（分析化学专业论文）四环素类药物的色谱分析和重叠色谱信号处理方法的研究.pdf

里型兰垫查盔兰堕主兰壁垒奎j ! 里 中文摘要 四环素类抗生素以其广谱抗菌作用和重要的经济价值被广泛应用于临床治 疗和疾病的预防，抗生素的出现为人类的防病治病等方面起到了重要的作用， 但也给人类带来了一定的危害，比如动物性食品中抗生素的残留。因此，痕量 四环素类抗生素的分析检测具有重要的意义。本文以7 种四环素类药物为研究 对象，对四环素类药物的色谱分析方法进行了研究。 论文采用反相高效液相色谱模式，提出用c 。柱为固定相，甲醇一乙腈一草酸 三元混合溶液为流动相的色谱分离体系，研究了流动相的组成、浓度、p h 值以 及紫外检测波长等因素对分离度和灵敏度的影响，建立了种简便、快速、灵 敏的r p h p l c 法，能同时分离和测定七种四环素类药物，并适用于实际样品 的分析。 7 基于在色谱分离过程中，流动相的梯度洗脱模式可改善复杂样品的分离度、 缩溢分析周期、改善峰形和提高灵敏度的特点，以甲醇乙腈一草酸为流动相， 探讨了不同的梯度洗脱条件对七种四环素类药物分离的影响，确定了最佳的梯 度洗脱条件，在1 0 m i n 内分离检测了七种四环素类药物。通过标准加入法定量， 得到了满意的结果。该方法具有快速、灵敏的特点。 为了解决四环素类药物测定过程中的互变异构体相互干扰问题，将免疫一遗 传算法用于互变异构体重叠色谱信号的快速解析与各成分的定量分析。结果表 明该方法可将完全重叠的互变异构体信号相互分离，且可同时得到各成分的定 量信息。对多西环素、差相脱水四环素、脱水四环素的混合物重叠色谱信号的 解析结果表明，该方法为复杂体系的信号解析提供了一种有效手段。、l j 一， 中国科学技术大学硕士学位论文 a b s t r a c t 摘要 t e t r a c y c l i n e a n t i b i o t i c s ( t c s ) a r ee x t e n s i v e l y u t i l i z e df o rt h e p r e v e n t i o n a n d c o n t r o lo fd i s e a s ea n da sf e e da d d i t i v e st op r o m o t ew e i g h tg a i na n di n c r e a s ef e e d c o n v e r s i o ne f f i c i e n c yb e c a u s eo ft h eb r o a ds p e c t r u ma n t i b i o t i c sa n dt h e i re c o n o m i c a l a d v a n t a g e sh o w e v e l t h ew i d e s p r e a du t i l i z a t i o no ft c sa l s or e s u l t si nac e r t a i nh a r m t o u s ，s u c h a st h er e s i d u e si nf o o ds oa c c u r a t e m o n i t o r i n go ft r a c e l e v e l so f t e t r a c y c l i n e a n t i b i o t i c sa n dt h e i rm e t a b o l i t e sh a sa ni m p o r t a n tv a l u ef o rt h ep u b l i c h e a l t hi nt h ed i s s e r t a t i o n ，w ec o n c e n t r a t e do nt h i s p r o b l e m a n d t e t r a c y c l i n e ， o x y t e t r a c y c l i n e ，c h l o r t e t r a c y c l i n e ，d o x y c y c l i n e ，m e t h a c y c l i n e ，a n h y d r o t e t r a c y c l i n e a n d 4 - e p i a n h y d r o t e t r a c y c l i n ew e r ec h o s e n a st h eo b j e c t i v eo f t h e s t u d y t h er e v e r s e d p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yf o rc o n v e n t i o n a l a n a l y s i sp u r p o s ew a sd e v e l o p e do nc l8 c o l u m nu s i n gm e t h a n o l a c e t o n i t r i l e o x a l i c a c i ds o l u t i o ne f f e c t so fe l