（植物学专业论文）多胁迫诱导型lehsp238启动子的分子克隆及其功能分析.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 伢搿灵盎 导师签字： 学位论文版权使用授权书 多l 磊 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 蕉j 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：锣弥天茧 签字日期：2 0 0 )6 月驴e t 导师签字纠云l 签字日期：2 0 0 ，年加旁日 山东师范大学博士学位论文 多胁迫诱导型l e h s p 2 3 8 启动子的分子克隆及其功能分析 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 摘要 暴露于高温条件下，生物体普遍的反应是产生一组热激蛋白( h s p ) 。热激蛋白基 因( h s p ) 表达调控包括选择性转录和选择性翻译，其中转录水平的调控是热激蛋白基 因表达调控的主要方式。热激因子( h s f ) 与热激基因上游调控片段中的热激元件( h s e ) 结合来调节热激基因的转录。我们通过构建质粒文库的方法首次克隆了番茄线粒体小分 子热激蛋白基因( l e h s p 2 3 8 ) 上游1 9 1 5b p 的调控区，通过与g u s 基因融合，在转基因番 茄中分析了其热诱导的组织特异性及发育性表达特征，详细分析了该启动子在不同发育 时期番茄果实中的热诱导表达模式，并证明该启动子还受低温、外源a b a 及重金属胁 迫诱导。进而构建了一系列的突变载体( p k l 9 1 5 、p k l 3 2 7 、p k 8 7 1 、p k 5 6 5 、p k 2 5 5 、 p k o o a t l 4 、p k a a t l 5 、p k a a t 3 4 、p k & a t l 2 、p k 。h s e ) ，通过对各种胁迫下转基 因烟草的g u s 活性分析来研究该启动- 7 ：f 拘功能序列。 主要实验结果如下： 1 通过构建质粒文库的方法从番茄中克隆了l e h s p 2 3 8 上游1 9 1 5b p 的调控区 ( a b 2 3 9 7 7 4 ) 。该序列含有t a t ab o x 及c a a tb o x 等启动子基本元件，还具有7 组典 型的h s e 元件及多个a t - r i c h 区，另外还有许多逆境反应元件，如a b r e ，c - r e p e a t，dre a p 1 。凝胶阻滞结果表明，纯化的h s f a 2 蛋白与l e h s p 2 3 8 启动子的h s e 元件在体外 具有结合活性，且与近端5 组h s e 的结合活性比与远端h s e 6 的结合活性强。 构建全长l e h s p 2 3 8 启动子( 1 9 1 5b p ) 与g u s 基因的融合载体，转化番茄，s o u t h e r n 杂交结果表明g u s 基因以单拷贝或两个拷贝形式整合在转基因植株基因组中。常温条件 下，转基因番茄中除个别组织中检测到g u s 弱表达外，大部分组织中检测不到g u s 表达。在l e h s p 2 3 8 启动子控制下，对转基因番茄中热诱导的发育性和组织特异性g u s 表达进行了检测。热激之后，转基因番茄的根、叶、花、果及萌发的种子均检测到高水 平的g 町s 表达。在花的不同组织部位中，l e h s p 2 3 8 启动子的热诱导活性随着花的发育 而有所差异。番茄果实各个部位中热诱导的g u s 酶活性是不同的。番茄果皮中g u s 酶活性高于胎座中，而果浆中g u s 酶活性最低。导致果皮中g u s 酶活性最高的热激温 山东师范大学博士学位论文 度随果实发育阶段的不同而不同，绿果为4 2 ，白果为3 6 ，微红果和红果为3 9 。 在3 9 c 长时间热激条件下，所有时期的果实都表现出高水平的g u s 酶活性。而且g u s 表达轮廓随番茄果实成熟度的不同而不同，随番茄果实的成熟，热激应答逐渐变弱。另 外，在低温、外源a b a 及重金属( c d 2 + ，c u 2 + ，p b 2 + 或z n 2 + ) 胁迫下，转基因番茄叶 片及幼根中均检测到明显的蓝色。低温及外源a b a 处理条件下该启动子的活性不是很 强，约为热激强度的四分之一以上结果表明l e h s p 2 3 8 启动子是热诱导强启动子并受 多种胁迫诱导。 2 构建5 缺失l e h s p 2 3 8 启动予与g - u s 基因的融合载体( p k l 9 1 5 、p k l 3 2 7 、p k 8 7 1 、 p k 5 6 5 、p k 2 5 5 ) ，转化烟草。对不同长度启动子转化株系在热激、低温、外源a b a 及 重金属p b 2 + 臌j , 迫条件下的g u s 荧光活性进行测定。 全长l e h s p 2 3 8 启动子( 1 9 1 5b p ) 转基因烟草的g u s 组织化学染色结果表明，常 温下检测不到g u s 表达，而热激处理后，在转基因烟草幼苗的根、茎、叶及不同发育 时期的花中均检测到强烈的g u s 组织化学染色。g u s 荧光分析结果表明5 6 5b p 启动 子介导的g u s 热诱导表达是最强的，而2 5 5b p 启动子片段驱动的g u s 热诱导表达最 弱，1 9 1 5b p 、1 3 2 7b p 、8 7 1b p 启动子介导的g u s 热诱导表达强度接近，但弱于5 6 5b p 启动子。启动子缺失分析表明，2 5 5 坳启动子含有的5 组热激元件是l e h s p 2 3 8 启动子 热诱导所需要的，5 6 5b p 至2 5 5 却片段之间的a t - d c h 区对l e h s p 2 3 8 启动子的热诱导 表达具有增强作用8 7 1b p 至1 9 1 5b p 片段之间的2 组h s e 对该启动子的热诱导活性 并不起增强作用。 