（应用化学专业论文）酶PETCO2自组装活性膜的组装及形态结构研究.pdf

浙江大学博士掌位论文 摘要 分子沉积自组装技术兴起于2 0 世纪9 0 年代，是种制备纳米级超薄膜的新技 术。浚方法简便易操作，得到的自组装膜超薄有序，厚度可以实现分子水平e 的调 控，并且可以得到预先设计的层间结构，提供具有特殊功能的超薄膜材料。 将分子沉积自组装技术用于蛋白质、酶等生物分子的超薄膜制备始于9 0 年代中 后期。由于该方法以静电相互作用力为推动力，减少了组装过程中对生物分子构像 的破坏，较大限度地保持了生物分子的生物特性，因此是制各生物分子薄膜栩料的 有效途径。 本文采用分子沉积技术，成功地制备了厚度在纳米级的超薄酶膜。论文中以人 类t 卜命中最重要的三种酶即c 【一淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶作为研究对象，以表面阴离 予化的p e t 作为基材，采用静电分子沉积技术，制备三种酶的单层组装膜和脂肪酶 。，聚电解质交替纽装的多层膜。运用原子力显微镜、x 光电子能潜、衰减全反射红 外等表面分析方法深入系统地研究p e t 、阴离子化p e t 及三种酶p e t c 0 2 自组装 膜的表面层结构利表面形貌，以及组装条件对酶p e t c 0 2 一自组装膜表面形态结构与 特性的影响。之后，建立了酶p e t ，c 0 2 一自组装膜活性测定评价方法并对其催化性能 进行了评估。 阿先在阴离子化p e t 基材上成功地制备了a 一淀粉酶、脂肪酶、中性蛋白酶三种 酶的自组装膜。p e t 薄膜在4 0 6 0 。c 的n a o h 溶液中发生水解，其表面部分链段断 裂可以得到表面羧基化的p e t c 0 2 - 基材。将阴离子化p e t 基材浸入酶溶液( 溶液中 的酶分子表面已被诱导出净正电荷) 中，在静电相互作用力的推动下，酶分子在p e t 农咖自发形成自纽装膜。x p s 分析发现在组装的薄膜表面出现了n 元素并且是由酶 分子中的酰胺基团的n 元素引起，证明成功制备了酶p e t c 0 2 。自组装膜，a f m 和 盯l r a r r 的分析电证实了上述结果。 其次探讨酶自组装过程中酶溶液的浓度、p h 值、组装时间以及基材的电荷密度 等凶索对酶p e t c 0 2 一白组装膜的表面形态结构与特性的影响。经分析发现改变酶溶 液的p h 值会引起自组装膜中酶分子分布状态的变化，溶液p h 值低时酶分子倾向于 分散分稚。表面电荷密度不同的基材上酶分子的组装形态不同，痞电荷密度基材上 浙江大掌博士掌位论文 的酶分子倾向于以立式形态存在。在组装溶液p h 值、基材表面电荷密度、组装时 州- i 个影响因素中，基材表面电荷密度对酶自组装膜的影响最大，其次是组装时间。 最后对酶p e r c 0 2 - 组装膜的催化性能进行了研究。三种酶p e t c 0 2 一自组装膜 都有较高的活力应j 收率，其中组装脂肪酶的活力回收率最高为1 7 2 ，组装0 【一淀粉 酶和组装中性蛋白酶的活力回收率分别是8 0 和7 7 。旺一淀粉酶p e t c 0 2 一自组装膜 和脂肪酶p e t c 0 2 一自组装膜均表现出较好的时间稳定性，保存两个星期后，两者的 洒力保持率为4 0 左右，中性蛋白酶p e t c 0 2 一自组装膜的时间稳定性较差。采用静 i 乜向组装技术制备的酶自组装膜具有良好的活力回收率和稳定性，对实际的应用具 有重要意义。 浙江大学博士掌位论文 a b s t r a c t r e c e n t l y ，t h em o l e c u l a r d e p o s i t i o nt e c h n i q u eb a s e d o nc h a r g er e v e r s a lh a sr e c e i v e d c o n s i d e r a b l ei n t e r e s ta sah o v e lm e a n so fs e l f - a s s e m b l e du l t r a t h i nf i h np r e p a r a t i o nt h e s e l f - a s s e m n e du l t r a t h i nf i l m so b t o n e db yt h i sm e a l l sh a v ec o n t r o l l e dm o l e c u l e 1 e v e l t h i c k n e s s ，t a i l o r e da r c h i t e c t u r ea n dp r o p e r t i e s ，a n dc a l lb eu s e dt of a b r i c a t ef u n c t i o n a l d e v i c e sb a s e do nu l t r a t h i nf i l m s i nl a t e r1 9 9 0 s ，t h em o l e c u l a r d e p o s i t i o nt e c h n i q u eh a d g o t t e n t ob eu s e dt of a b