凝血 ( d i s s e m i n a t e di n t r a v a s c u l a rc o a g u l a t i o n 。d i c ) 。大量内毒素在体内可破 坏红细胞，作用于白细胞释放促凝物质，激活凝血系统，使血小板大量聚集， 引起广泛的血管内凝血，各种凝血因子迅速消耗引起消耗性凝血障碍，产生广 泛的出血倾向，进而各器官出现缺血性或出血性坏死，引起d i c 的发生。 s h w a r t z m a n 反应。是内毒素引起的d i c 的一种特殊表现，将内毒素注入家兔皮 内，2 4 小时后再由静脉注射内毒素，于1 0 小时左右可见第一次注射部位的皮 肤发生出血坏死，若两次均为静脉注射，家兔则出现全身反应，肾上腺皮质坏 死，动物最终死亡。以上分别称作局部和全身的s h w a r t z m a n 现象。 机体非特异性免疫( n o n s p e c ：i f i ci m m u n i t y ) ，又称先天性免疫，是与生 具有，受遗传控制，不是针对某一种细菌的特有免疫。一般在特异性免疫尚未 建立之前，即可对入侵的微生物发挥抵抗和杀伤作用。这种保护作用可以是人 体固有的( 如完整的皮肤、溶菌酶、补体) ，也可是外源物质存在或入侵的结 果( 如细胞因子、n k 细胞) 。对任何微生物而言，该防疫功能是阻挡微生物入 侵的一道防线。 当机体发生感染性炎症( 如微生物、寄生虫感染或内毒素血症) 及非感染 性炎症( 如急性胰腺炎、心肌和脑梗塞以及烧伤等组织坏死等) ，扰乱了体液 成分和吞噬细胞的防御能力后，人体产生了另一种非特异的反应，称为急性相 反应( a c u t ep h a s er e s p o n s e ，a p r ) 0 1 。a p r 过程中，巨噬细胞和中性粒细胞 被激活，产生和释放大量细胞因子( 称为细胞因子风暴) ，从而损伤组织和器 官；另外，a p r 过程中血浆淀粉样a 蛋白( s a a ) 、c 反应蛋白( c r p ) 、脂多 糖结合蛋白( l b p ) 等( 称之为急性相反应蛋白) 急剧增加，使代谢从体内平衡 状态转为防御状态”3 。 l b p ( l p sb i n d i n gp r o t e i n ) 是由肝细胞合成的6 0k d 的糖蛋白，是存 在于血浆中的一种脂质转运蛋白，正常情况下人体血浆中含量极低( o 5 7 m g l ) ，机体在a p r 时可急剧升高至5 0m g l 。3 ，它与l p s 结构中的脂质a 部分 有高度亲和性，可结合l p s 并转运到具有c d l 4 膜受体的细胞( 单核巨噬细 胞、多形核白细胞等) ，激活细胞导致细胞因子释放和机体损伤，或转运到 h d l 上形成l p s l b p h d l 复合物，中和l p s 毒性“，”。( 如图2 ) 图2 ：l p s 作用于细胞示意图 a p o a i 是h d l 的主要载脂蛋白，担负着维持脂蛋白结构、调节酶活性、 作为配体识别和结合脂蛋白受体、调控脂蛋白代谢等功能。但近年来发现， a p o a i 在人体内具有非特异性免疫功能。1 9 6 8 年s h o r e 夫妇。1 首先从人高密度脂 蛋白中分离纯化了a p o a i ，a p o a i 一直是脂蛋白研究的热点。a p o a - i 是由2 4 3 个氨基酸残基组成的单一多肽链，其中第6 6 - 1 2 1 氨基酸是由2 2 个氨基酸残基组 成的重复两性螺旋片断串联排列区域，为l c a t 激活区域；第2 2 4 - 2 4 2 氨基酸残基 片断是磷脂结合区，对维持两性螺旋结构及脂质结合是必须的。a p o a i5 5 以 上是a 螺旋，有疏水氨基酸组成螺旋的非极性面和带电荷亲水的氨基酸组成的 螺旋的极性面，因此称双性螺旋“1 。典型的双性螺旋结构为：疏水氨基酸位于 疏水面，带负电荷氨基残基位于其对称部位，带正电荷的氨基残基位于上述两 类氨基酸所在曲面交界处，带正电荷和负电荷的氨基酸残基共同形成亲水面。 