（分析化学专业论文）基于表面等离子体共振的固体支撑双层膜的研究.pdf

基于表面等离子体共振的固体支捧双层膜的研究 摘要 生物膜在生命过程中起着十分重要的作用，它与众多的生命现象密切相关。 但是，由于生物膜的组成、结构、功能的复杂性，在原位进行现场的观测和研究 十分困难，因此，生物膜的模拟及其应用对于了解生物膜的特性显得非常重要。 本论文在自制的表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 分析仪基 础上，搭建s p r 电化学联用系统，进行了固体支撑双层膜的制备及其应用的研究， 具体开展了以下工作： l 、固体支撑双层膜的制备研究 通过脂质体吸附法，制备了两种无溶剂、稳定的固体支撑双层膜，并利用s p r 电化学联用技术，分别对磷脂分子在亲水性表面和疏水性表面铺展形成磷脂膜进 行了表征。结果发现：磷脂分子在亲水性表面组装所引起的共振波长移动基本是 疏水性表面的两倍，这是与磷脂分子在两种表面铺展形成的磷脂膜层数相关；磷 脂分子在疏水性表面铺展成膜之后，使电容电流值明显降低，表明磷脂层对离子 的渗透起了阻碍作用，而在亲水性表面铺展成膜之后未见电容电流值变化，这可 能是因为在亲水性表面铺展成的磷脂膜存在较多针孔缺陷所致。固体支撑双层膜 的制备，为有关生物膜的研究提供了基础和前提。 2 、表面活性剂和有机小分子对固体支撑双层膜的影响 在第一部分研究工作的基础上，利用s p r 和交流阻抗技术，研究了表面活性 剂和有机小分子对固体支撑双层膜的影响。结果表明：有机小分子只有在高浓度 才引起磷脂膜的破坏；而表面活性剂在很低浓度就破坏了磷脂膜的完整性，使磷 脂层存在着孔洞缺陷。这是由于它们破坏磷脂膜的机理不一样：高浓度乙醇或二 甲亚砜的水溶液增大了磷脂在溶液中的溶解度，使磷脂分子从固体表面解吸；而 表面活性剂是插入到磷脂膜中，与磷脂分子形成胶束，从固体表面解吸进入溶液 中。同时还比较了a u 烷基硫醇磷脂膜和a u 羟基硫醇磷脂膜抗化学破坏的能力， 发现它们有细微的差别，主要是由于支撑磷脂膜的基底不同所引起的。研究化学 物质对磷脂膜的影响，不仅对基于模拟膜传感器的构建具有指导作用，对环境科 学和生物毒理学的研究也有重要意义。 3 、制菌霉素与固体支撑双层膜相互作用的研究 利用s p r 来研究药物与模拟生物膜的相互作用，不仅可以对其机理进行验 证，还可以快速、简单、准确地进行药物筛选和鉴定，具有许多常规技术难以比 拟的优越性。关于多烯类抗生素的作用机理一直处于争论之中：固醇是否对多烯 类抗生素与生物膜的相互作用起决定性意义。针对这一问题，利用s p r 和交流阻 抗技术，研究了制菌霉素与两种固体支撑双层膜的相互作用。结果证实：当制菌 硕士学位论文 霉素在溶液中以单体的形式存在时，不能与纯磷脂膜相互作用；当制菌霉素在溶 液中以聚集体的形式存在时，能与纯磷脂膜相互作用，形成离子通道。由此可知： 制菌霉素在溶液中的状态，对其与纯磷脂膜相互作用非常重要。 关键词：表面等离子体共振：电化学；模拟生物膜；固体支撑双层膜 量：蚕塑量苎二竺茎篓墼星竺蚤兰翌量璧望丝丝 a b s t r a c t b i o m e m b r a n e sp l a yv e r yi m p o r t a n tr o l e si nl i f ep r o c e s s ，a n dc l o s e l yr e l a t et o m a n yl i f ep h e n o m e n a h o w e v e r ，i n - s i t uo b s e r v a t i o na n di n v e s t i g a t i o no ft h e s e m e m b r a n e sa r ev e r y d i f f i c u l t ，o w i n gt o t h e c o m p l e x i t yo ft h ec o m p o n e n t s ，t h e s t r u c t u r e s ，a n dt h ef u n c t i o n so fb i o m e m b r a n e s t h e r e f o r e ，t h es i m u l a t i o no f b i o m e m b r a n e sc a nb ea d a p t e da sav e r yp r o m i s i n ga n a l y t i c a lt o o lt ou n d e r s t a n dt h e p r o p e r t yo fb i o m e m b r a n e s i nt h i st h e s i s ，b a s e do nt h eh o m e m a d es p ri n s t r u m e n t ， t h es t u d yo fs o l i d s u p p o r t e db i l a y e rm e m b r a n e sw a sc a r r i e do u tu s i n gt h ec o m b i n e d s y s t e mo