（分析化学专业论文）壳聚糖复合材料的制备及其在生物传感器中的应用.pdf

摘要 摘要 壳聚糖是原材料来源丰富的天然高分子化合物，具有良好的生物相容性、成 膜性和化学、机械稳定性等优良性能，近年来已广泛应用于应用生物、医药、食 品、化妆品等多种领域，其产品开发研究己引起越来越多的国家和研究机构的重 视。单纯的壳聚糖作为材料应用有一定的局限性，对壳聚糖进行改性，合成壳聚 糖纳米复合材料国内外已经作了大量的研究工作。纳米科学和技术迅猛发展，为 纳米材料的应用带来了广阔的应用前景。而在纳米材料的研究中，碳纳米作为纳 米材料的重要一员，因其独特的物理、化学和力学等性质，引起了科学家们的极 大兴趣。碳纳米管或其它纳米材料与壳聚糖有机结合制备纳米复合材料，不仅能 保持壳聚糖所特有的优异性能，而且能得到壳聚糖和纳米材料相互作用时的综合 性能，可应用于生物传感和其他功能材料中，是目前研究的热点。本论文主要对 壳聚糖及其纳米复合材料的制备和在分析化学领域特别是生物电分析领域的应 用做了初步的探索和研究。主要内容如下： 1 采用一种简单、可控的电化学沉积方法制备具有三维多孔结构的单壁碳纳米 管壳聚糖二氧化硅纳米粒子复合膜，用氢氟酸溶液除去二氧化硅粒子后，得到 孔径大小均匀的三维多孔单壁碳纳米管壳聚糖( s w c n t s c s ) 复合膜，这种复合 膜的厚度可通过调节壳聚糖的浓度和沉积时间来控制，其特性受s w c n t s 的浓 度、二氧化硅纳米粒子的浓度的影响。这种三维多孔结构的复合膜具有良好的微 生物环境、比表面积大、孔隙率高，有利于电子传输速度和提高酶的负载量，用 戊二醛交联法将葡萄糖氧化酶固定在三维多孔杂化膜中，构建一种新型葡萄糖生 物传感器。该传感器具有响应快速( 达到稳定电流所用时间 5 s ) 、线性范围宽 ( 1 0 9 m 3 5 m m ) 和检测限低( 2 5 m 3 的特点。 2 利用电沉积方法对普鲁士蓝和壳聚糖二氧化硅纳米粒子复合膜进行组装，用 刻蚀法除去二氧化硅粒子，制备出孔径大小均匀的三维多孔壳聚糖普鲁士蓝膜， 这种三维多孔膜具有良好的微生物环境、比表面积大、孔隙率高，有利于负载更 多的葡萄糖氧化酶，从而构建了一种灵敏度高、稳定性好、响应时间短、检测范 围宽的葡萄糖生物传感器。 3 将二茂铁( f e r r o c e n e ，f c ) 分子通过非共价键合的方法修饰到单壁碳纳米管 ( s w c n t s ) 表面形成f c s w c n t s 纳米复合材料，用红外光谱方法对f e s w c n t s 进 行了表征，结果表明f c 不仅能快速、有效地修饰到s w c n t s 表面，而且还能有效 地改善f c 和s w c n t s 在水溶液中的分散性能。将复合材料和聚阳离子壳聚糖共同 修饰在电极表面，表现出传递电子快速的特点。将制备的复合材料与葡萄糖氧化 i i 摘要 酶结合，制备了以二茂铁作为电子媒介体的葡萄糖生物传感器。探讨了制备 f c s w c n t s 复合材料中f c 和s w c n t s 的浓度等因素对电极响应的影响，考察了电 极的重现性、抗干扰能力及使用寿命。实验表明，该传感器在0 1 m m 屯6 m m 范 围内葡萄糖浓度与电流呈良好的线性关系，检测限为6 8 a m ；达到稳定电流所用 时间 3 s ；米氏常数为2 2 8 m m ，表明所固定的酶具有较高的生物活性。 4 采用非共价键合的方法制备了二茂铁单壁碳纳米管复合材料，用紫外光谱方 法对f c s w c n t s 进行了表征。将复合材料和壳聚糖修饰在玻碳电极上并将其用于 固定辣根过氧化物酶。以f c 为电子媒介体制得的过氧化氢传感器。s w c n t s 的存 在大大提高了复合材料的传递电子能力，且复合膜中的壳聚糖提供了很好的微环 境来保持酶的生物活性。实验中讨论了复合材料浓度、酶的量、工作电位和p h 值对传感器的影响。该传感器在1 m 2 3 m m 浓度范围内有线性响应，最低检测 限为0 6 8 ，_ t m ；达塑j 9 5 稳态电流所用时闻少于5 s ，该传感器的米氏常数为0 9 m m 。 传感器有效消除了抗坏血酸等共存物质的干扰，实验结果表明，该传感器具有很 好的分析性能和稳定性。 关键词：壳聚糖：纳米复合材料；生物传感器；三维多孔结构：电沉积；碳 纳米管；二氧化硅纳米粒子；普鲁士蓝；二茂铁：葡萄糖氧化酶；辣根过氧化酶 1 1 i a b s t r a c t a b s t r a c t 1 i no r d e rt oa v o i dm a s st r a n s p o r tl i m i t a t i o no fa n a l y t e si nf i l m sb a s e db i o s e n s o r s ， m i c r o m a c r o p o r o u s f i l m sa r eu s u a l l ye m p l o y e d i nt h i s p a p e r , as i m p l ea n d c o n t r o l l a b l ee l e c t r o d e p o s i t i o nm e t h o dw a sd e s c r i b e dt of a b r i c a t