正常情况下，血浆中h d l 浓度为3 0 - 8 0m g m l ，a p o a i 浓度为1 0 0 i 5 0m g m l ， 人类a p o a i 的生物半衰期为5 8 天。 国外研究报道h d l 能够结合“”并中和l p s 毒性“”1 ，w ua 等“”报道高密 度脂蛋白具有抗炎特性，在最初感染过程中表现出关键的初始非特异性免疫， 减少机体和器官的损害。h d l 和l p s 的结合一方面阻断了l p s 与靶细胞的相互 作用，另一方面作为l p s 的一种载体将l p s 转运到清除器官，从而起到中和内 毒素毒性的作用“。我们实验室“”前期研究也显示h d l 可以和l p s 结合，并且 8 是人体血浆脂蛋白主要结合l p s 成分，l d l 、v l d l 极少和l p s 结合；h d l 可以保 护小鼠免受内毒素损伤；并且h d l 可以抑制l p s 激活的巨噬细胞释放t n f n 。 有人认为“2 ”1 h d l 抗内毒素作用是由于h d l 中的磷脂与l p s 中脂质相互作用的 结果。然而u l e v i t c h 等从血浆中分离出l p s 与血浆脂蛋白形成的复合物， 证明其中的蛋白成分正是a p o a - i 。m a s s a m i r i 、p a r k 等研究显示“”1 ：a p o a i 是h d l 抗内毒素的主要功能承担者。b l a c k b u r n 等1 报道a p o a i 可以抑制中 性粒细胞脱颗粒和超氧化物产生。我们实验室对a p o a i 对中性粒细胞调节功能 的研究发现，a p o a i 能够抑制f m l p ( 受体途径激活剂) 和p m a ( 非受体途径激 活剂) 激活的中性粒细胞功能，可以抑制激活中性粒细胞与纤连蛋白的黏附、 抑制中性粒细胞超氧化物生成、减少中性粒细胞脱颗粒及炎症细胞因子的释 放，但并不影响静息中性粒细胞的功能。 ( 资料待发表) 。我们实验室还发现 ( 资料待发表) l p s 诱导急性相反应时，h d l 结构组成发生剧烈改变：s a a 替代 h d l 中的a p o a i 。“，使a p o a i 从h d l 中释放出来，由h d l 颗粒中释放出来的 a p o a i 可以行使上述的机体自我保护功能；与此同时，h d l 的脂质成分也发 生了急剧变化，h d l 的主要脂质成分由胆圆醇变成甘油三酯，同时，血浆中出 现小粒径的h d l 颗粒。h d l 甘油三酯含量的急剧升高意味着h d l 由血浆中清除 的速度加快，从而促进h d l 结合的l p s 从血浆中清除。 本文将针对a p o a 一1 是否具有抗内毒素作用及其抗内毒素的机制进行探 讨。 9 ! 垫熊世点q 垒苎二i n 鱼! 竖t i n g 丛g 垦i 鲢量旦d 鲢q 墨i 娶! 垒墨i i y 材料与仪器 一、材料与试剂 l 、冰冻人血浆 2 、聚乙二醇2 0 0 0 0 ( p e g 2 0 0 0 0 ) 3 、昆明小鼠 5 、丙烯酰胺( a c r ) 6 、甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 7 、t e m e d 8 、低分子量标准蛋白 9 、l p s 1 0 、f i t c l p s l l 、r p m i 1 6 4 0 1 2 、9 6 孔细胞培养板 1 3 、酶标板 1 3 、m t n f q 测定试剂盒 1 4 、卡介苗( b c g )( 批号2 0 0 2 0 7 0 0 1 ) 1 5 、l 9 2 9 细胞 1 6 、m t t 1 6 、m i l l i p o r e 超滤离心管 1 7 、聚苯乙烯小珠 1 8 、其余试剂均为a r 二、仪器 1 、i o o m x 超速离心机 2 、7 2 2 分光光度计 3 、垂直平板电泳槽 4 、电泳仪e p s 一3 0 0 a 5 、i m a g em a s t e rv d s - c l 6 、电热恒温水浴锅 7 、超净工作台 8 、恒温c 0 。