（分析化学专业论文）基于纳米粒子、酶的信号放大生物分析方法研究.pdf

摘要 发展灵敏度较高的免疫分析技术一直以来是免疫分析领域研究的一个重要方 面，它对于实现一些重要疾病标志物的检测有着至关重要的意义。电化学仪器具 有简便、灵敏、易于微型化等优点。因此，开发新的电化学信号放大免疫分析技 术无疑可以推动免疫分析的发展。此外，人类的许多遗传性疾病都是由于基因的 变异引起的，其中尤以单碱基的突变，即单碱基多态性最为普遍。实现对这些基 因单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认，对于人类相关疾病的发病机理 研究及早期治疗具有非常重要的意义。目前，有关单碱基突变的检测方法已有许 多报道。而这些传统的方法普遍操作繁琐费时、不易定量、仪器昂贵、且对工作 人员要求较高的专业技能，因此仅能在少数实验室应用。开发一些简便、价廉、 精确且易于临床推广的方法是一件很有价值的工作。为此，本文主要在高灵敏度 的电化学免疫分析方法方面以及电化学d n a 检测技术方面做了一些工作： 1 提出了一种基于循环富集纳米金的新型电化学免疫分析方法。脱硫生物素 与亲合素的结合常数比较小，当其与亲合素结合后，在生理条件下即可被生物素 取代，利用此取代反应可对纳米金进行循环富集，从而实现提高免疫分析灵敏度 的目的。免疫分析采用夹心法。先将羊抗人i g g 包被在酶标孔里，经牛血清蛋白 ( b s a ) 封闭后再加入分析物人i g g ，接着加入标记有脱硫生物素的羊抗人i g g 形 成夹心复合物。然后加入金标亲合素溶液进行温育反应，最后加入生物素溶液通 过取代反应实现金标亲合素的洗脱。由于脱硫生物素标记的抗体在取代反应后仍 保持相当高的生物活性，故可再加入新鲜的金标亲合素与上一步保存的生物素溶 液进行循环洗脱，最后通过溶出伏安法( a s v ) 进行检测，实验证实金的阳极溶 出蜂电流随循环富集次数的增加而逐渐增加，当达到八次后信号趋于稳定。为了 缩短免疫分析时间，采用5 次循环富集，也可保证较高的灵敏度，检测限达o 7 5 n g m l 。在空白实验中，即使循环富集1 0 次，其背景信号仍是相当的低。可能得原 因是非特异性吸附的金标记物难以在生理条件下被洗脱，因此大大降低了背景信 号，因此如果提高循环洗脱的次数可以检测n o 1n g m 1 人i g g 。在同样的条件下8 次检测1n g m 1 人l g g ，相对标准偏差为9 5 7 。 2 提出了一种基于磁性纳米粒子放大金标伏安免疫分析技术。修饰有生物素 的磁性纳米粒子能够结合多个金标亲和素，形成磁性纳米粒子纳米金复合物。利 用脱硫生物素修饰抗体，夹心免疫反应后可与磁性纳米粒子纳米金复合物特异性 结合。通过生物素取代可洗脱复合物，结合溶出伏安分析可实现信号的线性放大。 通过生物素的竞争洗脱，可以有效地降低非特异性吸附引起的背景信号，从而为 低浓度抗原的检测提供了可能。我们采用了溶出伏安法检测，检测下限为o 1 n g m l 3 提出了一种基于循环富集辣根过氧化物酶的用于检测入i g g 的新型荧光免 疫分析方法。脱硫生物素与亲合素的结合常数比较小，当其与亲合素结合后，在 生理条件下即可被生物索取代，利用此取代反应可对辣根过氧化物酶进行循环富 集。当用缓冲液代替抗原进行实验时。发现即使循环富集步骤达到七次其产生的 背景信号也相当低，这种特性使得本方法能够检测到o 0 5n g m l 的人i g g 。 4 提出了一种基于铜增强的金标伏安免疫分析方法。在这种方法中，抗体首 先通过物理方法固定到酶标孔内壁，夹心免疫反应后，纳米金标记的抗体被捕获 到生物界面。再加入铜增强试剂，由于纳米金的晶核催化效应，在还原剂存在的 条件下，铜离子在纳米金的表面得以还原，形成厚厚的铜壳。然后通过化学法将 铜溶解后用溶出伏安法检测溶出的铜离子。检测下限为0 5n g m l 。将本方法应用 于实际血样的分析，取得了满意的结果。据我f f 】所知，这是酋例将铜增强引入到 免疫分析中来的报道。 5 在前面工作的基础上我们提出了一种基于铜增强新型电化学免疫传感器的 制备方法。在这种方法中。抗体首先通过化学方法修饰到玻碳电极表面，夹心免 疫反应后，纳米金标记的抗体被捕获到电极表面。再加入铜增强试剂，由于纳米 金的晶核催化效应，在还原剂存在的条件下，铜离子在纳米金的表面得以还原， 形成厚厚的铜壳。然后将传感器转移到电解池中施加线性扫描，就可以通过检测 铜的阳极蜂电流的大小来实现抗原分子的定量分辑检测下限为0 0 7 5r i g m 1 。与 传统的金增强和银增强比较，本文提出的铜增强具有一定的优势。如避免了溶出 伏安分析的繁琐步骤，采用的铜增强试剂也比较容易配制和保存，同时还保持了 较高的灵敏度。 6 结合琼脂糖免疫微球的分离特性及生物金属化的概念提出了一种新型电化 学免疫分析方法。琼脂糖微球表面标记有亲和素分子，因此我们可以将生物素化 的羊抗人i g g 通过生物素亲和素之间的亲和反应标记到琼脂糖微球表面。形成琼脂 糖免疫微球。然后将固定量的琼脂糖免疫微球，碱性磷酸酯酶标记的羊抗入i g g 抗 体以及待测抗原人i g g = 者混合反应后分离洗涤四次以保证除去未反应的碱性磷 酸酯酶标记的羊抗人i g g 抗体以及待测抗原人i g g 。最后加入磷酸抗坏血酸酯和硝 酸银的混合溶液，避光反应半小时。分离洗涤八次后用硝酸溶解银，溶出伏安法 检测银离子由于反应是在均相中进行，因此不仅缩短了免疫分析时间，还大大 提高了免疫反应的效率。 7 提出了一种基于分子信标和酶催化放大的电化学d n a 传感器的研制方法。 我们先将5 端标记有巯基，3 端标记有生物素的分子信标通过与巯基丙酸混合自组 装的形式固定到金电极表面。当与完全匹配的目标链杂交后，分子信标3 端的生 物素分子暴露出来再与链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶结合，最后通过检测酶 r i 博士学位论文 催化电流的大小就可以实现d n a 的定量分析。分子信标与传统的直线型d n a 链 相比具有较强的单碱基错配识别能力。同样的，我们设计的这个实验对单碱基错 配也具备较强的识别能力。 关键词：免疫传感器：免疫分析；纳米粒子；分子信标；酶 n a b s t r a c t d e v e l o p i n go fs e n s i t i v ei m m u n o a s s a yt e c h n o l o g yi so n eo ft h ei m p o r t a n tt a s k si n i m m u n o a s s a y , w h i c hi s c r u c i a lf o rr e a l i z i n gt h ed e t e c t i o no fs o m ev i t a ld i s e a s e s e l e c t r o c h e m i c a la p p a r a t u sa r es i m p l e ，s e n s i t i v ea n de a s yt ob em i n i a t u r i z e d s oi ti s u n d o u b t a b l et h a tt h e s t u d