u t i o nc o m p o s i t i o n ，t y p e sa n dc o n c e n t r a t i o no fm o b i l e p h a s e a d d i t i v e s ，p h o fm o b i l e p h a s e ，a n d d e t e c t i o n w a v e l e n g t h o nt h e r e s p o n s e a n d r e t e n t i o nw e r es t u d i e da s i m p l ea n ds e n s i t i v er p h p l cm e t h o dw a sp r o p o s e dt ot h e s u c c e s s f u l l ys e p a r a t i o na n ds i m u l t a n e o u sd e t e c t i o no f 7t e si tw a sp r o v e nt h a tt h e m e t h o di ss u i t a b l ef o rt h ea n a l y s i so f p r a c t i c a ls a m p l e b a s e do nt h ea d v a n t a g eo ft h eb e t t e r s e p a r a t i n gr e s u l t ，s h o r ta n a l y t i c a lc y c l e ， i m p r o v e dp e a ks h a p ea n du p p e rr e s p o n s eo fg r a d i e n te l u t i o ni nt h e p r o c e s s o f c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n ，t h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n tg r a d i e n te l u t i o np r o g r a m so n t h e s e p a r a t i o n o ft c sw e r e i n v e s t i g a t e d t h e s e p a r a t i o nc o n d i t i o n o ft c sw a s o p t i m i z e dw h e nt h e m o b i l ep h a s ew a st h em i x t u r eo fm e t h a n o l a c e t o n i t r i l e o x a l i c a c i ds o l u t i o n c o m p l e t es e p a r a t i o no fs e v e nt c sw a sa c h i e v e dw i t h i n10r a i nt h e p r a c t i c a ls a m p l e sw e r eq u a n t i f i e db ys t a n d a r da d d e dm e t h o d 1 i i ! 里型堂垫查奎兰堡主堂垡丝奎 ! ! 兰 i no r d e rt os o l v et h ei n t e r f e r e n t i a lq u e s t i o nb r o u g h tb ye n a n t i o t r o p i ci s o m e r si nt h e p r o c e s s o f t h ed e t e r m i n a t i o no f t c s 、a ni m m u n ea l g o r i t h m g e n e t i ca l g o r i t h m ( i a - g a ) w a sa p p l i e dt ot h ef a s tr e s o l u t i o na n dq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no ft h eo v e r l a p p i n g h p l cs i g n a l so fe n a n t i o t r o p i ci s o m e r s i tw a sp r o v e nt h a tc o m p l e t e l yo v e r l a p p i n g - i p l cs i g n a l so f t h ee n a n t i o t r o p i ci s o m e r sc a nb er e s o l v e db yu s i n gt h ep r o p o s e d a g am e t h o dm e a n w h i l e ，t h eq u a n t i t a t i v ei n f o r m a t i o no f e a