fs p r a n de l e c t r o c h e m i s t r ym e a s u r e m e n t s t h eb r i e fp a r t so ft h i sw o r ka r ea s f o l l o w s ： 1 s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o no fs o l i d s u p p o r t e db i l a y e rm e m b r a n e s t w ok i n d so fs o l i d s u p p o r t e db i l a y e rm e m b r a n e sw e r ep r e p a r e db yl i p o s o m e s a d s o r p t i o n ，w h i c hw e r es t a b l e a n ds o l v e n tf r e e t h ef o r m a t i o no ft h ep h o s p h o l i p i d l a y e r so nh y d r o p h i l i ca n dh y d r o p h o b i cs u r f a c e sw a si n v e s t i g a t e du s i n gt h ec o m b i n e d t e c h n i q u e so fs p ra n de l e c t r o c h e m i s t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ev a l u eo fs p r w a v e l e n g t hs h i f ti n d u c e db yt h ea s s e m b l yo fp h o s p h o l i p i d so nh y d r o p h i l i cs u r f a c e w a sa l m o s tt w i c ea st h a to nh y d r o p h o b i cs u r f a c e ，w h i c hw a sr e l a t e dw i t ht h en u m b e r o fl i p i dl a y e r so nt h et w od i f f e r e n ts u r f a c e s m e a n w h i l e ，t h ec a p a c i t yc u r r e n tw a s r e d u c e db yt h ea d s o r p t i o no fp h o s p h o l i p i d so nh y d r o p h o b i cs u r f a c e ，i n d i c a t i n gt h e b l o c k i n gb e h a v i o ro ft h el i p i dl a y e rf o rt h ep e n e t r a t i o no fi o n s h o w e v e r ，t h ec a p a c i t y c u r r e n tw a sn o tr e d u c e db yt h ea d s o r p t i o no fp h o s p h o l i p i d so nh y d r o p h i l i es u r f a c e ， a n di tm i g h tb ed u et ot h ep i n - h o l ed e f e c t si nl i p i dm e m b r a n e s t h ep r e p a r a t i o no f s o l i d s u p p o r t e db i l a y e rm e m b r a n e so f f e r e dt h eg r o u n d w o r ka n dp r e c o n d i t i o nf o rt h e i n v e s t i g a t i o no f b i o m e m b r a n e s 2 t h ee f f e c t so fs u r f a e t a n t sa n do r g a n i cs m a l lm o l e c u l e so ns o l i d s u p p o r t e d b i l a y e rm e m b r a n e s b a e s e do nt h ef o r m a t i o no ft h e p h o s p h o l i p i dl a y e r s o nh y d r o p h i l i ca n d h y d r o p h o b i cs u r f a c e si nt h ef i r s tp a r t ，t h ee f f e c to fs u r f a c t a n t sa n do r g