培养箱 9 、显微镜 上海市中心血站 j a p a n 进口分装 复旦大学医学院实验动物部 s i g m a 进口分装 f l u k a 进口分装 华美生物工程公司 上海思吉生物制品有限公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 g i b c o 公司 n u n c 美国p e r k i ne l m e r 公司 d i a c l o n e 公司 上海生物制品研究所 中国科学院上海细胞生物研究所 上海思吉生物制品有限公司 美国a m i c o n 科技公司 美国p e r k i ne l m e r 公司 日立公司 上海分析仪器总厂 上海精益有机玻璃制品仪器厂 天能科技上海有限公司 s w e d e n 上海恒一科技有限公司 上海净化设备厂 n u a i r 公司 重庆光学仪器厂 1 0 1 0 、e n p e n d o f f 离心机 1 1 、酶标仪 1 2 、b i o c a d 7 0 0 e 灌注色谱仪 1 3 、l s 5 5 荧光发光分光光度仪 e n p e n d o f f 公司 b i o t e k 公司 美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司 美国p e r k i ne l m e r 公司 睦q 垃q ! p q 二! i n ! 韭墼! i g 鳇i h s l n d ! 妇l i d ! i ! i i ! ! 实验方法 超速离心分离h d l 1 1 、h d l 的分离 8 0m l 冰冻人血浆( 7 0 储存) 3 7 ( 2 水浴迅速溶解，加入4 2 gk b r ( 1 0 3 ，2 h 烘干，待冷却后用) ，缓慢搅拌至k b r 完全溶解，调节血浆密度 至1 3g c m 。离心管预先拧紧，先加入2 3 m l 填液( 2 7 9 n a c i ，3 7 2g e d t a 2 n a 2 h 2 0 ，3 0 0 0 m lh 2 0 ) ，再加调好密度的血浆l om l ，平衡后离心 ( 4 c ，1 6 6 0 0 0g ，2 2 h ，转头p 7 0 a t ) 。离心后从离心管顶部向下依次为乳白 色区带( v l d l ) ，淡黄色区带( l d l ) ，淡黄色区带( h d l ) ，底部为 l f f 。由上至下每lm l 收集一管，测密度，收集密度在1 0 6 3 1 2 1 0g e m 3 部分 的h d l 及密度大于1 2 1 0g e m 3 部分的l f f ，将分别装有i t d l 及l f f 的透析袋 放在透析液( 2 7g n a c i ，1 1 2g e d t a 2 n a - 2 h 2 0 ，3 0 0 0 m lf 1 2 0 ，o 7 5g n a n 3 ) 中透析2 天( 4 c ，每4 - - - 6 小时更换透析液) ，用聚乙二醇2 0 0 0 0 浓缩， 考马斯亮兰法测定蛋白浓度。将h d l 及l f f 分装于7 0 冰箱中储存。 1 2 、d l 的脱魔 透析后的h d l 用聚乙二醇2 0 0 0 0 浓缩至约1 0m g m l 浓度。1m l 浓h d l 于1 0 冰室中滴加入5 0 m i 脱脂溶剂( 9 5 乙醇乙醚= 3 ：2 ) ，一1 0 下，4 0 r p m 搅拌1 7 h 后，于1 0 c 、3 0 0 0r p m 离心1 5 分钟，沉淀悬浮予5m 1 乙醚 中。上清液加入3 0m 1 乙醚，继续在一1 0 下，4 0r p m 搅拌6h 后于一1 0 、 3 0 0 0r p m 离心1 5 分钟，两次沉淀合并，1 0 下，4 0r p m 搅拌过夜，氮气吹干 后1 0 保存。 二、a l m a - 1 分离纯化及鉴定 2 1b i o c a dw o r k s t a t i o np o r o s 丑q 介质装柱 1 2 壁垒垃盟垦乜垒二! i 旦q 1 9 ! i 塾g g 皇i 塾s ! 