c hc o m p o n e n tc a na l s ob e o b t a i n e da f t e rt h er e s o l u t i o n o v e r l a p p i n g h p l c s i g n a l s o ft h r e em i x t u r e so f d o x y c y c l i n e ，4 - e p i a n h y d r o t e t r a c y c l i n e a n d a n h y d r o t e t r a c y c l i n e w i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o nw e r er e s o l v e da n dq u a n t i f i e di tw a sp r o v e nt h a tt h em e t h o di sa n e f f i c i e n tt o o lf o rt h er e s o l u t i o no f o v e r l a p p i n gs i g n a lo f c o m p l i c a t e ds y s t e m i v 里型兰垫查查兰堡主兰堡笙奎一堕 致谢 本论文是在张孝松教授的指导下完成。 张老师对我耐心的指导和帮助，为我的进一步发展打下了坚实的基础，使 我在科研工作的各方面得到了严格的训练。张老师在生活中给我的无微不至的 关怀以及对我前途的关心，令我终生感动。林长山教授在论文的完成中给予了 宝贵的修改意见。在此，我谨向两位老师表示衷心的感谢。 邵老师为我的实验提供了所需的仪器以及论文的完成所需的一切条件，并 为论文的完成倾注了大量的心血。邵老师对学生的支持、鼓励和严格的要求， 也是我能顺利完成论文的原因。在此，谨对邵老师两年中的辛勤指导与无私帮 助致以最诚挚的谢意。 徐智秀老师在本论文的整个实验过程中给了我耐心的指导，帮我分析和解 决了仪器和实验中出现的各种问题，并在论文的完成中提出了许多宝贵的建议 和给予很多帮助。徐老师在学习上对我的关心与鼓励以及生活中对我的帮助给 我以莫大的鞭策。在此，谨向徐老师表示最真诚的感谢。 感谢邵利民老师在仪器和实验上的帮助。 感谢虞正亮、程龙玖、陈达、姜海燕、李梅青、马超雄以及已经毕业的孙 莉等实验室的所有同学的帮助和支持，他们奋发进取的工作精神和兄妹情谊， 让我在这里度过了愉快而充实的两年。 感谢我的同学张海霞、孙秀玉、邹桂征、张锋三年来对我的真诚帮助和鼓 励，感谢赵要强、龚静鸣在论文的完成中给予的热情帮助。 感谢聊城师范学院的刘道杰教授、王霞同学为样品的分析测试提供了便利 的条件。 感谢我的父母及家人多年来的辛勤培养和悉心照顾。 谨以此文献给养育我的父母和家人以及所有关心我的老师、同学和朋友! 王蕾 2 0 0 2 年5 月于科大 ， ! 里型兰垫查查堂堡主堂堡垒苎一一墨三童l ! ! 生 第一章综述 1 1四环素类药物简介 ( 1 ) 历史背景 四环素类抗生素是由链霉菌产生的、临床上用于革兰氏阳性球菌和阴性杆 菌引起的感染的广谱抗菌素。四环素类化合物可分为天然品和半合成品两类， 天然品有四环素、土霉素、金霉素等，半合成品有美他环素、多西环素和米诺 环素等。自从1 9 4 8 年四环素类化合物的第一个成员金霉素( c h l o r t e t r a c y c l i n e ， c t c ) 被发现至今，已有八种这类化合物投入市场。由于这类化合物能够有效 地抑制多种细菌的生长，因此它们在医学上的应用非常广泛，被称为“广谱抗 菌素”【1 i 。 ( 2 ) 化学和功能机制 各种四环素类化合物的物理、化学性质非常相近、生物科学性能相似，都 含有一个由四个稠环组成的八氢化萘环结构骨架，含有很多的官能团，只是个 别取代基与取代基的空间位置不同。 四环素类化合物的广谱抗菌作用与其作用机制密切相关。四环素类药物的 主要作用是抑制微生物蛋白质的合成，它们可以特异性地与细菌的核糖体的3 0 亚基f 大分子物质的分子量常用沉降系数表示，单位为s 。核糖体由大小两个亚 基组成，3 0 亚基分子量约为o9 x 1 0 6 ) 结合，从而阻止了携带有氨基酸的t r n a 与m r n a 核糖类化合物的结合，抑制了细菌蛋白的生物合成【2 j 。四环素类药物 可以通过口服、注射或外敷，主要用于治疗葡萄状球菌、链球菌、肺炎球菌、 淋菌、霍乱、痢疾、杆状菌、百日咳、发疹伤寒等的病原体、支原体、衣原体、 立克次氏体和布氏杆菌等致病原引起的感染或混合感染【3 】，而且它们可以作为 食物添加剂、抗菌剂加入到动物饲料中来促进动物的生长【4 5 1 ，尽管随着病菌抗 药性的增强，它们在动物饲养中已经被禁止使用，然而，这导致了大量关于这 类化合物在动物组织中的分析方法改进的报道。 四环素类药物进入细胞主要有两个途径：一是通过外层细胞膜亲水基团的 ! 里型堂垫查奎堂堡圭兰焦堕奎三生! ! 生 被动扩散，二是由内层细胞的主动运输。