l e h s p 2 3 8 启动子中5 6 5b p 以内的序列足以响应低温、外源a b a 及重金属胁迫应答， 预测的远程胁迫相关元件( 如c - r e p e a td r e ，a b r e ，a p 1 ) 在p 厅印2 主占启动子的低温、 外源a b a 及重金属胁迫应答过程中并不起作用，可能近端的h s e 与a t - d c h 区在这些过 程中发挥重要作用。 3 为了进一步研究近端h s e 元件及a t - r i c h 区在l e h s p 2 3 8 启动子胁迫应答中的 作用，对该启动予进行了a t - n c h l - 4 叠加、a t - d c h l 5 缺失、a t - r i c h 3 - 4 缺失、a t - r i c h l - 2 缺失及近端5 组h s e 突变分析，构建g u s 融合载体p k o o a t l 4 、p k a a t l 5 、p k a a t 3 4 、 p k a t l 2 、p k * h s e ，转化烟草。对不同突变启动子转化株系在热激、低温、外源a b a 及重金属p b 2 + 胁迫条件下的g u s 荧光活性进行测定。 a t - r i c h l - 4 叠加的启动子介导的g u s 热诱导表达高于8 7 1b p 启动子，但低于5 6 5b p 2 山东师范大学博士学位论文 启动子，说明5 6 5 一2 3 5b p 之间3 3 1b p 片段具有增强作用，但是与启动子核心元件距离 变远时便有抑制作用；缺失a t r i c h l 2 和缺失a t - r i c h 3 - 4 的启动子介导的g u s 热诱导活 性明显低于8 7 1b p 启动子，甚至低于2 5 5b p 启动子，说明a t - r i c h l - 2 和a t - r i c h 3 - 4 具有非 常重要的增强作用；突变近端5 组h s e 元件后转基因植株失去热诱导活性。另外， a t - r i c h l - 4 叠加以后转基因植株g u s 热激表达沉默率降低，而a t - r i c h l - 2 、a t - r i c h 3 - 4 及 a t - r i c h l 5 缺失以后g u s 热激表达沉默率提高。 a t - r i c h l 4 序列叠加及a t - r i c h 3 - 4 缺失的启动子仍能介导g u s 的低温诱导表达，而 缺失a t - r i c h l 2 和缺失a t - r i c h l 5 及h s e 元件突变的启动子不能介导g u s 的低温诱导表 达，说明，上如够丝8 启动子中h s e 元件和a 确c h l - 2 序列在如如矽i 占基因的低温表达过 程中起重要作用，而a t - r i c h 3 - 4 序列t 虫l e h s p 2 3 8 基因的低温诱导表达过程中并不起主要 作用。 。 a b a 诱导表达模式与重金属诱导表达模式类似，a t - r i e h l - 4 叠加、a t - r i c h l - 2 缺失、 a t - r i c h 3 4 缺失启动子仍能介导g u s 的a b a 及重金属诱导表达，而缺失a t - r i c h l 5 或突 变h s e 元件的启动予不能够介导g u s 的a b a 及重金属诱导表达。l e k s p 2 3 8 启动子的 a b a 与重金属应答过程可能具有类似的途径。 本论文主要创新点： 1 首次克隆了多胁迫诱导型厶两酗i 8 启动子。通过与g u s 基因融合，在转基因番茄中分 析t l e h s p 2 3 8 启动子热诱导的组织特异性及发育性表达特征，并证明该启动子是受 热激、低温、外源a b a 及重金属胁迫诱导。 2 首次采用热激蛋白基因启动子与g u s 基因融合的方法来分析番茄果实中热激蛋白的 表达模式。详细分析t l e h s p 2 3 8 启动子在不同发育时期番茄果实中的热诱导表达特 征，证明该启动子的热诱导活性依赖于番茄果实的发育时期。 3 首次对l e h s p 2 3 8 启动子的元件进行了较为详细的分析。证明a t - r i c h 区对该启动子具 有重要的增强作用，并影响转基因沉默率。首次证明z e h s p e 7 8 启动子的a 确c h 区和 h s e 元件协同作用来决定热激蛋白的冷诱导表达。 关键词：l e h s p 2 3 8 ；启动子；g u s 活性；番茄果实；胁迫；缺失分析 中图分类号：q 9 4 5 3 山东师范大学博士学位论文 c l o n i n ga n d f u n c t i o n a la n a l y s i so fam u l t i p l es t r e s s - i n d u c i b l e l e h s p 2 3 8p r o m o t e r ( c o l l e g eo f l f f es c i e n c e s , s h a n d o n gn o r m a lu n i v e r s i t y , j i n a n2 5 0 0 1 4 ，c h i n a ) ， a b s t r a c t t h e p r o d u c t i o no f h e a ts h o c kp r o t e i n s 饵s p s ) i sau n i v e r s a lr e s p o n s e t oh i g ht e m p e r a t u r e e x p o s u r e t h es y n t h e s i so fh s p si sr e g u l a t e db yt r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o na n dt r a n s l a t i o n a l