（分析化学专业论文）微流控芯片上安培检测的设计及应用.pdf

垩堡盔兰堡主堂垡堕茎 ! 苎垫茎一 摘要 微型全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y t i c a ls y s t e m ，p t a s ) 在短短的十余年 内，已经发展成为分析领域的重要前沿。但是目前在微型全分析系统中应用较为 普遍的检测方法激光诱导荧光( e l f ) 、化学发光法和质谱法( m s ) 等各具特色和不 足，且不利于p t a s 的微型化和便携化，而电化学检测方法，尤其是安培检测出于 检测灵敏度高、选择性好，成本低等特点以及在微型化和集成化方面的优势，已 显示出它在微型全分析系统领域中的应用前景。但是许多问题尚待解决，比如， 电极尤其是参比电极没有实现集成化；电极的表面容易污染，安培检测结果的重 现性不高。针对这些问题本课题从芯片上电极的集成化及更好地实现系统的微型 化方面进行了研究。 首先，对安培检测设计原理的分析表明，影响检测信号的最主要因素包括检测 电位、电极表面积、电极布置、检测池厚度、表观电阻参数等。重点对三类微参 比电极性能进行了测试，a g a g c l 微参比电极最适合集成到芯片上；进而研制了微 型组台电极体系，其特点在于体积微小，三个电极位置相对固定，适于芯片微型 化的要求。进一步将微型组合电极用于微芯片，当检测池的厚度为1 1 3 3 6 微米， 表观电阻为4 5 8 7 7 q 时，此电阻在测定过程中造成的电压降仅为1 8 3 m v ，表明检 测池结构合理，电极安装方便，有利于拆卸。 在芯片设计理论的指导下，设计并制作出了四种结构的有机玻璃芯片。对各个 芯片的混合效果进行表观观测；再对芯片上的混合衍生化反应程度进行安培测定， 结果表明在含微反应器的有机玻璃芯片上，两液滤能够进彳亍有效地混合和衍生化 反应。在此基础上组建了安培检测微芯片系统，采用标准铁氰化钾一氯化钾体系， 选择重力进样方式，对微系统的性能作了测试。在选择的最佳操作条件下，响应 信号的线性范围1 2 1 0 x1 0 一m o l l 1 到2 4 2 0 1 0 5 t o o l l - 1 之间，相对标准偏差为 3 6 ，加标的合成样品的回收率为9 8 3 0 ，检出限为1 2 1 0 1 0 t m 0 1 l _ 1 ，测试结 果表明组建的微系统检测性能良好。 在组建的微系统中，利用碘酸钾一碘化钾一h + 体系的衍生化反应，优化测定 参数，对食盐样品中的碘含量进行铡定。在1 0 0 1 x 1 0 4 m o l l 1 到1 0 xl f f 6 m 0 1 u 1 线性范围内，测得样品中碘含量3 0 7 8 m g k g ，相对标准偏差为2 1 ，加标样品的 回收率大于9 2 4 3 ，方法检出限达5 0 0 5 1 0 。7 t o o l u 1 。表明本课题中研制和组装 的芯片安培检测系统，对实际样品的测定是可行的，它的建立为最终实现电化学 检测器与芯片的集成，乃至整个系统的集成打下基础。 关键词：微型全分析系统。安培检测方法，微反应器，碘 里鏖查堂堡主堂焦笙壅 一兰鎏塑! 壁一 a b s t r a c t m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y t i c a ls y s t e m ( p t a s ) h a sd e v e l o p e dt ob et h eh o t - p o i n ti n t h er e s e a r c h i n gf i e l d so fa n a l y t i c a lc h e m i s t r yd u r i n gt h ep a s td e c a d e g e n e r a l yu t i l i z e d d e t e c t o r so fk t t a sw e r el a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) ，c h e m i l u m i n e s e n s ea n d m a s ss p e c t r o s c o p y ( m s ) ，w h i c hh a v et h e i rr e s p e c t i v e l ya d v a n t a g e sa n ds h o r t c o m i n g s i t w a sd i f f i c u l tf o rt h e mt oh ea p p l i e df o rm i n i a t u r i z a t i o na n dp o r t a b i l i t y w h e l e a s e l e c t r o c h e m i s t r y ( e c ) m e t h o d s ，e s p e c i a l l ya m p e r o m e t r y , o f f e rg r e a ta d v a n t a g e f o rs u c h m i c r o s y s t e m s e cm e t h o d