（分析化学专业论文）基于静电吸附作用固定生物分子的免疫传感器研究.pdf

湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立研究所取得的科研 成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他人或集体已 经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：知j ) 5 5 ；餐日期：卿牟j 月 f j l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有保留、使用学问论文的规定，同意学校保留 并向围家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在 年解密后实用本 授权书。 2 、不保密眄 ( 请在以上相应方框内打4 ) 作者签名 导师签名 刎域 泐f ，扬 日期：沙呼年j 月 日 日期：跏睁厂月 日 硕士学位论文 摘要 长期以来，由于电化学免疫传感器具有设计制造简单、高灵敏度、价格低廉 而被广泛研究并己在生物检测中逐步得到了应用。然而，如何将生物活性组分有 效的固定在电极表面的固定方法、降低甚至消除蛋白质在传感器上的非特异性吸 附以及免疫传感器的重现性和重复使用性能等方面存在的问题阻碍了电化学免疫 传感器的发展和应用。其中有效的生物活性组分的固定方法是构建性能优良的生 物传感器的关键步骤。本论文研究的四个工作均采用静电吸附法固定生物分子， 构建了四种生物化学传感器。 l ，角叉胶富含磺酸基，是一种具有强负电性的天然聚电解质，通过静电吸附 作用将抗体固定到电极表面制得了基于带强负电性物质作电极界面的电流型转铁 蛋白免疫传感器。转铁蛋白抗原与响应电流在1 5 6 0t a gm l 。范围内呈准线性关 系。线性方程为： i = 一0 5 1 4 6 c + 5 9 0 6 ，相关系数为0 9 8 0 0 。 2 ，纳米金用于吸附固定抗体，已在免疫分析中得到广泛应用。近年来的研究 发现，纳米金能降低一些物质在电极上发生反应的氧化还原的电位，并催化这些 物质在电极上的电化学氧化还原反应。利用纳米金的上述特征，研制了基于壳聚 糖一纳米金固定i g g 抗体的荧光免疫传感器用于羊抗人 g g 免疫球蛋白的测定。以 对羟基苯丙酸为荧光底物，酶催化氧化对羟基苯丙酸生成二聚体，导致荧光增强， 通过荧光增强与待测抗原含量呈反比而对抗原进行检测，荧光增强与待测抗原在 1 1 2n gm l 一2 4 8 岭m l 之间呈准线性关系，线性回归方程为： i = 一6 9 0 4 c + 1 3 3 5 ，相关系数为0 9 8 6 0 。 3 ，第四章，辣根过氧化物酶通过与纳米氧化锆之间的静电吸附作用而被固定 在电极表面，以对苯二酚为电子媒介，通过测定酶催化双氧水产生的还原电流的 大小来间接测定双氧水的浓度。响应电流与双氧水在3 6 l o 7 2 1 0 。m o ll 。1 之 间呈准线性关系。线性回归方程为：i = 8 4 8 8 1 0 4 c + 0 4 8 9 2 ，相关系数为o 9 9 6 0 。 4 ，将含大量磺酸基的天然高分子角叉胶包埋于碳糊电极中制成表面带大量负 电荷的电极界面固定辣根过氧化物酶，以对苯二酚为电子媒介，通过测定酶催化 双氧水产生的还原电流的大小来间接测定双氧水的浓度。响应电流与双氧水在 3 6 l o 7 2 1 0 0 m o l l 。1 之间呈准线性关系。线性回归方程为：i = 2 3 2 1 c + 1 1 8 5 ， 相关系数为0 9 9 9 0 。 关键词：免疫传感器；酶传感器；生物分子固定；角叉胶；纳米金；纳米氧化锆 基于静电吸附作用固定生物分子的免疫传感器研究 a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sa r ew i d e l yu s e df o r t h ea s s a yo fb i o l o g i c a l a n a l y t e s t h ea d v a n t a g e s o ft h i s a p p r o a c hi n c l u d i n g t h e i r s i m p l e d e s i g n ， h i g h s e n s i t i v i t y a n dl o w - c o s ta t t r a c ts u b s t a n t i a lr e s e a r c he f f o r t sd i r e c t e dt ot h e d e v e l o p m e n t so fs o m en e we l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r si n t h el a s tt w od e c a d e s h o w e v e r ，t h em e t h o do fi m m o b i l i z a t i o n ，t h ep r e v e n t i o no re l i m i n a t i o no fn o n