eah o m o g e n e o u s p o r o u sc h i t o s a n s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( c s s w c n t s ) n a n o c o m p o s i t ef i l m t h et h i c k n e s so ft h en a n o c o m p o s i t ef i l mc a l lb ec o n t r o l l e dt h r o u g ht h ec h a n g eo f c o n c e n t r a t i o no fs w c n t s ，s i 0 2n a n o p a r t i c l e s ，c h i t o s a ns o l u t i o na n dd e p o s i t i o nt i m e g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) s e r v e da sam o d e le n z y m et od e m o n s t r a t et h ep o t e n t i a l a p p l i c a t i o no ft h em a c r o p o r o u ss t r u c t u r e df i l m si n f a b r i c a t i o no fa m p e r o m e t r i c g l u c o s es e n s o rw i t hn e g l i g i b l em a s st r a n s p o r tl i m i t a t i o n t h eg l u c o s eb i o s e n s o rw a s c o n s t r u c t e db ye n t r a p p i n gg o dm o l e c u l e st ot h ep o r o u ss w c n t s c sn a n o c o m p o s i t e f i l mu s i n gg l u t a r a l d e h y d ea sac r o s s - l i n k e r n l ef a b r i c a t e db i o s e u s o rw i t h t h r e e d i m e n s i o np o r o u ss t r u c t u r e sc a np r o v i d eb i o c o m p a t i b l em i c r o e n v i r o n m e n tf o r m a i n t a i n i n gt h eb i o a c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m e ，e n h a n c em a s st r a n s p o r to f g l u c o s es u b s t r a t e ，a n di n c r e a s et h ee n z y m el o a d i n g t h e r e f o r e ，t h ep r e s e n tb i o s e n s o r e x h i b i t sar a p i dr e s p o n s e ( 同年j p 月砷日 签字闩期： 胪7 年t z - - 乒l r 绪论 1 1 壳聚糖 第1 章绪论 壳聚糖( c h i t o s a n ) 又名脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲壳素，是由甲 壳素( c h i t i n ) _ e 至脱乙酰化反应转化而成的生物大分子。甲壳素广泛存在于海洋节肢 动物的甲壳中，也存在于昆虫、藻类、菌类和高等植物的细胞壁中，在自然界的 储存量仅次于纤维素，近年来，科学家们对壳聚糖的应用投入了很大的力量，深 入研究了许多机理，使其在食品营养【卜5 l 、工业 6 - 8 1 、农业【9 、医药1 4 1 、化工 1 5 q 6 、环境保护【1 7 1 、生物1 8 。3 ”等领域得到广泛的用途。因此，科学家们将壳聚 糖誉为继蛋白质、脂肪、糖类、维生素、矿物质之后人体必需的第六生命要素。 1 。1 。1 壳聚糖的结构和性质 1 1 1 1 壳聚糖的结构 壳聚糖是甲壳素经不同程度的脱乙酰基反应得来【3 2 埘。甲壳素的化学名称为 p 一( 1 ，4 ) 一2 一乙酸氨基一脱氧一d 一葡萄糖，它是由n - 乙酰胺基葡萄糖通过b ( 1 ，4 ) 糖苷键 相连而成的线形天然生物高分子化合物，其结构式见图1 1 。如果把甲壳素结构 式中糖基上的n - 乙酰胺基的大部分( 5 5 以上) 脱去后，就成了甲壳素最重要的衍 生物壳聚糖，其结构式见图1 1 ，由此可见，甲壳素与壳聚糖具有与纤维素相似 的化学结构。但它们的性质却有较大差别。 