a n i cs m a l l m o l e c u l e so ns o l i d s u p p o r t e db i l a y e rm e m b r a n e sw a si n v e s t i g a t e db ys p ra n d i m p e d a n c em e a s u r e m e n t s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e l i p i dm e m b r a n e su s u a l l y r e m a i n e di n t a c tu n l e s si nh i g hc o n c e n t r a t i o no fo r g a n i cs m a l lm o l e c u l e s ，b u tw e r e d e s t r o y e di m m e d i a t e l y i nav e r yl o wc o n c e n t r a t i o no fs u r f a c t a n t s ，o w i n gt ot h e d i f f e r e n tm e c h a n i s mo fd e s t r o y i n gl i p i dm e m b r a n e s h i g hc o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lo r i v ， d i m e t h y l s u l f o x i d ee n h a n c e dt h es o l u b i l i t yo fp h o s p h o l i p i d sa n dm a d et h e md e s o r b f r o ms o l i ds u r f a c e ，w h i l es u r f a c t a n t si n s e r t e dl i p i dm e m b r a n e st of o r mm i c e l l e sw i t h p h o s p h o l i p i d sa n dt h em i c e l l e sl e a v et h es o l i ds u r f a c ea n de n t e rt h es o l u t i o n a tt h e s a m et i m e ，af e wd i s t i n c t i o n sw e r eo b s e r v e di nt h er e s i s t a n c et oc h e m i c a l sd e s t r u c t i o n b e t w e e na u a l k a n e t h i o l p h o s p h o l i p i dm e m b r a n ea n da u h y d r o x y t h i o l p h o s p h o l i p i d m e m b r a n e ，d u et ot h ed i f f e r e n tf u n d sf o rs u p p o r t i n gp h o s p h o l i p i dm e m b r a n e s t h e i n v e s t i g a t i o na b o u tt h ee f f e c to fc h e m i c a l so nl i p i dm e m b r a n e sn o to n l ya f f o r d e dt h e g u i d a n c ef o rd e s i g n i n gs e n s o r sb a s e do nm e m b r a n e s ，b u ta l s oh a di m p o r t a n ts e n s ef o r t h es t u d yo fe n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n db i o t o x i c o l o g y 3 r e s e a r c ho ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nn y s t a t i na n ds o i i d s u p p o r t e db i l a y e r m e m b r a n e s t os t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd r u g sa n dm i m e t i cb i o m e m b r a n e sw i t hs p rw a s n o to n l ya b l et ov a l i d a t ei t sm e c h a n i s m ，b u ta l s oa b l et os e l e c ta n dj u d