s e l e c t i o no fh e a ts h o c kt r a n s c r i p t s t h ee x p r e s s i o no fh s p si sr e g u l a t e dm a i n l ya tt h e 缸a n s c r i 砸o n a ll e v e l t h i sr e g u l a t o r yc o n t r o lo c c u r st h r o u g ht h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n t h e h e a t s h o c kf a c t o r s 饵s f ) a n dt h ee i s - a e t i n g h e a ts h o c ke l e m e n t s f f i s e s ) i nt h i sp a p e r , a l l a p p r o x i m a t e l y1 9k bo f l e h s p 2 3 85 - f l a n k i n gs e q u e n c ew a s i s o l a t e df r o mt o m a t og e n o m e b yu s i n gt h e3 - g l u c l l r o u l d a s e ( g u s ) l c p o r t e fg e n es y s t e m , t h ed e v e l o p m e n t a la n dt i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o no ft h eg u sg e n ec o n t r o l l e db yt h el e h s p 2 3 8p r o m o t e rw a sc h a r a c t e r i z e d i nt r a n s g e n i ct o m a t op l a n t s 。t h eh e a t - i n d u c e de x p r e s s i o np r o f i l e so ft h el e h s p 2 3 8 ：g u s w e r ed e f i n e di nt r a n s g c u l ct o m a t of r u i t sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s 。o b d o u sg u s a c t i v i t i e su n d e rc o l d , e x o g e n o u sa b aa n dh e a v ym e t a l ( c d 2 + ，c u 2 + p b 2 + o r 叠+ ) s t r e s s c o n d i t i o n sw e r ea l s od e t e c t e d f u r t h e r m o r e ，s e r i e so ft h em u t a g e n e s i sl e h s p 2 3 8 p r o m o t e r - g u se x p r e s s i o nv e c t o r s ( p k l 9 1 5 ，p k l 3 2 7 , p k $ 7 1 ，p k 5 6 5 ，p k 2 5 5 ，p k o o a t l 4 ， p k a a t l 5 ，p k a t 3 4 ，p k a a t l 2a n dp k + h s e ) w e a ec o n s t r u c t e d i no r d e rt of u r t h e r d e f i n et h ef u n c t i o n a lc i se l e m e n t si nt h el e h s p 2 3 8p r o m o t e r , q u a n t i t a t i v eg u sa s s a y sw e l e p e r f o r m e du n d e rm u l t i p l e - s t r e s sc o n d i t i o n si nt r a n s g e u l ct o b a c c op l a n t s t h em a i nr e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 t h e5 - f l a n k i n gs e q u e n c eo fl e h s p 2 3 8w a si s o l a t e df r o mt o m a t og e n o m e t h e l e h s p 2 3 8p r o m o t e r ( a b 2 3 9 7 7 4 ) w a s1 9 1 5b pi nl e n g t hw i t hs e v e r a lt y p i c a ls e q u e n c e s ，s u c h a st a t ab o xa n dc a a tb o x at o t a lo fs e v e nh s e sa n ds e v e r a la t - d c hr e g i o n sw e r ef o u n d i nt h es e q u e n c e a d d i t i o n a l l y ，t h e r ea r es o m et r a n s e d p t i o nf a c t o rb i n d i n gm o t i f sr e l a t e dt o s t r e s sr e s p o n s e ，s u c ha sa b a - r