s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s ，t h er e p r o d u c i b i l i t ya n dt h er e u s a b i l i t ys t i l lr e m a i nt ob et h ek e ys t e p s t h e f o u r p a r t so ft h i s t h e s i sw e r ea l lu s e de l e c t r o s t a t i ca b s o r p t i o nt o i m m o b i l i z i n g b i o m o l e c u l e s 1 ，c a r r a g e e n a nw h i c hi st h en e g a t i v e l yc h a r g e dn a t u r a lp o l y e l e c t r o l y t e ，a n t i b o d y i sa g g r e g a t e dt ot h es u r f a c eo ft h ec a r r a g e e n a n c a r b o np a s t ee l e c t r o d eb ye l e c t r o s t a t i c a d s o r p t i o n ，s u c ha ni m m u n o s e n s o rb a s e do nc a r r a g e e n a n e m b e d d e d i nc a r b o np a s t e e l e c t r o d ef o rt r a n s f e r r i na s s a yh a sb e e nc o n s t r u c t e d t h es e n s o re x h i b i t sal i n e a r r e s p o n s et ot h et r a n s f e r r i ni nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e df r o m1 5p gm l 一1t o6 0p gm l ， t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nc a nb ee x p r e s s e da sf o l l o w s ： i = 一0 51 4 6 c + 5 9 0 6 c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti s0 9 9 6 0 2 ，i th a sb e e ns h o w nt h a tg o l dn a n o p a r t i c l e s ( c o l l o i da u ) c a nb eu s e da s a p l a t f o r mt oi m m o b i l i z ea n t i b o d i e sb ya d s o r p t i o n a d d i t i o n a l l y ，g o l dn a n o p a r t i c l e sc a n r e d u c et h er e d o xp o t e n t i a la n dc a t a l y z et h ee l e c t r o c h e m i c a lr e d o xr e a c t i o no fs o m e c o m p o u n d so nt h ee l e c t r o d ei n t e r f a c e c o n s i d e r i n gt h e s ec h a r a c t e r i s t i c so fg o l d n a n o p a r t i c l e s ，w ed e s i g n e da f l u o r e s c e n c ei m m u n o s e n s o rb yi m m o b i l i z a t i o no fi g g a n t i b o d yt oan a n o a um o n o l a y e rm o d i f i e dc h i t o s a n e n t r a p p e dc a r b o np a s t e u s i n g h p p aa ss u b s t r a t e ，h r pc a t a l y z eh p p aa n df o r mh p p a d i m e r ，w h i c hr e s u l t si n f l u o r e s c e n c ei n c r e a s eo ft h es u b s t r a t es o l u t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fi g ga n t i b o d yc a n b ed e t e r m i n e db yf l u o r e s c e n c ei n c r e a s eo fh p p a d i m e r t h es e n s o re x h i b i t sa1 i n e a r r e s p o n s et oi g gi nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e df r o m1 1 2n gm l 。