g ed r u g sw i t h s p e e d ，s i m p l i c i t ya n ds e n s i t i v i t yi nc o n t r a s tt oc o m m o nt e c h n i q u e s t h e r ew a sa d e b a t et h a tw h e t h e rs t e r o lp l a y e dac r u c i a lr o l ei nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np o l y e n e a n t i b i o t i c sa n db i o m e m b r a n e sa l lt h et i m e s a i m i n ga tt h i sp r o b l e m ，w eu s e ds p ra n d i m p e d a n c e t o i n v e s t i g a t et h e i n t e r a c t i o nb e t w e e n n y s t a t i n a n dt w ok i n d so f s o l i d s u p p o r t e db i l a y e rm e m b r a n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn y s t a t i nd i dn o ti n t e r a c t w i t hp u r ep h o s p h o l i p i dm e m b r a n e si nm o n o m e rs t a t e ，b u ti n t e r a c t e dw i t ht h e m e m b r a n e st of o r mi o nc h a n n e l si na g g r e g a t i o ns t a t e i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h es t a t e o fn y s t a t i ni ns o l u t i o nw a sv e r yi m p o r t a n tf o rt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nn y s t a t i na n d p u r ep h o s p h o l i p i dm e m b r a n e s k e y w o r d s ： s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e ；e l e c t r o c h e m i s t r y ； m i m e t i c b i o m e m b r a n e s ；s o l i d - s u p p o r t e db i l a y e rm e m b r a n e s v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：；王；日期：w 年2 - 月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“寸) 作者签名： 导师签名： ；皂f l 弓础 彳。，给 e t 期：o o 年月r 日 日期：岬年止月r 日 硕士学位论文 第1 章绪论 生命是迄今为止人们发现的自然界中最为复杂和奇妙的现象。细胞作为生命 形态的结构和生命活动的基本单位，得到了人们的密切关注。而生物膜是细胞的 基本结构，它独特的结构和功能，将细胞中的生命物质与外界环境分隔开，维持 着细胞特有的微环境，使细胞成为一个相对独立的生命体。生物膜同时又介导着 细胞与外界环境以及细胞与细胞之间的物质交换、能量传导和信号传递，使细胞 与环境成为一个有机的整体【1 1 。可以说，几乎所有的生命过程都与生物膜有关； 反之，如果生物膜受到损伤，将会引起机体内许多的疾病。例如，神经节苷脂 ( g a n g l i o s i d e s ，g g ) 是大多数哺乳动物细胞膜的组成成分，广泛存在于中枢神经系 统，当中枢神经受损后，外源性g g 易通过血脑脊液屏障，聚集到受损脑区，与 受损组织有高度亲和力，模仿内源性g g 的某些功能，不仅可稳定胞浆膜的各种 酶活性，还可提高局部脑血流，恢复受损组织形态等【2 】。因此，生物膜的研究将 为许多疾病诊断与治疗提供新的途径。 然而生物膜的组成、结构和功能极为复杂，要直接研究膜上所发生的各种过 程显然非常困难。因此，生物膜的模拟及其应用十分重要1 3 】。模拟生物膜的研究 可以使我们在分子水平上研究单个膜组分的结构和性能。 六十年代初，m u l l e r 等【4 1 成功地构造了分割两个水溶液的人工自组装平板双 层类脂膜( p l a n eb i l a y e rl i p i dm e m b r a n e ，简称b l m ) 。