e s p o u s i v ee l e m e n t a b r e ，c - r e p e a t _ d r ea n da c t i v a t i n g p r o t e i nb i n d i n gs i t e s a p 一1 】e l e e t r o p h o r e s i sm o b i l i t ys h i f ta s s a y ( e m s a ) a n a l y s i ss h o w e d 4 山东师范大学博士学位论文 t h a tt h ep u r i f i e dh s f a 2p r o t e i nb o u n ds p e c i f i c a l l yt oh s e so ft h el e h s p 2 3 8p r o m o t e r 加 v i t r o a n db o u n ds t r o n g l yt ot h ep r o x i m a lf i v eh s e st h a nt 0t h ed i s t a lh s e 6 t h ef u s i o nc o n s t r u c t i o no fl e h s p 2 3 8 ：g u sw a si n t r o d u c e di n t ot o m a t o s o u t h e r nb l o t r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec h i m e r i cg u sg e n ew a si n t e g r a t e di n t ot h et o m a t og c n o m ew i t ha s i n g l ec o p yo rt w oc o p i e s a tn o r m a lt e m p e r a t u r e ，m o s to ft h et i s s u e ss h o w e dn og u s a c t i v i t y t h ed e v e l o p m e n t a la n dt i s s u es p e c i f i ce x p r e s s i o no ft h eg u sg e n ec o n t r o l l e db yt h e z , e h s p 2 3 8p r o m o t e rw a sc h a r a c t e r i z e di nt r a n s g e n i ct o m a t op l a n t s s t r o n go u ss t a i n i n gw a s d e t e c t e di nt h er o o t s ，l e a v e s ，f l o w e r s ，f r u i t sa n dg e r m i n a t e ds e e d sa f i e fh e a ts h o c k t h e h e a t - i n d u c e dg u sa c t i v i t yw a sd i f f e r e n ti nt h ef l o r a lt i s s u e sa tv a r i o u sd e v e l o p m e n t a ls t a g e s f l u o r o m e t r i cg u sa s s a ys h o w e dt h a tt h eh e a t - i n d u c e dg u sa c t i v i t yw a sh i g h e ri nt h e p e r i c a r pt h a ni nt h ep l a c e n t a , a n di tw a st h el o w e s ti nt h el o c u l a rg e l t h eh e a t - s h o c k i n d u c t i o no f t h ek h s p 2 3 8p r o m o t e rd e p e n d e do i ld i f f e r e n ts t a g e so f f i t t i td e v e l o p m e n t t h e o p t i m a lh e a t - s h o c kt e m p e r a t u r e sl e a d i n gt ot h em a x i m a lg u sa c t i v i t yi nt h ep c r i c a r po f g r e e n , b r e a k e r , p i n ka n dr e df r u i t sw e r e4 2 。c ，3 6 0 c ，3 9 0 ca n d3 9 。c ，r e s p e c t i v e l y t h e h e a t - i n d u c e dg u sa c t i v i t yi nt o m a t of r u i t si n c r e a s e dg r a d m a l yw i t h i n4 8ho ft r e a t m e n ta n d w e a k e n e dd u r i n gt o m a t of r u i tr i p e n i n g o b v i o u sg u sa c t i v i t i e su n d e rc o l d ，e x o g e n o u sa b a a n dh e a v ym e t a l ( c d 2 + ，c u 2 + ，p b 2 + o rz n ls t r e s sc o n d i t i o n sw e r ea l s od e t e c t e d t h em a x i