目前对四环素类药物作用机制的研究 已经进入了分子水平，对于其作用机制有两种不同的解释：1 四环素类药物的 分子与3 0 亚基核糖体的结合破坏了t r n a 和核糖体上m r n a 之间的密码子与 反密码子的相互作用；2 四环索类药物分子的存在干扰了延伸因子t u 的作用， 这一作用可直接影响核糖体和延伸因子t u 之间的相互作用或间接破坏了反密码 子识别密码子时，t u 与t r n a 的作用。 ( 3 ) 药物动力学简介 对于不同的四环素类药物，肠的吸收效果不尽相同。金霉素( c h l o t e t r a c y c l i n e ， c t c ) 只有3 0 能被人和动物吸收，土霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ，o t c ) 和四环素 ( t e t r a c y c l i n e t c ) 有6 0 8 0 ，而多西环素( d o x y c y c l i n e ，d c ) 的吸收为9 5 ， 米诺环素( m i n o c y c l i n e ，m n c ) 的吸收为1 0 0 ”1 。 四环素类药物的口服量一般为每天01 05 9 ，肠的吸收效果与口服量成反 比关系，而且牛奶、乳制品和抗酸剂都会影响四环素类化合物在体内的吸收”1 。 四环素类药物能广泛分布于全身各处和各种组织分泌物中，如尿液、前列腺， 而且也可以富集在各种组织的网状内皮细胞中，如牙质中产生四环素牙”1 。 四环索类药物主要通过尿液排出体外，也可以通过胆汁进入肠，然后通过 肠肝循环分解吸收。金霉素、多西环素能够部分生物转变成为非活性的代谢产 物。其半衰期在6 1 8 h 范围内。表1 1p - 0 出了部分四环素类化合物的主要药物 动力学性质。 表1 1 几种主要的四环索类药物的药物动力学性质【6 9 1 p r o t e i ni n t e r a c t i o n v d c 1p l a s m ac 1r e n a l d r u gt m ( )( m l m i n )( m l m i n ) t c 1 16 5l51 1 76 8 o t c9 4 51 71 5 09 0 c t c62 0 4 04 2 d c1 88 807 53 71 5 m n c1 67 6l37 07 i 2 ! 望型堂垫查查堂堡圭兰垡兰茎 一兰三兰生! i 生 1 2 四环素类药物的分析方法 四环素类抗生素药物的出现为人类的防病治病等方面起到了重要的作用， 但也给人类带来了一定的危害，比如动物性食品中抗生素的残留。其来源是 饲以带抗生素的饲料，对幼畜禽的发育有促进作用，但也造成了残留；另个 来源是由于治疗时使用抗生素，也造成了残留，前者比后者用量大，后者比前 者用量集中。当摄入含抗生素的食品后，会在人体内长期停留，影响人体健康。 为了防止任何由于四环素在动物性食品中的残留对人们的健康造成的威胁 现象的发生，1 9 6 9 年世界卫生组织f a o w h o ( f a o w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ) 对各国提出衷告：应对各种动物性食品中抗生素的残留量提出允许的标准。欧 洲联盟( e u r o p e a nu n i o n ) 在1 9 9 2 年1 月1 目实施了n o 2 3 7 7 9 0 法律，该法律规 定了欧共体成员国中所有动物源性食品中允许的药物最大残留量 m r l ( m a x i m u m r e s i d u el i m i t ) ，美国f d a ( f o o da n dd r a ga d m i n i s t r a t i o n ) 、日本 f j a p a n e s ef o o ds a n i t a t i o nl a w s ) 等都已经通过立法确定了各种抗生素在各种动物 组织中的最大残留量1 v r l 9 。”1 。 因此对于这一类化合物给药后的分析、它们以及其代谢产物在生物体液和 组织中的快捷而灵敏的分析监测不仅可以用于病理和疾病的诊断、观察药物的 疗效和毒性、对研究四环素类药物的作用机理、设计新药具有很大的指导意义， 而且对于保护人类的健康及环境有很大的帮助，而这种分析检测需要高灵敏性 的特点。 目前四环素类药物含量的测定最通用的检测方法是微生物法 1 3 - 16 】。该法虽 能反映其生物效价，但存在精度不高、操作复杂、检验周期长及定性定量不能 一次完成等缺点1 1 7 - 1 8 1 。 四环素类抗生素具有相似的物理和化学性质，由于这类化合物有很多的官 能团，使得它们在p h l 1 2 范围内存在三个不同的离解常数。所以四环素类抗生 素都是两性化合物并具有特征p h 值，它们在酸性和碱性条件下分别形成含有 羟基的结晶水合物和盐”。它们在强酸性和强碱性的溶液中稳定性差，极易发 生立体异构化反应形成可相互转化的差相异构体，在弱酸性( p h 3 ) 、强酸性 ( p h 2 ) 、碱性下分别形成4 - e p i t c s ，a n h y d r o t c s 和i s o t c s f 2 “。在中性和酸性 溶液中，它们的吸收光谱在2 7 0 r i m 和3 6 0 n m 附近有很强的吸收【2 1 1 。