s w e r eo ff e a t u r e s ，s u c h 耶r e m a r k a b l es e n s i t i v i t y , h i g h s e l e c t i o n ，l o wc o s t , a n di n h e r e n tc h a r a c t e r i s f i c so f m i n i a t u r i z a t i o na n di n t e g r a t i o n b u t t h e r ea r es t i l ll o t so f p r o b l e m s f o re x a m p l e , t h ee l e c t r o d e s ，e s p e c i a l l yr e f e r e n te l e c t r o d e , h a v en o tb e e ni n t e g r a t e dc o m p l e t e l yo nm i c r o c h i p ；t h ee l e c t r o d es u r f a c ei se a s i l y s t a i n e da n dt h er e s u l t sb o r ep o o rr e p e a t a b i l i t y t h i ss t u d ya i m e da ti n t e g r a t i o no ft h e e l e c t r o d e sa n dm i n i a t u r i z a t i o no f t h es y s t e m f i r s to fa t l ，a c c o r d i n gt oa m p e r o m e t r i cd e s i g nt h e o r y , e cd e t e c t i o ns i g n a tw a s a f f e c t e d m a i n l yb y t h ef a c t o r ss u c ha sd e t e c t i o n p o t e n t i a l ，e l e c t r o d e s u r f a c e ， a r r a n g e m e n to fe l e c t r o d e s ，a n dt h i c k n e s sa n da p p a r e n t r e s i s t a n c eo fd e t e c t i n gc e l l t h e p e r f o r m a n c e o f t h r e ek i n d so f m i c r o - r e f e r e n te l e c t r o d e sw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n da g a g c l m i c r o - r e f e r e n te l e c t r o d e sw a ss h o w na st h em o s ts u i t a b l ef o ri n t e g r a t i o no nm i c r o c h i p w i t ht h em e r i t s & t i n yb u l ka n df i x e d p o s i t i o no f t h r e ee l e c t r o d e s ，t h em i c r o c o m b i n e d e l e c t r o d e ss y s t e mw a sd e s i g n e da n di n t e g r a t e do 1 m i c r o c h i p t h et h i c k n e s so ft h e d e t e c t i v ec e l lw a s113 , 6m i c r o n ，a n dt h ea p p a r e n tr e s i s t a n c eo fd e t e c t o rw a s4 5 8 7 7q ， t h ep o t e n t i a ld r o pw a s1 8 3 i n v t h e s ep a r a m e t e r ss h o w e dt h a tt h es t r u c t u r eo ft h ec e l l w a sr e a s o n a b l e t h e a r r a n g e m e n t a n dr e p l a c e m e n to fe l e c t r o d ew a sp r o v e dt ob e f a e i l i t a t e d a c c o r d i n g t ot h ed e s i g nt h e o r yo fm i e r o s y s t e m ，f o u rk i n d so fp m m a m i c r o c h i p f r a m e w o r k sw e r ed e s