m a l g u sa c t i v i t yi nt h el e a v e su n d e rc o l da n de x o g e n o u sa b ac o n d i t i o n sw 砸a b o u to n ef o u r t h a sm u c ha st h a ta f t e rs e v e r eh e a ts h o c lt h e s er e s u l t ss h o wt h a tt h el e h s p 2 3 8p r o m o t e ri s c h a r a c t e r i z e da ss l z o n g l yh e a t - i n d u c i b l ea n dm u l t i p l e - s o e s sr e s p o n s i v e 2 t h ee x p r e s s i o nv e c t o r s ( p k l 9 1 5 ，p k l 3 2 7 ，p k 8 7 1 ，p k 5 6 5a n d p k 2 5 5 ) w g r e c o n s t r u c t e dc a r r y i n gt h eg u sg e n ed r i v e nb yt h e5 d e l e t i o np r o d u c t so ft h el e h s p 2 3 8 p r o m o t e r a n dt h ec o r r e s p o n d i n gt r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t sw f f f eg e n e r a t e d t h eg u sa c t i v i t y u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n s ，s u c ha sh e a t , c o l d , e x o g e n o u sa b aa n dh e a v ym e t a l 酽+ ) ，w a s c h a r a c t e r i z e di nd i f f e r e n tt r a n s g e n i ct o b a c c ol i n e s h i 曲l e v e l so fh e a t - i n d u c e dg u ss t a i n i n gw d e t e e t e di nt h el e a v e s ，s h o o t s ，r o o t sa n d d i f f e r e n td e v e l o p m e n t a lf l o w e r so ft h ep k l 9 1 5t r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t s t h er e s u l to f f l u o r o m e t r i cg u s a s s a y ss h o w e dt h a tt h eh e a t - i n d u c e dg u sa a i v i t yo ft h e5 6 5b pp r o m o t e r w a st h es t r o n g e s t , w h i l et h a to ft h e2 5 5b pp r o m o t e rw a st h el o w e s t t h eh e a t - i n d u c e dg u s 5 山东师范大学博士学位论文 a c t i v i t ym e d i a t e db yt h e1 9 1 5b p ，1 3 2 7b po r8 7 1b pp r o m o t e rw a ss i m i l a r , a n di tw a sl o w e r t h a nt h a to f t h e5 6 5b pp r o m o t e r d e l e t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ef i v eh s e sw i t h i nt h e2 5 5 b pu p s 仃e a mo ft h el e h s p 2 3 8g e n ew e r en e c e s s a r yf o rt h eh e a t i n d u c i b l ea c t i v i t yo ft h e p r o m o t e r t h ea t - r i c hr e g i o n sb e t w e e n - 2 5 5b pa n d 5 6 5b pi nt h el e h s p 2 3 8p r o m o t e r s e r v e da sa t h a n c e r sf o rt h eh e a t - i n d u c e de x p r e s s i o no ft h ec h i m e r i cg e n e a n dt h et w oh s e s b e n - 8 7 1b pa n d - 1 9 1 5b pw e r en o tn e c e s s a r yf o re n h a n c i n gt h el e h s p 2 3 8p r o m o t e r a c t i v i t y 1 1 1 ec h i m e r i cg e n ew i t ht h e5 6 5b pp r o m o t e rs t i l lc a nb ei n d u c e db yc o l d , h e a v ym e t a l a n de x o g e n o u sa b a 1 1 