（分析化学专业论文）多糖类物质的光谱和电化学分析方法的研究.pdf

宣曼型垫查堂塑塑皇堂壁堡苎 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 摘要 糖类物质不仅是自然界中全部生命体的重要组成部分，还是一种重要的信息 分子，在生命科学、化学、医学等学科研究中都具有举足轻重的地位。光谱和电 化学方法具有仪器价格便宜、实验操作简单、灵敏度高等优点，在生物大分子与 有机小分子相互作用的研究中广泛应用。本论文以生物多糖肝素钠为主要研究对 象，由于肝素钠本身没有光谱和电化学信号，采用有机小分子染料作为光谱和电 化学探针，利用其能与多糖糖苷链上的某些基团发生静电结合非共价键的相互作 用生成生物超分子复合物的本质，以及分子识别反应导致溶液的光谱和电化学信 号发生变化的现象，将光谱分析和电化学分析同多糖类物质的检测相结合，开展 了生物多糖光谱和电化学分析新方法的研究。本论文主要包括以下内容： 1 选择了中性红和吖啶橙为光谱探针，利用分光光度法对肝素钠进行了测 定。 根据有机小分子自身光谱特性，研究了体系加入肝素钠前后光谱信号的变 化。从紫外一可见光谱图可以观察到有机小分子在紫外可见区有最大吸收峰，当体 系中加入一定量的肝素钠后，溶液颜色变浅，最大吸收波长处的吸光度降低，表 明有机染料与加入的肝素钠发生结合反应，生成了生物超分子复合物。对体系的 识别条件进行了优化，考察了常见干扰物质如金属离子和氨基酸等对测定的影 响。在最佳条件f ，建立了测定肝素钠的工作曲线，并将所建立的方法应用于肝 素钠注射液的测定，结果令人满意。用摩尔比法计算了体系的结合比。 2 选择了甲基紫、结晶紫、吡哕红b 、亮绿等为电化学探针，用电化学分 析法对肝素钠进行了测定。 电化学分析法由于灵敏度高、选择性好、适用范围广，成为研究生物大分子 结构与功能关系的有效方法，也可以用于多糖类物质的分析。依据肝素的结构特 点选择了相应的有机小分子染料如甲基紫、结晶紫、吡哕红b 、亮绿等作为电化 学探针，以滴汞电极、静汞电极等为工作电极，采用循环伏安法、线性扫描极谱 法等电化学手段，根据分子识别前后体系电化学信号的变化，建立了多糖分析的 新方法。在一定条件下，有机小分子在汞电极上可以发生电极还原反应，从而出 现良好的线性扫描极谱波，当加入肝素钠后，峰电流明显降低，峰电流的降低值 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 与j h , x 的肝素浓度呈i f 比，由此可以对肝素钠进行分析，建立了分析测定肝素的 新方法。将建立的新方法对肝素钠实际样品和模拟样品进行了测定，结果令人满 意。对染料肝素反应体系在汞电极上的电化学行为作了详细的讨论，计算了相关 的电化学参数，利用电化学方法对反应体系的结合比和结合常数进行了推导。 关键词：分光光度法电化学分析法肝素中性红吖啶橙甲基紫结晶紫吡哕 红b 亮绿相互作用超分子复合物 妻鱼型垫查兰盟塑竺堂堡丝墨 s p e c t r o p h o t o m e t r i ca n d e l e c t r o c h e m i c a ls t u d i e so n g l y c o & u 垤i n o g l y c a n s g l y c o s a m i n o g l y c a n s ( g a g s ) a r em o s ti m p o r t a n tc o m p o n e n ti n a l ll i v e so ft h e w o r l d ，w h i c hp l a ys i g n i f i c a n tr o l e si nt h er e s e a r c hf i e l d so fl i f es c i e n c e ，c h e m i s t r ya n d m e d i c i n ea si n f o r m a 抽nm o l e c u l a r s p e c 仃o p h o t o m e t r i ca n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s h a v em a n ya d v a n t a g e ss u c ha sc h e w e ra p p a r a t u s ，s i m p l i c i t yo fo p e r a t i o na n dh i g h s e n s i t i v i t y , s ot h e yw e r ew i d e l yu s e d i nt h er e s e a r c ho ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n b i o m o l e c u l a ra n do r g a n i cm o l e c u l a r i nt h i st h e s i s ，h e p a r i ni ss e l e c t e da sm o d e lo f g a g sf o rt h ei n v e s t i g a t i o n ，w h i c hh a sn os p e c t r o p h o t o m c t r i ca n de