图i - 1 甲壳素和壳聚糖的结构 1 1 1 2 壳聚糖的性质 1 1 1 2 1 一般物理性质 壳聚糖是白色无定型、半透明、略带珍珠光泽的固体，分子量从数十万到百 绪论 万不等，不溶于水和碱液，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸，不 溶于稀的硫酸、磷酸。在稀酸中，壳聚糖的主链会缓慢水解，溶液的粘度逐渐降 低。 壳聚糖可以溶于稀盐酸、稀醋酸、1 0 柠檬酸、丙酮酸和乳酸等，不溶于碱 溶液。壳聚糖溶于某些稀酸中，实际上是壳聚糖分子链上许多游离的氨基同溶液 中的氢离子结合，使壳聚糖成为带正电的聚电解质，类似于高分子内盐，破坏了 壳聚糖分子间和分子内的氢键，使之溶于水中。如图1 2 所示： + 2 n h + 溶解 不溶解 图1 2 壳聚糖的溶解图 因壳聚糖可以结合h + ，成为天然多糖中唯一的碱性多糖 3 4 36 1 。壳聚糖脱乙 酰度越高，分子链上的游离氨基越多，离子化强度越离，也就越溶于稀酸。分子 量越高，溶解就越慢。壳聚糖溶解后，就成为一种高聚物溶液，具有一定的粘度， 溶解的浓度越高粘度越大，一般浓度不超过1 。壳聚糖溶于酸后，糖链上的一 n h 2 与h + 结合成强大的正电荷阳离子基团，非常有利于改善酸性体质。 1 1 1 2 2 化学性质 壳聚糖分子的基本单元是带有氨基的葡萄糖，分子内同时含有氨基和羟基， 所以性质比较活泼，可进行修饰、活化和偶联。其主要特性表现如下： 壳聚糖大分子链上分布的羟基、氨基。还有一些n - 乙酰胺基会形成各种分 子内和分子间的氢键，使壳聚糖具有长链糖分子特性，与纤维素形成的多膳食纤 维有相似的特性，如保水、膨润、吸附、扩散、难于被人体吸收等。另外，这些 氢键的存在和其分子的规整性，使壳聚糖分子容易形成结晶区。氢键的形成及结 晶度的改变对所制备材料的性能尤为重要。 壳聚糖分子中的活性侧基一n h 2 能够被酸化成盐、导入羟基，并能制备出 具有水溶性、醇溶性与表面活性的各种衍生物。若一n h 2 先与过渡金属离子形成 络合物再与交联剂进行交联，即可具有“模板剂”的记忆力和选择吸附性能。从 而表现出良好的生物相容性和血液相客性，对细胞组织不产生毒性影响。这一特 性在医学领域具有重要的应用意义 1 1 2 壳聚糖在分析化学中的应用 2 绪论 由于壳聚糖结构上的特殊性，具有离子交换、鳌合、吸附等作用，加上本身 是一种高分子化合物，不溶于大多数溶剂，有一定的刚性和抗压性，便于制备各 种各样的衍生物，因此在分析化学中得到广泛的应用。作为一种天然、无毒的有 机高分子聚合物，壳聚糖在以下几个方面有很好的应用前景。 1 1 2 1 分离富集方面的应用 壳聚糖分子的重复单元中有羟基和氨基基团，能与许多的金属离子( 如 c u 2 + ，f e ”，p b ”，h g ”等) 形成稳定的螯合物，因而在分析领域中被作为吸附剂分 离富集待测组分【3 7 枷l 。壳聚糖直接作为富集过程的富集剂，极大地提高了检测地 灵敏度，但螯合金属离子地差别较大，选择性不高，往往采用接枝了其它基团的 壳聚糖衍生物来进一步提高选择性 4 1 , 4 2 1 。 1 1 2 2 对氨基酸及其它有机物的分离分析 壳聚糖作为一种高分子螯合剂，当其螯合了铜离子后，就形成了配位交换色 谱用的树脂，可以用来分离氨基酸。m u z z a r e l l i 等人m 】用此树脂对苷氨酸、组氨 酸、异亮氨酸、丝氨酸、胱氨酸、色氨酸和门冬氨酸分别做出了贯流曲线，研究 表明，它们的穿透体积是不同的。在用铜螯合的壳聚糖吸附氨基酸时，氨基酸对 吸附量的显著影响主要决定于该氨基酸与铜离子的配位能力，而且上柱液的p h 对配位能力也有一定的影响。此时，看不到氨基酸的等电点对吸附量的显著影响。 1 1 2 3 电分析化学中的应用 壳聚糖结构上活泼的一n h 2 和一o h ，对某些具有电化学活性的金属离子、 阴离子及有机物等有很强的螯合、吸附作用，因此，壳聚糖可以直接作为修饰材 料，制成壳聚糖修饰电极应用于电分析化学测定。用这种电极测定a g + 、p p 、 p d 2 + 、h 9 2 + 、c u 2 + 、f e 3 + 、和p b 2 + 等金属离子均有报道m 4 羽。壳聚糖用于测定有 机物也有报道。崔胜云等研究了对氨基水杨酸钠在壳聚糖修饰碳糊电极上的 伏安行为，利用壳聚糖在酸性条件下对对氨基水杨酸钠的富集作用，建立了一种 快速分析测定的方法。谭学才等【5 0 】应用电化学方法研究了壳聚糖与茜素红的相 互作用并对其作用机理进行了探讨。 1 1 2 4 生物传感器中的应用 生物传感器是由固定化的生物材料( 包括酶、抗体、微生物等生物活性物质) 与适当的转换器件密切接触而构成的分析工具或系统。它利用的生物活性物质的 亲和性，如酶一底物、酶一辅基、抗原一抗体、激素一受体等的分子识别功能。 生物传感器以灵敏度高、选择高、分离过程和检测技术合为一体和不需要样品制 各等特点而受到广泛重视，目前发展很快，已应用于临床测定、工业过程控制、 环境检测、化学物质安全性评价以及食品和制药等许多领域。壳聚糖是一种具有 绪论 良好生物相容性的线型聚合物，分子中的一n h 2 对各种蛋白质的亲合力非常高， 而且。壳聚糖具有多孔结构，能适用于大生物分子酶的固定化，有良好的导电性。 采用壳聚糖制成的多孔膜 5 1 - 5 4 j 和多孔微颗粒 5 5 5 8 j 可作为酶、抗原、抗体等生物活 性物质的固定化载体。 