t o2 4 8g gm l t h e r e g r e s s i o ne q u a t i o nc a nb ee x p r e s s e da s ：i = 一6 9 0 4 c + 1 3 3 5 ，c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti s 0 9 8 0 0 3 ，i nc h a p t e ri v , h r pw a si m m o b i l i z e do ne l e c t r o d es u r f a c ei n v o l v i n gs t r o n g e l e c t r o s t a t i ca b s o r p t i o ni n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ee n z y m ea n dn a n o 。z i r c o n i ad i o x i d e t h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2c a nb ed e t e c t e db yd e t e r m i n i n gt h er e d o xc u r r e n to f p - h y d r o q u i n o n e ，w h i c hw a so x i d i z e db yh 2 0 2i n t h ep r e s e n c eo fh r p t h el i n e a r r e s p o n s et oh y d r o g e np e r o x i d er a n g e df r o m3 6 x 1 0 6t o7 2 x 1 0 3m o ll w a so b t a i n e d 一i l + t h ee q u a t i o nc a nb ee x p r e s s e da s ；i = 8 4 8 8 1 0 。4 c + o 4 8 9 2 t h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n ti s0 9 9 6 0 4 ，c a r r a g e e n a n ，w h i c hi st h en e g a t i v e l yc h a r g e dn a t u r a lp o l y e l e c t r o l y t ea n dh r p e n z y m ew e r ee n t r a p p e di nt h ec a r b o np a s t ee l e c t r o d e ，t h u sas t r o n g n e g a t i v e l ye n z y m e e l e c t r o d eh a sb e e nc o n s t r u c t e d t h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2c a nb ed e t e c t e db y d e t e r m i n i n gt h er e d o xc u r r e n to fp - h y d r o q u i n o n e ，w h i c hw a so x i d i z e db yh 2 0 2i nt h e p r e s e n c eo fh r rt h es e n s o re x h i b i t sal i n e a rr e s p o n s ei nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e d f r o m3 6 x 1 0 。t o7 2 x 1 0 。m o ll 。t h e r e g r e s s i o ne q u a t i o nc a nb ee x p r e s s e da s ：i = 2 3 2 1 c + 1 1 8 5 c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti s0 9 9 9 0 k e y w o r d s ：i m m u n o s e n s o r ；e n z y m e s e n s o r ；i m m o b i l i z a t i o n o f b i o m o l e c u l e ； c a r r a g e e n a n ；g o l dn a n o - p a r t i c l e s ；n a n o - z i r c o n i ad i o x i d e 【i 硕十学位论文 1 1 概述 第1 章绪言 在现代分析化学众多新兴测定技术中，生物传感器以其专一的识别功能，可 在复杂的有机、生化样品中进行快速分析检测，甚至生物活体测定的独特优势， 在近l o 年间得到迅速发展，引起人们的普遍关注。