l e c t r o c h e m i c a l r e s p o n s e si t s e l f s e v e r a lo r g a n i cd y e sa r es e l e c t e da sp r o b e sf o rt h es t u d i e so nt h e i n t e r a c t i o nw i t hh e p a r i n w h i c hc a ni n t e r a c t 耐mh e p a r i nb ye l e c t r o s t a t i cf o r c et of o r m as u p r a m o l e c u l a rc o m p l e x ，a n dr e s u l ti nt h ec h a n t so fs p e c t r o p h o t o m e t r i ca n d e l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s e t h ec h a n g e so fa b s o r b a n c co rc u r r e n t sa r ef u r t h u ru s e dt o e s t a b l i s hs e n s i t i v ea n a l y t i c a lm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh e p a d n t h ep a p e rc a nb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h es p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o df o rh e p a r i na r ee s t a b l i s h e du s i n gn e u t r a lr e d ( n r ) a n da c r i d i n eo r a n g e ( a o ) a ss p e c t r o p h o t o m e t r i cp r o b e n ra n da oh a ss p e c i f i c a b s o r p t i o ns p e c t r ai nt h ew a v e l e n g t hf r o m3 0 0 t o7 0 0n i n a f t e rt h ea d d i t i o no fh e p a r i n ， t h ea b s o r b a n c ev a l u ed e c r e a s e dg r e a t l y , w h i c hi n d i c a t e dt h a ta ni n t e r a c t i o nh a dt a k e n p l a c ei nt h em i x e ds o l u t i o n t h ec o n d i t i o n so ft h eb i n d i n gr e a c t i o nw e r eo p t i m i z e da n d t h ei n f l u e n c eo fs o m ec o e x i s t i n gs u b s t a n c e ss u c ha sm e t a li o i i sa n da n l i n na c i d sw e r e i n v e s t i g a t e d u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，t h ew o r k i n gc u r v eo ft h eh e p a r i nw a s e s t i b l i s t i e da n dt h ed e c r e a s eo fa b s o r b a n c ea tm a x i m u m a b s o r p t i o np e a kw a si nl i n e a r 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fh e p a n ni nac e r t a i nr a n g e t h em o l a ra b s o r p t i v i t yo ft h e m e t h o da n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw e r ec a l c u l a t e d t h ep r e s e n tm e t h o dw a sa p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fh e p a r i ni n j e c t i o ns a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h eb i n d i n g n u m b e rw a sc a l c u l a t e db ym o l a rr a t