四环素类抗 生璺型兰苎查盔堂堡主兰堡笙塞堑兰墅! ! 生 生素能溶于酸、碱、乙醇和极性的有机溶剂中，也可以用正丁醇和乙酸乙脂来 萃取。 四环素类药物在碱性条件下或和金属离子结合均可产生强烈的荧光2 ”，它 们和金属离子在d 一二酮( c 。c ：) 和酰胺基( c ：) 位形成络合物【2 3 1 ，也可以和固定相 中的蛋白质、硅羟基键合【2 4 1 。 基于上述物理化学特性，在过去的几十年中，关于四环素类抗生素的色谱 分析方法已有大量的报道，如薄层色谱( t l c ) 、毛细管电泳( c e ) 、高效液相色谱 f h p l c ) 等。 1 2 1 薄层色谱法( t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) 薄层色谱是一种设备简单、操作方便、分离速度快、灵敏度及分辨率高的 色谱分析方法，已经有人报道了以纤维素2 5 2 ”、硅藻土2 8 。3 0 】、硅胶”刮为吸附剂 的薄层色谱方法用于四环素类抗生素的分离，然而，由于四环素类药物可以与 吸附剂中存在的痕量金属离子形成稳定的络合物，使得分离效果较差。因此， 一种改进的方法是：薄层板用饱和的e d t a 水溶液预处理和在应用到样品前已 经被激活【”3 5 】。 o k a 等 3 2 1 采用氯仿一甲醇一5 e d t a ( 6 5 ：2 0 ：1 5 ) 在硅胶板上成功的分离了8 种 四环素类抗生素药物，并把这种薄层色谱技术用于蜂蜜中8 种四环素类抗生素 的残留。经氯化镁喷雾显色后通过在紫外灯下观察它们的荧光，检测限为 01 p p m 。 n a l d o n g 等m 峙艮道了金霉素、去甲基四环素、脱氧土霉素、甲烯土霉素、 土霉素和四环素共6 种四环素类抗生素的薄层荧光一半定量纯度控制的方法。硅 胶薄层板临用前喷1 0 e d t a n a 水溶液( p h 80 时用于金霉素、去甲基四环素 和四环素，p h 90 时用于脱氧土霉素、甲烯土霉索和土霉素) ，临用前需活化， 二氯甲烷甲醇水( 6 0 ：3 5 ：5 ) 用于金霉素，( 5 9 ：3 5 ：6 ) 用于其余五种四环素类抗 生素，展开前需在双底展开室中饱和1 h ，展距1 5 c m ，n ，气吹干溶剂，浸板于 3 0 液体石蜡正己烷溶液中，在紫外光3 6 5 n m 下观察比较斑点的纯度。 x i e 等【3 7 1 提出了薄层色谱荧光扫描密度计量学的方法用于蜂蜜、血清、尿 液种的土霉素、四环索、多西环素的测定。采用0 2 7 m o l l 的e d t a 和由氯仿 4 ! 望型兰垫查查兰堡圭兰焦堡壅堑二量! 至生 甲醇。丙酮1 的氨水溶液( 1 0 ：2 2 ：5 0 ：1 8 ) 的溶剂体系预处理过的硅胶薄层色谱 板，样品中的四环素类药物被完全分离，荧光斑点用光密度计( 九。：3 6 5 n m ，九廿n ： 4 4 0 n m ) 进行扫描。 赵芬霞m 1 采用经p h 75 的5 n a 口e d t a 处理的硅藻土h 做薄层，以p h 7 5 的5 n a 2 e d t a 饱和的乙酸乙酯为展开剂，在氨气中蒸熏后置于2 5 4 n m 紫j b 女l - 下检测，可用于脱氧土霉素中土霉素、甲烯土霉素及d 一差相异构体的检查。 周文枭等【3 9 1 采用经5 n e d t a 预处理的微晶纤维素薄层，以p h 8 2 的 5 n a ，e d t a 溶液饱和的正丁醇为展开剂( 用前加入1 滴浓氨水) ，在氨气中蒸 熏后于u v 3 6 5 n m 紫外灯下检测，较好地分离了盐酸四环素的有关物质，且重 现性较好。 田淑玲m 1 采用经5 n a 。e d t a 预处理的硅藻土薄层板，以丙酮一乙酸乙酯一 水( 3 0 ：6 0 ：6 ) 为展开剂，氨蒸汽熏后于3 6 5 n m 的紫外光下观察，用于金霉索、 4 一差相四环素、脱水四环素和4 一差相脱水四环素的分析。 对于反相薄层色谱( r p t l c ) ，已报道的文献多数都采用含草酸的溶剂体 系。已经有人报道了以甲醇一乙腈草酸溶液为溶剂的体系用于8 种四环素类药 物在c 。薄层色谱板上的分离j 。通过把薄层色谱技术和c ，。萃取清洗技术的结 合，动物组织和蜂蜜中四环素类药物的残留已经被成功的用于分离测定，四环 素类药物的检测限为0l p p m 。 张启华等”1 1 利用c 。小柱固相萃取出t c s ，经麦氏缓冲液处理的正相高效薄 层色谱( h p t l c ) 进行分离，喷雾显色后，用紫外灯和薄层扫描仪进行定性、定 量检测，该方法可用于蜂蜜中四环素类抗生素残留量的测定。 陈杰等 4 2 1 以_ d h 83 的5 n e d t a 溶液调制硅藻土g 板为薄层，以丙酮 02 m o l l 氢氧化钠乙酸乙酯( 9 ：2 ：2 0 ，v v v ) 为展开剂，探讨了四环素、土霉素、 盐酸金霉素等的检查方法，较好地解决了个别样品拖尾和月，值接近的问题。 常高翔1 4 3 1 采用硅胶、硅藻土混合吸附剂，同时展开剂以适量冰醋酸酸化后 进行2 次展开，解决了由于四环素、4 一差相四环素、4 一差相脱水四环素及盐酸 金霉素斑点的碍值均较小，盐酸四环素斑点拖尾严重，重现性差等问题，得到 了满意的结果。 ! 