自动生化分析技术ppt课件

第五章自动生化分析技术,1,自动生化分析技术是指将生物化学分析过程中的取样、加试剂、去干扰、混合、保温反应、自动检测、结果计算、数据处理和打印报告，以及实验后的清洗等步骤自动化的分析检测技术。,2,自动生化分析仪种类繁多，根据不同分类标准，可分成不同的种类。,3,半自动分析仪：分析过程中的部分操作需手工进行，而其他部分操作可由仪器自动完成。分析速度慢，适用于样品数量少、化验项目少的小型医院。,全自动分析仪：指从加样至打印结果的全过程，均由仪器程序控制自动完成。适用于样品数量多检测项目多而且复杂的综合性大医院的临床生化检验室应用。,4,5,干片式：将测定一个项目所需的试剂固定在固相载体上，加上定量血清后，干片的背面即产生颜色反应，用反射光度计检测便可进行定量分析。,6,7,8,第二节半自动生化分析仪,一、结构特点与设计原理特点：体积小，结构简单，灵活性大，价格便宜；一般不受试剂、方法的限制。工作原理：连续流动式分析，其流动管道中的特定位置有一微型比色杯称为流动比色杯，无不同比色杯之间的吸光度差异。,9,二、分析仪性能评价,键盘显示器多功能软件参数设置全自动方式波长选择结果存储测试方法类型质控恒温装置微量流动比色杯比路式泵结果打印,10,三、操作程序及注意事项1.开机前的准备工作2.开启仪器3.冲洗流动比色池4.设定仪器系统参数5.设定质控参数6.设定试验参数7.进行试验操作8.打印分析结果,11,注意事项：1.由于检测所加试剂及样品量都很少，要特别注意取样和加试剂的准确性；2.使用过程中，严禁吸入强酸试剂；3.每次使用完毕，必须用蒸馏水冲洗比色杯和管道；4.应用连续检测法检测时，非线性反应不得超过所定范围（10%）；,12,5.做酶动力学检测时，要特别注意起始的吸光度值，应注意每次试验检测试剂空白；6.如反复多次吸入蒸馏水后，不能调整零点或吸光度不稳，应使用清洁液浸泡比色池后再用水清洗；7.仪器若长时间不使用，应在一个月内至少通电一次。,13,四、保养和维护1.日常保养：每天工作结束之前进行的仪器保养。（1）拔去电源插头后，用微湿的抹布轻抹仪器的外壳，注意不要让水滴入仪器；（2）检查打印机的电缆线是否接上，打印纸是否足够第二天使用；（3）将废液瓶中液体倒掉并进行清洗；（4）按仪器规定要求用清洁剂和蒸馏水依次清洗管道及比色杯，2.定期维护：吸光度的调零检测或仪器部件的检查与更新。,14,一、分立式分析仪目前临床实验室所用的大部分分析仪都属于分立式，具有结构简单、检测速度快等优点。,日立7180型分析仪,15,分立式自动生化分析仪是按手工操作的方式编排程序，并以有序的机械操作代替手工操作，用加样探针将样品加入各自的反应杯中，试剂探针按一定时间自动定量加入试剂，经搅拌器充分混匀后，在一定条件下反应，反应后进行比色测定。各环节用传送带连接，按顺序依次操作。,16,全自动生化分析仪工作流程图,17,分立式自动生化分析仪的结构包括：样品盘（架）、取样装置、试剂室（瓶）、取液装置、反应盘、混匀装置、温控装置、光学监测系统、清洗系统和计算机控制系统等。,试剂盘2,试剂盘1,试剂针2,试剂针1,样品针,样品盘,反应盘,搅拌器,清洗装置,18,1.样品盘或样品架样品盘：放置一定数量的样品，通过样品盘的转动来控制不同样品的进样。样品架：由步进马达控制移动，以样品架上的条形码或底部编码孔识别样品架及样品位置号。,传送条带状样品架,圆盘状样品架,19,2.取样装置：由注射器、步进马达或传动泵、加样臂和样品探针等组成，能定量吸取样品并加入到反应杯中。取样容量：一般2l-35l，步进0.1l不等交叉污染：在吸取不同样品时可产生携带交叉污染防止措施：对样品针内外壁进行水冲洗特殊功能：液面感应：取样针尖上设有电子感应器防碰撞装置：遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警阻塞报警：某些取样针有,20,21,3.试剂室：存储试剂，大多数试剂室具有冷藏装置，条形码检测系统。