r i c a t e l a y e r b y l a y e rp r o t e i ni m m o b i l i z a t i o n ，w h i c h i sa d e v e l o p m e n ti nt h ea l t e r n a t ep o l y c a t i o n p o l y a n i o ns e l f - a s s e m b l yp r o c e s sd e v e l o p e db y d e c h e r t h eu l t r a t h i nf i l mo fm o s tw a t e r s o l u b l ep r o t e i n so re n z y m e sc a nb eo b t a i n e d b e c a u s et h e yc a r lb ei n d u c e dt ob ec h a r g e ds p e c i e ss i m i l a rt op o l y c a t i o n so rp o l y a n i o n s s i n c et h eu l t r a t h i nf l i l l sa r ea s s e m b l e df r o mp r o t e i ns o t u t i o nu n d e rm i l dc o n d i t i o n sl i k e l 、0 0 1 t it e m p e r a t u r e ，d e n a t u r a t i o nd u r i n gs e l f - a s s e m b l yp r o c e s sw o u l db em i n i m a l i nt h i st h e s i st h es e l f - a s s e m b l e du l t r a t h i no n el a y e rf i l m so f0 t - a m y l a s e ，l i p a s e ，n e u t r a l p l o t e i n a s ea n dm u l t i l a y e rf i l mo fl i p a s ea n dp o l y i o nw e r ep r e p a r e d w ei n v e s t i g a t e dt h e p r o c e s so fe n z y m ea s s e m b l y ，a n dd i s c u s s e dt h ee f f e c to ft h ec o n d i t i o no nt h eu l t r a t h i n f i l mo f e n z y m e ，s i n c ep r a c t i c a lu s e f u l n e s so f t h e s ee n z y m ef i l m sd e p e n d so nt h es t a b i l i t y “e n z y m e si nt h ef i l m ，w eo b s e r v e dt h ee f f e c to f i m m o b i l i z a t i o no l lc a t a l y t i ca c t i v i t y ， s t o r a g es t a b i l i t y , p hd e p e n d e n c y , a n d s oo nt h e r ew e r et h r e em a i n p a r t si nt h ep a p e r f i r s t l y ，w ef o c u s e do u rm i n do nt h ef a b r i c a t i o no fs e l f - a s s e m b l e df i l m so fc c a m y l a s e ， i p a s ea n dn e u t t a lp r o t e i n a s eo n t h e n e g a t i v e l yc h a r g e dp o l y ( e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ) ( p e t ) s u b s t r a t et h ec o m m e r c i a lp e tw a s h y d r o l y z e du s i n gn a o h t h em o d i f i e dp e t s u r f a c e c o n t a i n e dam i x t u r eo fc a r b o x y l i ca c i da n da l c o h o lf u n c t i o n a lg r o u p sw h i c hr e s u l t e di na n e g a t i v e l yc h a r g e ds u r i a c ei nt h es o l u t i o n t h r e es u b s