i om e t h o d 2 t h ei n t e r a c t i o no fo r g a n i cm o l e c u l e ss u c ha sm e t h y lv i o l e t ( m ，c r y s t a lv i o l e t ( c 、，) ， p y r o n i n eb ( p b ) a n dl i g h tg r e e n ( l g ) w i t hh e p a r i na r e s e l e c t e da n du s e da s e l e c t r o c h e m i c a lp r o b e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o n t h eo r g a n i cp r o b e sa r ee l e c t r o a c t i v ea n d c a nb ee a s i l yr e d u c e do nt h em e r c u r ye l e c t r o d e o nt h ea d d i t i o no fh e p a f i na n dd u et o t h ei n t e r a c t i o n ，t h er e d u c t i v ep e a kc u r r e n td e c r e a s e dg r e a f l y t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fo r g a n i cm o l e c u l e sa n di t si n t e r a c t i o nw i t h h e p a r i na r ec a r e f u l l ys t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r ya n dl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fb i n d i n gr e a c t i o na n de l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o ns e l e c t e d u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，t h ew o r k i n gc u r v eo ft h eh e p a r i nw a se s t a b l i s h e d t h e p r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fh e p a d ni n j e c t i o ns a m p l e sa n d a r t i f i c i a ls a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h eb i n d i n gr a t i oa n dt h eb i n d i n gc o n s t a n t a r eg o tb ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o da n dt h ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r sa r ec a l c u l a t e d k e yw o r d s ：s p e c t r o p h o t o m e t r i c ；e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s ；h e p a r i n ；n e u t r a lr e d ； a c r i d i n eo r a n g e ；m e t h y lv i o l e t ；c r y s t a lv i o l e t ；p y r o n i n eb ：l i g h tg r e e n ； i n t e r a c t i o n ；s u p r a m o l e c u l e 青岛科技人学研究g 一学位论文 第一章文献综述 糖类是一种重要的生物人分子，它是存在j 二高等植物、动物细胞膜、微牛物 的绌胞壁中的天然大分子物质，是由单糖基以糖苷键相连而形成的高聚物，是含 多羟基的醛类或多羟皋的酮类化合物。糖类利蛋门质、核酸一样，不仪是高密度 的信息载体，而且是基因信息的延续。大罩事实表明糖类参与许多! j i 理和病理过 程，许多疾病的发生和治疗都与其有密切的关系。它不仅能够产生和储存能量， 也可以为细胞提供动力支持；糖类的氧化是整个7 卜物圈产生能量的最基本的代谢 过程；它还是所有乍命有机体的重要的、独特的组成成分与维持生命所必须的结 构材料。如小质植物的纤维素、细菌的细胞壁，以及中虫的外壳、甲壳都属j 。糖 类；糖类能影响分子的抗原性，人类的a 、o 、b 血型以及市h 关血型抗原性是由 糖链决定的：糖l ， 作为信息分了的受体，通过糖类和蛋白质的相互作用，诱发， 计多生理和病王甲过程；糖类还可作为动态调市的信号，通过蛋白质残基的糖基化 对蛋白质的些功能进行动态调节。 