壳聚糖膜因其具有比表面积大、负载酶量多等特点，已被用作葡萄糖氧化酶、 过氧化氢酶、脲酶、脂肪酶等的固定化载体，制成反应器或酶电极。 壳聚糖与其它固定酶载体比较，其原料易得，价格低廉，机械性能好，韧性 强，能在温和的条件下固定酶，固定酶的效率高，反应活性高，这种固定酶可以 长期保存，反复使用。固定化酶较游离酶的突出优点是：可以重复使用且易从被 作用物中分离出来，大多数聚合物中的残存单体易使酶失活，而壳聚糖不存在残 存单体，故它作为酶载体时比许多聚合物具有更大的优越性。 酶在壳聚糖上的固定有以下几种常用技术：( 1 ) 物理吸附法。吸附法是最早的 酶固定方法。酶与载体之间的作用力可以是氢键、疏水键、尢一电子亲合力、离子 键合力等。壳聚糖的氨基对一些酶有较强的吸附结合能力，如通过物理吸附的方 法可将酶液中的酶吸附，过滤，洗涤后，即可得固定化酶。此方法的特点是不易 破坏酶的活性中心和高级结构，但酶与壳聚糖之间的结合力较弱，酶容易脱落。 ( 2 ) 包埋法。传统包埋法是将酶包埋在凝胶中或者膜中，再固定到电极上。与其 它固化方法相比，包埋法一般不需要与生物物质的残基进行结合，可以较好地保 持蛋白质表面微观结构地整体性和方向均一性，对组分地活性和稳定性损伤较 小，可适合于任何种类的生物组分，但是，酶容易漏失，催化反应受传质阻力的 限制，不易催化大分子底物的反应。谭学才等1 5 9 j 通过原位溶胶一凝胶技术，用 壳聚糖和甲基三甲氧基硅烷( m r o s ) 制备了壳聚糖- - 氧化硅有机一无机复合材 料，并将其用于对葡萄糖氧化酶( g o d ) 的固定，研制出葡萄糖生物传感器。采 用普鲁士蓝( p b ) 作为电子媒介体，并外加一层n a t i o n 膜以增强其选择性。实验 结果表明，所研制的传感器灵敏度高、选择性好、使用寿命长。将其用于i i 每床血 样分析，其结果与酶联比色光度法的结果基本一致。他们还用壳聚糖- - 氧化硅 复合材料对辣根过氧化酶进行固定【酗】，研制了电流型过氧化氢传感器，测定效 果良好。c o n s t a n i n e 等【6 i j 利用层层自组装技术把壳聚糖聚( 噻吩一3 一醋酸，p t a a ) 组装在亲水的石英片上，然后把有机磷水解酶固定在壳聚糖p t a a 中制成酶传 感器。该传感器可与有毒的有机磷农药对氧磷作用，改变p t a a 的光谱特性，从 而到达检测对氧磷的目的。( 3 ) 交联法。交联法是用交联剂使酶与壳聚糖之间形 成共价键结合，此方法的特点是酶不会脱落，提高了酶的稳定性，改善了酶的易 变性，缺点是会损失部分酶的生物活性。壳聚糖可通过双官能团的醛基或酸酐进 行交联，戊二醛是一种常用的交联剂，反应能在均相条件下，于室温迅速进行， 4 绪论 因而被普遍采用。李春香等1 6 2 1 以玻碳电极为基底电极，先于电极表面聚合一层 硫堇薄膜作为电子传递媒介，后以壳聚糖膜作为酶固定基质，用戊二醛交联固定 辣根过氧化酶( h r p ) 和胆碱氧化酶( c h o d ) ，制得双酶电流型胆碱传感器。实验 发现葡萄糖、尿酸、抗坏血酸等都对胆碱测定无明显干扰。这表明该传感器具有 较好的选择性。s a k u r a g a w a 等( 6 3 1 用戊二醛把h r p 固定在壳聚糖颗粒上，并应用 于发光法测定环境试样中微量过氧化氢，测定下限为o 0 5 m g l ，且酶的活性较 好，可以使用数天。陈刚等m j 采用浸涂法将卜二茂铁基乙胺和壳聚糖修饰到铂 电极表面，在与葡萄糖氧化酶作用后用戊二醛进行交联，制成了壳聚糖固定化葡 萄糖氧化酶生物传感器。该传感器作为毛细血管电泳的检测器，已成功地应用于 糖尿病和正常人血清中葡萄糖地测定。( 4 ) 电化学沉积法。电化学沉积法是一种 设备投资少、生产费用低、操作简单、原材料利用率高、生产工艺具有连续性以 及易于实现自动化的方法。这种方法具有受电极尺寸和形状限制小、没有溶胶凝 胶法繁杂的后续过程、技术难度较小、工艺灵活和易于控制的优点。因此，可以 用此方法来制备修饰电极，组装生物分子等1 6 5 4 9 1 。陈洪渊等采用电化学沉积法制 得多孔的壳聚糖，并以之组装金【2 3 】、碳纳米管【7 0 】以及过氧化酶、葡萄糖氧化酶 等，制备了过氧化氢和葡萄糖生物传感器。该方法综合了壳聚糖和纳米粒子的优 点，能有效地固定酶以及蛋白质并保持其生物活性，操作简单、方便，适合各种 生物分子的固定。朱俊杰等1 7 l 】先于玻碳电极表面电沉积一层普鲁士蓝膜( p b ) 为 电子媒介体，然后再电沉积金纳米粒子、壳聚糖和葡萄糖氧化酶，制作了一种高 灵敏的生物传感器用于葡萄糖的测定。鞠烷先等【兕】用电沉积的方法制备了壳聚 糖和碳纳米纤维的复合物，并将此复合物用于固定k 5 6 2 细胞，构建了一种具有 较好的生物相容性和导电性的细胞传感器。杜丹等【7 3 j 采用电沉积方法制备壳聚 糖和金纳米粒子复合膜，由于这种复合膜表现出良好的生物相容性和稳定性，可 用于固定乙酰胆碱酶来测定有机磷杀虫剂。 1 2 生物传感器 生物传感器由于灵敏度及选择性高，能将分离过程和检测过程技术合为一 体，因而受到广泛重视，目前发展很快，已用于临床医学检测、工业过程控制、 环境检测、化学物质安全性评价以及食品、制药等许多领域。而电化学传感器由 于器测定原理相对简单，仪器设备价格便宜，目前在各种传感器中起着主导作用， 其研究已经取得显著进展。 