（1）试剂转盘式：放置一定形状试剂瓶，数量不等，试剂盘转动可使某个试剂瓶到达特定的试剂吸取位置。（2）试剂架形式：放置大容量任意形状的试剂瓶，由每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，不同试剂间无交叉污染,22,试剂条码阅读器,试剂室,23,4.取液装置：用于定量吸取试剂加入反应杯。取试剂量：一般为20-380l，步进1-5l不等交叉污染：吸取不同样品时可产生携带交叉污染防止措施：对样品针内外壁进行水冲洗特殊功能：液面感应防碰撞装置预热试剂,24,5.反应盘：由100只或更多的反应杯围成一圈组成，有的分析仪具有两圈反应杯反应盘作恒速圆周运动，转动到某些特定位置时短暂停止，在反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀反应杯：是样品与试剂进行化学反应的场所由透光性好的硬质玻璃或石英玻璃制成,25,26,6.混匀装置：反应杯里的样品与试剂需要混匀（1）混匀方式：搅拌混匀：用搅拌棒，多数超声混匀：可杜绝携带污染，极大程度较少泡沫产生（2）搅拌棒搅拌棒形状：扁平棒状或扁平螺旋状，表面疏水材料工作方式：旋转式搅拌震动搅拌防交叉污染：水洗,27,28,7.恒温装置：反应杯需浸浴在恒温环境中，一般固定在37，温度波动不能大于0.1。温浴方式：（1）空气浴恒温：升温速度快，不稳定，受环境温度影响大。（2）水浴循环恒温式：温度稳定，需加防腐剂保持水洁净，并要定期更换循环水。（3）恒温液循环间接加热式：兼具空气和水浴的优点，用一种无污染、惰性的不蒸发液体，用很小的缝隙的空气把比色杯与恒温液隔开。,29,30,8.清洗系统（1）样品针、试剂针和搅拌棒的随时清洗在用于下一个样品、试剂或反应杯前需清洗一次，多数为去离子水冲洗（2）反应杯的随时清洗多数全自动生化分析仪具有反应杯清洗装置一个反应杯内的化学反应和吸光度检测结束后该反应杯就被冲洗系统及时冲洗冲洗过程：吸液针吸去废液排液针注入清洗液1（碱性）吸去废液水洗并吸干注入清洗液2（酸性）吸去废液水洗并吸干擦干吸光度检查,31,32,反应杯清洗装置,33,9.光学监测系统：由光源、单色器和信号检测器组成（1）光源：一般采用卤素灯或疝灯，当灯的发光强度不够时，仪器会自动报警，应及时更换。（2）单色器：多采用光栅分光，常在340-800nm范围内设10-12种固定的单色光分光方式：前分光：光源分光元件单色光反应液检测器后分光：光源反应液分光元件单色光检测器分光后取多个固定单色光同时通过各自的信号传送通路传输到对应的信号检测器优点：单色器中没有转动部分提高了检测精确到和速度后分光的特点：（1）不需移动仪器光学系统中的任何部件。（2）可同时选用双波长或多波长进行测定，这样可降低比色的噪声。（3）提高分析的精确度和减少故障率,34,35,（3）信号检测系统光信号光敏二极管电信号放大电路模数转换电路数字信号微处理器按各测定项目的分析参数选择其波长的吸光度值可选择1或2个波长,36,37,二、干片式分析仪应用干化学技术将测定一个项目所需要的试剂固定在待定载体上，成为干片试剂。测定方式：在干片试剂上滴加液态样品，载体上试剂溶解并与样品中待测成分发生反应，测定检测信号的反射光强度“干化学”技术是相对于经典的“湿化学”而言，实际上干化学也是在一定潮湿状态下的化学反应,38,干片式分析仪与配套试剂组成一个检测系统包括：血糖仪血氨测定仪尿液化学分析仪全自动干化学分析仪：急诊化验室常用优点：体积小、操作简便。标本用量少、检测结果快速、准确缺点：成本偏高,39,根据试剂载体的复杂程度可将干化学分析技术分为双层膜法和多层膜法，专用小型生化分析仪使用的试纸条为双层膜法，大型全自动生化分析仪的干片为多层膜法。多层膜法是目前生化检验中最具代表性的干化学法。多层膜法干片试剂的结构从上到下共有四个功能层，依次为扩散层、试剂层、显色剂层、和支持层。