壁垫鱼坌l q 苎i n ! 立苎i i ! y 0 8gh q 粉末溶于1 2m l 的0 5m n a c l 溶液，p e e k 柱接到不锈钢装置 上，灌入介质溶液，密封、接于b i o c a d 仪器上。用o 1 m n a c l 、1 0 m l m i n 流 速灌柱约1 分钟后，流速增为2 0m l m i n 。灌柱结束后让系统静置5 分钟，以使 柱内压力缓慢释放。用5 l o 体积的去离子水冲洗柱，除去柱中甲醇，再以5 0 m mt r i s h c i 、p h8 5 缓冲液洗柱( 流速2m l m i n ) ，平衡3 小时后用标准样品 检测柱性能。 2 2 标准样品检测柱性能 样品：5 r a g m 1 b s a 和5 m g m l 卵清蛋白混合液，o 2 2 u m 滤膜过滤。 缓冲液a ：5 0m mt r i s h c i 、p h8 5 缓冲液b ：5 0m m t r i s h c i 0 5 mn a c l 、p h8 5 线性洗脱梯度：n a c i 浓度在5 分钟内从0 增加到0 5m 检测：2 8 0 n l t l 进样：2 0u1 2 3a p o a 1 分离纯化缓冲液配制 a 装柱冲洗液：o 0 5mt r i s - h c i 缓冲液( p h8 5 ) ： o 1m i r i s5 0m l 与0 1 nh c i1 4 7m l 混合后加水稀释至 1 0 0m l ，o 2 2l im 滤膜过滤、脱气。 b 平衡液( s t a r tb u f f e r ) ：5 0m mr i d s h c i - 6 mu r e a ( p h 8 2 ) 0 1m t r i s5 0 0 m l 与0 i n h c i2 2 9 “混合，加入3 6 0 3 6g 尿素，定容至1 0 0 0m 1 o 2 2um 滤膜过滤、脱气。 c 洗脱液a ：5 0m m t r i s h c i 6 mu r e a 0 8 mn a c l ( p h 3 _ 2 ) 0 1m t r i s5 0 0 m l 与o 1 n h c l2 2 9 m l 混合，加入 3 6 0 3 6g 尿素、4 6 7 5gn a c l ，定容至1 0 0 0m 1 o 2 2 t , tm 滤膜过滤、脱气。 d 洗脱液b ：5 0m mt f i s h c i 2 mn a c l ( p h8 2 ) o 1m t r i s5 0 0 m l 与o 1 n h c i2 2 9 m l 混合，加入 1 1 6 8 8g n a c l 定容至1 0 0 0 m 1 o 2 2u i i i 滤膜过滤、脱 气。 e h q 柱再生清洗液( 酸) ：1 0 m 乙酸 f h q 柱再生清洗液( 碱) ：1 0 m n a c i 一1 0 m n a o h 2 4 a p o a - 1 分离纯化 a p o h d l 溶于5 0 m m i r i s h c l 6 mu r e a ( p h8 2 ) ，配成5m g m l 浓度， 0 2 2 u i n 滤膜过滤。 h q 柱用洗脱液b 按2 c v m i n 流速洗脱10m i n ，平衡液按2c v m i n 流速平 衡2 5 m i n ，进样1 0 0 9 l 。梯度洗脱：n a c l 的浓度在1 2 分钟内从0 增加到0 8 m ，检测：2 8 0 砌，流速：3c v m i n ，按每管0 4m l 量在自动收集仪上收集流出 组分【2 2 1 。 收集的各峰分别用超滤离心管( 1 0 0 0 0m w ) 于4 c ，3 5 0 0r p m 离一i i , 1 5 分 钟。加入5 0 m m i r i s h c l ( p h8 6 ) ，4 c ，3 5 0 0r p m 离心1 5 分钟，反复3 次，达到脱盐浓缩的目的，用微量移液器小心吸t i t 脱盐浓缩后的蛋白，待s d s p a g e 电泳鉴定。 