近1 0 午来对糖类的结构测定利研究已经成为人们竞棚研究丌发的目标 1 1 ，并 已取得了长足进展，大量的实验结果揭示了糖类也是重要的信息分了，参- r 许 多生理和病理过程，有关的研究渗透到生物学的各个领域。人们利用重组d n a 技术生产了十几种有治疗作用的糖蛋白，而目重销蛋白中的糖对基因糖蛋白药物 产生了作用，如影响其稳定性和生物有效性。研究还表明多糖具有许多方面的牛 物活性，日多数无毒，是一类比较理想的药物。现在，人们已经对发展糖基消炎、 抗肿痛药物产生了浓厚的兴趣，并且证明了蛋门质糖基化作用中的变化对j r 多种 人类疾病的诊断是非常有用的。随着刈糖蛋白生物重要性认识的深入，人们越来 越需要宵种快速、方便、低价的分析方法去描述糖蛋广中糖部分的内容和结构。 冈此对糖类物质的研究及其分析方法在：十一世纪的牛命科学领域有着深远的 作用。 1 1 生物多糖的分类、结构、功能和研究意义 1 1 1 生物多糖的分类 糖类物质按照糖的结构可分为单糖、寡糖、多糖及糖复合物四大类。 不能被水解为更小的糖为单糖。根据精分子r r 含碳原子数的多少u 分为丙 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 糖、戊糖、己糖等。其中戊糖和己糖在自然界中分布最广、意义较大。如核糖、 脱氧核糖为戊糖，是构成核酸的基本组分；葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖为己 糖，是形成糖原、淀粉等多糖的基本单元。 能水解为2 - 6 个单糖分子的糖为寡糖。蔗糖( 葡萄糖一葡萄糖) 、麦芽糖( 葡萄 糖一果糖) 、乳糖( 半乳糖葡萄糖) 是寡糖的重要代表。 能水解为多个单糖分子的糖为多糖。多糖在自然界中无所不在，按照来源可 分为哺乳动物类多糖、原生动物类多糖、植物类多糖、藻类多糖和微生物类多糖： 按照结构可分为同聚糖( 糖原、淀粉、纤维素、葡聚糖等) 、同聚氨基糖( 甲壳 素等) 、同聚糖醛酸糖( 果胶酸、藻酸等) 、异聚糖( 多为糖胺聚糖类，如神经氨 酸、硫酸角质素、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等) 。 糖复合物是糖类和蛋白质或脂类形成的共价结合物，“泛分布于细胞膜、细 胞质和胞外基质中，在生命过程中发挥巨大作用，其生理学功能尚在研究中。根 据组分的不同可分为蛋白聚糖、糖脂、蛋白质糖脂复合物。 1 1 2 生物多糖的结构与功能 对于生命和生命过程复杂性的研究是当前生命科学领域研究的热点课题。生 物系统的复杂性不仅在于其组成、结构的复杂性，还表现在生物系统中化学过程、 生物应答的分子机理等方面极具复杂性，其中生物大分子结构和功能的复杂性是 生物学家共同关注的问题。 糖类物质的结构非常复杂，其多数是由各种不同的单体通过各种各样不同类 型的键互相连接成的具有复杂立体结构的分支状物质，并且与蛋白质和脂类形成 多种糖复合物。但在不同条件下，糖类物质的分子构型、自身物理常数( 如粘度 等) 都会发生显著的变化，如有的溶于水，有的则只能溶于有机溶剂、酸或碱液 中，这就决定了生物多糖活性的环境影响因素的多样性。这些影响因素有温度1 2 1 、 口h 值、浓度、溶剂【3 l 、相对分子质量、放置时间、纯度、添加剂以及其它一些物 理因素等等。生物大分子的空间构象是决定其活性的重要因素，其结构与功能的 关系密不可分，因此糖的空间结构的研究极端重要。糖类的结构与功能关系的研 究，成为当今生命科学的最前沿领域之一。 糖类具有一级结构、二级结构、三四级结构，如此复杂的结构，对化学家来 说研究糖类物质步履维艰。糖类与蛋白质及核酸分子相比，其糖链“一级”结构 的含义要丰富得多，主要表现在：( 1 ) 糖链的糖基组成、各种单糖的分子数比例； ( 2 ) 每个单糖残基的d 一或l 广构型，吡喃环或呋喃环形式；( 3 ) 各个单糖残基之 间的连接次序；( 4 ) 每个糖苷键所取的a 或d 一异构形式；( 5 ) 每个糖残基上羟基 被取代的情况；( 6 ) 糖链与非糖部分( 肽链、脂类物质等) 连接点的情况。另外， 2 青岛利技人学研究生学何论文 与蛋白质和核酸分子相似，糖及糖复合物还具有复杂的高级结构。 随着现代分析技术的发展与进步，阐明多糖的1 级结构已建也了许多分析方 法，新技术不断引入到糖链的结构分析中l4 i 。日前能有效分析糖的一级结构的方 法有化学方法、物理方法和生物方法。化学方法包括水解法、高碘酸氧化法、s m i t h 降解、甲基化反应、免疫学方法、仪器分析法。物理方法主要有红外光谱、核磁 芡振波培、气相色谱、质谱、气质联用、毛细管电泳等。生物学方法主要是利用 特异性糖圩酶进行的酶法分析。多糖分子是类生物大分子物质，测定其：维结 构十h 当困难，迄今为l r ，x 劓线衍射分析是较好的满足生物大分子空间构象分析 的方法和技术p j 。 多糖的构效关系( 多糖的级结构和高级结构，其生物活性的关系) 的研究 是多糖乍物学的1 个主要领域，是当6 u 糖化学和糖生物学共州天注的焦点0 日题。 多糖的高级结构与其生物活性的天系全令尚不十分清楚，但高级结构比缎结构 存活性方而起更大的决定作用，对丁返观点的认识则是一致的。