1 2 1 电化学生物传感器 绪论 电化学生物传感器是以生物材料为敏感元件，以电化学电极为信号转换器， 以电势或电流为特征检测信号的生物传感器。由于电化学生物传感器表面的微结 构可提供各种能利用的势场，使待测物质能进行有效的分离富集，调整控制电位 又能进一步提高选择性，而且还能把测定方法的灵敏度和表面物质化学反应的选 择性相结合，因而可以认为电化学传感器是把分离、富集和选择性测定三者合而 为一的理想体系，其在提高选择性和灵敏度方面具有独特的优越性。电化学传感 器种类繁多，在生化传感器研发及其商业化领域中处于重要地位，可广泛应用于 医疗保健、食品工业、农业、环境等领域，被认为是2 l 世纪最具有前途的研究 领域之一。 酶是一种能催化生命体系的化学反应蛋白，作为催化剂，它具有催化效率高， 选择性好等优点，因而，生物电化学，特别是酶的电化学是电化学研究中极为活 跃的领域【7 。酶传感器反应原理是传感器敏感膜中包含有固定化的酶，当酶与 待测物质反应时，反应产物被传感器响应。关于酶电极的报道出现在6 0 年代1 7 5 】。 目前已经报道的酶传感器有几百种，商品化的有几十种，如葡萄糖氧化酶电极传 感器、l 一乳糖单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器、胆固醇传感器、生化 需氧测定仪等。通过对酶电极进行深入研究不仅可以获得其热力学和动力学性 质，还可以了解生物体内的能量转换和物质代谢，探索生物分子的结构及其在生 命体内的生理作用和作用机制，这些研究对理解基于组织、细胞、微生物分子的 传感器也有着重要的意义。 1 2 2 生物传惑器的三代历程 按照酶或者其它生物分子与电极之间的电子转移机理，生物传感器可以分为 以下所示的三代传感器【7 6 1 。 1 2 2 1 第一代生物传感器 用酶的天然电子传递体一氧来作为酶与电极之间的电子通道，直接检测酶反 应底物减少或者产物生成的传感器，称为第一代生物传感器。以葡萄糖氧化酶为 例，此类生物传感器通过检测反应物的消耗( 0 2 的减少) 或产物的增加( h 2 0 2 或者 一) 来反应检测浓度的变化。但这种检测易受环境中氧分压的影响，响应时间较 长且难于进行活体分析，灵敏度也不高，同时，h 2 0 2 在金属电极或者碳电极上 存在着氧化过电位高，抗坏血酸、尿酸等干扰严重的特点。 1 2 2 2 第二代生物传感器 为克服第一代生物传感器受氧分压和溶解度影响、h 2 0 2 过电位高，干扰多等 限制，自7 0 年代起人们开始用小分子电子媒介体代替氧沟通酶活性中心与电极 6 绪论 之间的电子通道，通过检测媒介体电流的变化来检钡4 底物浓度的变化。目前用于 生物传感器研究的电子媒介体按分子结构特点和分子量大小可以分为有机小分 子和高分子媒介体。有机小分子媒介体包括：二茂铁及其衍生物 7 7 , 7 8 、钌和锇等 金属的配合物 7 0 - 8 1 】、有机染料f s 2 - s 4 、醌及其衍生物【8 5 l 、四硫富瓦烯、富勒烯和 导电有机盐1 8 6 】等。它们具有以下优点：( 1 ) 能迅速与还原态酶反应；( 2 ) 过程的可 逆程度高；( 3 ) 有较低的氧化电位；( 4 ) 氧化态和还原态都较稳定；( 5 ) 对0 2 反应呈 惰性。第二个阶段是以媒介体修饰剂的电催化为基础丽构建的，它增加了化学修 饰层，扩大了基体电极检测化学物质的范围，同时也提高了测定的灵敏度。电子 媒介体的使用促进了电子传递，降低了工作电位，但加入的媒介体易污染电极， 影响电极的性能。 1 2 2 3 第三代生物传感器 第三代生物传感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极间的直接电子传递 制作的酶传感器。这种传感器已成为生物电化学研究最重要的发展方向之一。寻 找有效的方法和手段实现蛋白质和酶的直接电化学，以满足生物医学、环境监测 和工业快速分析的需要，必将成为这个领域的发展趋势。但氧化还原蛋白质与裸 露的电极表面直接接触通常会引起蛋白质的结构和功能发生变化，并失去活性， 使蛋白质在电极上的电子转移受到抑制f 8 7 1 ，而且蛋白质的电活性中心通常被包 埋，不易暴露，难于接近电极表面，因此实现蛋白质与电极间的直接电子转移通 常比较困难。 实现蛋白质的电子转移的方法之一为酶的各向异性和定向排列设计合适的 表面，如自组装单层表面。自组装单层表面是指某些物质通过静电吸附或共价键 合固定在固一液、固一气界面，自发地组装成一种热力学稳定且高度有序的单分 子层 s s 8 9 1 。含硫化合物在金电极表面 9 0 - 9 蜘、硅烷在二氧化硅f 9 6 p 7 或其它氧化物电 极表面都能发生这种自组装。它可以使固体表面带上所需的官能团，实现修饰电 极功能的多样化，提高检测的灵敏度和选择性，为生物传感器的制备提供了良好 的途径。 实现蛋白质的电子转移的另一种方法是将酶分子包埋在一些导电材料中。应 用这些导电材料构成的酶固定的基质某些意义上增加了电极的实际面积，他们允 许固定在这个基质中的远离电极表面的酶分子也能够实现电子传递。这一点对于 制备微型化的生物传感器非常重要。迄今为止，已有大量文献报道了酶在含有导 电纳米材料及导电聚合物膜中的包埋【9 8 1 。