发酵工程ppt课件.ppt

,第四章发酵工程FermentationEngineering,1,.,Outline,1.菌种的选育2.培养基的配制3.培养基和设备的灭菌4.扩大培养和接种5.发酵过程6.产品的分离提纯,发酵工程内容,2,发酵工程,“发酵”（Fermentation）一词是拉丁语“沸腾”（fervere）的派生词.,它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产生气泡的现象。产生气泡的现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。,3,发酵工程,发酵工程(fermentationengineering):研究发酵工业生产过程中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学。具体包括菌种选育、菌体生产、代谢产物的发酵以及微生物机能的利用等。,1.菌种的选育2.培养基的配制3.培养基和设备的灭菌4.扩大培养和接种5.发酵过程6.产品的分离提纯,发酵工程内容,4,5,1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。,LouisPasteur1822-1895,1.菌种的选育,6,Paster最终使科学界信服在发酵过程中酵母所遵循的规律其后不久，科赫(Koch)建立了单种微生物分离和纯培养技术，利用这些技术研究炭疽病时，发现动物的传染病是由特定的细菌引起的。从而得知，微生物也和高等植物一样，可以根据它们的种属关系明确地加以区分，从此以后，各种微生物纯培养技术获得成功。单种微生物分离和纯培养技术的建立，是食品发酵与酿造技术发展的一个转折点。,科赫(Koch),18世纪后期，Hansen在Calsberg酿造厂建立了酵母纯种培养技术,7,科赫的主要贡献,发明了固体培养基并用其纯化微生物等一系列研究方法的创立。创造了细菌染色方法。发现了许多病原菌，为以后研究药物和寻找治疗方法提供了依据。证实炭疽病因炭疽杆菌发现结核病原菌结核杆菌提出了为证明某种特定细菌是某种特定疾病的病原菌的“科赫原则”,8,用划线法获得单菌落,9,colony：,bacteriallawn(菌苔),10,利用微生物的特点,发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌,(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大适应能力(2)有极强的消化能力(3)有极强的繁殖能力,利用微生物的特点：,UseofMicroorganismsPositive（益处）BiomassProductionConversionNegative（危害）PathogensSpoilage,11,微生物的种类,真菌：酵母、霉菌、担子菌显微藻类原生动物,细菌、放线菌支原体、衣原体、立克次氏体、兰细菌,具有细胞结,构的微生物,草履虫,水绵,细菌、放线菌支原体、衣原体、立克次氏体、兰细菌,没有细胞结构的微生物,原核生物,由原核细胞构成的）,真核微生物,（由真核细胞构成的）,病毒,亚病毒,12,原核微生物-细菌、放线菌真核微生物-霉菌、酵母,13,细菌是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。,（一）细菌,Escherichiacoli（大肠杆菌）Salmonellatyphimurium（沙门氏菌）Bacillussubtilis（枯草芽孢杆菌）Clostridiumbotulinum(肉毒梭状芽孢杆菌)Streptococcuslactis（乳酸链球菌）Lactobacillus.Bulgaricus(保加利亚乳杆菌)Bacillusthermophilus(嗜热芽孢杆菌)CorynebacteriunPekinensis（北京棒杆菌）,Usuallymicroorganism:,14,ArrangementsofCocci,单球菌,双球菌,链球菌,四联球菌,八叠球菌,葡萄球菌,球菌,15,streptococcus链球菌,Streptococcuspyogenes,酿脓链球菌,单球菌,双球菌,16,tetrad,tetrad四联球菌,micrococcustetragenus四联微球菌金属镀膜，40000,17,Sarcina（八叠球菌）：,streptococcus(葡萄球菌),18,Bacillus(杆菌)：,流产布鲁氏菌,escherichiacoli,大肠杆菌,19,Bacillusthuringiensis,苏云金芽孢杆菌,银合欢根瘤菌,rhizobium,大肠杆菌,Escherichiacoli,ElectronMicrographofClostridiumbotulinum,肉毒杆菌;肉毒芽孢梭菌,Bacillusanthracis,炭疽杆菌;,20,cyanobacterium(蓝细菌)光合微生物，.,21,mycobacterium分枝杆菌,Bacillusbifidus双歧杆菌,bifidobacterium,22,Spirlla（螺旋菌）Therearefewkindsinbacteriaandalwayspathogenicbacteria;(螺旋菌在细菌中种类较少，通常是病原菌),vibrio弧菌spirillum螺旋菌spirochaeta螺旋菌,Vibriocholerae霍乱弧菌,Leptospira钩端螺旋体,23,rhodovibriosalinarium红弧菌,spirillumvolutans迂回螺菌,helicobacterpylori幽门螺杆菌,Vibriocholerae霍乱弧菌,24,spirochaeta(螺旋体),spirillum(螺旋菌),25,亮发菌的形态示丝状特殊形态,Someparticularbacteriamorphology,26,细菌分裂方式是裂殖，根据其核的分裂方式不同分无丝分裂核有丝分裂等。