t r a t e sw i t hd i f f e r e n tc h a r g ed e n s i t y w e r ep r e p a r e db yc h m _ 】g i n gt h ec o n d i t i o n so fm o d i f i c a t i o n t h e nt h en e g a t i v e l yc h a r g e d p e ts u b s t r a t ew a si m m e r s e di n t ot h ee n z y m es o l u t i o ni nw h i c ht h ee n z y m ew a si n d u c e d t ob ep o s i t i v e l yc h a r g e d d r i v e nb yt h ee l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o nb e t w e e n n e g a t i v e l yc h a r g e d s u b s t r a t ea n dp o s i t i v e l y c h a r g e de n z y m e ，t h ee n z y m ea s s e n t h l e dt o f o r mu l t r a t h i nf i l m s p o n t a n e o u s l y t h en i sr e g i o ne m e r g e di nt h ex p ss p e c t r u mo fs e l f - a s s e m b l e de n z y m e f i l ma n dt h er o o t - - m e a n - - s q u a r e r o u g h n e s so fs u b s t r a t ec o v e r e du l t r a t h i ne n z y m ef i l m i i l c r e a s e d 油 江大学博士掌位论文 _ s e c o n d l y ，e f f e c t so nt h es t r u c t u r ea n dt o p o g r a p h i e so fs e l f - a s s e m b l e de n z y m ef i l m so f a s s e m b l i n gc o n d i t i o n st h a tw e r es u b s t r a t e sw i t hd i f f e r e n tc h a r g ed e n s i t y ，a s s e m b l i n gt i m e ， p hv a l u e a n dc o n c e n t r a t i o no fe n z y m e s o l u t i o n ，w e r es t u d i e d t h ec o n t r i b u t i o no f e n z y m em o l e c u l e si nt b es e l f - a s s e m b l e dc h a n g e dw i t ht h ep hv a l u eo f e n z y m es o l u t i o n w h e np hv a l u ew a sl o w e rt h a np io fe n z y m e ，t h ee n z y m em o l e c u l e si nt h ef i l mw e r e i n c l i n e dt o d i s p e r s e e a c ho t h e ra st h e p hv a l u ed e c r e a s e d t h e f i g u r e o fe n z y m e m o l e c u l e si nt h ef i l mo nt h ed i f f e r e n ts u b s t r a t ei sd i f f e r e n t i n g e n e r a l ，t h ef i g u r eo f e t l z y l t t e st h a ta s s e m b l eo nt h eh i g h e rc h a r g ed e n s i t ys u b s t r a t ei ss h a r p e rt h a nt h a to nt h e l o w e rc h a r g ed e n s i t ys u b s t r a t e t h ea b s o r b e da m o u n to f e n z y m e sw o u l db ei n c r e a s ew h e n t h ec o n c e n t r a t i o no f e n z y m es o l u t i o no ra s s e m b l i n gt i m ei se n h a n c e d t h i r d l y ，t h ee n z y m a t i ca c t i v i t y o fs e l f - a s s e m b l e d e n z y m e f i l m sw a so b s e r v e d i ti s p o s s i b l et h a ti m m o b i l i z e de n z y m ei sp a r t i a l l yd e n a t u r e dr e s u l t i n gi naw e a k e ra c t i v i t y e x a m i n i n gt h et h r e ee n z y m e ss e l f - a s s e m b l e df i l m ，w ef o u n dt h a ta tl e a s t7 5 o ft h e e n z y m a t i ca c t i v i t y w a sm a i n t a i n e d u p o ns e l f - a s s e m b l yw ec o u l dc o n c l u d et h a t s e l f - a s s e m b l yd i d n o tc a u s eas e r i o u sl o s si ne n z y m a t i c a c t i v i t y t h el o n g t e r ms t a b i l i t yo f s e l f - a s s e m b l e de n z y m e si so n eo fi m p o r t a n tr e q u i r e m e n t si nt h ep r a c t i c a l a p p l i c a t i o n s ， t h es e l f - a s s e m b l e de n z y m e sw e r es t o r e di nc l o s et u b e sa tr o o m t e m p e r a t u r e a f t e rg i v e n p e r i o d so ft i m e ，t h es a m p l e se n z y m a t i ca c l i v i t yw a sm e a s u r e dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h es a m p l eh a v es l o wd e c r e a s e si na c t i v i t y , a n da p p r o x i m a t e l y6 0 8 0 o f t h ea c t i v i t yw a s l o s ta f t e rt w ow e e k s i no u r e x p e r i m e n t ，t h et w og r o u p so fa a m y l a s es e l f - a s s e m b l e df i l m s w e r es t o r e da t4o co rr o o mt e m p e r a t u r er e s p e c t i v e l y ，d u r i n gt w ow e e k s ，t h es a m p l e ss t o r e da tr o o m t e m p e r a t u r es h o w e ds i m i l a rd e c r e a s et ot h a ta t4 a n dt h e i ra c t i v i t ya p p r o x i m a t et ot h ea c t i v i t yo f s e l f - a s s e m b l e d e n z y n l e s s t o r e da t4 。cs ow ec o n c l u d e dt h a tt h es e l f - a s s e m b l e d e n z y m e sh a v e a d v a n t a g e so fs t o r a g e a n dt r a n s p o r tt h ee f f e c t so fa s s e m b l i n gc o n d i t i o n so i l t h ea c t i v i t yo ft h e s e l f - a s s e m b l e de n z y m ew e r es t u d i e di nt h i sp a r t 浙江大学博士掌位论文 第一章绪论 1 1 分子自组装发展与分子层薄膜 分子自组装技术是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种制备超薄膜的技术，它主要 依靠组装基材和组装物质分子之间的氢键、静电相互作用、疏水亲脂作用、范德华 力等弱相互作用，在无外来因素影响的条件下自发形成具有特殊结构和功能的超薄 膜自组装膜。该方法简便易行，组装条件温和，对成膜物质分子的破坏较小， 可得到单分子层的薄膜，是一种高效的制备超薄膜的方法。 