i g n e da n df a b r i c a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a te f f e c t i v em i x t u r e a n dr e a c t i o nw e r er e a l i z e do nt h em i c r o c h i pw i t hm i c r o - r e a c t o r o nt h eb a s i so f t h i s ， m i c r o c h i ps y s t e m w i t h a m p e r o m e t r i c d e t e c t o rw a ss e t u p a n dt e s t e d b y k 3 f e ( c n ) 6 一k c ls t a n d a r ds a m p l e w i t hg r a v i t yi n j e c t i o nu n d e r o p t i m a lc o n d i t i o n s t h e l i n e a rr a n g ew a sf r o m1 2 1 0 x l o 。t o o l l 。1 t o2 4 2 0 1 0 。t o o l l 一a n dr e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o nw a s3 6 r e c o v e r yo f s t a n d a r da d d i t i o no f s y n t h e t i c a ls a m p l ew a s9 8 3 0 ， a n d t h e d e t e c t i o n l i m i t w a s1 2 1 0 x l o 。m o l l 1 ，w h i c hs h o w e d g o o d p e r f o r m a n c e o f t h i s 里塞查兰堡主兰垡堡奎 蔓苎塑茎 s y s t e m f u r t h e r m o r e , b y t h ed e r i v a t i o no fk 1 0 3 一k i h + r e a c t i o n s y s t e m ，o p e r a t i n g c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e di nt h i ss y s t e m i o d i cs a l ts a m p l ew a st e s t e di nt h el i n e a r r a n g ef r o m1 0 0 1 x 1 0 4 m o l l 1t o1 0 0 1 x 1 0 6 m o l - l t h ec o n t e n to f i o d i n i nt h es a m p l e w a s3 0 7 8 m g k g , r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s2 1 r e c o v e r yo f s t a n d a r da d d i t i o no f s a m p l e w a s9 2 4 3 ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s5 0 0 5 1 0 m o l l 1 a l lo f t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h em i c r o s y t e ms t u d i e da n ds e tu pi nt e s t i n gp r a c t i c a ls a m p l ew a sf e a s i b l e t h er e s e a r c hw a s h e l p f u lf o r t h ei n t e g r a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t o rw i t l lm i c r o c h i p a n de v e nw i t l lu t a si nt h e c o m i n g f u t u r e k e y w o r d s ：l a t a s ，a m p e r o m e t r y , m i c r o - r e a c t o r , i o d i n i i i 重盎盔堂堡主兰垡堡苎一 一! 丝羔! 一 1 绪论 1 1 微型全分析系统检测方法的现状和进展 微型全分析系统( m i n i a t u r i z e d t o t a la n a l y t i c a ls y s t e m ，扯t a s ) 主要是利用微细加 工技术，在玻璃等基片上制作以管道网络为主的微型结构，通过对微流体的控制， 实现对生化样品进行集成处理和分析的微型技术平台【1 】。