具有何种结构 的多糖4 具有活性、结构的改变如何影响多糖的活性，这此方向的研究为；7 找具 乍物活性多糖和多糖药物的_ j | ：发提供r 基础。但多糖的构效关系的研究至今还1 i 完善，通常足通过得到活性多糖较为准确的一级结构，然后将特定的物弹常数计 算利现代分析疗法联合，从而推断多糖的高级结构，并利用多糖高级结构模型与 生命细胞受体模型推断多糖的作用方式，可为人们筛选和改造生物多糖提供必要 | 【| 勺理论皋础。近午束，以精确三维结构知识为基础，揭示酉要生命活动觇律的研 究已达到前所未有的深度和广度【6 l 。多糖作为类重要的生物活性大分子，其结 构的研究势必推动对多糖的认识向深层次发展。为提高多糖的活性，多糖分子修 饰( 结构改造) 研究也有很大进展，将多糖或寡糖进行衍生化，如降解、硫酸化、 磺酰化、乙酰化、烷基化等，台”j 能大大提商多糖的生物活性。 糖类物质足继蛋白质和核酸后新发现的又一类型的信息载体，它具有相对稳 定性、生物安全性、生物相容。| 牛、生物降解性、粘度可调肖性、会属离子络合性、 吸湿保溻性、成膜性、絮凝性、凝胶性、生物再叶 件和多种生物活性( 免疫、抗 感染、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗变性反惠等) 。斟此，生物多糖在医药、食 品、化学、f 1 用品、生物技术、农业及环境工程等领域均有重要应用【7 】。 牛物学家对此产q i 了极大的兴趣并刈具有牛物活阡的糖复合物中糖链部分 的功能做j ，一衅推测，发现糖类物质仃以卜- 几点功能： ( 1 ) 糖成分的存存可能起到保护7 之相连的蛋白质部分以防f 卜体内广泛存 在的蛋白质水解酶刘蚩广1 质的分解。 ( 2 ) 糖部分影响勺之相连的蛋白质的折叠和构象，从而改变整个蛋白聚糖 的物理化学性质和生物活性。 3 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 ( 3 ) 有些带有负电荷的糖组分不但影响整个蛋白聚糖分子的性质，而且会 因其在细胞表面的分布影响整个细胞的行为。 ( 4 ) 糖组分有时可成为糖复合物的标记物，经过细胞表面的受体识别后， 参与细胞粘着等生理活动。 近年来，由于糖的特殊生理功能，对糖类物质的研究愈来愈受到生物学家的 重视。随着免疫物质、生物模拟以及多种生物活性物质的研究进展表明，糖类在 生物体内的功能已不限于提供能量和参与结构，同时还具有多种多样的生物学功 能，在生命活动中参与了细胞的各种活动，如多糖的糖链能控制细胞的分裂和分 化、调节细胞的生长和衰老等。 我国是中药的起源之地，而糖类是中药材中普遍存在的成分，因此在对各种 中药材的化学成分研究过程中，都少不了对其中多糖成分的关注，尤其是植物多 糖的研究已成为关注的热点l 0 】。药理实验证明：不同的植物多糖具有不同的免 疫促进作用。如香菇多糖具有对胆固醇溶解作用，其含有一种干扰素诱导剂，能 干扰病毒蛋白质的合成，提高抗病毒免疫力；它还是理想的免疫促进剂，作为t 细胞定位的佐剂和辅助t 细胞刺激参与集体免疫增强作用；茶多糖具有明显的降 血糖的作用；黑木耳多糖具有缓冲动脉浆样硬化、抗辐射的功能；银耳孢子多糖 具有抗放射的作用：人参多糖、枸杞多糖有抗突变活性的作用；硫酸酯化多糖能 抑制靶细胞与病毒结合，增强机体免疫作用，作为抗生素，可以治疗艾滋病已引 起人们的广泛重视。 以下为几种典型生物多糖类物质： ( 1 ) 壳聚糖( c h i t o s a n ，简称c t s ) ，是自然界中唯一的碱性多糖。c t s 为白色、 淡黄色片状或青白色粉末，不溶于水，可溶于醋酸和无机酸等稀酸溶液，是线性 聚合物甲壳质脱乙酰后的产物。c t s 及其衍生物是重要的生物活性物质，具有抗 肿瘤、抗血栓、抗血脂和增强免疫力等功斛1 1 卅3 1 。c t s 在生物医学、环境科学、 农业、食品、化妆品等领域都有广阔的应用前景，可用作医药保健品等的添加剂， 也可作为制备人造皮肤和手术缝合线等的重要原料。目前各国对c t s 及其衍生 物的研究越来越关注，尤其是对c t s 的生物活性及其在生物体内的作用机理已成 为研究的热点。近几年来，世界上有许多国家都致力于c t s 产品的开发并有产品 上市，但c t s 的含量测定多采用酸水解间接比色法进行分析，此法操作繁琐，不 适合复杂样品中微量c t s 含量的分析检测。焦庆才等【m 1 6 】对c t s 与锌试剂和茜 素红等相互作用的机理和应用进行了研究，建立了具有高选择性和高灵敏度的简 便、快速测定c t s 的分光光度法。 ( 2 ) 肝素( h e p a r i n ，简称h e p ) ，是由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛 酸组成，在水溶液中由于其酸性基团的离解而成为带多个负电荷的大阴离子l ”。 4 青岛利技大学研究生学位论义 肝素具有广泛的生物学功能，在人体内由肥大细胞分泌而自然存在j 二血液巾，存 血渗析和体外血循j ；i = 巾均柏延缓或阻j r m 液凝固的作用。h e p 或其衍，物逊可用 丁渊肖血脂、抗血栓、改善血液流变学指标、抗炎、抗过敏及免疫调市等，是重 要的生化药物之- - 1 8 1 。刈不刚的疾病，h e p 有不1 爿的最遁剂量，临床上常采用生 物方法f 1 9 1 来进行监控。但由于受生物个体的影响较人，故使其席用受到限制。