生物传感器是一门由生物、化 学、物理、医学、电子技术等多学科互相渗透成长起来的新技术。通常固定化的 生物材料包括酶、抗体、抗原、微生物、生物组织、d n a 等与物理化学换能器密 切接触而构成的分析工具或系统，是发展生物技术必不可少的一种先进检测工具。 生物传感器一般有两个组成部分：其一是分子识别元件( 感受器) ，由具有分子识别 能力的生物活性物质构成；其二是信号转换器( 换能器) ，主要是电化学或光学检测 元件。生物传感器的作用原理是待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子 识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定 量和可处理的信号，再经二次仪表放大并输出，便可间接知道待测物浓度。其优 点包括：( 1 ) 采用固定化生物活性物质作催化剂，使价值昂贵的生物试剂可以重 复多次使用，克服过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点；( 2 ) 专一 性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响；( 3 ) 分析速度快， 可以在较短的时间内得到结果；( 4 ) 准确度较高，通常测定的相对误差较小；( 5 ) 操作系统比较简单，容易实现自动分析；( 6 ) 成本较低，在连续使用时所需要费 用较低；( 7 ) 有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副 产物的产生。生物传感器作为直接或间接检测生物分子的相关参数值的方法，灵 敏度高、选择性好、响应快、测定简便迅速、价廉、可微型化、便于携带、可以 现场检测等优点，因此，它作为一种新的检测手段正迅猛发展 1 】。有的已在生物工 程、医学与临床、环境检测等领域展现出十分广阔的前景【2 3 ，因此长期以来受到 世界各国的广泛关注【4 4 ，从而为生物医学、环境监测、食品医药工业及军事医学 领域直接带来新技术革命。2 0 世纪8 0 年代起国际上对生物传感器进行了广泛的研 究和探索，近些年来已经研制出一系列在环境监测、临床检验和生化分析等方面 有实用价值的生物传感器。生物传感器大致可以分为以下几类：酶传感器、组织 传感器、微生物传感器、免疫传感器、场效应晶体管生物传感器、d n a 传感器【7 4 j 几大类。生物传感器的发展过程大概可以分为三个阶段：第一代生物传感器( 即 c l a r k 型) ，基于以溶解氧为电子媒介的电催化过程；第二代生物传感器，基于以 人为修饰的具有电活性物质为电子媒介的电催化过程：第三代生物传感器，基于 酶与电极之间直接电子传递的电催化过程。 基于静电吸附作用固定生物分子的免疫传感器研究 1 2 从免疫分析技术到免疫传感器 免疫在医学、生物学方面的概念是机体免疫系统对抗原物质的一种生物学应 答过程，其生理功能是识别和排除抗原性异性物质，以维持机体的生理平衡与稳 定。机体进行免疫应答反应产生抗体或致敏淋巴细胞。任何一种物质当其通过非 肠道的途径进入动物体后，能使该动物产生抗体，并和抗体特异性结合，被称为 抗原。根据抗原的来源和制各方法，通常可将抗原分为三类：天然抗原即包括细 菌、病毒、蛋白质、多糖和结合蛋白；人工抗原即指通过人工合成方法，将半抗 原( 有机小分子) 结合到蛋白质上形成的完全抗原；合成抗原即人工合成的多肽 抗原。抗体是一种特效试剂，具有与抗原发生特异性结合反应的球蛋白。抗原抗 体结合的反应特点是：特异性结合；按一定比例结合；结合具有可逆行、结合常 数很高；结合具有阶段性”1 12 1 。随着单克隆技术及生物工程技术的发展，人们能 够更廉价的获得抗体，基于抗原抗体的特异性结合的免疫分析技术已广泛地应用 在医学、临床、生物、化学、环境、农业、工业、分析等领域【l ”】。 免疫分析技术分为非标记免疫分析法和标记免疫分析法【2 3 6 。非标记免疫分 析包括凝聚反应分析法( a g g l u t i n a t i o na s s a y ) 、免疫浊度测定法 ( i m m u n o n e p h e l o m e t r y ) 、琼脂扩散分析法( a g a rd i f f u s i o na s s a y ) 、微量免疫电泳 ( m i c r o i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ) 等。