经过近二十年的发展，成膜物质已经由最初的有机化合物逐渐扩展到聚合物、 生物大分子、无机材料等，薄膜中的超分子系统也由最初的单组份扩展到功能相关 的多组份，分子自组装逐渐成为化学、物理、材料科学、生命科学的交叉点。运用 自组装技术制备的分子薄膜、液晶、胶束等材料，在光、电、磁信息的转换和处理、 生物组织功能的模拟及研究、高效催化剂的开发等方面有着广阔的应用前景，尤其 是基于生物活性分子薄膜的生物传感器的研制，近几年f 成为各国科学工作者的研 究焦点。 在各种自组装方法中，兴起于2 0 世纪9 0 年代的分子沉积技术逐渐脱颖而出， 成为制备超薄膜、构筑功能性纳米级超分子结构的有效方法，分子沉积技术主要是 以静电相互作用作为驱动力。最早用分子沉积技术得到的自组装体系是聚电解质的 自组装体系，将带有相反电荷的聚电解质逐层交替进行组装可以得到一种异质结构 的超薄膜，只要有足够数量的电荷，组装可以无限制地进行下去，并且每一组装层 的厚度可以实现人工调节。 日本的k u n i t a k e 教授和我国的沈家骢教授率先将分子沉积技术引入到制备生物 分子的超薄功能膜中，得到了葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、抗免疫球蛋白g 等多种 蛋白质与聚电解质交替的组装膜。由于组装的推动力是静电相互作用，所以在组装 过程中蛋白质的空间构像得到良好的保持，得到的生物分子组装膜的活性保持率高 予由其它方法制备的超薄膜的活性保持率；并且组装膜的稳定性( 如对温度、酸碱 的稳定性) 得到改善。用此方法不仅可以制备单组份的超薄膜，还可以制备多组份 1 一 第一章绪论 的超薄膜，如沈家骢教授制备的葡萄糖氧化酶和葡萄糖淀粉酶的双酶组装膜可以用 来检测麦芽糖的浓度。制备按照预先设计的顺序排列的多酶自组装体系可以实现级 联的酶促反应，这在微反应器的制备和应用中有着极大的潜力。 目前，利用分子沉积技术制备蛋白质、d n a 等生物分子的超薄膜的研究方兴未 艾，虽然对得到的生物分子膜的实际应用研究还处于实验室阶段，但可以预期这种 生物分子的分子沉积膜在生物传感器、高效催化剂、微反应器等等领域将会有巨大 的应用潜能。 1 2 酶生物活性膜的制各与应用 酶是一种催化效率高、专一性强、反应条件温和、催化活性可调控的生物催化 剂。早在认识酶的本质之前，人类就开始了对酶的利用，如我国古代的酿造、制饴 技术。人类对酶的真正认识始于1 0 0 多年以前，到了2 0 世纪初，酶学得到了突飞猛 进的发展，1 9 】3 年m i c h a e l i s 和m e n t e n 提出了酶反应动力学原理米氏学说；1 9 2 6 年s u m m e r 首先证明了酶的蛋白质本质。随着对酶认识的深入，人类对酶的利用更 有指导性、方向性，酶的应用空间也得到不断拓展，被广泛应用在食品、农业、医 学、能源开发、环境工程、化学合成等领域。 酶的广泛应用使以酶的催化性能为研究目标的酶工程得以迅速发展，其中酶的 固定化和自组装更是酶工程和酶基功能超分子的重要研究内容。酶的蛋白质本质决 定了酶在脱离生物体后，极容易失去催化活性，在实际的应用中酶很难回收，这极 大地限制了酶的应用。而固定化酶将酶固定在载体上，使酶既保持原有的催化特性 又能便于回收，实现连续化、自动化的生产工艺。 表1 1 中列出的是传统的酶固定化方法。它们的共同特点是得到酶分子的堆积 层，降低了酶的利用率。同时，由于底物和产物的扩散限制，使得固定化酶的催化 性能的灵敏度降低，响应时间长，不适应微量范围的微反应器、生物传感器的要求， 因此开发新的酶固定化技术是十分必要的。 2 浙江大学博士掌位论文 表1 - 1 传统同定化技术的优缺点 固定化技术优点缺点 吸附法简单，活力回收率高酶和载体结合不牢固，易 脱落 包埋法反应条件温和，活力回存在扩散效应，仅适用于 收率高小分子底物和产物的反应 交联法酶与载体结合牢固活力回收率低 共价法酶与载体结合牢固活力回收率低 分子沉积技术是新兴的酶固定化方法，浚方法制备的酶膜超薄有序，酶的活性 保持率高。最早进行这方面研究的是日本的k u n i t a k e 教授和我国的沈家骢教授，近 几年来国内外许多学者在这方面开展了大量的研究工作并取得了一定的进展。 k u n i t a k e 教授采用分子沉积技术制备了溶菌酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶等多种 酶的自组装膜，汪实了只要在实验条件下带有相应电荷的水溶性酶均可与带有相反 电荷的聚电解质交替组装形成多层膜。他的研究组对g o d 自组装膜进行了大量的 基础研究工作，发现在g o d p e i 自组装体系中，每g o d 吸附层包含有四个单分 子层的g o d ，其厚度大约为3 4 0 a ：而在g o d p d d a 的自组装体系中g o d 是以单 分子层进行组装的，厚度约为7 2 a ；并对g o d 膜的活性、保存时间、热稳定性、p h 稳定性进行了测定。运用分子沉积技术还可以得到多酶交替组装的体系，从而实现 多级酶反应的串联结构，例如沈家骢教授曾在电极表面组装得到葡萄糖氧化酶和葡 萄糖淀粉酶的多酶体系，并用于检测麦芽糖浓度，在麦芽糖浓度为i - 6 m m o l l 的范 围内，电流响应值与浓度呈线性关系。