这种膜与细胞生物膜的组成 和性质相似，是一种可用于研究的模拟生物膜。这种非支撑b l m 和以后相继出 现的支撑b l m ，为人们对生物膜的研究提供了有力的手段。人们模拟生物膜的特 点，制备具有不同功能的模拟膜，已解决其他方法难以奏效的复杂问题，如s u i 等【5 1 不仅定量地测量了胰岛素与固体支撑双层膜上受体的结合，并且还测定了该 受体具有结合常数不同的两个配体结合位点。 1 1 生物膜的化学组成、结构及性质 1 1 1 生物膜的化学组成 虽然不同的生物膜有着不同的生物功能，但它们在化学组成上却有着很多的 共同性，主要化学成分是蛋白质和脂类，也含有少量的糖。几种生物膜的化学组 成见表1 1 1 6 1 。脂类是一些溶于有机溶剂而不溶于水的大分子，在膜中主要起基础 结构作用。多数膜蛋白是酶、受体或通道，具有一定的生物功能，在细胞与外界 物质和信息的交换中起着重要作用。糖类多以复合物形式存在，通过共价键与某 些脂类或蛋白组成糖脂和糖蛋白。除上述成分以外，生物膜还含一定的水分，水 基于表面等高于体共振的固体支撑双层膜的研究 与膜紧密结合，也是维持膜结构所必需的。 表i 1 几种生物膜的化学组成【6 】 t a b l e1 1t h ec h e m i c a lc o n s t i t u t eo f s o m cm e m b r a n e s l 6 1 p c ：磷脂酰胆碱；p e ：磷脂酰乙醇胺；p s ：磷脂酰丝氨酸；p i ：磷脂酰肌醇；p g ：磷脂酰 甘油；c l ：二磷脂酰甘油；s m ：神经鞘磷脂 1 1 1 1 脂类 细胞膜中含有两种脂类，一种是非极性脂质，例如由脂肪酸与甘油酯化所形 成的三酯，它们是一类疏水性的物质，称为真脂；另一类属极性脂质，这种脂质 分子具有一个亲水的头部( 即极性端) 和一个疏水的尾部( 即非极性端) ，因此 具有两性的特点，被称为类脂。生物膜中一般不含有非极性脂类；磷脂 ( p h o s p h o l i p i d ) 、糖脂( g l y c o l i p i d ) 和固醇( s t e r 0 1 ) 三种极性脂质，是构成生物 膜总体结构的主要成分【6 】。 1 1 1 2 膜蛋白 脂类是生物膜的基本骨架，膜蛋白则是生物膜功能的主要执行者。膜蛋白具 有的生理功能包括：( 1 ) 选择性离子通透；( 2 ) 进行能量的转换；( 3 ) 响应细 硕士学位论文 胞膜一侧的信号，并将其传递到膜的另一侧；( 4 ) 形成可溶性代谢物( 葡萄糖和 氨基酸) 的跨膜转运系统：( 5 ) 通过与细胞骨架中的非膜结合大分子以及胞外基 质的相互作用来调节细胞的形态结构 。不同生物膜由于所含蛋白质的不同，而 具有明显不同的功能，如髓鞘膜主要使神经绝缘，其总量的2 5 为蛋白质：而能 量转换膜( 如线粒体内膜和叶绿体) 的蛋白质含量为7 5 【6 】。 根据将膜蛋白从膜上释放出来的方法的不同和膜蛋白与膜脂相互作用方式以 及在膜中排列部位的不同，膜蛋白可分为两类：( 1 ) 膜外周蛋白( p e r i p h e r a l p r o t e i n ) ，分布在膜的外表面，可通过改变p h 或离子强度而从膜上去除，同时 脂双层的结构不被破坏；( 2 ) 膜整合蛋白( i n t e g r a lp r o t e i n ) ，插入或跨越膜， 只有通过去污剂把膜溶解才能从膜上去除。近年来，人们发现了一种不属于上述 两类的膜蛋白，这类蛋白通过与膜脂的共价连接而锚定在膜上。虽然这类蛋白的 肽链位于膜的外周，但通过改变p h 或离子强度并不能将其从膜上去除。我们称 这类蛋白为脂锚定蛋白( 1 i p i d a n c h o r e d p r o t e i n ) b l o 1 1 1 3 糖类 生物膜中的糖类含量较少，主要是以寡糖侧链与膜蛋白通过共价键结合，形 成糖蛋白，也有少数与神经酰胺或甘油脂形成糖脂。 1 1 2 生物膜的结构 脂类、蛋白质和糖类物质在膜中的存在形式和排列方式决定着生物膜的各种 基本生物学特征。研究表明，各种物质，特别是大分子在生物膜结构中特殊的有 序排列，是各种生命现象的基础。研究也表明，膜脂、膜蛋白以及膜上糖基在分 布上都具有两侧不对称性，正是由于这种不对称性才使膜具有方向性这一功能， 这是生物膜发挥作用所必须的。人们对生物膜的认识经历了一个漫长的过程，2 0 世纪初期人们就提出了有关生物膜的分子结构的各种假说，其中得到较多实验室 支持并为大多数人所接受的是由s j s i n g l e 和g l n i c o l n s i n 于1 9 7 2 年提出的 “流动镶嵌模型”( 如图1 1 所示) 【l j 。 流动镶嵌模型的基本概念认为：膜基本结构的重复单位是脂类分子的双层排 列，膜蛋白质分子以镶嵌的形式不同程度地与脂类双分子层( 脂双层) 结合。此 模型首先强调膜的流动性，它认为脂双层构不是固定不变的，而是一种具有流动 性特点的结构，即脂类分子与蛋白质分子总是处于流动变化之中：其次该模型强 调了脂类分子与蛋白质分子之问的镶嵌关系，即蛋白质分子可以完全穿过脂双层， 也可以部分插入脂双层。此外，该模型还指出了生物膜各种化学成分的分布是高 度不对称的。 