刘 缁璞【2 0 1 等人采用分光光度法剥不同染料作为小分子探针与h e p 的结合反应体系 进行了探讨。 ( 3 ) 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ，简称h a ) ，是乙酰氨皋葡糖( c 8 h , 5 n 0 6 ) 和葡糖 醛酸的交替共聚物【2 m 羽，分子量在1 o x l 0 6 。8 o x l 0 6 范围之内。h a 足人体和动物 体巾重要的。种多糖成分，它实际卜以钠盐的形式广泛存在丁所有脊椎动物的结 缔组织巾，起润滑关市和在剧烈运动时起减震、吸收冲击的作用，从而使关节免 受伤害。它还能维持体内水分平衡等生理作用，伍新血管形成，外周神经冉生等 生理过程- p 也具有重要意义1 2 3 。】；它还存在于连续状球茼的荧膜巾，是脊椎动物 和细菌部具有的少数几种氨基葡糖聚糖之。高分子量的h a 分子卷成一紧密的 螺斟，这一构象赋予它具有吸收l o o o 倩_ j 自重的水的能力，甚至在吸收厂这样 多水的情况卜，其水溶液的粘度还要比水自身的粘度大1 自力倍。因此分子量大 小是h a 应用的首要冈素。h a 的其它心用包括创伤护理、皮肤保养和约物缓释 等。它能为严重的烧伤提供一层保护膜，既能阻挡绌菌义能让氖气透过，还能在 创伤和刎带之f i i j 形成隔离层，防止它们粘连1 2 8 1 。 ( 4 ) 硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，简称c s ) ，足r 泛存在动物软骨中的一 类酸性粘多糖，具有许多重要的生理活性和药理作用。c s 具有特殊的免疫抑制 作用，如抗关仃炎、调节血脂等作用，还可防止动脉粥状硬化，在临床上j 司于治 疗风湿痛、灭节炎、神经痛及腰痛都有较好效果，因此广泛用于临床、化妆品和 医用材料等领域。夸克安等1 2 9 j 用分光光度法、瑞利光散射法和圆：色性法等光谱 技术研究r 硫酸软骨素与业甲摹蓝( m b ) 的_ 卡 | 互作用及其分析应用。 1 1 3 生物多糖的研究意义 蛋n 质、核酸和糖类物质足牛命活动中最基本的_ ：三人类重要物质。多年来， 人们一直致力于研究蛋白质和核酸在生命过程巾的重要作用，以蛋白质工稗和基 因工程为代表的生物工程已经大大造福于人类卡 会。随着“多糖时代”的到来， 2 l 世纪生命科学的研究焦点是对细胞生物的多层次生命现象的阐释，因此对，卜命 体内细胞识别和调控过程的信息分子糖类的研究是必不可缺的。糖生物学是 生物化学和生物医学交叉点的前沿，它涉及列计：多生物学科，如分子生物学、绌 胞生物学、病理学、免疫学、神经叶i 物学等等。糖生物学的研究与发展，毫无疑 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 _-h_-_-_一一 问推动着这些学科的发展，同时，多糖的资源开发、结构分析、结构改造、药理 机能、合成机理及控制等各个方面都将会有较大的突破。各种生物多糖对人体有 着不可忽视的作用，因此人类进入了研究提取利用生物多糖的阶段。各 国学者从各种生物材料中寻找与提取具有一定生理活性的多糖成分的研究十分 活跃，从而使多糖类物质的研究有了空前迅速的发展。但就其研究现状而言，糖 类尽管取得了巨大的研究进展，但与蛋白质和核酸的飞跃式发展相比，显得远远 落伍。这是因为，最初在糖类的认识方面还停留在储能物质和结构组分这一观念； 其次，多数糖类物质是由不同的单体以不同类型的键互相连接成具有复杂立体结 构的分支状物质：最后，糖类还可与蛋白质和脂类等形成多种糖复合物，而且在 自然界中分布十分广泛并且分离提取困难，因而在人们的认识过程中具有很大的 难度。 随着生命科学的发展和分离提取技术的提高，新的合成手段及分析方法也不 断发展，使得人们对糖类物质的认识逐渐深入，许多糖类物质得到了广泛的应用。 糖类物质的重要生理作用如在机体免疫、细胞识别、信息传递等生命活动中具有 的重要作用日益受到人们的重视。目前，对糖类物质的合成方法、结构测定、结 构与功能关系以及糖类药物开发等方面进行深入的研究已成为分子生物学发展 过程中的又一次高峰【3 0 “】。 糖类药物的开发也具有深远的意义。药用多糖能治疗多种免疫缺损疾病；细 胞表面的糖复合物与许多疾病的发生密切相关：病原体依靠细胞表面的糖蛋白和 糖脂将自身寄身于某种客体，并且迅速扩散；癌细胞利用细胞表面的糖复合物避 开人体免疫系统的监视；有害的炎症反应常常由糖类物质引发。糖类物质与肿瘤、 肝炎等疾病的发生发展之问的关系是糖生物学家十分关注的问题之一。目前，糖 类药物正在开发与应用之中。一些糖类抗肿瘤疫苗使得免疫系统能更灵敏地发现 癌细胞的转移扩散；治疗炎症的糖类药物取决于开发有效的选择蛋白抑制剂，从 而破坏选择蛋白与细胞的键合；抑制肝炎病毒的糖类药物克服了传统药物的副作 用；治疗糖脂储积病的糖类药物十分有效，在临床试验中已获得成功。 糖类物质对整个人类有着不可忽视的作用，但也存在着许多难点：( 1 ) 糖类 药物与它们的目标“靶子”的结合较弱，这意味着需要较大的剂量才能产生效果： ( 2 ) 这些药物分子易于被破坏或从体内清除出去，不易吸收；( 3 ) 糖类药物不 易穿透细胞膜；( 4 ) 糖类药物的分支结构难以合成，生产成本高。然而许多研究 糖的专家认为糖类药物开发具有光明的前景，并采取多种方法克服糖类药物开发 中的种种困难。 