k u n i t a k e 以石英为基材，得到了g o d - p o d 通过p s s 、p e i 交替沉积的多组份自组装膜，结果表明该自组装膜可以实现g o d 、 p o d 之削偶联的酶促反应。c a r u s o 则得到了该体系在聚苯乙烯胶体微粒上的自组装 多层膜，用于酶促反应实验，表现出良好的稳定性。应用这种逐层静电组装的方法 得到葡萄糖淀粉酶葡萄糖异构酶的多层膜体系，可以实现由糊精到果糖的一步反 应。由分子沉积技术得到的分子级的酶超薄膜，在生物传感器等酶基分子器件、高 效催化剂等领域有着广阔的应用前景。 3 第一章绪论 1 3 本论文的研究内容 本论文的主要工作是以人类生命中最重要的三种酶即一淀粉酶、脂肪酶、蛋白 酶作为研究对象，以表面阴离子化的p e t 作为基材，用静电自组装技术研究聚合物 基材p e t 表面的纳米级超薄生物活性酶膜的制备；对于深化认识生命现象中的酶性 质和功能，扩展酶自组装膜应用都具有重要意义。 用a f m 、x p s 、f t j r a t r 等表面分析方法深入系统地研究p e t 、阴离子化p e t 及三种酶p e t c 0 2 一自组装膜的表面层结构和表面形貌，详细讨论和分析了三种不同 表面电荷密度的阴离子化p e t 基材；探讨不同电荷密度基材、溶液p h 值、组装时 间等因素对三种酶p e t c 0 2 一自组装膜的表面形态结构与特性的影响：为系统深化认 识酶p e t c 0 2 。自组装膜并扩展其应用积累了基础数据。 建立了酶p e t c 0 2 一自组装膜活性测定评价方法，研究了不同体系、不同条件酶 p e t c 0 2 自组装膜的时间稳定性和活力保持率；并探讨酶p e t c 0 2 自组装膜的稳 定性等性能指标；满足近年来发展的分子器件、生物传感器以及微反应器等领域微 量、灵敏、响应快等特点的要求。 论文的具体结构如下： 第一章：绪论部分介绍论文的背景及论文达到的目标； 第二章：对大分子的自组装膜的研究历史、现状进行了综述，概括介绍了大分 子自组装的成膜技术；文献报道的聚合物、生物大分子的自组装膜体系；常用的表 征自组装膜的分析技术；及大分子自组装膜的应用。 第三章：对p e t 薄膜进行表面离子化处理得到阴离子化的表面，以作为生物活 性酶自组装的基材。用f t i r a t r 、a f m 、x p s 等表面分析方法深入研究了p e t 及 阴离子化p e t 的表面层结构和表面形貌，详细讨论和分析了三神不同表面电荷密度 的阴离子化p e t 基材。 第四章：以人类生命中最重要的a 一淀粉酶、脂肪酶、中性蛋白酶三种酶作为研 究对象，在阴离子化的p e t 基材上的自组装得到酶p e t c 0 2 自组装膜，用a f m 、 x p s 、f t i r a t r 等表面分析方法进行了系统的研究。 第五章：以a f m 、s e m ( 扫描电镜) 为主要分析手段，研究了溶液p h 值、基 4 浙江大掌博士掌位论文 材表面电荷密度、组装时问、酶溶液浓度等因素对酶p e t c 0 2 1 自组装膜的表面形貌、 表面性质等的影响，并分析了各因素影响的权重。 第六章：建立三种酶p e t c 0 2 一自组装膜的酶活力测定方法，评价不同条件下所 得到酶p e t c 0 2 一白组装膜的活力回收率，并就溶液p h 值、基材表面电荷密度对酶 p e t c 0 2 自组装膜活力的影响进行了探讨，考察了酶p e t c 0 2 一自组装膜的稳定性。 第七章：总结 第二章大分子自组装膜的研究现状 第二章大分子自组装膜的研究现状 大分子自组装膜是指大分子( 聚合物和生物大分子) 在各种基材( 如金属、无 机物、聚合物等) 巴通过自组装行为而形成的超薄膜。大分子自组装膜超薄有序， 具有特殊的光、电、磁等性质，在新型功能性材料的研制和开发中占有重要的地位。 本文主要从大分子自组装成膜技术、大分子自组装膜的体系、大分子自组装膜的表 征以及大分子自组装膜的应用四个方面介绍了大分子自组装膜的研究现状和进展。 2 1 大分子自组装成膜技术 2 1 1 共价结合法 共价结合法制备自组装膜是基于特定的化学物质之间形成的化学键，有时也被 称为化学吸附法，这种自组装膜包括金一硫、硅烷一二氧化硅、金属磷酸盐化学等， 其中金一硫自组装膜是该类自组装膜中研究最为深入且较成熟的自组装体系。 会一硫自组装膜以金作为组装基材，成膜化合物以硫醇类化合物和二硫化物居 多，金属与硫之问形成的是化学键。 瑟一 幽2 - 1 化学吸附法原理示意图 f i g u r e2 一i s c h e m a * i cf o rt h eb u i l d u po fm o n o l a y e ra s s e m b l yb yc h e m s o r p t i o n 图2 1 是金一硫自组装过程的示意图，将金基材或表面镀金的基材浸入含硫化 合物溶液中，化合物中的s 原子与金键合，在金的表面形成一层含硫化合物的单分 子层膜。起初人们研究了小分子硫醇类化合物在金表面上的自组装行为，得到了稳 - 6 、誓o 浙江大学博士掌位论文 定性高、有序性好、紧密键合的单层有机膜，此后逐渐发展了聚合物硫化物在金表 丽的自组装膜。 