自从2 0 世纪9 0 年代由瑞 士c i b a - g e i g y 分析实验室的w i d e r 和m a n z 等提出此概念以来，它不仅可以使贵重 的生化试样量消耗减小( 至微升甚至纳升级) ，而且使分析速度得到很大提高，成 本降低。因而，在短短的十余年中，已经发展成为分析领域的重要前沿1 2 圳。 伴随微加工技术的发展，p t a s 的检测系统也得到相应的进展。检测技术是提 高微芯片系统性能的关键之一，因为它决定了p t a s 的最终检出限。理论上，凡是 常规分析的方法，都可缩微化到“t a s 上，但是由于微芯片处理和分析的样品量极 少( 仅为纳升至皮升级) ，而且分析检测多在几秒内完成，故对检测系统的要求很 高。与p t a s 其它研究相比，与微芯片相匹配的高灵敏度的微型检测器的研制却相 对落后。笨重、体积很大的检测器已经成为制约t a s 发展的一个障碍。 目前在微型全分析系统中应用较为普遍的检测方法主要有光学方法、电化学方 法和质谱法。光学方法主要有激光诱导荧光( l i f ) 【4 ，5 6 ，”，化学发光 8 , 9 , 1 0 , 1 1 1 和光度法 b 2 , 1 3 等：电化学方法分为安培法 1 4 , 1 5 , 1 6 , 1 7 3 8 , 19 】，电导法f 2 0 1 ，电位法f 2 1 】及电化学发光 法等等。激光诱导荧光方法灵敏度高，相关仪器技术也日益成熟，甚至可进行单分 子检测。但因绝大部分样品需荧光衍生，且还需要体积庞大、结构复杂的光学系统， 难以达到系统微型化和集成化的要求。光度方法结构简单，价格低廉，但是其对检 测样品的光程有要求，在pt a s 中由于管道的微小，光程也非常短，其应用范围在 定程度上受到限制，这只有通过对管道的特殊设计来达到要求；化学发光方法灵 敏度高，装置简便，无需激发光源，分析的线性范围较宽，但化学发光的选择性不 高，干扰很大，因此，测定的样品类型有局限。微流体芯片与m s 的联用已经表现出 了极大的应用前景和良好的技术可行性【2 2 芦】。但是，如何提高微流控芯片与质谱 的接口性能，降低加工成本仍是目前有待研究解决的问题。 1 2 微型全分析系统中电化学检测方法的发展和应用 相比较而言，电化学检测具有独特的优点：( 1 ) m e m s 技术可将微电极甚至超微 电极集成到微芯片上，而在微芯片上加工微光学器件却困难得多；( 2 ) 与光学检测 法不同，电化学检测的灵敏度并不随着通道几何尺寸的微型化而降低；( 3 ) 电化学 检测尤其是安培检测，只响应具有电活性的化合物，具有较好的选择性2 5 1 。因此， 里堕查兰堡主堂垡丝塞 一坐量兰一 作为微型全分析系统的集成化检测方式，电化学检测在微型化、集成化方面符合要 求，并且已经成为微系统中最具吸引力的检测方式之一。 近年来，各种电化学检测方法，如安培法、电导法、电位法、线性扫描、方波、 吸附溶出伏安法等，在ut a s 中的应用逐渐增多口6 1 。关于毛细管电泳芯片电化学检 测( e c c e ) ，国外w a n g 等研究小组进行深入研究，国内的汪尔康2 6 】、罗国安【2 7 1 等也在此领域展开初步研究。 1 2 1 安培法 安培检测具有灵敏度高，检测限低，选择性好等优点，因而在h p l c 和常规毛 细管电泳( c e ) 中已广泛应用，自1 9 9 8 年w o o l y _ f 2 s 等报道了第一例芯片毛细管电 泳的安培检测以来，微型全分析系统中的安培检测逐渐增多，且较集中于电泳芯片 安培检测。同时，它也是微型全分析系统中应用得最多的种电化学检测方法。 在电泳芯片中，分离高压所产生的电流比检测电流高几个数量级，它的微小波 动都严重影响检测信号，因此隔离分离高压的干扰是非常重要的。根据高压电场隔 离方式的隔离方式：安培检测一般分为离柱( o 昏c o l u m n ) 检测、柱端( e n d - c o l u m n ) 检测和在柱( o n c o l u m n ) 检测三种。 离柱检测 在工作电极前放置去耦器，使分离高压电流到达检测器之前从地线流走，从而 减小干扰。将去耦器直接放在管内容易导致溶液渗漏和形成死体积，导致检测电流 降低，w a l l e n b o r g 等 2 9 1 为了提高检测电流，尽量缩小了管术端与电极浏距，以减小 扩散和对流导致的谱带拓宽。c h e r t 等【3 0 提出，工作电极与去耦器的距离越小，安 培信号越大，另外，为了解决溶液渗漏问题，他们还将固态金属钯沉积到管内以代 替去耦器接口。r o s s i e r 等口i 】在距检测池i m m 的微管道内制作了直径为5 t i m 和1 0 t u n 的微孔去耦器，即使有高达5 心的分离电流，检测半波电位漂移也只有1 6 m v 。 w u 3 2 1 等将三个电极与去耦器沉积在同一个玻璃基体上，为了减小安培检测过程中 的电位漂移，在工作电极附近集成镀铂的电极作为准参比电极。o s b o u m 等【3 司在直 径为2 0 3 0 p r o 的微孔内填充醋酸纤维素制成的去耦器，此装置机械性能稳定，制 作简单，可有效隔离高达6 0 “a 的分离电流，噪音低于l p a ，对多巴胺的检测限为 2 5 r e t 0 0 1 l 一。 