近几十年来，由于相关研究包括膜的化学功能、免疫物质的研究以及对新药 物资源的寻找等，人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料，更 6 青岛科技人学研究生学位论文 重要的足它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的牛物学功能。因 此糖的研究逐步活跃起来，其巾，一些分子量在几r 以上，具有很强生物活性的 活十牛多糖的研究受到h 益重视。这些活性多糖的生瑚活性、化学结构以及构效关 系成为多糖研究的前沿阵地，取得_ 广很大的进展1 3 2 1 。 2 1 世纪是海洋的世纪，随着陆地资源的逐渐匮乏，探索海洋、丌发海洋、从 海洋中索取资源，变得h 益迫切，面海洋药物的刀发迫在眉睫。月前，荚皿j 、闩 水、德国走在世界的前列，卜在进行大量的生物研究。我同的科学家也作r 人量 的研究工作，有很多种海洋多糖类物质已经商品化。海洋生物多糖的药用潜力逐 渐被发挪出来，比陆地植物多糖更多的药用价值逐渐被发现，如螺旋藻多精等已 被制成药品和保健品。 1 2 生物多糖的分析方法研究进展 大约存1 0 0 年前德罔著名的科学家e m i l 就，r 始了对糖类的研究。】0 0 多年来 人们逐渐对多糖这一类重要生命物质产牛r 新的认识，从而使这一学科成为目前 乍命科学中研究最活跃的领域之一 3 3 l 。 近1 1 b 年来，我酬科技工作者在多糖的研究中，特别是真菌多糖和传统的中医 药多糖研究中取得了一定的成果。但是，国内多糖的研究一股仅限于分离纯化、 化学组成、，i - 物活性和免疫药删研究，而糖结构的分析和多糖构效关系研究没有 很大突破。而国外，特别是n 小学者加强了对中药多糖活性片段( 活性决定簇) 的化学结构与功能荚系的系统研究【3 4 1 ，并在柴胡、当归多糖研究方面取得r 突破 性进展，他f f j 认为多糖像蛋白质和酶一样呵能在多糖分子中存在一个或几个寡糖 片断的“活性中心”，并从大量巾药多糖一级结构中探索其活性片段。研究多糖 的活性j 【i 段及活性片段与多糖之间的关系，不仅有利于研究复杂的多糖结构，而 且对描刁亡多糖结构与功能的关系，对阐明多糖在机体内的吸收分布，代谢途径等 动态变化以及作用机制都有重要的价值，特别是多糖制品的功效和多糖类药物的 质量控制标准的研究都将起到重要促进作用。 从生命科学的角度柬看，糖类物质经过个世纪的不断研究，已有很大进展， 但是，由f 其结构的复杂性和研究手段的局限性，使得它的研究远远落后j 二其它 两类生物人分子蛋白质和核酸。这是凶为：糖类的结构比核酸和蛋白质复杂 得多，难以研究；早年发现糖类的功能比较单调，不易深入。而从近年来刈糖类 结构的测定和研究取得了艮足进展中人们认识到：糖类小仅是种重要的生命物 质，而且由丁糖结构的自身特性，使糖类成为携带着最人信息量的生命分f ，扯 卜物体内发挥多方向的生命作用。l 盘| 此，有人称糖生物学将足牛物化学中最后 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 个重大的前沿研究课题。研究糖类物质的结构与功能、大分子存在的形态、与小 分子的相互作用以及对糖类物质进行定性定量分析是生命研究科学中的重要课 题。因此，对糖类进行定性和定量的分析测定，无论是在化学方面还是在生命科 学方面必将具有重大的研究意义。 糖类的检测比较困难，因为它既无紫外吸收，又无荧光基团，因此糖类的检 测一般需要先进行预处理，即衍生化，使之具有u v 吸收、荧光特性或其它一些 可测定的物理化学性质。由于多糖结构的复杂性，在多糖一级结构的分析中，往 往需要使用多种方式获得糖链的一级结构信息。多糖的分离纯化就是将存在于生 物中的多糖解离出来以获取研究对象的过程，般这一过程包括分离、纯化和纯 度鉴定三步。其中分离纯化是多糖研究的关键，其成功与否、效果的好坏都会直 接影响后续研究的可行性与可信度。多糖是极性大分子化合物，不同的多糖提取 的溶剂不同，要尽量避免酸性溶剂，这会引起多箱中糖苷键的断裂。而有的多糖 则需要脱脂、脱色处理后分离，在进行纯化，将一些杂质去除。 糖类的分离一般采用色谱技术，如气液色谱( g l c ) 、薄层色谱( t l c ) 、高 效液相色谱( h p l c ) 、超临界色谱( s f c ) 及毛细管电泳( c e ) 。随着糖生物学 的发展和新技术的不断涌现，糖结构的分析方法不断进步。作为分离手段的色谱 技术和作为分析手段的质谱技术、酶学方法的联用已在糖的结构分析中得到广泛 地应用，而近来发展最为迅速的则是h p l c 和c e ，它们具有分离效率高、分析 时间短、进样量少、检测限低、多模式等特点。各种分离分析手段的自动化与智 能化使糖链的分析变得更为高效、准确、快速和灵敏。 1 2 1 分子光谱法 分子光谱法由于其仪器简便、易操作、能够对分子结构进行表征而成为研究 小分子与大分子结合反应及对生物大分子进行定量分析的重要手段。糖分子中既 没有吸光基团也没有发光基团，所以直接利用分子光谱法测定糖类有很大的困 难，因此，普遍采用的方法是向缺乏明显光学性质的糖类物质体系中加入光谱探 针( 如染料) ，使反应体系具有某种光学性质，继而可以采用分子光谱法进行研 究。由于有机染料较易得，而且稳定、廉价，因此染料结合法成为分子光谱研究 多糖的首选方法，并在应用中取得了很大成功。 