金属与硫之间形成的是化学键，因此这种膜的牢固度与热稳定性都很好。金一 硫自组装膜的成膜条件比较容易控制，成膜速度较慢；金一硫自组装膜的有序性强， 一般受到金基材晶型的影响；吸附杂质少：选择性高 1 j 。金一硫自组装膜是严格的 单分子层膜，但是应用此方法很难得到多层膜。 2 1 2 叠层沉积法( l a y e r - b y l a y e rd e p o s i t i o n ) 叠层沉积法兴起于2 0 世纪9 0 年代，利用该方法既可以制备单层自组装膜，又 可以制备多层自组装膜。就成膜物质而言，采用该方法不仅可以制备单组份的自组 装膜，还可以制备多组份的自组装膜。根据叠层沉积组装过程中的推动力而分，有 静电叠层沉积法、酰胺反应叠层沉积法和生物特异反应叠层沉积法。前一种方法适 用范围广，是目前自组装成膜研究中使用最多的一种方法，后两种方法则主要适用 于生物分子的成膜。 一、静电叠层沉积法 静电叠层沉积法又称为分子沉积方法，1 9 9 1 年由德国m a i n z 大学的d e c h e r 首 先提出来，其原理是：将带电荷的固体基材与带有相反电荷的聚电解质溶液接触、 吸附，然后用水洗净，使表面带有相反电荷，再浸入与固体基材带有相同电荷的聚 电解质溶液中，取出后用水洗净，表面电荷发生反转，如此往复进行，即可成多层 自组装膜 2 1 。以聚电解质为例的分子沉积自组装的原理示意图如图2 2 。 翌 - 7 - 第二章大分子自组装膜的研究现状 分子沉积技术的关键是电荷过量，即成膜分子表面带有的电荷数量多于基材表 面的电荷数量，从而保证基材表面的电荷发生反转，使得带有相反电荷的聚电解质 能够继续沉积在第一层上，循环往复，形成多层膜。另外，电荷过量可以保证带同 种电荷的分子之间具有斥力，有利于得到单分子层的白组装膜1 3 j 。这种仅仅依靠静 电相互作用的分子沉积法，在理论上适用于一切聚电解质分子，具有成膜情况不受 基材尺寸、形状和形貌的影响，不破坏成膜分子结构，操作简便易行的特点【4 j 。 二、酰胺反应法 酰胺反应叠层沉积法是利用生物分子中羧基( c o o h ) 和胺基( - n h 2 ) 之间的化学 反应生成酰胺键( c o o n h ) ，从而形成生物大分子多层自组装膜的方法。其自组装 过程是：将含有胺基或羧基的生物大分子通过酰胺键连接到含有羧基或胺基反应基 团的基材表面，以形成单分子层薄膜，若生物大分子上还含有胺基或羧基，则可与 含有羧基或胺基的另一分子发生酰胺反应，如此重复循环下去，可以制备得到生物 大分子的叠层自组装多层膜。 ld u s a n 等【5 】利用这种方法构造了葡萄糖氧化酶( g o d ) 的单分子层膜，他们 将硫醇修饰的金表面的自组装单分子层( s a m ) 的末端羧基化，通过酰胺反应在g o d 与s a m 之间形成共价键，从而得到g o d 的单分子层膜。 l c y o o n 等【6 j 利用这种 方法在金表面构造酶的叠层交替沉积多层膜，他们通过酰胺反应将接枝聚合物第四 代聚酰胺 f o u n h - g e n e r a t i o np o l y ( a m i d o a m i n e ) ( g 4p a m a m ) t t l lg o d 交替沉积到金表 面，这样构筑出来的电极可应用于生物传感器；对g 4 用二茂铁进行修饰后川，由于 二茂铁可作为电子转移的媒介，g o d 酶电极的灵敏度最高。 由于蛋白质分子中具有羧基和胺基，可通过这种方法将其固定到胺基化或羧基 化的表面上，因此这种方法被广泛应用于蛋白质的自组装。 三、生物大分子的特异识别自组装 利用某些生物大分子和特定的生物分子之间的特异识别进行生物大分子的叠层 沉积自组装，是一种简易的自组装方法，例如抗生素蛋白与生物素之间，伴刀豆凝 集素( c o n a ) 与甘露糖之间的强生物亲和力等。 通过这种方法，s vr a o 等 8 】获得了蛋白质的叠层沉积多层自组装薄膜，他们 先将辣根过氧化物酶( h r p ) 进行生物素化得到b c a p - h r p ( b i o t i n y l a t e dh o r s e r a d i s h r 浙江大学博士掌位论文 p e r o x i d a s e ) ，其中每个h r p 分子含有两个生物素分子，然后利用抗生素蛋白和生物 素的相互作用进行交替沉积，实验发现这种方法组装的h r p 比酰胺反应组装的活性 高，也比游离的b c a p h r p 溶液的活度高。j i a n z a i 等【9 在石英晶体表面得到了抗 生素蛋白和连接有生物素分子的抗体间的交替沉积膜，并研究了它的活性。 另外还可通过c o n a 与含糖酶的糖链之间的生物特定络合作用进行糖蛋白的叠 层交替沉积组装。j ia n z a i 等通过c o n a 和天然g o d 的相互作用，在铂电极表 面进行交替沉积以形成g o d 的多层薄膜，并将其应用为葡萄糖传感器。对于一些 本身无糖链的生物大分子，如乳酸氧化酶( l o x ) 【】1 1 , 可先用甘露糖等进行修饰后， 再与c o n a 进行络合反应，这样就可得到叠层交替沉积的多层薄膜。 