柱端检测 它是目前微芯片安培检测最常用的去耦方式，其检测限和分离效率分别为几微 摩尔几十纳摩尔和1 0 0 0 2 0 0 0 0 塔板，但是这种检测方式对电极与管道出口的准直 要求很高。w a n g 等按流出通道方向与工作电极的相对位置，将芯片毛细管电泳柱 端安培检测池分为流经式( h o w - b y ) 、流向式( f l o w - o n t o ) 和流通式( f l o w - t h r o u g h l 三种类型：同时必须考虑以下两个因素，首先，高压电场对检测电位仍有影响，且 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 物质在管末端和检测池之间的空隙扩散，导致检测电位漂移而难以找到最佳检测电 位 3 4 1 。通过减小两者之间的距离，尽量使其处于相同场强中，或者将工作电极放置 在一个管端增大的储液池里，降低溶液在检测区域的电阻，可减小此漂移。其次， 工作电极与参比电极的距离会影响检测器的行为，通常需要将两电极间距离控制在 几微米范围内。e w i n g 等 3 5 】在微芯片上建立一种快速制作和集成电极，并可很好地 控制电极距离的方法。w a n g 掣3 6 】设计的柱端检测装置，可有效地防止高压电场干 扰，减小噪音，肾上腺素和儿茶酚的检测限分别为1 5 0 n m o l l 4 和2 8 0 n m o l - l ，低 于流经式玻璃微芯片上的筛印( s c r e e np r i a t e d ) 碳膜电极检测1 3 ”和p d m s 微芯片 上的碳电极检测8 3 9 】的检测限。e w i n g 等 4 0 建立的微芯片装置可同时进行安培检测 和荧光检测，此双检测装置可扬长避短，扩大检测范围；工作电极距分离管道5 0 胁 并集成在玻璃平板上，距电极6 5 p m 的激光束在分离管内聚焦，以提高信噪比，降 低谱带展宽。 在柱检测 在柱检测将电极直接集成在管道上，样品虽然在电极附近迁移，但仍然被限制 在微管道内，故克服了柱端检测中常出现的谱带展宽问题。但是对一个场强为 2 0 0 v 锄4 的电场，假设电位差呈线性，c e 内距离为1 0 0 1 - | m 的两电极引入的电位差 高达2 v 。c a s s i a y 等【4 i 】在c e 内插入一导电材料可观察到电极周围出现大量的气泡， 原因是高压电场导致不同部位的细丝与溶液间的电位差不同而在细丝末端产生氧 化或还原反应。利用这个高压电场，g 蛙 4 2 1 等提出一种新型安培检测方法，在不同 高压电场下测量相邻两个金宽带微电极之间的电流和电位差，记录下的e - i 曲线与 使用常规恒电位仪记录的伏安图形状相似。m a r t i n 等【4 3 l 利用专门设计的体积为4x 9 2 e m 3 的微型恒电位仪，不需要去耦装置即可进行在柱检测，此微型恒电位仪的 设计与制作为片上集成各种微型功能器件奠定基础。 1 2 2 电导法 电导检测法是根据带电组分对溶液电导率的贡献不同而进行检测的，它不像安 培法要求待测组分在电极上具有电化学活性。只要是离子型组分都能检测。因此， 电导检测器是一种通用型检测器，尤其对于其它方法难于测定的小离子电导检测具 有独特的优势。作为一种易于微型化、集成化的通用型检测器，它在微型全分析系 统中的应用最近开始为人们所重视。 毛细管电泳中所使用的电导检测器根据电极与毛细管的相对位置可分为在柱、 柱端和离柱三类1 4 4 】。而目前报道的微型全分析系统上的电导检测器多采用在柱方 式，另外，根据电极与待铡溶液的接触与否，电导检测器可分为接触型检测和非接 触型检测两种。在微流控芯片上制作接触型电导检测器可采用喷镀结合光刻成型的 方法，在作为通道盖板的平面塑料基片上制作一对薄膜型铂电极，将制有电极的基 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 片与刻有通道的基片准确定位并封合后，即制成带有电导传感器的微流控芯片。 g r a s s 等比较详细地介绍了在p m m a 基片上制作等速电泳一电导检测微芯片的方 法。目前这种接触型电导检测器已被应用于芯片等速电泳预分离浓缩- 等速电泳分 离、芯片等速电泳预分离浓缩区带电泳分离联用体系的检测器，分离测定数十l l m 0 1 l - 1 n 0 等无机阴离子和数百l am o l l 。1 乙酸等有机酸。p r e s t 等 4 6 , 4 7 设计制作了一 种特殊的接触型单电极电导检测器，用于芯片等速电泳的分离分析，分离测定了 m m 0 1 l “水平的l i + ，l a 3 + , d y 3 + ，y b 3 十离子化合物。此电导检测器具有制备方便，分辨 率高等特点。 接触型电导检测器的电极与通道内的电解质溶液直接接触，由此会导致电导检 测系统未能和电泳分离电压有效隔离，产生“漏电”干扰，使基线噪音增大；或者 使电极溶液间发生电化学反应，会产生气泡使基线噪音增大。为了克服以上问题， g u i j t 等【4 s 】在传感电极表面涂覆介电常数较大的碳化硅涂层，制成非接触型电导检 测器。但是这种涂覆绝缘层的非接触型电导检测器只能用于分离电场低的场合，柱 效和分离速度受到限制。 最近p u m e r a 等【4 9 】制作了一种基于电容耦合的非接触型电导检测器。