基于表面等离子体共振的固体支撑双层膜的研究 图1 i 生物膜的流动镶嵌模型【l l f i g 1 1s c h e m a t i co ff l u i dm o s a i cm o d e lf o rb i o m e m b r a n e 【 1 1 3 生物膜的性质 1 1 3 1 膜的流动性 所谓生物膜的流动性是指它的组成成分的代谢更新、分子运动以及状态的改 变，主要体现为膜中脂类的流动性和膜蛋白的运动性。许多物理学和生物学的方 法都证明了膜的流动性是膜结构的一个基本特征，生物膜的整个结构是动态的而 非静止不动的，这也是膜行使多种功能的重要体现。它使细胞内的代谢活动顺利 进行，它影响酶的功能、受体的运动和功能，还与其他诸如免疫、细胞分裂和发 育、衰老、疾病等生命活动有密切关系。c r e m e r 等1 7 】用荧光方法验证了脂类的侧 向流动性，如图1 2 所示。 图1 2 双层膜的分割、电泳和愈合过程【7 1 f i g 1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h eb i l a y e rp a r t i t i o n i n g ， e l e c t r o p h o r e s i sa n dh e a l i n gp r o c e s s e s 7 i 硕上学位论文 1 1 3 2 膜的通透性 双层类脂膜是半通透性膜，不同分子的扩散速率和离子穿过膜的速率有极大 的不同【8 】。通透性大小的一般规律是：( 1 ) 脂溶性分子比水溶性分子容易透过； ( 2 ) 非极性分子比极性分子容易透过：( 3 ) 小分子比大分子容易透过。例如， 非极性小分子，0 2 、c 0 2 、n 2 可以很快透过脂双层；极性小分子，如水、尿素、 甘油等也可以透过脂双层，尽管速度较慢；分子量略大一点极性分子，葡萄糖、 蔗糖则很难透过脂双层。而带电荷的物质，如h + 、n a + 、k + 、c i 、h c o f 是高度 不通透的( 图1 3 ) 。 图1 3 生物膜的通透性1 1 1 f i g 1 3s c h e m a t i co f t h ep e n e t r a t i o no f b i o m e m b r a n e i l j 1 2 生物膜的模型及应用 生物膜的组成、结构和功能极为复杂，要深入研究膜上的各种过程显然非常 的困难。我们知道，构成生物膜的主要两类化合物是脂类和蛋白质，而生物膜特 有的脂双层结构与生命中物质流、能量流和信息流三大体系的运输、转换和传递 密切相关，生物膜模拟体系的构建就基于这一特点，对复杂的生物膜进行了简化， 但同时又保持了脂双层的基本特性。生物膜的转运功能、脂类的作用以及脂类和 蛋白质的相互作用都可以通过模拟膜体系的研究得以阐明，因此模拟膜体系的研 究越来越受到人们的重视。+ 长期以来化学家和生物学家也为此做出了不懈努力， 目前使用的模拟体系有脂质体( 1 i p o s o m e ) 、l a n g m i u r b l o d g e t t ( l b ) 膜、乎板双 层类脂膜( p l a n n e rb i l a y e rl i p i dm e m b r a n e ，简称b l m ) 。 基于表面等离子体共振的同体支撑双层膜的研究 1 2 1 脂质体模型 脂质体( 1 i p o s o m e ) ，或称囊泡，由类脂双分子层将水相分隔为内、外两部分 的模型膜体系，这是一种封闭的脂双层结构。脂质体是1 9 6 5 年英国学者b a n g h a m 等将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现并命名的，由于脂质体的结构类似于生 物膜，最初它主要作为生物膜模型用于生物膜结构和功能关系的研究；1 9 7 2 年 r r e g o r i a d i s 等将脂质体用作药物载体以来，它作为一种新型的药物载体在医药等 领域的研究取得了飞速的进展并被广泛应用1 9 j 。随着分子生物学和生物工程学的 飞速发展，脂质体与日新月异的基因工程相结合，作为基因转移的载体和手段， 用于基因疗法和基因产物的分离。 当类脂分子分散在水相时，依靠疏水缔合作用在水中自发形成一种有序的分 子组合体，通常为各种大小混杂的囊泡结构l l 们。其中最多的是呈同心球壳的多层 囊泡，每层均为类脂双分子膜，层间和脂质体内核均为水相，双分子膜间为油相， 被称为多片层脂质体( m u l t i l a m e u a r v e s i c l e s ，简称m l v ) ，其大小不均匀，直径 约为0 2 1 0p m 。将m l v 悬浮液作超声处理后，m l v 变为单个双分子层结构， 直径小于2 0 0n m ，称为小单片层脂质体( s m a l lu n i l a m e l l a rv e s i c l e s ，简称s u v ) 。 近年来，又研制出了直径2 0 0 1 0 0 01 1 1 1 1 的大单片层脂质体( 1 a r g eu n i l a m e l l a r v e s i c l e s ，简称l u v ) 。