yo fn e we l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a yw i t hs i g n a l e n h a n c e m e n tc a na c c e l e r a t et h ed e v o l p m e n to fi m m u n o a s s a y m o r e o v e r , m a n y p a t h o g e n i ca n dg e n e t i cd i s e a s e sa r ea s s o c i a t e d w i t hc h a n g e si nt h e s e q u e n c eo f p a r t i c u l a rg e n e s a m o n gt h e s ec h a n g e s ，t h ep o i n tm u t a t i o n ，i e s i n g l en u e l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) ，a r et h em o s ta b u n d a n tf o r mo fg e n e t i cv a r i a t i o n a c h i e v i n g e a r l y , a c c u r a t e ，s i m p l ea n dr a p i di d e n t i f i c a t i o nt ot h e s es i n g l e - b a s em u t a t i o n si so f p a r t i c u l a ri m p o r t a n c ef o re a r l yd i a g n o s i sa n dt h e r a p yo fc o r r e s p o n d i n gd i s e a s e s u pt o n o w , m a n yt e c h n i q u e sh a v e b e e nd e v e l o p e df o rs n pd e t e c t i o n h o w e v e r , t h e s e c o n v e n t i o n a lp r o c e d u r e sa r ea p p l i e dt od a t ei nv e r yf e wl a b o r a t o r i e sa st h e ya r e g e n e r a l l yt i m e - c o n s u m i n g ，n o tq u a n t i t a t i v e ，c o m p l i c a t e d ，a n dr e q u i r i n ge x p e n s i v e i n s t r u m e n t a t i o na n dt e c h n i c a l s k i l l s ，a c c o r d i n g l y , e x p l o r i n g s o m e s i m p l e ， c o s t e f f e c t i v e ，a c c u r a t ea n de a s yt ob ec l i n i c a l l yp o p u l a r i z e dd e t e c t i o nm e t h o d sf o r s n p si ss t i l lo fc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t t h e r e f o r e t h i sr e s e a r c hf o c u s e so nt h es e n s i t i v i t y e n h a n c e m e n to fe l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a ya n dt h ed e v e l o p m e n to fe l e c t r o c h e m i c a l d n a q u a n t i f i c a t i o n t h ed e t a i lc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： 1 an e wm e t h o db a s e do nc y c l i ca c c u m u l a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e sh a sb e e n p r o p o s e d f o rd e t e r m i n i n gh u m a ni m m u n o g l l o b u l i ng ( i g g ) b ya n o d i e s t r i p p i n g v o l t a m m e t r y t h ed i s s o c i a t i o n r e a c t i o nb e t w e e nd e t h i o b i o t i na n da v i d i ni nt h e p r e s e n c eo fb i o t i np r o v i d e se f f i c i e n tm e a n sf o rt h ec y c l i ca c c u m u l a t i o no fg o l d n a n o p a r t i c l e su s e df o rt h e f i n a la n a l y t i c a lq u a n t i f i c a t i o n 1 1 1 ei m m u n o a s s a yw a s c o n d u c t e db yf o l l o w i n gt h et y p i c a lp r o c e d u r ef o rs a n d w i c h t y p ei m m u n o r e a e t i o n g o a t a n t i h u m a ni g gi si m m o b i l i z e do nt h ew e l l so fm i c r o t i t e rp l a t e s 1 1 1 eh u m a nl g g a n a l y t ei sf i r s tc a p t u r e db yt h ep r i m a r ya n t i b o d ya n dt h e ns a n d w i c h e db ys e c o n d a r y a n t i b o d yl a b e l e dw i t hd e t h i o b i o t i n a v i d i n - a us o l u t i o nw a si n t r 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