标记免疫分析法包括放射免疫分析法和非放射免 疫分析法，放射免疫分析法又分为放射免疫分析( r a d i o i m m u n o a s s a vr i a ) 和免疫 放射分析( i m m u n o r a d i o m e t r i ci r m a ) ，非放射免疫分析法又分为酶免疫分析法 ( e n z y m ei m m u n o a s s a ye i a ) 、酶联免疫分析法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e l i s a ) 、酶标电化学分析法( e n z y m e l a b e l l e d e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a y e i e c i a ) 、荧光免疫分析( f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a yf i a ) 、荧光偏振免疫分析 ( f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o ni m m u n o a s s a yf p i a ) 、时间分辨荧光免疫分析 ( t i m e r e s o l o v e df l u o r o i m m u n o a s s a yt r f a ) 、电化学免疫分析( e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a ye c i a ) 、化学发光免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a yc l i a ) 、 化学发光酶免疫分析( c h e m i l u m i n e s c e n c ee n z y m ei m m u n o a s s a yc l e i a ) 、流动注射 免疫分析( f l o wi n j e c t i o ni m m u n o a s s a yf i i a ) 、胶体金免疫分析( c o l l o i d a lg o l d m a r k i n gi m m u n o a s s a yc g m i a ) 、克隆酶给予体免疫分析( c l o n e de n z y m ed o n o r i m m u n o a s s a yc e d i a ) 、多组分免疫分析( m u l t i a n a l y t ei m m u n o a s s a ym i a ) 、脂质体 免疫分析( 1 i p o s o m ei m m u n o a s s a yl i a ) 、控温相分离免疫分析( t e m p e t u r ec o n t r o l l e d p h a s e - s e p e r a t i o ni m m u n o a s s a yt c p s i a ) 等。免疫分析技术由于存在分析时间长、分 离分析操作繁琐及对分析操作技能要求高或所用仪器、试剂价格昂贵，不便于分 析系统的集成化、微型化，不能满足实际生物样品分析的在线、快速检测的要求。 以免疫分析技术为基础而发展起来的免疫传感器的应用，大大地推动了免疫分析 硕士学位论文 技术在医学、临床、生物、化学、环境、农业、工业等方面的应用和发展”43 1 。 目前在临床上应用的免疫分析主要有：放射免疫分析、免疫放射分析、均相酶免 疫分析、酶增强免疫分析、酶免疫分析。2 0 世纪8 0 年代以来，生命科学的发展为 免疫传感技术的发展提供了强有力的帮助。将抗原抗体的特异性反应与酶联放大 效应相结合，形成了酶联免疫传感器，这种传感器是将免疫组分固定在信号转换 器上，使免疫反应、酶催化反应、信号产生、信号检测集成在一起。由于抗原抗 体反应的特异性和酶联反应的信号放大作用，使得该类传感器较其它生物、化学 传感器具有更高的选择性和灵敏度。 1 3 免疫传感器的分类 免疫传感器按换能器分可为光化学免疫传感器、压电免疫传感器、量热免疫 传感器、电化学免疫传感器。 1 3 1 光化学免疫传感器 光化学免疫传感器是测量免疫反应后引起的光学信号变化量的一类传感器。 光学信号包括光吸收、荧光、磷光、反，折散射等，所以具有较大的发展空间。依 据反射光信号的来源又可以分为荧光免疫传感器、化学发光免疫传感器、电化学 发光免疫传感器。下面主要介绍荧光免疫传感器。荧光免疫传感器是将荧光检测 与免疫分析相结合的高灵敏度分析技术，主要类型有：直接荧光免疫传感器、酶 促荧光免疫传感器、底物标记荧光免疫传感器、时间分辨荧光免疫传感器和荧光 偏振免疫传感器等。t o p p o z a d a 等 4 4 】将抗体固定于光纤上，以荧光素标记可卡因， 利用抗原抗体发生免疫反应后引起荧光淬灭从而测定了可卡因；p l o w m a n 【4 副小组 用二种荧光素分别标记抗原、抗体，通过荧光激发传递使一种荧光被吸收，其吸 收量与样品中待测物含量成正比，由标准曲线推算出含量；p u l i d e o t o f i n o 等1 4 6 】 用溶胶凝胶技术包埋抗体，把流动注射和荧光检测相结合对i s o p o r t u r n 进行了检 测；r i c o 等【4 7 1 用流动注射和荧光检测相结合固定蛋白a 检测茶碱，该过程可消除 许多干扰物的干扰；v o d i n b 等 48 成功的运用光纤免疫荧光传感器测定人类胎盘中 d n a 一苯核加和物；a o y a g i 4 9 1 和b a r t 5 0 1 分别研究了一种无试剂荧光增强免疫传感器 测定人体i g g 和荧光素标记抗原用于测定爆炸性的三甲撑三甲硝基胺的流动免疫 传感器。这类直接荧光免疫传感器一般灵敏度不高，受非特异性吸附影响较大。 酶促荧光免疫传感器是建立在酶联免疫传感器基础之上的一门高灵敏度传感 技术。