,扩散层,指示剂层,反射光,入射光,试剂层,支持层,40,1.扩散层：快速吸附液体样品并使之迅速。均匀地渗透，阻挡固体物质和大分子物质进入试剂层，同时为反射光检测提供反射背景。2.试剂层：根据实际测定的需要，由数个至数十个功能试剂层组成。实现试剂与待测物质进行化学反应。3.指示剂层：包含染料或相似的指示剂，使反应产物到达指示剂成后生成了有色化合物，其颜色变化与分析物浓度成比例。4.支持层：由透明塑料制成，起支持其他层的作用，且允许光线百分之百透过。,41,三、离心式分析仪运行特点：样品和试剂分别置于转盘中各自相应的凹槽内，样品在外侧，试剂在内侧，离心使内侧试剂受离心力甩向外侧凹槽内，与样品相互混合发生反应，最后流入转盘外圈的比色凹槽内由比色计检测。分析过程中，样品与试剂的混合、反应和检测等每一步骤几乎都是同时完成，故又称“同步分析”。缺点：同一个离心盘一般只能同时分析一个项目反应盘无自动清洗功能分析速度慢,42,离心式生化分析仪工作原理示意图,43,四、连续流动式分析仪测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应，均在同一管道中经流动过程完成，又称管道式分析仪。,单通道管道式自动分析仪结构示意图,44,第四节自动生化分析方法和校准,一、自动生化分析的方法用自动生化分析仪进行的生物化学物质检测的方法称自动生化分析方法。1.终点法：被测物质经过一定反应时间后，当反应达到平衡时测定吸光度，根据终点吸光度大小求出被测物浓度，称为终点法。包括一点终点法和两点终点法。,45,（1）一点终点法：指加入标本和试剂后，当反应达到一定阶段时（或终点）测定吸光度值计算待测物质浓度的方法。主要用于总蛋白、白蛋白、血糖、甘油三酯和胆固醇等项目测定。计算公式：CU=（待测吸光度AU-试剂空白吸光度AB）K,K为校正系数。,一点终点法反应曲线,46,（2）两点终点法：主要用于双试剂分析中，在第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度A1，相当于样品空白。追加第二试剂，反应到达终点后选择第二个点，读取吸光度A2，两点吸光度之差用于计算结果，称两点终点法。二点法又称为二点终点法，使用双试剂进行分析时多采用二点法主要用于总胆红素、直接胆红素、甘油三酯和胆固醇等项目测定。,计算公式：CU=（待测吸光度A1-待测吸光度A2）K,两点终点法反应曲线,能有效地消除溶血、黄疸和脂浊等样品本身光吸收造成的干扰。,47,两点终点法的意义：一定条件下可降低样品对反应或反应本身的特异性于扰(主要指色度干扰溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）)。常采用双试剂，多以加R2前某一点作测定始点；某些情况下，也可以加R2后一点作测定始点。,48,2.固定时间法：指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-timeessay），其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)K。主要用于Jaffe法测定肌酐。,固定时间法反应曲线,49,固定时间法与两点终点法的区别只是在：测定读数的末点不在反应平衡区段，而是根据方法学选择。如血清肌酐(苦味酸法)测定。,苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。,50,3.连续监测法：根据酶促反应的特点，当底物浓度足够大时，当酶促反应达到最大时，单位时间内底物的消耗量和产物的生成量维特不变，即单位时间内吸光度变化值不变，在酶促反应的零级反应区内选取两个时间点，计算出出每分钟吸光度变化，吸光度变化值同酶活性大小成正比。速率A法常应用于酶活性的测定。计算公式：CU=A/minK,单试剂连续监测法,双试剂连续监测法,51,连续监测法反应曲线,52,二、自动生化分析仪的校准生化分析仪应定期进行校准（定标），使仪器性能状态符合仪器的质量标准。