由于这种 非接触型电导传感器与电泳分离电压完全隔离，电导检测不受分离电压的干扰， 6 0 m m 的分离通道上分离电压高达3 0 0 0 v 时基线噪音仍不显著，柱效则高达 5 0 0 0 0 m 左右。k + ，n a + ，l i + 的检测限达到1 0 - 6 m o l l 1 水平，线性范围高达3 个数 量级。由于电极不接触溶液，不再存在电极的钝化和沾污。这种电容偶合的非接触 型电导检测器制作简单，分析性能好，颇具发展前途。 1 2 3 电位法 电位检测是ut a s 中有应用价值的一种检测方式【3 。一系列微型液膜离子选择 性电极( i s e ) 、涂层液膜线状i s e 、导电聚合物涂层i s e 以及陶瓷和金属等材料制作 的i s e 已成功地用于l c 和c e 等流动体系的检测。t a n t r a 和m a n z t 5 ”报道了与芯片 流通池集成于一体的b a 2 + 离子选择性微电极。该芯片刻有一条u 形通道和一条直线 形通道。u 形通道内充有能响应b 矿离子的溶剂高聚物膜，直线形通道为试样通道， u 形通道的底部与直线形通道的中部由一短通道沟通( 短通道内填有液体接界膜) 。 在u 形通道的一端储液池加入内参比溶液并插入一支微a g a g c l 参比电极，在试 样通道的出i z l 储液池中也插入一支微a g a g c l 参比电极，即构成了测定b a 2 + 离子的 微流控电位检测器。当试样溶液用注射泵输入试样通道流经u 形通道的液体接界， b a 2 + 离子扩散进入敏感高聚物膜而产生电位信号。据报道，该电位检测器在1 0 1 o _ 6 m o l - l - 1 浓度范围内对b a 2 + 离子呈线性响应，b a 2 + 离子浓度在1 0 1 0 4 m 0 1 l 。内信号 在数秒钟内即可稳定。但是，与安培检测和电导检测相比，微流控芯片上的电位检 测器少得多a 然而，对于那些其他方法难以检测，电导率又低的离子来说，电位法 重瘗盔堂堕圭堂垡丝壅土丝型i 一 无疑是最好的选择。目前t at a s 电位检测的研究倾向于发展固态i s e ，因为固态i s e 更加耐用，容易微型化制作并与分析系统集成。随着微型化和集成技术的提高，涂 层膜技术以及i s e 相关理论的发展，i s e 将更多地应用于! - 1t a s 中。 1 2 4 其他电化学检测方法 线性扫描、方波和吸附溶出伏安法 除安培检测外，w a n g 等5 2 1 将线性扫描、方波、吸附溶出伏安等电化学方法应 用于带有反应系统的微芯片进行检测，以儿茶酚、肼、n 盯、n i 为被测物表征了几 种伏安检测方法。方波伏安检测得到n 汀的检测限为2 1 0 一o l l q , 溶出伏安方 法检测n id m g 配合物反应体系中的n i 。 电化学发光( e c l ) 法 电化学发光检测同时具有了电化学检测和化学发光检测的优点，表现出极高的 灵敏和选择性，容易进行时间和空间调变，此外电极可制作成金属薄膜、或直接在 基底上制作金属涂层，与微型光检测器结合在一起可制作成微型电化学发光探针。 电化学发光主要用于免疫和d m a 杂交分析，还广泛用于流动体系检测有机胺、蛋白 质、药物以及生化样品。h s u e h m 用硅制作了三联吡啶钌r u ( b ，y ) 3 2 龟c l 检测池， 用于分析d n ap c r 扩增产物。检测池采用微加工的硅片或者玻璃片制作，低温固 化的聚酰亚胺粘合在一起，i t o 薄膜电极热粘合在玻璃板上，硅检测池体上用光学 刻蚀方法制作a u 薄膜电极，分别作为阳极和阴极。这种微型化的检测池容易和p m t 或s p d 等光学检测器组合在一起。k r e m s k t - t e r e 5 4 设计了一种体积只有5 4 9 l 的e c l 流通检测池，光学玻璃上涂一层i t o 层作为工作电极，共价结合葡萄糖氧化酶。利 用l u r n i n o l 与过氧化物的发光反应检测葡萄糖含量，p m t 作为光检测器。f i a e e a b r i n o 等1 5 副在面积5 6 m m 2 的硅微芯片上制作了微型的e c l 探针，包括电极、光检测器 等器件。微芯片上的两个检测池内安装叉指阵列微电极( t a d ) ，电极位于p n 型光二 极管检测器的上部，电极上产生的光可被检测器直接检测，微分方式记录光强度信 号。这种微芯片e c l 针设计简单，将检测和e c l 反应集成一体，对于ut a s 而言是 一种很好的微型化器件。从微型化制作技术角度来看，以上微型e c l 检测器可以 加工在c e 微芯片上，与迸样、反应、分离部分集成在一起，组成一个完整的“t a s 。 1 3 课题的意义、目的和研究内容 近年来，很多工作者大力开展对采样，流体驱动和分离模式的微型化研究，并 取得很大进展，而对检测模式的微型化研究却相对较少，笨重、体积很大的检测器 已经成为制约l at a s 发展的一个障碍。随着微加工技术向微纳米尺寸发展，新的u t a s 不断开发并趋于集成化和微型化。电化学检测由于其固有优越性而成为ht a s 中极具潜力的检测方式。