三种脂质体的结构见图1 4 所示，制备脂质体的方法主要 有：注入法、薄膜分散法、超声波分散法、冷冻干燥法、逆相蒸发法等【1 1 1 。 埘 围1 4 三种脂质体的结构【6 i f i g 1 4t h es t r u c t u r eo f t h r e ek i n d so f l i p o s o m e l 6 脂质体都是包含有水室的封闭双层膜结构，在模拟膜体系中，脂质体和活细 胞形式最为接近，可以作为一种生物膜的简单模型。l i u 等【1 2 1 以铂的复合物与脂 质体相互作用为模型，探讨抗癌药物与细胞的作用机理。t a m b a 等1 1 3 1 以大型脂质 体为生物膜模型，研究抗菌肽链m a g a i n i n2 与脂质体的相互作用，发现脂质体并 没有溶解，但引起了脂质体内荧光探针的泄漏，说a 拥m a g a i n i n2 在脂双层结构中 形成了膜通道。为了更好地理解细胞膜的渗透性，w i l l i a m s 等 1 4 1 现p h o s p h o l i p a s e a 2 ( p l a 2 ) 会引起脂质体的溶解，导致荧光物质的释放，如图1 5 所示。 图1 5 固体支撑的脂质体阐明了p l a 2 溶解活性引起了荧光团的释放【“】 f i g 1 5s c h e m a t i co ft h es o l i d s u p p o r t e db i l a y e rv e s i c l ei l l u s t r a t i n gt h el y s i sa c t i o no f p l a 2o nt h em e m b r a n ec a u s i n gt h er e l e a s eo ft h ee n c a p s u l a t e df l u o r o p h o r e l 州 1 2 2 类脂l a n g m i u r - b l o d g e t t 膜模型 l a n g m u i r - b l o d g e t t ( l b ) 膜的制作：将两性的类脂溶于易挥发的有机溶剂中， 铺展在平静的气水界面上，待溶剂挥发后沿水面横向施加一定的表面压，这样类 脂分子便在水面上形成紧密排列的有序单分子膜( 如图1 6 所示) 1 6 1 。形成的膜 也可以转移到固体基底上。 拴膜杆 器 图1 6 类脂l b 膜示意图【6 i f i g 1 6s c h e m a t i co fl - bm e m b r a n e l 6 尽管l b 膜是单层膜，但是它作为生物膜最简单的模型系统，一直受至0 人们 的极大重视。蛋白质和糖类等各种生物大分子( 如抗体、受体、离子通道等) 可 基于表面等离子体共振的固体支撑双层膜的研究 以镶嵌到单分子层中，在水亚相中也可以加入各种离子和蛋白质等成分来模拟细 胞膜的内外环境。用膜天平测定的表面压面积等温曲线，能够对类脂的微小结构 变化做出响应，提供分子排列和取向的准确信息，并且可以帮助了解膜的流动性 以及溶解于膜中的物质( 如蛋白质) 与成膜分子相互作用情况。把l b 膜转移到 基底上，借助表面敏感技术可以研究膜构象的变化，以及蛋白质、药物与膜之间 的相互作用i ”，1 6 】。还可以利用l b 膜模拟一种生理环境，研究其他生物分子问的 相互作用7 强j 。 1 2 3 平板双层类脂膜模型 球形脂质体不便于电化学和电学测量，但平板双层类脂膜恰好能弥补这一不 足，一般稳定的平板双层类脂膜的膜电容为o 3 1 3p f c m 2 ，膜电阻为1 0 3 1 0 9 f l c m 2 1 1 9 】。平板双层类脂膜可分为非支撑平板双层类脂膜和支撑平板双层类脂膜。 1 2 3 1 非支撑平板双层类脂膜 最早被研究的平板双层膜就是非支撑平板双层膜。m u l l e r 等【4 】描述了在水相 中成功制作平板双层膜的方法，并初步研究了这种膜的电化学性质，从此开辟了 用生物膜的简单模型来研究复杂生物膜结构与功能的新途径。其制备过程为：在 一个有机玻璃材料制作的实验槽内，中间以强疏水性的聚四氟乙烯材料做的隔板 ( b l m 支持物) 隔开，将槽分为两室，隔板中间预先开一个小圆孔，孔的面积一 般不超过0 2 5c m 2 。在槽内加入所需的水溶液，把小孔浸没，然后将一滴类脂成 膜液加到小孔中( 用毛刷或微量进样器) 。由于隔板具有极好的亲脂性，故脂滴 比较容易在小孔的四周附着并扩散到整个孔，随着脂滴从中间慢慢变薄，最后可 形成双分子层。当类脂膜为双分子层时，在显微镜下呈现黑色( 由于膜的厚度小 于可见光波长的缘故) ，所以这种膜又称为黑膜。一般可认为，b l m 形成后，其 电容值在o 5p f c m 2 左右，这个电容值可作为b l m 是否形成的一个判据。 生物膜的脂双层是内外不对称的，膜两侧的溶液也是不对称的，为了更好地 模拟生物膜，通过将前面的方法加以改进，也可得到非对称性的类脂双层膜，所 以这种非支撑平板b l m 与细胞膜也非常的接近。因此，在非支撑平板b l m 上开 展的各种研究一直经久不衰，直到9 0 年代，仍有许多报道，主要利用该生物膜模 型来研究了膜电位、膜通道蛋白、细胞色素的光电反应以及氧化还原对的电子传 递过程、配体受体的相互作用等 2 0 l 。 