1 ep u t a t i v ee l e m e n t sc - r e p e a t _ d r e a p - la n da b r ei n t h e l e h s p 2 3 8p r o m o t e rw e r en o ti n v o l v e d i nt h es t r e s sr e s p o n s et oc o l d , h e a v ym e t a la n d e x o g e n o u sa b a t h ep r o x i m a lh s e sa n da t - r i c hr e g i o n sm a y , t os o m ee x t e n t c o n t r i b u t et o t h em u l t i p l e - s t r e s sr e s p o n s i v ec h a r a c t e ro f t h el e h s p 2 3 8p r o m o t e r 3 t oa n a l y z ei nd e t a i lt h er o l eo fp r o x i m a lh s e sa n da t - r i c hr e g i o n si nt h el e h s p 2 3 8 p r o m o t e ru n d e rm u l t i p l es t r e s s e s ，t h ee x p r e s s i o nv e c t o r s ( p k o o a t l 4 ，p k a a t l 5 ，p k z x a t 3 4 ， p k a a t l 2a n dp k + h s e ) w e r ec o n s t r u c t e de a r r r i n gt h eg u sg e n ed r i v e nb yt h em u t a g e n e s i s l e h s p 2 3 8p r o m o t e r a n dt h ec o r r e s p o n d i n gt r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t sw e r eg e n e r a t e d t h e g u sa c t i v i t yu n d e rs t r e s sc o n d i t i o n s ，s u c h 觞h e 鸸c o l d , e x o g e n o u sa b aa n dh e a v ym e t a l 口b 2 + ) ，w a sc h a r a 删i n d i f f e r e n tl r a n s g e a i ct o b a c c ol i n e s c o n s t r u c tp k o o a t l 4c o n t a i n i n gr e p e a t e da t - r i c h l 4r e g i o ns h o w e dh i g h e rg u s e x p r e s s i o nl e v e lt h a nc o n s t r u c tp k 8 7 1 ，b u tl o w e rt h a nc o n s t l a l e tp k 5 6 5 t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h e3 3 1b ps e q u e n c e sb c t w e e a - 5 6 5a n d - 2 3 5b ph a de n h a n c e ra c t i v i t y h o w e v e r , i t r e s t r a i n e dt h eg u se x p r e s s i o nw h e nt h ed i s t a n c eb e c o m e sf a r t h e rf r o mt h ec o l ep r o m o t e r e l e m e n t s t h ed e l e t i o no fi n t e r n a lr e g i o na t - r i c h l 一2o ra t - r i c h 3 - 4s i g n i f i c a n t l ya f f e c t e dt h e h e a t - i n d u c e dg u se x p r e s s i o n , w h i c hs u g g e s t e dt h a ta t - r i c h l - 2a n da t - r i c h 3 - 4h a d i m p o r t a n t e n h a n c e r a c t i v i t y p r o m o t e rh a r b o r i n gt h em u t a g e n e s i sh s e sl a c k e dt h e h e a t - i n d u c i b l ea c t i v i t y i na d d i t i o n , r e p e a t i n ga t - r i c h l - 4r e g i o nd e c r e a s e dt h e 扛a n s g e n i c s i l e n c er a t i ow h i l ed e l e t i o no f t h ei n t e r n a la t - r i c h l 2 。