这种方法制备的传感器固定酶容量较 大，通用性强，可渗入特定粒子，以增加密度或赋予磁性等其它性质，因此得到 了较为广泛的研究。 新型纳米材料的合成为发展新型生物传感器提供了新的途径。纳米材料具有 绪论 比表面积大，表面反应活性高，表面活性中心多，催化效率高，吸附能力强等优 良的特性。当纳米材料作为酶固定的载体时，能增加酶的负载量，提高传感器的 灵敏度和选择性。例如金纳米粒子可以提高葡萄糖氧化酶的生物活性及葡萄糖传 感器的稳定性等 9 9 1 。 1 3 纳米材料 广义地说，所谓纳米材料，是指微观结构至少在一维方向上受纳米尺度 o h m 1 0 0 r a n ) 调制的各种固体超细材料，它包括零维的原子团簇( 几十个原子的 聚集体) 和纳米微粒；一维调制的纳米多层膜；二维调制的纳米微粒膜( 涂层) ： 以及三维调制的纳米相材料。简单地说，是指用晶粒尺寸为纳米级的微小颗粒制 成的各种材料，其纳米颗粒的大小应为纳米尺寸。目前，国际上将处于1 - l o o n m 纳米尺度范围内的超微颗粒及其致密的聚集体，以及由纳米微晶所构成的材料， 统称为纳米材料，包括金属、非金属、有机、无机和生物等多种粉末材料。纳米 材料研究是目前材料科学研究的一个热点，纳米材料是纳米技术应用的基础，其 相应发展起来的纳米技术则被公认为是2 1 世纪最具有前途的科研领域【i 吣1 0 6 】。 1 3 1 纳米材料的分类和特性 纳米材料可以根据化学组成、物理性质、内部结构和具体应用等进行多种分 类。其中按其结构可分为以下3 类：具有原子簇和原予束结构的称为零维纳米材 料；具有纤维结构的称为一维纳米材料；具有层状结构的称为二维纳米材料。( 1 ) 零维纳米材料：该材料在空间三个维度上尺寸均为纳米尺度，即纳米颗粒、原子 团簇等。但) 一维纳米材料：该材料在空间二个维度上尺寸均为纳米尺度，即纳 米丝、纳米棒、纳米管等，或统称为纳米纤维。( 3 ) - - 维纳米材料：该材料只在 空间一个维度上尺寸为纳米尺度，即超薄膜、多层膜、超晶格等。由于这些单元 具有量子性质，因此对零维、一维和二维基本单元又分别称为量子点、量子线和 量子阱。其中纳米粒子的研究开发时间最长、技术最为成熟，是制备其他纳米材 料的基础。 纳米材料的特性与其构成单元( 1 - l o o n m ) 的性质密切相关，而这些介于宏观和 微观原予、分子之间尺度的纳米粒子体系作为一类新的物质层次，出现了许多独 特的性质和新的规律，如：小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧 道效应及介电效应等。( 1 ) 小尺寸效应：当纳米微粒尺寸与光波的波长、传导电 子的德布罗意波长以及超导态的相干长度或穿透深度等物理特征尺寸相当时，晶 体周期性的边界条件将被破坏，声、光、电、磁、热力学等特性均会呈现新的小 8 绪论 尺寸效应。( 2 ) 表面与界面效应：纳米微粒由于尺寸小，表面积大，表面能高， 位于表面的原子占相当大的比例。这些表面原子处于严重的缺位状态，因此其活 性极高，极不稳定，很容易与其它原子结合，产生一些新的效应。( 3 ) 量子尺寸 效应：当粒子尺寸下降到最低时，费米能级附近的电子能级会由准连续变为离散 能级。纳米微粒的声、光、电、磁、热以及超导性与宏观特性有着显著的不同， 称为量子尺寸效应。( 4 ) 宏观量子隧道效应：隧道效应是指微观粒子具有贯穿势 垒的能力，人们发现一些宏观量，如磁化强度、量子相干器件中的磁通量等具有 隧道效应，称之为宏观量子隧道效应。由于以上4 个效应的存在，纳米材料呈现 如下的宏观物理性能：( 1 ) 高强度高韧性；( 2 ) 高热膨胀系数、高比热和低熔点：( 3 ) 异常的导电率和磁化率：( 4 ) 极强的吸波性；( 5 ) 高扩散性等。 1 3 2 纳米材料的应用 纳米粒子既不同于微观原子、分子团簇，又不同于宏观体相材料，是介于团 簇和体相之间的特殊状态，既具有宏观体相的饱和键合结构，又具有块体所没有 的崭新的物理化学性能，即它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的 性质和大块固体相比有显著的不同，从而使它在催化、粉末冶金、燃料、磁记录、 涂料、传热、雷达波吸收、光吸收、光电转换、传感等方面有巨大的应用前景， 可作为高密度磁记录材料、吸波隐身材料、磁流体材料、防辐射材料、单晶硅和 精密光学器件抛光材料、微芯片导热基片与布线材料、微电子封装材料、光电子 材料、先进的电池电极材料、太阳能电池材料、高效催化剂、高效助燃剂、敏感 元件、高韧性陶瓷材料、人体修复材料及抗癌制剂等。目前，虽然纳米材料的具 体应用还不是很多，但因其具有特殊且优异的性能而具有潜在的应用价值，因此， 纳米材料将具有广泛的应用前景i l 弘n l l 。此外，纳米材料还可用做敏感材料等， 可广泛应用于电子显微镜、核磁共振波谱仪以及太阳能装置中的光吸收材料、热 线性检测器的涂料等。 1 3 3 碳纳米管 自1 9 9 1 年l i j i m a 发现碳纳米管【2 】以来，碳纳米管因其独特的力学、电学和 物理、化学性质，吸引了无数的科学家对其制备、性能和应用等方面进行了大量 的研究，也取得了很大的进展1 1 1 3 - 1 5 6 。 碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b e ，c n t ) 是由碳六元环构成的类石墨卷曲而成的数层 同轴中空一维管状碳结构。