2 1 3 旋涂成膜法 旋涂方法指将配制好的聚合物溶液滴加到高速旋转的底物表面形成薄膜，在离 心力作用下多余的溶液被甩出，留下比较均匀的涂层，再重复以上的过程直到得到 满意厚度的膜为止。1 9 9 4 年，k i m 等人把聚k 8 ( ( ( 丁氧一羧基) 甲基) 尿烷基) 一1 一( 5 - 砒 碇基) 辛1 ，3 二炔目溶于1 ( w v ) 氯仿中，然后用不同速度把这个溶液旋涂到玻璃底 物上以获得合适的厚度，再真空干燥过夜，得到白组装膜。用f t i r 和介电光谱确 证了自组装膜的氢键网络结构。1 9 9 6 年，张榕本等人把浓度为o 5 m o l l 的n 一( 4 - 硝基苯基) 一l 脯胺醇的n 甲基砒咯烷酮溶液和对二烯丙氧基苯硅氢化产物溶液等混 合得到均一透明的溶液，在此溶液中加入定量的水于室温下搅拌4 8 小时，过滤后用 旋涂方法在玻璃上涂膜，再固化得自组装膜，并用红外光谱、原子力显微镜( a f m ) 及示差扫描量热( d s c ) 研究了自组装结构的形成过程1 3 。w e i d o n gc h e n 等人则用 旋涂得到发光二极管的聚合物自组装膜 1 4 】。r u s s e l 等人也得到苯乙烯和甲基丙烯酸 甲酯共聚物的自组装膜【”1 。与旋涂类似地，g e o r gk r a u s h 用浇铸方法得到了氘代聚 苯乙烯和溴化聚苯乙烯混合物的自组装膜【l “。 2 1 4 慢蒸发溶剂法 k u n i t a k e 和他的合作者首次通过缓慢蒸发水获得了两亲分子自组装膜，接着， 他们又通过蒸发非质子性有机溶剂得到两亲分子自组装膜【”1 。沈家骢等人把长脂链 单胺、乙二胺、环氧氯丙烷熔融聚合得到一个两亲性聚合物( m = 7 8 0 0 ，长链烷基占 9 第二章大分子自组装膜的研究现状 7 5 8 ，一个分子平均占2 0 8 个硬脂酰侧链) 。把这个聚合物溶于氯仿乙醇( 7 ：3 ) ，在 固定蒸气压和室温条件下蒸发有机溶剂4 8 小时，得到自组装膜。i m i r e 则利用这 种自组装方法合成了超分子侧链液晶聚合物19 1 。在这种方法中，聚合物亲水和憎水 的平衡是关键因素。 2 1 5 枝接成膜法 把一端枝接在固体表面的聚合物浸入溶剂中，如果聚合物与溶剂不相溶，且枝 接不均匀，憎溶剂相互作用使高分子链白组装成有序膜【2 0 1 。b a l a z s 等人利用这种方 法得到了均聚物刚和共聚物自组装膜。m a r k o 制得了共聚物自组装膜 2 3 】。s i n g h v i 则制得了作为生长生物细胞模板的自组装膜 2 ”。这种成膜技术的优点是膜的尺寸能 通过改变聚合物链长、溶剂性质和枝接密度来控制。 2 2 大分子自组装膜体系 2 2 1 聚合物的自组装膜 一、聚合物的金硫自组装膜 m c c a r t h y 等人首先利用制备了含硫聚合物的自组装单分子层膜【2 5 】，研究了聚苯 乙烯一聚硫代丙烯的共聚物在金表面的自组装行为，指出聚合物中的含硫部分发生了 化学吸附，形成了以强键结合的薄膜。1 9 9 3 年d w g r a i n g e r 等人 2 6 在硅表面依次 涂上钛、钯、金后，将一个嵌段中含二硫键的丙烯酸酯的三嵌段共聚物在金表面通 过化学吸附成膜，结果发现聚合物分子与基片通过多点接触，与传统的二硫化物的 自组装膜相比，膜结构更趋于各向同性，在湿环境中的热稳定性大大增强。1 9 9 6 年， 他们2 7 1 用金属蒸发器在高真空条件下将硅表面依次涂上1 0 0 a 的铬层、2 0 0 0 a 的金 层后，让含有烷基二硫化物侧链的聚硅氧烷与全氟代聚醚的接枝共聚物在金表面吸 附成膜，此种膜具有高度疏水性，耐高、低温，化学稳定性、润滑性较好等特点。 j f r a b o l t 等人制得了两种含硫量不同的聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a 1 0 0 和 p m m a 一1 0 ) ，并研究了鼹种化合物在金表面上的自组装单层膜的结构与性质，得出 了组成、结构与性质问的关系，对于聚合物分子如何在固体表面上进行自组装和两 1 0 浙江大学博士掌位论文 者之间的相互作用做了一些解释，为在实际应用中设计制造稳定持久的超薄膜指导 了方向。基于含硫的p m m a 在余表面形成的自组装膜具有多孔性这一事实，他们【2 9 】 通过共沉积的方法得到了含硫的p m m a 与聚环氧乙烷( p e o ) 的两组份共混自组装 膜，并对其表面结构进行了测试。此后，他们又对含硫醇侧链的聚二甲基硅氧烷 ( p m d s ) 在金表面形成的自组装膜进行了研究p “，发现了“胶粘”( s t i k e r ) 单元 的含量对聚合物膜的厚度、表面润湿性以及p d m s 骨架的取向有显著影响。 t a k a oi s h i d a 等人i 引】在云母表面涂上金( 1 1 1 ) 薄层，用不对称的碳氟一碳氢二硫 化物在金表面自组装成膜，结果发现在加热条件下界面处的二硫键断裂，使碳氟链 与碳氯链发生相分离，并定量计算出两者问的交角，高度差等。v - k o u t s o s 等人【3 2 j 利用十二烷基硫醇和以一s h 为端基的聚苯乙烯的混合甲苯溶液在同样的金表面成 膜，用扫描力显微镜( s f m ) 测试发现单个的