a d c h 3 - 4o ra ，r r i c i h l - 5r e s u l t e di n i m p r o v e dt r a n s g e n i es i l e n c er a t i o t h ec h i m e r i cg e n ew i t l lc o n s t n a e tp k o o a t l 4o rp k a a t 3 4s t i l lc a nb ei n d u c e db yc o l d 6 坐奎墅翌奎兰堡圭兰竺丝兰 s t r e s s ，w h i l et h a tw i t hc o r i s t b l c tp k a a t l 2 ，p k a a t l 5o rp k h s ec a n t t h er e s u l t s h o w e dt h a ta t - r i c h l - 2a n dh s e sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h ec h i m e r i cg o n ee x p r e s s i o n u n d e rc o l ds _ 拉e s s ，w h i l ea t - r i c h 3 - 4d i d a td o t h ec h i m e r i cg e n ew i t hc o n s t r u c tp k o o a t l 4 。p k a a t l 2o rp k a a t 3 4c a l lb ei n d u c e d b ye x o g e n o u sa b a a n dh e a v ym e t a ls t 碍s s e s h o w e v e r , c o n s t r u c tp k a a t l 5a n dc o n s t r u c t p k + h s el a c k e dt h ec h i m e r i cg e n ee x p r e s s i o ni nt h et r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t su n d e r e x o g e n o u sa b a a n dh e a v ym e t a ls t r e s s e s i tm i g h th a v et h es i m i l a rp a t h w a yi nt h er e s p o n s e t oe x o g e n o u sa b aa n dh e a v ym e t a ls t r e s s e so f t h el e h s p 2 3 8p r o m o t e r t h ei n n o v a t i o n si nt h i sd i s s e r t a t i o nw e r es h o w na sf o l i o w s ： 1 i tw a st h ef i r s tt i m et oc l o n et h em u l t i p l es t r e s s - i n d u c i b l el e h s p 2 3 8p r o m o t e rf r o m t o m a t o b yu s i n gt h eg u sr e p o r t e rg e n es y s t e m ，t h ed e v e l o p m e n t a la n dt i s s u es p e c i f i c e x p r e s s i o no ft h eg u sg e n ec o n t r o l l e db yt h el e h s p 2 3 8p r o m o t e rw a sc h a r a c t e t i z e di n t r a n s g e n i ct o m a t op l a n t s t h er e s u l t sa l s op r o v e dt h em t d t i p l e - s t r a s sr e s p o n s i v ec h a 残l c t e r o f t h el e h s p 2 3 8p r o m o t e r 2 i tw a st h ef i r s tt i m eu s i n gt h eg u sr e p o r t e rg e n es y s t e mt oa n a l y s i z et h eh e a t - i n d u c e d e x p r e s s i o np r o f i l e so ft h eh s pi nt o m a t of r u i t s t h eh e a t - i n d u c e de x p r e s s i o np r o f i l e so f t h el e h s p 2 3 8 ：g u sw e r e d e f i n e di nd e t a i li nt r a n s g e n i ct o m a t of r u i t s w ep r o v e dt h a tt h e h e a t - s h o c ki n d u c t i o no ft h el e h a p 2 3 8p r o m o t e rd e p e n d e do nt h e s t a g e so ff r u i t d e v e l o p m e n t 3 i tw a st h ef i r s tt i m et od e f i n et h ef u n c t i o n a ld se l e m e n t si n t h ei 2 却2 3 8p r o m o t e r o u r r e s u l t sp r o v e dt h a ta t - 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