微系统中电化学检测的发展方向，一方面进一步微型化， 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 使检测系统与nt a s 更匹配，另一方面是设计合理的柱前、柱后衍生化反应器以扩 大电化学检测的分析范围，此外，还要发展功能完善的电化学检测方法，对同一体 系进行多重分析。近年来，安培检测由于检测灵敏度高、选择性好，成本低等特点 以及在微型化和集成化方面的优势，已显示出它在微型全分析系统领域中的应用前 景。但是许多问题尚待解决，比如，电极尤其是参比电极没有实现真正意义上的集 成化；电极的表面容易污染，导致安培检测结果的重现性不高等。 本课题主要研究了以下内容：首先，对安培检测原理进行分析，找出影响检测 信号的因素，为了在微芯片上设计出合理的检测池，针对影响最大的检测池的大 小、电阻和电极尺寸等因素，对检测池设计和电极的布置进行分析；制作微电极， 包括微工作电极参比电极，以及组合式微型三电极系统，分别对其进行表征和测 试，进一步将组合式微型三电极系统用于微芯片。以自制的有机玻璃微芯片，对检 测池参数进行测定和理论计算，优化检测池电极的放置。其次，讨论了影响微管道 流体流动的因素，对微管道中流体的扩散和混合进行理论分析，对微芯片的管道形 状和布局进行设计，在此基础上设计制作了含衍生化反应器的安培检测微芯片。最 后，组建了安培检测微芯片系统，采用k 3 f c c n ) 6 一k c l 体系考察微芯片系统的测试 性能；在组建的微系统中，对碘酸钾- 碘化钾。h + 体系先进行参数优化，再对食盐样 品中的碘进行测定，验证组建的微芯片系统用于实际样品测定的可行性。 重庆大学硕士学位论文 2 微型分析系统安培检测的设计原理 2 微型全分析系统安培检测的设计原理 安培法相对其它电化学检测方法更具有高选择性、高灵敏度和结构简单等特 点，因此应用最为广泛。其基本原理是指在外加电压( e 。) 作用下，待测物在工 作电极表面将被还原或氧化，在溶液和电极间形成电流，该电流符合法拉第定律且 与分析物浓度呈的线性关系。通式可表示为式( 2 1 ) i = - n f a d c * 6( 2 1 ) 其中，i 为检测电流，a 为电极面积，n 为电子交换数，f 为法拉第常数，d 为扩散 系数，6 为扩散层厚度，c 为样品浓度。 一方面，电极形状、检测池结构或流体流动状况不同的时候，安培电流的具体 表达式都各有差异；另一方面，与常规分析系统相比，微型全分析系统的核心在于 系统的微型化，其通过在微米级的通道和结构中实现，这不仅带来分析设备尺寸的 缩微化，而且在分析性能上也有质的优越性。但是，系统微型化不能是无限制的， 它也有一些负面的影响，如反应时间缩短，灵敏度下降，检测限升高等。而微型全 分析系统的目标应是分析性能的全面提高，至少要达到常规体系的水平。所以这里 将深入讨论与微体系中安培测量结果直接相关的各项因素，如微芯片管道结构、电 极材料和几何尺寸和检测池结构等，从而为体系的缩微化和微芯片的设计提供理论 依据。 2 1 微芯片上微管道结构设计 微芯片是微型全分析系统的关键部位，因为分析的一系列过程：预处理、分离 混合反应，以及检测等都在微芯片上完成。所以微芯片的微通道结构的设计是否合 理，将会影响整个微芯片的分析分离和检测等性能。微芯片的基本部件包括储液池、 微反应器以及检坝4 池等。在有限大小的片上合理地分配和布置这些部件，并充分发 挥其功效，以实现真正的“芯片实验室”，这是微型全分析系统工作者的最根本目 的所在。微流控芯片上微管道设计涉及微动力学、微摩擦学、微流体力学、微传热 学、微电予学、化学等多门学科【5 6 】，需要对微反应器的各个集成单元以及它们之间 的相互关系分别研究。这里主要讨论了提供热质传递和反应界面的微管道的设计的 影响因素。 2 1 1 微管道形状 微管道的形状对其热质交换与传递有很大的影响。微管道的传质与其形状的关 系较为复杂。微芯片管道尺寸一般为| lm 量级，流体在其中流动，雷诺数很小，流 体为层流状态。对一个稳定的层流和完全发展流来说，流量由可以表示为： 里盎奎堂堡主堂垡笙奎 ；垡型坌堑墨丝窒苎堕塑箜堡盐垦型 巾= a 2 p c rt 1 l ( 2 2 ) 其中a 为微管道截面积，p 为微管道上的压降，q 和l 分别为流体的粘度和微 管道的长度，c 。为微管道的几何系数。对于一个截面积和流体固定的微管道来说， 要增大流量，可以增大压降，减小管道长度或几何系数。压降太大是不合适的，这 会给反应带来较大的压力梯度，影响反应的均匀性，也会给微管道的封装带来一定 的困难。微管道需要提供反应的界面，其长度至少要满足化学反应的需要，不能太 短。c 。由微管道截面的几何形状决定1 5 ”。可以表示为： c r = u2 p o 8 a ( 2 3 ) 其中，u 为微管道湿润周长，p 0 为泊肃数。当截面为圆形时，c 。值最小，则流量 最大，传质速率也越大。所以，本课题中采用压印法在有机玻璃上制作微芯片时， 管道形状做成圆形的。 2 1 2 微管道尺寸 微管道尺寸般在1 11 1 3 量级的，这给化学反应的传质带来了技术上的突破。因 为液相反应在管道中进行时，反应液体为层流状态，扩散是传质的主要途径，扩散 混合效率通常采用f o 戚翻致( f o 衡量： f o = d t w 2 ( 2 4 ) 其中d 为液体扩散系数，t 为接触时间，w 为液体扩散长度，即微管道的宽度或直径。 