,生存环境：温暖潮湿、富含有机物的地方，都有大量细菌活动。有特殊的臭味或酸败味，发粘、发滑.,27,一般细菌的大小范围：,0.5-1mm（直径）,0.2-1mm（直径）X1-80mm（长度）,0.3-1mm（直径）X1-50mm（长度）(长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度),28,最小：与无细胞结构的病毒相仿（50nm）,最大：肉眼可见（0.75mm）,费氏刺骨鱼菌(0.08mmx0.6mm)(Epulopisciumfishelsoni)比大肠杆菌大100万倍（1985年发现）,德国科学家H.N.Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫磺细菌（sulfurbacterium），其大小可达0.75mm，Thiomargaritanamibiensis，-“纳米比亚硫磺珍珠”,29,（nanobacteria）（50nm）,最大和最小细菌的个体大小悬殊：,（Thiomargaritanamibiensis）（0.75mm）,10亿100亿倍,30,每个细菌约有250300条菌毛。有菌毛的细菌一般以革兰氏阴性致病菌居多，借助菌毛可把它们牢固地粘附于宿主的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的粘膜上，进一步定植和致病。,31,细菌细胞壁以外的构造性毛(pili,单数pilus),构造和成分与菌毛相同，但比菌毛长，数量仅一至少数几根。,性毛一般见于革兰氏阴性细菌的雄性菌株（即供体菌）中，其功能是向雌性菌株（即受体菌）传递遗传物质。有的性毛还是RNA噬菌体的特异性吸附受体。,32,1、放线菌分类系统,属原核微生物类群，介于细菌和真菌之间的单细胞微生物,放线菌菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状生长并因此而得名,放线菌对人类最突出的贡献就是它能产生大量的、种类繁多的抗生素达4000种,2.2Actinomycetes(放线菌),33,放线菌的应用：1、能产生大量的、种类繁多的抗生素(包括金霉素、氯霉素、卡那霉素、红霉素等)。2、生产维生素和酶(很好的葡萄糖异构酶产生菌)3、进行甾体转化、烃类发酵和污水处理,UsuallymicroorganismActinomycetesStreptomyces(链霉菌属)Nocardia（诺卡氏菌属）Micromonospora（小单孢菌属)Actinomyces（放线菌属),colony,工业上有重要的放线菌属,34,孢子丝,孢子囊,streptomyces链霉菌,35,大多数放线菌是好气的，生产抗生素过程中必须足够的通气量,大多数放线菌的最适生长温度为2337,放线菌的最适生长pH值为中性至微碱性,在自然界中分布很广，尤其在有机质丰富的微碱性土壤中较多。,大多腐生，少数寄生。,产生多种抗生素（12000余种，60%左右来自放线菌），经济价值大,36,（基内菌丝),Substratemycelium,Aerialmycelium（气生菌丝),Reproductivemycelium（孢子丝）,直形、波浪形或螺旋形,37,放线菌生殖方式,38,三、霉菌,霉菌和酵母同属于真菌。工业上最常用的霉菌以曲霉菌和青霉菌为主，根霉属和红曲霉属也较常用。霉菌：为丝状真菌的统称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌（除少数外），统称为霉菌。,39,霉菌生殖方式,40,1、黑曲霉（Aspergillusniger）,2、米曲霉（Aspergillusoryzae）,3、红曲霉（Monascus）,4、青霉（Penicillium）,5、木霉（Trichoderma）,6、根霉（Rhizopus）,7、毛霉（Mucor）,),常用青霉菌生产青霉素、头孢等,41,1、根霉(Rhizopus),米根霉(Rhizopusoryzae)淀粉酶活力极强，多作糖化酶使用；又由于具有较强的蛋白质分解能力，也可用于制造腐乳。,华根霉(Rhizopuschinentis)是酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。,42,分类：与毛霉同属接合菌纲毛霉目。分布:分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。形态特征：很多特征与毛霉相似，菌丝也为白色、无隔多核的单细胞真菌，多呈絮状。与毛霉主要区别在于根霉有假根和匍匐枝，与假根相对处向上生出孢囊梗。孢子囊梗与囊轴相连处有囊托，无囊领。繁殖：无性繁殖产孢囊孢子，有性繁殖产生接合孢子。根霉的孢子囊和孢囊孢子多为黑色或褐色，有的颜色较浅。,代表种：米根霉（R.oryzae)、黑根霉(R.nigrican)等。