1.用校准品进行校准用仪器厂商配套的试剂及校准品进行相应测定项目的校准，参考操作手册，执行校准程序，当已知浓度的校准品吸光度测出后，仪器会自动计算出校准常数K，存储于计算机中，供样品测定时计算用。,53,用校准品进行校准应注意：选择合适的校准品，以保证检测结果的可溯源性；根据试验项目确定校准的频度，但每6个月至少进行一次校准；室内质控出现异常的趋势或者偏移时的项目应重新校准；注意区别定值质控血清和校准品，绝不可用定值质控血清代替校准品进行校准校准方法可采用两点或多点校准。,54,2.用实际K值进行校准多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：,U/L=A/minK,为理论摩尔吸光系数，由此计算的K值称为理论K值。,55,采用理论K值得前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯的光径准确，温度控制精确以及波长准确等。事实上由于各型分析仪的性能不一，特别是仪器的加样系统、分光系统等方面的差异，以及温度的影响，使仪器达不到理论上的最佳状态，从而导致该仪器的实际K值与理论K值不一致，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实际K值。使用实际K值应注意：不同的仪器，实际K值不同同一仪器的不同时期，特别是仪器进行了维修甚至更换了重要部件，实际K值不同不同的检测系统K值不同,56,第五节自动生化分析仪的参数设置,仪器的参数就是仪器工作的指令，参数的正确设置和合理使用是仪器正常工作的前提条件。封闭式生化分析仪的参数及开放式生化分析仪的有些参数由厂家提供无需设定。开放式生化分析仪的部分参数，应在使用前根据各自实验室及各自使用仪器不同，正确设置。,57,（一）基本参数设置1.试验名称：指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。2.方法类型：自动生化分析仪分析方法是在常规检测方法的基础上，借助仪器的机械和电子装置做进一步扩展。常用的方法一点终点法、两点终点法、固定时间法、连续监测法等。根据被测物质的检测方法原理选择其中相应的分析方法。,58,3.反应温度：自动生化分析仪通常设有25、30、37三种温度，为了使反应的温度与体内温度一致，一般选用37。4.测定波长：单波长：当测定体系中只有一种组分或混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收峰无重叠时，可用单波长检测。自动生化分析仪常用双波长或多波长。根据光吸收曲线选择被测物质反应产物最大吸收峰作为主波长，尽量避开或减少来自试剂空白和样品空白的干扰；次波长的选择原则是干扰物主波长的吸收与次波长吸光度越接近越好，测定时主波长的吸光度减去次波长的吸光度可消除溶血、浊度等干扰物的影响。,59,5.反应方向：正向反应和负向反应，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。6.样品量和试剂量：样品量与试剂量一般按照试剂说明书上的比例，并结合仪器的特性，即样品和试剂最小加样量及加样范围、最小反应体积等，进行设置。亦可按比例缩减或重新设计，但需考虑仪器的检测灵敏度及线性范围，尽可能使稀释倍数大些，以降低样品中其他成分的影响。7.总反应容量：一般是180-350l，总反应容量太小，无法进行吸光度测定。,60,8.样品空白：终点法用，即依据是否需要扣除空白，选择YES或NO。9.孵育时间：终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间；固定时间法是第一吸光度选择点开始至第二吸光度选择点为止。10.延迟时间：连续监测法用，是样品与反应试剂（第二试剂）混匀至连续监测期第一吸光度选择点之间的时间。