2 5 柱再生 h q 柱效下降后应进行柱再生清洗：i 至5 柱体积的碱洗，大量去离子水过 柱洗去碱，再用i 至5 柱体积的酸洗，大量去离子水过柱洗去酸后，im n a c l 平衡柱，进样前用平衡液( s t a r t b u f f e r ) 平衡柱。 2 6 a p o a i 的s d s - p a g e 鉴定 储备液配制( 4 储存) ： a 液：3 0g n 烯n n ( a c r ) ，0 8g 甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 加水至1 0 0 m l ，棕色瓶保存； 1 4 b q 缝q ! b q = li b i 世盟i g g i n s ! e n 4 鲢照i n ! ：丝i i y b 液：3 6 3g 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 用水溶解后用lm h c i 调节p h 至8 8 ，加水至1 0 0 m l ； c 液：6g t r i s 用水溶解后用lm h c i 调节p h 至6 8 ，加水至1 0 0 m l ： 1 t e m e d ：1m lt e m e d 加水至1 0 0 m l ，棕色瓶保存； 1 0 s d s ：1 0 g 十二烷基硫酸钠( s d s ) 加水至1 0 0m l ： 1 0 a p ：0 1g 过硫酸按( a p ) 用lm l 水溶解，临用前新鲜配制： 1 m t r i s - h c l ( p h 6 8 ) ：1 2 1 4gt r i s 用水溶解后用1 mh c i 调节p h 至 6 8 ，加水至1 0 0 m l ： 1 溴酚兰：o 1g 溴酚兰加水至l om l ； 电极缓冲液：3g t r i s ，1 4 4g 甘氨酸( g l y ) ，5 m l1 0 s d s ，加水至 1 0 0 0 m l ； 染色液：o 2 5g 考马斯亮蓝r - 2 5 0 ，加入4 5 4 m l5 0 乙醇和4 6 m l 冰乙 酸： 脱色液：7 5 m l 冰乙酸，8 7 5 m l 蒸馏水与5 0 i n l 乙醇混合 保存液：7 冰醋酸 经过阴离子交换柱分离制得的各组分，分别调整蛋白浓度为o 2 5m g m l ， 取上述蛋白溶液2 0 耻l ，加等体积样品溶解液( 含s d s ，巯基乙醇) 沸水浴5 分 钟，再进行s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( 浓缩胶浓度6 ，分离胶浓度1 5 ) ，同时以低分子量标准蛋白作对照。样品近阴极端，恒流2 0m a ，样品进 入分离胶后恒流4 0m a ，至溴酚兰接近底端1c m 时停止电泳，置染色液中过夜， 再用脱色液脱色。 三、a o o a - i 保护小鼠免受内毒素损伤 ( 1 ) 本校实验动物部购买昆明种雄性小鼠3 0 只，体重为8 - 1 0g 。卡介苗 粉针剂溶解于无菌生理盐水，配成2 0g l 浓度的混悬液，按0 1m l 1 0 9 体重剂 量给小鼠尾静脉注射。1 0 天后，将增敏后的小鼠随机分成3 组：每组1 0 只， ( 对照组、实验组a 和实验组b ) ；对照组小鼠尾静脉注射l p s ( 注射剂量为8 m g k g ，3 7 水浴3h ) ；实验组a 小鼠尾静脉注射l p s 与超速离心制备的 a p o a i 的混合物( 3 7 。c 水浴3h ，注射剂量为8m g k g ，a p o a i 为5 0 m g k g ) ；实验组b 小鼠尾静脉注射l p s 、超速离心制备的a p o a i 与l f f 的 混合物( 3 7 水浴3h ，l p s 注射剂量为8m g k g ，a p o a i 为5 0m g k g ，l f f 1 5 一跑瞳q ! q q = ! i n q 吐i n g g i n s ! g n