当管道缩小l o 倍，扩散混合效率增大1 0 0 倍；当r o o 1 时，液相间可以较好的混合； 当r 1 时，液相问可以完全混合。大多数液体的扩散系数在1 0 g m 2 s 4 至f j l 0 s m 2 s ， 如果需要在1 到1 0 s 内实现液体的良好混合，微管道的宽度为3 0 到3 0 0um 。从化学反 应传质的需要可以看出，当微管道宽度在l o pm 到1 0 0 1 am 时，可以带来良好的传质。 微管道的长度是由化学反应的需要决定的。对于液相反应，由于微反应器可以提供 很好的传质和传热，使得化学反应可以快速的进行。在反应完成后，生成物应该迅 速离开微管道以减少副反应的发生。因此，微反应器的长度只需要满足微管道中流 体的相互混合。通常流体的流速为1 0 2 m s ，流体的混合时间为l s ，则微管道的长度 为1 0 2 m 是合适的。 综上所述，微管道的几何尺寸一般为：长度为厘米量级，宽度和高度为微米量 级。在我们的实验中，芯片尺寸一般是4 c m x 3 c m ，管道长度在1 0 2 0 c m 2 _ 间，管道 宽度受到实验技术条件的限制，一般设计为2 0 0ul r l 。 2 1 3 微管道布局 一般流体的驱动方式主要有电渗流驱动和压力驱动，目前电渗流驱动是微流控 芯片，尤其是毛细管电泳芯片中用得最多的一种。本研究中采用压力驱动方式。以 下分别分析了这两种驱动方式微芯片的基本设计思想，并重点讨论压力驱动芯片的 设计，结合在本课题的实际条件对芯片的设计进行分析。 重庆人学硕士学位论文 2 微_ 犟! 分析系统安培检测的设计原理 电泳芯片 依靠电渗流驱动的电泳芯片般采用十字形或者双t 形结构的微通道流路，此 设计简单，并且分离管道是直管，利于塞状的样品节的驱动。在定程度上提高分 离电压可以改善分离效率和分析速度，但焦耳热的影响也随之增大，在有些分离中 反而会降低分离度。这时可以在保持电场强度不变的条件下通过延长分离管道的长 度来提高分离度和分离效率。但是，受到芯片几何形状的限制，十字形或者双t 形 结构的分离长度有限，一般在8 0 m m 以下，这样的分离长度所能达到的塔板数很难实 现物质的分离；为了在有限面积的芯片上容纳足够长的分离通道，需要合理设计管 道的流路和布局。通常的设计思想是在芯片上引入弯道 58 1 。但是弯道的引入会带来 样品带中样品分子迁移距离的差异和电场强度分布的不均匀，从而增加了样品带的 分散，这种几何分散依赖于溶质分子径向扩散时间与通过弯道所需时间的比率。有 效的引入弯道需要研究弯道中电场的分布情况和样品分子在弯道中的传制机理，合 理的设计弯道，可有效的消除由于弯道带来的额外样品带的几何扩斟5 9 1 。同时考虑 路径和场强上的差异，试样带通过弯道时所引起的谱带长度增量为 a i = 2 0 w 1 一e x p ( - t d t 。) 】 ( 2 5 ) 式中：w 为弯道处的通道宽度；0 为弯道的圆心角， 一t 。t 为组分分子沿着 弯道径向扩散所需的时闻“和组分分子通过该弯道所需的时间t t 之间的比侈0 。由此 可得到，由于弯道效应所引起的谱带方差为： 盯羔。：笙： 2 0 w 1 - e x p ( t d t , ) 2 ( 2 6 ) 盯赫2 7 = i 一 ( ) 可见，减小由于弯道效应所引起的谱带扩宽的最有效办法是减小通道宽度。 压力芯片： 在压力芯片的设计中，可以不考虑弯道效应的影响。在流动体系分析中，我们 要求样品的轴向分散尽量小的同时，更要求样品和试剂能尽量的混合。要在尽可能 短的距离把样品送到检测器，而且样品到达检测器要一定的检出信号。在微刻蚀管 道中，由于管道的微小，流体流动呈层流状态，两载流的混合主要由分子扩散控制。 在宏观体系中，分子的扩散通常处于可忽略的水平，而在微管道中这种扩散变 得非常显著。粒子扩散一定距离h 所需的时间t 为： t = h 2 d( 2 7 ) 其中，粒子的扩散系数为： d = r t n ( 3 n r l d ) ( 2 8 ) r = 8 3 1 x 1 0 。：n = 6 0 2 1 0 玎：t 是绝对温度：，7 是液体黏度；d 是粒子的直径。 不同分子质量的扩散系数不同，h + 的扩散系数非常大为9 0 0 0 p m 2 s ，扩散迁移 重庆人学硕士学位论文 2 微型分析系统安培检测的设计原理 1 0 p r o 的距离，仅需要1 0 m s 的时间；而如果迁移l c r n 的距离，则需要1 0 s ( 即2 8 h ) 。 对于较大的病毒吓n ，分子，分子大小在3 0 0 n m 左右，其扩散迁移1 0 9 m ，也只需 2 0 s 的时间；而如果迁移l c m 的距离，则需要2 1 0 7 s ( 即2 3 0 天) ，可见在微系统 中存在显著的扩散效应，这种效应可以用于微流体间的快速混合，即可在芯片上设 计混合系统；在层流条件下，达到有效混合的两种方法是：一拉长或剪切层流， 以增大流体间的接触面积：二分流混合，即将大的液流分裂成多个小的液流，使 流体的厚度大大降低。假设每一条流线被划分为n 层流，将会产生n 2 倍更快的混台 1 6 0 。混合时间为原来的i r 1 2 ： t = 旦2 n 2 d ( 2 9 )