11.连续监测时间：在延迟时间之后即开始，一般为60-120s，不少于4个吸光度监测点。,61,12.标准液浓度：已知线性较好者只需一个浓度，非线性方法学可5-6个浓度。13.校准K值或理论K值：通过校准得到的K值为校准K值，由计算得到的K值为理论K值。14.计量单位15.小数点位数：按有效数字设定。16.线性范围：用于设定吸光度的最大值和最小值。当吸光度在线性范围时，认为吸光度和物质浓度成正比。超过线性范围应增加样品量或减少样品量重测。,62,17.底物耗尽：在负反应的酶活性测定中可设置此参数，以规定一个吸光度下限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。18.参考值范围：对超出此范围的检测结果，仪器会打印出提示。质控参数通常每个项目要求至少两个水平的质控品。每个质控品的名称、批号、每个检测项目的靶值和标准差均需设置于自动生化分析仪中。（二）特殊分析参数设置,63,（二）特殊分析参数试剂空白吸光度范围试剂空白速率样品预稀释前区检查方法学补偿系数底物耗尽限值,64,第六节自动生化分析仪的性能指标,性能指标是评价仪器的主要依据，正确评价仪器的性能，合理选用适合自己实验室的仪器，对每个实验室来说，都非常重要。在自动生化分析仪的发展过程中，仪器的结构和性能不断完善，功能和技术指标不断更新，自动程度越来越高，检测速度越来越快，检测结果的精密度和准确度也越来越高。,65,（一）自动化程度自动化程度指仪器能够独立完成生化检验操作程序的能力。一般而言，自动化程度越高的仪器使用越简单，但维护要求很高。生化分析仪自化程度的高低，取决于仪器的计算机处理功能和软件的智能化程度，表现为：1.能否自动处理样品、自动加样、自动清洗、自动开关机等。2.单位时间处理样品的能力、可同步分析的项目数量等。3.软件支持功能是否强大，例如，是否有样品针和试剂针的自动报警功能、试剂剩余量的预示功能、数据分析和处理能力、故障自我诊断功能等。,66,（二）分析效率分析效率是指在分析方法相同的情况下分析速度的快慢，反应单位时间内仪器可处理标本的能力。效率的高低取决于一次测定中可测样品的多少和可测项目的多少。不同类型的自动生化分析仪，由于其结果和设计原理以及微机应用程度不同，分析效率差别很大。,67,1.单通道自动生化分析仪一次只能检测一个项目，分析效率低；多通道自动生化分析仪可同时检测多个项目，分析效率较高。目前，全自动生化分析仪多数采用同步分析设计原理，加样品、加试剂、混匀、比色、清洗管道和比色杯同时进行，大大提高了分析效率。2.小型生化分析仪使用单针加样和加试剂，速度较慢，分析效率较低。目前，全自动生化分析仪使用样品针和试剂针分别加样加试剂，甚至使用多针采样方式，使分析效率大大提高。,68,（三）准确度和检测精密度准确度是一台分析仪最重要的性能指标。是决定自动生物化学分析仪检测结果准确性和可靠性的主要因素，其高低取决于分析仪个部件的加工精密度和精确的工作状态。吸样、加试剂、温控准确度，以及光路系统如波长、检测器准确度和波谱带宽等都能影响检测准确度，这些因素往往使相同项目的检测结果向同一方向偏离。吸样精度以及样品针、试剂针、反应杯的交叉污染是影响精密度的主要因素。,69,1.目前自动生化分析仪采用先进的液体感应探针，准确吸样，使样品携带率低于0.5%。2.特殊的不粘特力伦材料制作的搅拌装置，采用旋转的搅拌方式，可调整搅拌针的转速和旋转方式，不仅使混匀更充分，同时提高了抗交叉污染的能力。3.探针的自动清洗装置，各种清洗方式的使用，反应杯的温水清洗、擦干、风干等，使交叉污染的程度控制在最低限度，从而保证检测结果的准确度。4.恒温方式和测光方式不断改进，使自动生化分析仪的分析准确度达到相当的高度。,70,（四）应用范围应用范围是衡量自动生化分析仪的一个综合指标，与仪器设计原理及结构有关。自动生化分析仪的应用范围包括可测试的生化项目、反应的类型及分析方法的种类等。1.可测试的生化项目：应用范围