尽管以非支撑平板b l m 为生物膜模型开展了许多研究，取得了一些有意义 的结果，但是，在两个分隔的水相之间所形成的双层类脂膜极不稳定，轻微的机 械扰动就会使膜破坏：膜的寿命也非常的短，一般只有几个小时到十几个小时。 出于延长b l m 寿命的考虑，也为了进一步向实用方向发展，因此在2 0 世纪八十 年代初，固体支撑双层类脂膜( s u p p o r t e db i l a y e rl i p i dm e m b r a n e ，简称s b l m ) 硕士学位论文 应运而生。 1 2 3 2 支撑平板双层类脂膜 。 1 9 8 1 年，t s c h a m e r 和m c c o n n e l l l 2 l 】首先制备出烷基化的疏水基底支撑的双层 膜。他们先将玻璃片用硅烷烷基化，再沉积上磷脂单层。类脂单层沉积采用l b 法，用d i p p i n g 方式将玻片从上向下，浸入水面上铺有类脂单层的槽内，即形成 硅烷类脂双层。1 9 8 4 年h o r n 等1 2 2 j 将新解离的云母片浸入含有脂质体的溶液中， 脂质体会吸附于云母片上，然后打开，最后完全铺展于云母片上形成类脂双层。 1 9 8 5 年，m c c o n n e l l 等【2 3 l 将玻片和石英片经亲水处理后，采用l b 法连续两次将 类脂沉积在基底上，形成双层类脂膜。1 9 9 1 年k a l b 等【2 4 】采用类似的方法将石英 片亲水处理，然后用l b 法将单层类脂沉积在基底，使石英表面烷基化，再将石 英片泡在脂质体溶液中，就可以形成双层类脂膜。 1 9 8 9 年，t i e n 等【2 5 】在金属( 包括p t ，a g 等) 的新生表面上自组装形成了支撑 双层类脂膜，发现稳定性得到很大改善。其制备的方法是：将新劈开的金属表面 浸入成膜液中一段时间，类脂分子与新劈开的金属表面接触，具有两亲基团的类 脂分子将在剖面上发生定向吸附，其极性基团不可逆地结合到金属表面，疏水的 非极性基指向有机相，当转移到水相中时，类脂分子再次在有机相水相界面上取 向，自组装形成双分子层类脂膜。尽管这种方法的使用不是很普遍，但已显示出 较强的生命力，除了可用作传感器之外，在研究蛋白质的直接电化学方面也有其 独到之处。 在金属表面自组装形成双层类脂膜的关键是基底的更新与平整，人们大多采 用切割的方法来获取新鲜的表面，这虽然能够保证基底的新鲜，但是却很难保证 有原子级平整度的基底，导致双层类脂膜有严重的缺陷，在电子的跨膜转移研究 中遇到了极大的困难。然而，含硫化合物特别是硫醇在金基底上形成的自组装单 分子层( s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ，简称s a m ) 具有良好的稳定性、致密性、有序 性，因此在金属基底上制备硫醇类脂膜也日益引起人们的重视。1 9 9 3 年，s t e l z l e 等【2 6 】报导了：首先通过硫醇自组装方法在金表面形成烷基化的s a m ，然后脂质 体吸附并铺展于烷基化的s a m 表面，形成支撑双层类脂膜。类脂膜在固体表面 的形成，除了采用脂质体吸附法和l b 膜法外，f l o r i n 和g a u b 2 7 1 报导了一种更为 简单的涂抹法，将类脂的癸烷溶液直接涂抹在烷基化的金电极表面，几分钟后， 在电化学池中士l o o m v 的电位窗内连续扫描以促进类脂单层的形成，并用光学显 微镜观察了膜的形成过程。 在过去几十年中，固体支撑膜体系已经发展得相当成熟【2 引，包括固体支撑的 类脂双层膜、多聚物支撑的类脂双层膜、杂化双层膜、锚定的类脂双层膜、悬浮 的类脂双层膜以及支撑的囊泡层等( 如图1 7 所示) 。还在金纳米颗粒 2 9 1 和硅纳 童三耋璺要兰：丝苎耋丝塑兰吝耋登星墨墼兰釜 米颗粒3 0 l 表面成功地制备了类脂膜。 图1 7 固定于表面的生物膜模型1 2 。i ( a ) 固体支撑的类脂双层膜；( b ) 多聚物支撑的类脂双层膜；( c ) 杂化双层膜，含 有自组装单层膜( 硫醇键合在金上或者硅烷键合在玻片或硅片上) 和类脂单层； ( d ) 锚定的类脂双层膜：( e ) 自由悬浮的类脂双层膜：( f g ) 支撑的囊泡层 f i g 1 7s u r f a c e c o n f i n e dm e m b r a n em o d e l s t “j ( a ) s 0 1 d s u p p o n e dl i p i db i l a y e r ；( b ) p o l y m e r c u s h i o n e dl i p i db i l a y e r ；( c ) h y b d d b i l a y e r 。c o n s i s t i n go fas e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ( t h i o l so f ta uo rs i l a n e so ng l a s s o rs i l i c a ) a n dal i p i dm o n o l a y e r ；( d ) t e t h e r e