h u a n g 等 5 u 研究了以3 , 6 一荧光素二磷酸脂为荧光底物，开发了一种高灵敏 测定2 ，4 硝基酚的新型e l i s a 技术。这类方法是利用具有潜在荧光的底物作为酶 标催化放大的显示系统，由于积累放大和荧光的高灵敏性，使该法的灵敏度提高 很多，一般为p g 级，对羟基苯乙酸5 ”，对羟基苯丙酸53 1 ，阿魏酸1 等都曾用作 基_ 二静电吸附作用固定生物分子的免疫传感器研究 辣根过氧化物酶的荧光底物。但是已有的辣根过氧化物酶的荧光底物存在以下不 足：酶催化反应速率慢，荧光产物的荧光较弱且发射波长与蛋白质相近；对h 2 0 z 敏感，h ：0 2 对荧光底物的影响很大：荧光产物的s t o k e s 位移小。开发新型酶联荧 光底物是发展该项技术研究的关键所在。 一般荧光技术的缺点是荧光寿命短、背景荧光高。这些背景荧光主要来自散 射光( 样品池中的胶体颗粒和溶剂分予引起) 和非特异荧光( 血清蛋白质和其它 化台物) ，一种新型荧光免疫技术( 时间分辨荧光免疫技术) 应运而生。p e t r e a 等 5 5 1 以2 一萘三氟丙酮酯为荧光载体，将e u 2 + 通过一种很强的双功能螯合剂与抗体的 氨基相连，利用时问分辨荧光免疫技术测定了兔抗人i g g ：j 6 r g 等 56 利用对羟基 苯乙酸为h r p 底物，通过标记酶催化产物与稀土金属( t b 2 + ) 形成有时间分辨荧光 的螯合物从而测定了i g g 。稀土离子的荧光特点一是寿命长( 比背景荧光长3 - 4 个 数量级) ；二是s t o k e s 位移大；螯合物荧光强，可获得高信噪比和高灵敏度。 1 3 2 压电免疫传感器 压电免疫传感器是以压电晶体( 材料) 为基体而制成的高灵敏度质量响应特 性的体声波传感器5 7 枷 。压电晶体的频率变化与质量变化成正比，并符合如下关 系：f = c q f a m a ，具有结构简单、价格低廉、检测下限低等特点；但易受到外 界因素如电磁场、溶液密度及黏度、流变特性等影响；其检测准确度难以保证等 缺陷。 1 3 3 量热免疫传感器 量热免疫传感器是基于测量化学和生物反应中热量变化的量热计原理而制成 的热电堆( t h e r m i s t o r s ) 传感器【6 1 6 2 1 。具有结构简单、价格低廉等特点，但检测 灵敏度低，所报道的热传导免疫传感器研究工作较少。 1 3 4 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器按照在免疫分析过程中是否使用标记物可分为：非标记型 的免疫传感器和标记型免疫传感器；按照测量信号可分为：电位型、电流型、电 容型、电导型四种形式。就目前的研究和应用情况而言，电流型( 安培分析型) 免疫传感器是研究较多应用较广的一种。 1 3 4 1 电位型免疫传感器 电位型免疫传感器兴起于7 0 年代，集酶标放大的高灵敏性、免疫反应和选择 电极的高选择性于一体，直接或间接用于各种抗原、抗体的检测，它具有可实时 监测，响应时间较快等特点。通常离子选择电极、气敏电极被用来作为基底电极。 常用的离子选择电极如：氟离子电极、碘离子电极、三甲基苯胺阳离子电极等： 一4 一 硕士学位论文 常用的气敏电极有n h 3 ，c o ：，0 2 等。酶作为标记物用来催化底物的反应，使底物释 放出离子或者气体，待测抗原( 或抗体) 的浓度与酶催化产物在基体电极上的响 应相关。电位型免疫分析过程中一般需要异相分离和二抗。其检测限可达到g m l 。因此，寻求均相酶免疫分析，不需要二抗来直接检测抗原或抗体的浓度是 众多研究者的追求目标。 1 3 4 2 电容式免疫传感器 电容式免疫传感器是建立在双电层理论上的一种传感技术。物质的吸附和表 面电荷的改变对双电层结构都产生显著影响。一根金属电极插到溶液中时，电极一 溶液界面的行为近似地认为是一个平板电容器，它能够储存一定的电荷，并能够 给出类似于电容器界面区的模型 63 1 。在给定电势下，金属电极上的电荷为电极一 溶液界面的特性，由双层电容c d 表征，其典型值在1 0 4 0 p f c m 2 ；但这并非是电 容器，其电容值不依赖于所施加的电压，而c d 往往是电势的函数。电容传感器的 测量原理比较简单，电解电容的电容值决定于平板表面介电层的厚度及介电性质。 电极上的电层电容可以用方程来表达： c = a 80 r d ( 1 ) 其中e 。为真空介电常数，e ，为电极与移动电荷隔离开的物质介电常数，a 是电 极面积，d 是移动电荷同电极表面最近的距离。电解电容决定于电绝缘层和固液 界面厚度及介电性质旧，由于在电极表面形成复合体将导致电容的下降，当电极 表面修饰上一层电绝缘性物质时，就会增大界面厚度从而电容会相应地降低。同 时，介电常数的减小，这会引起电容的进一步下降 ，b a t a i l a r d 等m 1 认为这种结 构是由几个电容器串联在一起组成的。它们之问的关系通过方程表示为： 1 c i = 1 c i + 1 c v ( 2 ) 测得的总电容用c i 表达，其中c i 是起始状态的电容，由介电层和固定在电极表面 的分子识别体构成，c 。是连接上受体后的电容。在受体被接上后，根据方程( 2 ) ， 由引起的电容变化就可以得知被测物浓度与电容之间的关系，如果采用实时监测 就会得到动力学的变化过程。