里型堂垫查查兰堡主兰垡笙塞j 兰已堕 1 2 2 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 与高效液相色谱( 玎，l c ) 技术相比，毛细管电泳( c e ) 具有操作简单、试样量 少、分离时间短、分离效率高、成本低等优点，但是毛细管电泳在迁移时间上 的重现性、进样的准确性和检测灵敏度方面比高效液相色谱法稍逊，定性、定 量能力差。 2 0 世纪8 0 年代后，毛细管电泳已成为分析化学领域中发展最快的分离技 术，随着应用和仪器技术的发展，c e 定量的重复性和定性的准确性都已经接近 h p l c 的水平。最近已有大量关于毛细管电泳紫外检测分离抗生素的报道，大 部分的毛细管分离分析方法在碳酸或磷酸的缓冲介质中进行，毛细管电泳是四 环素类抗生素痕量检测的一种理想的方法。 c h e n 等报道了毛细管电泳技术用于牛奶、血清、尿液中的土霉素、四环 素、金霉素、多西环素的同时测定。利用琥珀酸除去样品中的蛋白质后，经金 属螯合亲和柱色谱将上层清液中的四环素类药物提取出来。洗出液中的盐类经 三甲基硅烷化的c ，。萃取柱去除。结果表明，样品中四环素类药物的回收率在 4 0 一8 0 之间，相对标准偏差在33 91 之间。 卢菀华等【4 5 1 通过对电极缓冲体系、d h 值、乙腈添加浓度、n 一甲基吗啡啉添 加浓度及温度、电压的优化选择，用毛细管电泳方法分离土霉素、金霉素、多 西环素、四环素、氯霉素等5 种抗生素。应用胺类修饰剂n 甲基吗啡啉作为添 加剂，提高了抗生素的分离效果。 方禹之等m 1 采用自制的高效毛细管电泳一电化学检测装置，以3 5 0 9 i n 铜圆 盘电极为工作电极，在碱性溶液中，对7 种多羟基抗生素的分离进行了研究。 z h o u 等 4 7 1 将毛细管电泳快速循环伏安检测的方法用于四环素、土霉素、 金霉素的分离与定量分析，并通过将硼酸电解液体系与快速循环伏安法的结合 改善分离效果与检测的灵敏度。 祝仕清等”8 】采用高效毛细管电泳法将四环素、4 一差向四环素、脱水四环素、 脱水差向四环素、二甲胺四环素、去甲基金霉素及土霉素完全分离，并测定了 四环素中杂质。结果表明，该方法简便、高效、快速，为四环素类抗生素中杂 质的测定提供了一种新方法。 在非水相的毛细管电泳中，金属络合作用被用来评价四环素类药物的分离 6 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 效果，同时应用激光诱导荧光检测技术来改善检测的灵敏度。实验结果表明， 镁离子作为对离子时分离效果最佳，同时，四环素类药物络合物在n ，n 一二甲基 甲酰胺溶液中的荧光强度是在水溶液中的1 0 倍。这种毛细管电泳技术已经被用 于牛奶和血浆中的四环索类药物的检测。 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , 简称 m e c c ) 作为一种融合毛细管电泳技术和高效液相色谱技术优点的新型分离方 法，已经用于四环素类抗生索的迁移行为和分离的研究【5 0 川，t j o r n e l o n d 和h a n s e n 的研究表明，尽管使用胶束毛细管电动色谱，在水相缓冲体系中完全分离t c 、 o t c 、c t c 依然非常困难f 5 2 】。 郭福庆f 5 3 1 对采用不同的表面活性剂的胶束电动毛细管色谱法分离四环素类 抗生素的方法进行了初步的研究，结果表明，t r r o nx 一1 0 0 的m e c c 法可获得 令人满意的结果，而阳离子及阴离子的表面活性剂之m e c c 法分离效果较差。 1 2 3 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 1 分离模式 四环素类药物的分离多采用反相高效液相色谱法的模式，以c ，。柱为固定 相，甲醇一水、乙腈一水为流动相的反相色谱体系。这主要是因为反相柱稳定性 好，流动相价格便宜，操作简便，所得数据重复性好，对t c s 的分离有较好的 选择性。 四环素类化合物的色谱性能较差，在反相色谱柱上，它们极易与金属离子 形成螯合物，也可与色谱柱固定相上的自由的硅醇基结合，导致分离过程中色 谱峰的拖尾，影响其色谱分析1 5 4 5 ”。通过将c 。柱硅烷化或者用e d t a 欲处理， 在流动相中加入一定量的络合剂，如磷酸邮5 q 、柠檬酸【6 0 】、e d t a t 6 1 - 6 3 1 、酒石酸“、 草酸、四氢呋喃等可以较好地结解决这一问题，其中以加入草酸时峰形与分离 度最好。 范柏等采用s g ew 5c i 8 - a r 柱，以0 0 5 m o l l 草酸铵一二甲基甲酰胺 0 2 m o l l 磷酸氢二氨( 7 5 ：2 0 ：5 ) ( p h 80 - + 0 2 ) 为流动相，对土霉素、盐酸土霉 素及土霉素片进行了含量和有关物质测定方法的研究，获得了良好的分离效果， 达到了同时准确测定土霉素和有关物质含量的目的。 7 ! 里型堂垫查查兰堡主兰垡堕奎笙二里! ! 生 将含有草酸的流动相用于四环素类化合物的色谱分析已有相关的报道m 1 ， 色谱峰的分离度与对称性决定于流动相中草酸水溶液的p h 值，实验结果表明 最佳的p h 值为2 0 ，当草酸浓度增加时，色谱峰的分离度与峰形变好。 