1 2 1 1 分光光度法 分光光度法是基于长链多糖带有多个大阴离子，在水溶液中离解后可与染料 阳离子相互结合发生反应，从而引起染料吸收光谱的变化进行测定。已经研究过 的染料类型有碱性二苯基萘基甲烷染料、碱性三苯甲烷染料、碱性吩嗪类和碱性 8 青岛科技人学研究牛学位论文 吩噻嗪类染料等等。对结合反应的条件如缓冲溶液体系、反应溶液的温度以及常 见干扰离子等影响因素进 j 二了优化。结果表明除常见干扰物质外，其它凶素均会 影响多糖与有机小分子染料的结合反应，因此对反心的最佳条件进行了优化；离 了强度的增大会明显地f 扰结合反应的进 j ：，这是冈为溶液中存在了离子竞争反 应；常见金属离子、氨基酸等于扰物质对反心均不影响，这种方法具有选择性妤 的优点，可用丁实际样品的测定并取得较满意的测定结果。 g o l d 等1 3 5 i 曾利用阿利新蓝测定多糖，此方法不需加热、离心、长时问平衡和 复杂的仪器，并且蛋白质和单糖均不影响测定，iu 用于估测尿液和血液巾的总糖 胺聚糖的量。常理文等【3 6 1 在单糖的毛细管区带电泳分析中，对牛物体中常见的9 种单糖还原端接上强紫外吸收的n 萘胺基团划糖进行检测。刘绍璞等i ”2 0 1 月 碱忡 二苯基茶摹矸l 烷类染制利碱十牛二苯甲烷类染料为光潘探针，建立了分光光度分析 测定肝素的新方法，其中以乙基紫和维多利业监4 b 尤为灵敏。焦庆才等1 3 ”9 】，l f j 大苛a 分析测定透叫质酸和肝素钠，对空间定向和相互作用机理进行阐释，并指 m 分了的聚集状态对结合反应有一定的影响，糖类0 染料结合反应模式除了静电 力外，还存在疏水作用或耦合作用。 虽然分光光度法只有仪器简单、结果直脱等特点，但其灵敏度不够高，因此 一般用1 。常量糖的测定，而日在存线、存何、适时、微型化、自动化及多组分一j 时测定方面具有定的局限性，这就需要不断地探索新的显色试剂，研究新的反 应体系，进一步改善反应的分析性能并与其它分析手段联用，这些将成为分光光 度法的新的研究内容。 1 2 1 2 荧光分析法 荧光药物分析的迅速发展成为生物分析巾不可缺少的分析于段，这与该法的 高灵敏度利高选择性的特点足分不开的。但是糖类本身并没有荧光基团，要使用 特定的衍生化试剂1 糖发生反应，使糖类物质牛成具有荧光的物质。住h p l c 及 c er r | ，广泛应用必光探针对分离后的不同糖进行生物衍生化，以达到检测的f 1 的。以卜刈糖类常用的荧光探针作详细的叙述。根据作用机理，糖类的荧光探针 大体有以下儿类： ( 1 ) 自- 机探针 n 奉的o h k u r a 等1 4 0 l 及m o m o s 等先后使用5 羟基萘满酮作为探针来测定己 糖，以及分子中含有己糖的低聚糖及多糖等。这些糖与5 羟基一1 一萘满刚侄硫酸介 质中发生缩合反应，所生成的产物苯并萘二酮在紫外灯照射下发出明亮的绿色荧 光，其测定范围为0 2 0 0g m l 。 b o s w o r t h 等【4 2 】将己糖胺脱氨基和乙酰基后，与2 ，5 一脱水糖酐耦含，将产物与 9 多糖类物质的光谱和电化学分析新方法的研究 3 5 一二氨基苯甲酸反应，从而产生一种荧光物质，经调节酸度后可测定糖胺聚糖 中的己糖胺。这种方法不受肽及其盐类的干扰，即使肝素的含量小于1 0m g l 也 可以检测出来。 n a a 【4 3 1 利用肝素可提高1 - 二甲氨基萘5 磺酰鱼精蛋白的荧光强度柬测 定肝素，线性范围为o 5 1 0 0m g l 。 胺类化合物是糖类常用的荧光探针。这是由于一n h 2 容易与糖类的官能团醛基 或酮基反应，生成c = n 键；丙二酰胺、2 腈基乙二胺在一定条件下与糖类反应均 可以生成强荧光物质；胍是一种有较高灵敏度的荧光试剂。 其它的荧光探针还有：苯脒、甲氧基苯脒、牛黄酸、脒基牛黄酸、乙醇胺、 氨基一萘磺酸，2 萘酰咪唑，c b q c a ( 3 【4 一羧基苯甲酰胺】_ 2 羰基，醛醇喹啉) ，丹 磺酰肼，9 甲芴氯甲酸脂肼等等。 ( 2 ) 金属探针 利用某些糖的还原性，可以使用有氧化性的金属离子来测定还原性糖。 k i k u t a n i 发现镧系元素中e u 、n 和d y 的荧光在与某些糖如葡萄糖、木糖、半乳 糖和果糖等共热后可以增强，利用该效应可用来测定1 0p , m o l 一5m m o l 的葡萄糖。 另外，利用c e ( ) 具有较强的氧化性而本身被还原成有荧光的性质可以测定某 些还原性糖。 m i a o 等m 利用在d h7 2 的缓冲溶液中，1 b “可与抗菌素环丙沙星 ( c i p r o f l o x a c i n ，简称c i p ) 在5 4 5l h - n 处产生一种强荧光物质，加入肝素后会使 荧光增强，而且荧光的增强量与加入肝素的浓度成一比来测定肝素，线性范围为 o 1 1 2 肛g m l ，检测限为6 8 9n g m l ，并求解了肝素与此荧光探针的结合比与结 合常数。 荧光法因实际可利用的探针相对较少而在应用上受到了限制，因此，需要探 索新的荧光探针并与其它分析方法联用，将成为荧光法发展的主要方向。 1 2 1 3 光散射分析法 光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，光散射是指当光通过介质 时，在入射光以外的各个方向上所观察到光强的现象，它是电磁辐射与物质之间 相互作用的一种表现形式，源于光电磁波的电场振动而导