同其它生物传感器一样，敏感膜的制备技术是电容 式免疫传感器中最为重要的环节。它要求首先在金属电极或者半导体表面形成一 种电绝缘层，否则就会构成一种所谓的“短路”状态，电容式免疫传感器的成功 与否在很大程度上取决于这一电绝缘层。目前随着膜技术、自组装技术的不断发 展和完善。7 3 1 ，能够实现在分子水平上的定向组装，形成高度致密有序的单分子 或多分子层，为制备高灵敏的电容式免疫传感器提供了很好的途径。 1 3 4 3 安培免疫传感器 安培分析免疫传感是将免疫技术和电化学检测相结合的一种有标记的免疫分 析，其标记物有酶和电活性物质两类。常用作为标记的酶有碱性磷酸酶、辣根过 基于静电吸附作用固定生物分子的免疫传感器研究 氧化物酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶和尿素水解酶等。电化学的安培测定是 在恒电位( 电势) 下，电子从具有氧化还原特性的分子流向或流出电极，形成的 电子流是一个动态过程，其大小可用三电极系统测量，即工作电极用来承载电化 学反应；参比电极用来控制工作电极的工作电位；对电极用于从参比电极上获取 电流。实际操作中可采用两电极系统，即将工作电极用做虚拟的参比电极。安培 法具有操作简便、仪器价格低廉、准确度较高和测量快速等优点，促使人们努力 的发展竞争性和非竞争性电化学免疫传感器m 。75 1 。安培型免疫传感器在生物免疫 传感器中占有重要地位，是电化学生物传感器发展的一个重要方面。 1 3 4 4 电导免疫传感器 电导免疫传感器是基于检测换能器( 电极) 与溶液之问的导电性变化而建立 的 7 6 - 7 9 。可以采用酶标记技术，通过免疫反应和酶催化放大效应，使溶液中的离 子种类或数目发生改变，从而改变溶液的导电性而达到检测的目的，如用尿酶标 记二抗 8 0 1 ，可用来放大溶液的电导率的变化来完成对h c g 的检测，也可以通过改 变传感器表面的导电性能和影响离子在电极表面的迁移速度而达到检测的目的， 如在构建尿液中的甲基安菲他明( m e t h a m h e t a m i n ，m a ) 的免疫传感器时【8 ”，用戊 二醛交联法将m a 抗体固定在铂电极上，当m a 与免疫传感器发生免疫反应时导 致免疫识别分子层与电极之间电导率降低。但是，这类传感器存在较高的背景和 易受实测样品中的离子强度影响，检测灵敏度欠佳。 1 4 免疫分析定量方法 免疫分析法主要有竞争型免疫分析法、竞争型酶抑制免疫分析法、夹心型免 疫分析法、无分离竞争抑制法。 竞争型免疫分析法它是建立在被测物质与酶标记物同某种特异试剂( 抗原或 抗体) 进行竞争结合的基础上，将固定抗体的传感器再用酶标记抗原与对应的待 测抗原的混合液培养，让他们竞争键合到固定的抗体上，酶标记抗原量一定时， 待测抗原浓度越高导致结合在传感器表面上的酶标记抗原的量越少，从而酶催化 产物越少。 竞争型酶抑制免疫分析法是在竞争型免疫分析法基础上发展起来的，一般用 于半抗原的测定。其原理是：如欲测定某种小分子化合物( 称半抗原h ) ，先制备 该药物抗体，其次将药物与酶( e a ) 连结，成为( e a h ) ，固定抗体的传感器在酶 标半抗原溶液中培养后，酶标半抗原结合到传感器表面，结果阻挡了底物进入酶 的活性位置使酶失活。当结合酶标半抗原的传感器又在待测半抗原溶液中培养时， 待测半抗原可置换出传感器上酶标半抗原，使酶标释放出来，酶得以复性。待测 半抗原浓度越高，复性的酶越多，其催化产物越多。 硕士学位论文 夹心型免疫分析过程首先将抗体固定在传感器表面，加入抗原培育后形成抗 原抗体复合物，洗掉过量的抗原，再加入酶标抗体培育，使示踪酶标抗体结合到 抗原上。最后在测试体系中加入底物，通过测定酶转化产物，从而间接计算待测 抗原的含量。 无分离竞争抑制法是以酶或生物素标记抗体，它与待测的抗体竞争的吸附到 固定有抗原的乳胶板上，未参与免疫反应的示踪物由于生物素和亲和素之间强烈 的相互作用而结合到固定有亲和素的乳胶板上，这部分酶标物中酶由于生物素一亲 和素之间的作用而失活。在测试体系中加入溶液，只有参与免疫反应的酶标物能 催化底物而产生响应信号，未参与免疫反应的酶标物因为失活，无需分离洗脱。 一般夹心法适于检测大分子抗原，灵敏度高，但较竞争法繁琐。竞争法即可 检测大分子，其衍生法一竞争型酶抑制法适于检测半抗原分子，分析过程相对简单 快速，但灵敏度不及夹心免疫分析法。 1 5 生物分子的固定方法 在生物传感器的制作中，生物分子的固定是影响其性能的一个重要因素。生 物分子的固定方式、数量及活性等直接影响传感器的重现性、检测限、循环使用 等性能。通常将生物分子固定于基体电极或固体基质内，主要有以下四种基本方 法：( 1 ) 吸附法，是一种通过物理吸附作用将免疫组分固定于传感器表面的方法， 这是一种相对较简单的方法，转换器表面经过适当地处理或修饰后，用抗原( 抗 体) 溶液浸泡或涂覆抗原( 抗体) 由于分子间作用力而直接固定在转换器表面， 形成具有识别功能的生物敏感层。主要有高分子膜吸附法，先在电极表面上修饰 一层合成高分子或天然高分子，然后将生物功能物质吸附到高分子膜上，制备成 感应膜，再与转换器结合，构成传感器【8 ”；无机材料吸附法，利用无机材料如： 分子筛或氧化铝等的强烈吸附特性，并以此作为载体，先将分子筛用聚乙烯醇调 制后固定于电极表面，然后使生物功能物质吸附固定于分子筛内，即构成生物传 感器盼8 4 】；纳米颗粒表面吸附法；静电自组装吸附法，k a r y a k i n 8 5 1 小组报道了利 用抗体本身的巯基能与金相互作用的特点将其固定在金电极表面。