四环素类药物的分离行为因采用不同厂家的的类型相同的柱子( c 。) 而表现 出很大的差异。实验结果表明，改变流动相中有机相与草酸水溶液的体积比例， 四环素类化合物都可得到好的分离结果。自2 0 世纪8 0 年代末期以来，已有大 量文献报道了采用含有革酸的流动相的四环素类药物的液相色谱分析方法”5 8 训。 采用c 。柱分析四环素类化合物时，在流动相中加入草酸对于改善四环素 类化合物的峰形与增加分离度是完全必要的。然而，将c ，。柱硅烷化封尾处理 后的改性硅胶柱可以在不加入草酸的条件下用于四环素类药物的分离【8 8 。8 9 】。因 为硅醇基已经被封尾以及金属离子被完全除去，所以色谱峰的分离度并未降低。 使用各种化学键合相色谱柱也可以解决由于四环素类化合物与硅醇基的结 合引起的色谱峰的拖尾，如聚苯乙烯一二乙烯苯的二元共聚物( p s d v b ) 色谱柱 ” ，由于聚苯乙烯二乙烯苯的聚合物不含有硅羟基，因此在这种色谱柱上分离 四环素类药物时，即使流动相中不含有草酸，也可得到较好的分离度。 吴燕等【9 3 1 应用3 种高分子聚合柱对四环素( t c ) 及其有关杂质进行h p l c 分 离测定。其中聚苯乙烯类日立3 0 1 1 0 柱分离效果最佳。可以使四环素及其3 个 有关物质：4 一差向四环素( e t c ) 、差向脱水四环素( e a t c ) 矛i j 脱水四环素( a t c ) 达 到良好的分离效果。各组分间分离度均符合要求。 2 检测方法 ( 1 ) 紫外_ 可见检测 紫外一可见光检测器( u l t r a v i o l e t v i s i b l ed e t e c t o r , u v s ) 是液相色谱应用最广 泛的检测器，即可测1 9 0 3 5 0 n m 范围( 紫外光区) 的光吸收变化，也可向可见光 范围3 5 0 - 7 0 0 n m 延伸。几乎所有的液相色谱装置都配有紫外可见光检测器， 该检测器具有灵敏度高，选择性等优点。此外，因为这种检测器对温度和流速 不敏感，因此，很适用于梯度洗脱。 大多数四环素类药物的h p l c 分析是采用u v v i s 或二极管阵列检测器检 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章综述 测的。四环素类化合物具有很好的u v 吸收特性，摩尔吸光系数较大，它们在 中性与酸性的水溶液中在2 7 0 和3 6 0 n m 左右有很强的吸收【2 1 1 ，采用u v 或二极 管阵列检测器，其检测限可以达到n g g 或n g m l ；同时，液相色谱一二极管阵列 检测可以实现四环素类抗生素的分离和测定，通过保留时间、吸收光谱进行定 性分析。对不同的样品，通过选择合适的流动相，可以提高其选择性，改善色 谱峰形，降低信噪比。因此，紫外检测器是四环素类药物的最常规的检测方法。 在四环素类药物的高效液相色谱紫外分析中，应用最广泛的色谱柱是c 。 柱，大量的研究工作都是建立在o k a 等【6 5 瑚1 的工作基础上的。o k a 等以甲醇乙 腈一0o l m o l l 草酸溶液( p h 20 ) 为流动相成功地用于四环素、土霉素、金霉素和 脱水四环素的分离分析。 e k s b o r g 等f 5 6 1 采用乙腈一磷酸的水溶液为流动相的反相离子对液相色谱方法 测定了多种四环素类药物。 b j 6 r k l u n d m l 采用乙腈d m f 一00 1 m o l l 草酸溶液( p h 21 ) 为流动相用于四环 素、土霉素、金霉素的分离与定量分析。 s o k o l 等【7 5 1 通过样品的离线预处理、固相萃取的预浓缩等过程，提出了一种 快速、灵敏的高效液相色谱分离方法用于动物组织中四环素、土霉素、金霉素 的残留量的测定。 意大利的c e s a r i n a 9 4 1 以乙腈- 00 l m o l l 草酸溶液( 1 ：4 ，“v ) ( 包含1 四氢呋喃 和0i - - - l 基胺) 为流动相梯度洗脱七种四环素类抗生素，流动相中乙腈甲醇 ( 1 ：1 ) 由0 变化至1 5 ，整个洗脱过程持续1 8 r a i n ，七种四环素类抗生素得到良 好的分离。 c o o p e r 等| 9 5 1 将在线金属螯合亲合色谱一高效液相色谱( m c a c 一，l c ) 方法用 于动物组织和鸡蛋中四环素类药物的测定。 杨大军等【1 采用w a t e r sc 】8 色谱柱，以乙腈一二甲基甲酰胺一00 2 m o l l 的柠 檬酸水溶液为流动相将四环素、去甲基四环素、金霉素、去甲基金霉素和它们 的差相异构体8 种化合物、它们及其差相异构体以及它们的脱水物十六种化合 物完全分离。 王蕾等”1 在c 1s 柱上以甲醇一乙腈一0o l m o l l 草酸溶液( p h 2o ) ( 体积比为 1 1 ：2 2 ：6 7 ) ：为流动相，将7 种四环索类抗生素全部洗脱并达到基线分离，探讨了 ! 里型兰垫查查兰堡主兰堡堕塞兰二兰! ! 生 流动相的p h 、草酸的浓度、流动相的组成以及检测波长等因素对分离度和灵敏 度的影响。 ( 2 1 荧光检测 荧光检测器( f l u 0 f e s c e l l c ed e t e c t o r , f l d ) 是利用测量化合物荧光强度对化 合物进行检测的液相色谱检测器。在紫外光照射下能产生荧光的化合物，绝大 多数为环状化合物，但环状的结构并不是产生荧光的必要条件。由于有些化合 物荧光强度弱，有些化合物在紫外光的照射下不产生荧光，限制了荧光检测器 的应用。化学衍生色谱法是常用的扩大荧光检测范围的方法。 由于四环素类药物与金属离子相结合或在碱性的条件下均可产生强烈的荧 光，1 6 j ，所以通过检测四环素类药物在碱性条件下的荧光2 8 1 以及四环素类药物 与金属离子形成的络合物发出的荧光，”“，可以对四环素类药物进行非常灵敏 的h p l c 检测。 因为p s d v b 色谱柱在碱性条件下非常稳定，采用p s ，d v b 色谱柱和碱性 流动相，可以检测四环素类药物的降解产物发出的荧光，实验结果表明，采用 荧光检测的各化合物的检出限比其它紫外检测方法检出限降低许多。 四环素类药物能与许多的金属离子形成有色的螯合物，其中以它们与镁、 铝、铜、锌、锆、铈、钍、铀形成的螯合物最为稳定，可用于四环素类抗生素 的鉴别及含量的测定。一些螯合物在一定p h 值条件下的荧光强度强于四环素 类药物本身，这为四环素类药物的荧光检测提供了前提与基础。对于四环素类 药物与金属离子形成螯合物，已有文献报道了两种方法：一为四环索类药物与 镁离子在流动相中形成金属螯合物，另一种方法是四环素类药物与锆离子 7 6 7 7 】、 铝离子 7 9 , 8 6 1 柱后衍生产生的荧光，四环素类药物的检出限降低了1 0 多倍。 c r o u b e l s 等m 1 以甲醇乙腈一00 1 m o l l 草酸( p h 2 0 ) ( 1 0 ：1 5 ：6 0 ，“v ) 为流动 相，在p l r p s 柱上分离了四环素、土霉素、金霉素的混合样品，淋出液在柱 后与5 z r c l 。( p h 2o ) 的溶液反应，生成t c s z r 配合物，再进行荧光测定。 张孝松等i i o 。”1 借a l ”作为柱前衍生剂，提出了于反相柱上分离和荧光检测 测定四环素类药物的一种简单、快速、灵敏的新方法，并应用于实际样品的测 定。 1 0 里型兰垫查盔堂堡主兰垡笙苎 第一章综述 赵一兵等【1 0 3 1 利用t c 和a t c 与a i ”的络合增敏性质和十二烷基硫酸钠 ( s l s ) 的胶束增敏性质，结合同步荧光分析技术，研究了t c 和a r c 的同时 测定，并用于实际样品的测定。 傅承光等】采用常规的反相色谱条件，结合柱后调节p h 及胶束增敏，建 立荧光检测的方法进一步提高了灵敏度，四种四环素类药物同时测定，检出限 达到8o 7 56 p g 。 k a u f m a n n 等”1 测定了食品中四环素的含量，食物样品处理后用3 “mc 。 柱，利用1 葵烷碘酸钠盐于草酸缓冲溶液中( a ) 和1 - 葵烷碘酸钠盐于草酸、 乙腈、甲醇( 2 ：1 ：1 ) 中( b ) 作流动相实施梯度洗脱，经硼酸镁水溶液和硼酸 ( n a o h 调整p h 为9 ) 柱后衍生获得高的灵敏度和选择性。此方法实现了色谱 分离和荧光检测条件的统一。 f 3 ) 液相色谱质谱联用技术 色谱一质谱联用技术结合了色谱对复杂基体化合物的高分辨能力与质谱独特 的选择性、灵敏度、分子量与结构信息于一体，具有广泛的应用领域。与常规 的紫外检测、荧光检测方法相比，质谱因其高度的灵敏性和对化合物的识别能 力在四环素类抗生素的分析中正在被广泛的应用0 6 1 “i 。 已经用于四环素类药物的质谱技术有：热喷雾质谱( t h e r m o s p r a ym a s s s p e c t r o m e t r y , t m s m s ) f ”、快原子轰击质谱( f l i tf a s ta t o mb o m b a r d m e n t f l i tf a b m s ) t ”、大气压化学电离质谱( a t m o s p h e r i cp r e s s u r e c h e m i c a li o n i z a t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y , a p c i m s ) 【8 7 川】、电子喷雾质谱( e l e c t r o s p r a ym a s ss p e c t r o m e t r y , e s i m s ) 【8 9 ”2 1 以及粒子束质谱( p a r t i c l eb e a mm a s ss p e c t r o m e t r y , p b m s ) i “3 1 ，这些方法 都已经成功的应用到四环素类抗生素在食品中的残留的分析中。 质谱技术以其高灵敏度与高选择性可以用于残留四环素类药物的确定，因 此，将简单、准确的色谱分离与合适的质谱检测技术相结合对于残留四环素类 药物的测定具有重要的意义。尽管l c m s 联用技术似乎最适合这个目的，但是 对于大多数的色谱体系而言，由于