碳纳米管层与层之间保持固定的间距，约为0 3 4 r i m ， 直径一般为2 - 2 0 n m ，而长度可以达到微米数量级。根据碳纳米管中碳原子层的 9 绪论 数目而分成单壁碳纳米管( s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e ，s w c n t s ) 和多壁碳纳米 管( m u t i p l e - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e ，m w c n t s ) 。碳纳米管在力学、电学、光学等 方面都具有优良的性能。在力学方面，碳纳米管有极高的强度、韧性和弹性模量， 可以作为扫描探针显微镜( 尤其是原子力显微镜) 的针尖，是碳纳米管最接近商 业化应用之一【1 1 6 1 。在电学方面，碳纳米管侧壁碳原予的s p 2 杂化形成大量离域的 i t 电子，这些电子可以被用来与含有7 c 电子的共轭化合物通过删t 菲共价键合作用 相结合，因此，具有良好的电学性质。利用碳纳米管的这些性质可以改善复合材 料的导电率并制备新型的导电聚合物复合材料。在光学方面，碳纳米管能在光电 子器件和激光防护材料得到应用 1 1 7 , 1 1 8 i 。此外，碳纳米管在氢气储存“9 1 、催化剂 材料l l2 0 j 等领域也具有广阔的应用前景。 近年来随着研究的不断深入，碳纳米管的研究热点转移到生物医用材料方 面，并在生物医学方面得到了广泛的应用。例如，用碳纳米管可以制备各种生物 传感器，生物医学微电子器件的导线、开关、记忆元件等l 坦卜控8 1 。但由于碳纳米 管具有高度的稳定性，一般情况下几乎不溶于任何溶剂，甚至在大部分溶剂中也 很难分散，这严重影响了对它的应用研究和应用范围。为了使碳纳米管在一般常 见溶剂中( 如水溶液中) 能具有很好的分散性能，在其表面进行修饰或功能化是常 见的方法【坦弘1 3 2 1 。用生物相容性好的天然高分子修饰碳纳米管，制备成碳纳米管， 天然高分子复合材料，是改善碳纳米管生物相容性的一种重要方法。而将碳纳米 管与壳聚糖结合制备复合材料，不仅有望于利用生物大分子的亲水性来改善碳纳 米管的分散性，更有可能赋予碳纳米管某些生物学的性质，为碳纳米管在生物医 学领域的应用提供了途径。 1 4 纳米复合材料 1 4 1 复合材料 材料科学是推动当代科学技术进步的重要支柱之一，复合材料作为材料家族 的新成员，越来越多地受到人们的重视和青睐。复合材料通常是由两种或两种以 上物理和化学性质不同的物质组合而成的一种多相固体材料。在复合材料中，通 常有一项为连续相，成为基体：另一项为分散相，称为增强材料。分散相以独立 的相态分布在整个连续相中，两相之间存在着相界面。分散相可以是纤维状、颗 粒状或是弥散的填料。复合材料中各个组分虽然保持其相对独立性，但复合材料 的性质却不是各个组分性能的简单加和，而是在保持各个组分材料的某些特点的 基础上，具有组分间协同作用所产生的综合性能。由于复合材料各组分间的取长 1 0 绪论 补短，充分弥补了单一材料的缺点，产生了单一材料所不具备的新性能。开创了 材料设计方面的新局面。 1 4 2 纳米复合材料的合成及其应用 几十年来，对纳米材料的制备、性能和应用等方面的研究取得了丰硕的成果。 自8 0 年代初r o y 和k o m a m e n i 提出“纳米复合材料”的概念以来，纳米复合材 料( n a n o c o m p o s i t e s ) 的研究得到迅速发展。与单一相组成的纳米结晶材料和纳米 相材料不同，纳米复合材料是由两种或两种以上的吉布斯固相至少在一个方向以 上以纳米级尺寸( 1 l o o n m ) 复合而成的复合材料。这些固定相可以是非晶质态、 半品质态、晶质态或者兼而有之，而且可以是无机、有机的或两者都有。纳米复 合材料广泛存在于整个生物体( 如植物和骨质) 中，真正人工合成的纳米复合材 料，如石墨层间化合物、层柱粘土矿物、粘土矿物有机复合材料和沸石有机复合 材料等较少。这类材料有有机和无机材料的特点，并通过两者之间的耦合作用产 生许多优异的性质，它们以其独特的光学、电学、催化性能和广泛的应用前景受 到人们关注，有着广阔的发展前景。纳米复合材料种类很多，根据材料类型的不 同可以将它们分为两部分，即无机载体和有机载体的纳米复合材料，其分类图如 图1 3 所示。 厂金属，金属 i r - 非聚合物纳米材料 金属，陶瓷 li 纳米复会材辩 i b ) ，说明去除s i 0 2 纳米粒子后，电极表面的膜 层内部存在均匀的孔道结构，大量的孔隙可供f e ( c n ) 6 4 - 3 - 通过而到达金电极表 面，但是由于c s 膜的存在使f e ( c n ) 6 4 - 3 - 向金电极表面扩散的有效面积变小，所 以i c i d ，其原因是孔隙中的s w c n t s 增加了三维多孔复合膜的导电性，使峰电流增 大。 