这类方法固定 免疫组分无需使用化学试剂，对生物组分的活性影响较小，固定的生物敏感层的 稳定性较好，可经过酸碱处理后使表面再生从而达到连续分析的需要。( 2 ) 交联 法，如用戊二醛与蛋白质分子相互结合，从而使抗原( 抗体) 固定于电极表面。( 3 ) 包埋法【8 “9 1 】，其中包括高分子载体包埋法、电聚合高分子包埋法、碳糊包埋法。 高分子载体包埋法是将抗原( 抗体) 与合成高分子如n a t i o n 或生物高分子丝蛋白 经溶剂混合而使抗原( 抗体) 包埋其中，制备成具有生物活性的敏感膜，再将其 覆盖到转换器即电极表面构成免疫传感器。电聚合高分子包埋法是将单体和抗原 ( 抗体) 同时混合于电解液内，通电使单体电聚合成高分子，与此同时即可将抗 基于静电吸附作用固定生物分子的免疫传感器研究 原( 抗体) 包埋于高分子内，制备成具有生物活性的敏感膜再将其覆盖到支持体 上而制得传感器。碳糊包埋法是将抗原( 抗体) 用石蜡油等溶剂调匀，再加入石 墨粉调制成糊状，填充于玻璃管内制备成碳糊免疫电极；( 4 ) 共价键合法1 9 2 ”】， 通过硅烷试剂或生物素亲和素蛋白共价键合；( 5 ) 分子自组装固定法【9 “9 8 】，在单 晶金电极表面，先修饰一层硫醇类化合物，这是通过分子间的引力进行自组装构 成的单分子层，然后再通过自组装方法将媒介体和抗体( 抗原) 一层层修饰于电 极上，构成免疫传感器。 1 6 生物传感器的应用情况 生物传感器的应用发展经历了由临床检测、环境保护等领域进入到了能源开 发领域。在糖尿病和其它许多代谢紊乱的疾病中，血液中的葡萄糖的测定是必不 可少的。以往的方法往往以操作复杂，耗时多而越来越不适应时代发展的要求。 在各种血糖测定方法中，酶电极以其准确，快速和最低的测定成本而具有较强的 竞争力。如m e u s e l 等用电流型免疫传感器测定了血清中阿朴脂蛋白质e 的含量， v e t c h a 等发展便携式电化学免疫传感器检测抗h a n t a 病毒抗体。w i l l n e r 等1 9 9 1 发现 了组装在电极上的f d a 分子层能直接将葡萄糖酶活性中心的电子转给电极，他们 利用此技术构建了一种新型的微电化学的葡萄糖传感器。现在医疗诊断方面利用 生物传感器可以对乳酸、尿酸、尿素、谷氨酰酸、转氨酶、肌酸和肌肝等进行测 定。为疾病的快速诊断开拓了广阔的前景。另外，生物传感器可用于血清，蛋白 质代谢异常等疾病的诊断，如梅毒血清的诊断、免疫球蛋白、人绒毛膜促性腺激 素的测定等。在环境领域中的应用，如b e n d e r s 等发展了用电化学免疫传感器检测 水中的多氯联苯。a b d e l 用免疫电极检测大肠杆菌。在能源领域的应用，如k a t a 等 1 0 0 利用酶电化学传感器技术发展了自供能源的微装置，期望用于人造心脏的自 运行。在生物传感器的应用方面，还有许多需要探索和改进的地方。但是，随着 技术的不断进步，在各个领域里生物传感器的应用和普及将会越来越受到重视。 1 7 免疫传感器的发展趋势 主要有如下几点：( 1 ) 标记物的种类层出不穷，从酶、荧光素发展成胶乳颗粒、 胶体金、磁性颗粒和金属离子等；( 2 ) 向微型化、商品化方向发展，廉价的一次性 传感器大有潜力可挖；( 3 ) 酶免疫传感器、压电免疫传感器和光学免疫传感器发展 最为迅速，尤其是光学免疫传感器品种繁多，目前已有几种达到了商品化，它们 代表了免疫传感器向固态电子器件发展的趋势；( 4 ) 与计算机联用，向智能型、操 作自动化方向发展；( 5 ) 应用范围日渐扩大，已深入到环境监测、食品卫生等工业 和临床诊断等领域，以后者尤为突出；( 6 ) 继续提高其灵敏度、稳定性和再生性， 硕士学位论文 使其更简便、快速和准确。随着分子生物学、材料学、微电子技术和光纤化学等 高科技的迅速发展，免疫传感器会逐步由小规模制作转变为大规模批量生产，并 在大气监测、地质勘探、通讯、军事、交通管理和汽车工业等方面起着目益广泛 的作用。 1 8 本论文的工作构思 结合现有文献报道及在本实验室的原有基础上，拟进行新的生物分子固定方 法的研究，对以往固定方法进行改良和提高，利用几种传感原理，发展了以下几 种免疫传感器。 ( 1 ) 人血清中转铁蛋白抗体通过与角叉胶的强静电作用力而被固定到包埋了 角叉胶的碳糊电极表面，以辣根过氧化物酶标记转铁蛋白抗原，然后再与待测转 铁蛋白抗原和酶标转铁蛋白抗原进行竞争型免疫反应，催化产物的量与待测抗原 的量呈反比，因而实现对转铁蛋白的检测。 ( 2 ) 羊抗人i g g 抗体通过与纳米金的相互静电力作用被固定到吸附了纳米金 的支持体表面，以辣根过氧化物酶标记i g g 抗原，选择对羟基苯丙酸为荧光底物 制备的荧光免疫传感器用于羊抗人i g g 抗原的测定。 ( 3 ) 将纳米氧化锆( z r 0 2 ) 包埋于碳糊电极，制备成一种灵敏的过氧化氢传 感器。辣根过氧化物酶通过与纳米颗粒间的静电作用力和与碳粉的非特异性吸附 而固定在电极表面，以对苯二酚为电子媒介，对过氧化氢进行测定。 ( 4 ) 研制一种基于包埋角叉胶的表面带强负电性的碳糊电极用于检测