p o t e n t i a l ( v ) 图2 2 不同修饰电极在5m mf e ( c n ) 6 “钧循环伏安图( 曲线a 、b 、c 、d 分别为裸金电极、 s w c n t s s i o t j c s 修饰的金电极、三维多孔s w c n t s c s 复合膜修饰的金电极、c s 膜修饰的 金电极的循环伏安曲线) 我们用电化学交流阻抗图谱( e i s ) 对不同修饰电极进行测定( 图2 3 ) ，同样以 f e ( c n ) 6 4 f e ：( c n ) 6 3 。为探针1 蚓。在裸金电极上交流阻抗图近似是一条直线( 图 2 3 a ) ，表明电极表面没有阻碍f e ( c n ) 6 * 0 。电子转移的物质，电化学过程受扩散控 制。当在金电极表面沉积一层s w c n t s s i 0 2 c s 杂化膜后，得到的交流阻抗谱图 薯lu 第2 章三维多孔碳纳米管壳聚糖复合膜的制备及其在生物传感中的应用 在高频区有明显的半圆出现( 图2 - 3 b ) ，说明电极表面有绝缘物质引入，探针在电 极表面的电子转移受到阻碍，其中半圆的直径代表电子转移电阻( r e t ) ，其大小标 志着电极表面修饰层对探针分子电子转移的阻碍程度，与只在金电极表面沉积 c s 相比( 图2 3 d ) ，r e t 减小，说明s w c n t s 提高了修饰层的导电性，使修饰电 极的电子转移能力显著增强。当用h f 溶液除去s i 0 2 后，r e t 迅速减小( 图2 - 3 c ) ， 这是因为电极表面已形成三维多孔的s w c n l 科c s 膜，膜内大量的孔道有利于探 针分子到达电极表面。以上现象与c v 实验所得结果相同。 z t d f 2 图2 - 3 不同修饰电极在5m mf e ( c i 皑4 的电化学阻抗图。裸金电极( a ) ；s w c n t s s i 0 2 c s 修饰的金电极( b ) ；三维多孔s w c n t s c s 复合膜修饰的金电极( c ) ；c s 膜修饰的金电极( d ) 2 3 3 三维多孔s w c n t s c s 修饰电极对h 2 0 2 的电催化 h 2 0 2 是一种重要的生物反应中间体和多种氧化酶催化生成的产物，例如可通 过检测葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成的产物h 2 0 2 的量来间接检测生物体内葡萄 糖的浓度。制备的三维多孔s w c n t s c s 修饰电极对h 2 0 2 的电催化性能有良好的 电催化性能。图2 4 为该修饰电极对不同浓度h 2 0 2 催化的循环伏安图。与裸金电 极对l m mh 2 0 2 的c v 图相比( 图2 - 4a ) ，三维多孔s w c n t s c s 修饰电极在0 1 v 左右 开始对h 2 0 2 还原，而h 2 0 2 还原的电位是0 1 5 v 。很明显，三维多孔s w c n t s c s 修饰电极能降低h 2 0 2 的氧化还原的过电位，从而可在低电位下检测h 2 0 2 ，而且， 三维多孔s w c n t s c s 修饰电极对h 2 0 2 的催化电流显著增大，且催化电流随着 h 2 0 2 的浓度的增大而继续增加( 图2 4b 一曲，在一0 1v 电位下，还原电流与加入的 h 2 0 2 的浓度在2 o 1 0 击5 o x l o o m 范围内呈线性关系，检测限为5 o x l o 。m 。 说明所制备的三维多孔s w c n t s c s 修饰电极对h 2 0 2 有良好的电催化性能，为进 第2 章三维多孔碳纳米管壳聚糖复合膜的制备及其在生物传感中的应用 一步制备葡萄糖生物传感器奠定了基础。 p o t e n t i 盘n 图2 4 对h 2 0 2 催化的循环伏安图( a 为裸金电极对1 o m mh 2 0 2 催化的循环伏安图；b ，c ，d ，e ，f 分别为三维多孔s w c n t $ c s 修饰电极对1 0 r a m ，2 0 m m ，3 0 r a m ，4 0 r a m ，5 0 m m ，6 0 m m h 2 0 2 催化的循环伏安图) 2 3 4 三维多孔s w c n t s c s 修饰电极构建条件的优化 制备三维多孔s w c n l s c s 修饰电极的过程中，s w c n r s s i o d c s 杂化膜的 厚度和s w c n t s 的浓度都会影响三维多孔s w c n t s c s 修饰电极对h 2 0 2 的催化 性能。 由于c s 是一种长链高聚物，其等电点为6 3 ，故在p h5 0 时带正电，可以 吸附大量带负电的s w c n t s 和s i 0 2 纳米粒子。电沉积时，由于溶液呈酸性，电 极表面析出氢气，电极周围溶液小离子浓度迅速降低，p h 值超出c s 的等电点， 导致电极附近吸附了s w c n t s 和s i 0 2 纳米粒子的c s 沉积到电极表面，从而获 得s w c n t s s i 0 2 c s 纳米粒子杂化膜。c s 膜的厚度受电位、c s 的浓度和沉积时 间的影响 6 5 1 ，因此，可通过调节以上因素来控制杂化膜的厚度。实验中发现， 如果延长电沉积时间或增大c s 的浓度，则所得的三维多孔杂化膜的厚度增加， 对h 2 0 2 的催化电流也增大，但杂化膜的厚度过厚会造成背景电流的增大和响应 时间延缓。实验结果表明，选择c s 的浓度为0 2 5 w t 、沉积时间在2 0r a i n 时效 果最佳。 实验中还研究了s w c