,43,2、毛霉(Mucor),鲁氏毛霉(Mucorrouxianus)从我国小曲中分离出来；能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用来制作腐乳,总状毛霉(Mucorracemosus)是毛霉中分布最广的一种，几乎在各地土壤中、一些生霉的材料上、空气中都能找到；酒曲中常见可制作豆豉,44,分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，毛霉属,单细胞，菌丝无隔，多核。菌丝有分枝，主要有两个类型：单轴式，假轴式。,1.单轴式孢囊梗、总状分枝（高大毛霉、总状毛霉）2.假轴式孢囊梗（鲁氏毛霉）3.孢子囊结构,孢囊梗顶端膨大为孢子囊，内生孢囊孢子,45,分布:广泛分布于土壤、空气中，也常见于水果、蔬菜、各类淀粉食物、谷物上，引起霉腐变质。形态特征：菌丝发达、繁密；白色无隔多核，为单细胞真菌。毛霉的孢子囊梗有单生的，也有分枝的。分枝有单轴、假轴两种类型。毛霉的菌丝多为白色，孢子囊黑色或褐色，孢子囊孢子大部分无色或浅兰色，因种而异。繁殖：可形成孢囊孢子、厚垣孢子、接合孢子。经济价值：蛋白酶、淀粉酶、有机酸、甾体转化,46,分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。形态特征：菌丝发达多分枝，有隔多核，分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞（footcell足细胞）上垂直生出；分生孢子头状如“菊花”。曲霉菌丝、孢子常呈现各种颜色，黑、棕、绿、黄、橙、褐等，菌种不同，颜色各异,3、曲霉(Aspergillus),47,子囊菌纲，曲霉属,分生孢子梗从厚壁而膨大的菌丝细胞（足细胞）生出,曲霉为多细胞，菌丝有分隔。营养菌丝大多匍匐生长，无假根,分生孢子梗常顶端膨大而形成棍棒形、椭圆形、半球形、球形的顶囊，其表面产生小梗，单层或双层。,48,繁殖：无性繁殖产分生孢子；大多数有性阶段不明，归为半知菌类。少数种可形成子囊孢子，归为子囊菌亚门。-大多数为无性世代产分生孢子；少数种可形成子囊孢子。代表种：黑曲霉(Asp.Niger）、黄曲霉(Asp.flavus)、米曲霉应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）农业上用作生产糖化饲料的菌种。,49,黄曲霉,曲霉的分生孢子穗扫描电镜图片,50,米曲霉,黑曲霉,黄曲霉,51,分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。代表种：产黄青霉(Pen.chrysogenum)，桔青霉（Pen.citrinum)，展青霉(Pen.patulum)分布：广泛分布于土壤、空气、粮食和水果上，可引起病害或霉腐变质形态特征：与曲霉类似，菌丝也是由有隔多核的多细胞构成。但青霉无足细胞，分生孢子梗从基内菌丝或气生菌丝上生出，有横隔，顶端生有扫帚状的分生孢子头。分生孢子多呈蓝绿色。扫帚枝有单轮、双轮和多轮，对称或不对称。繁殖：无性繁殖产分生孢子；大多数有性阶段不明，归为半知菌类。少数种可形成子囊孢子，归为子囊菌亚门。,4、青霉（Penicillium）,52,产黄青霉(Penicillumchrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸,娄地青霉(Penicillumroqueforti)属不对称青霉组，具有分解油脂和蛋白质的能力，可用于制造干酪；该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基酮,青霉素的发现和应用，被人们誉为科学史上的一项奇迹，是二次大战中与原子弹和雷达并驾齐驱的三大发现之一。,常用青霉菌生产青霉素、头孢等,53,展开青霉(P.patulum)：又名寻麻青霉，主要用于生产灰黄霉素（一种有效的可口服抗生素，用于治疗真菌性皮肤病、痢疾及灰指甲）,橘青霉(P.citrinum):许多菌系可产生橘霉素，也能产生脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶有的菌系产生5-磷酸二酯酶，可用它生产5-核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸具有很强的助鲜作用）,54,5、白地霉(Geotrichumcandidum),节孢子单个或连接成链，具真菌丝，有的分枝，横隔或多或少。裂殖，节孢子单个或连接成链，呈长筒形、方形，也有椭圆形或圆形，末端圆钝。白地霉的营养价值并不比产朊假丝酵母差，因此可供食用或作饲料。也可用于提取核酸，在废料废水的利用上很用价值,菌落白色，呈毛状或粉状,55,6、产黄头孢霉(Cephalosporiumchrysogen),营养菌丝分隔；分生孢子梗短，大多从气丝上生出；分生孢子从顶端长出后推至侧旁，靠黏液连成假头状，遇水散开,头孢霉素、先锋霉素,56,酵母有酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属和汉逊酵母属。1、酵母菌形态：酵母菌是一群单细胞的真核微生物,其形态因种而异.通常为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、藕节状、腊肠形，假菌丝等。,四、酵母,单细胞真核，主分布于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。,57,Saccaharomycescerevisiae啤酒酵母,Saccharomycescerevisiae）的芽殖过程,58,Saccharomycescerevisiae的子囊和子囊孢子,59,芽生孢子,厚垣孢子,假菌丝,白假丝酵母,60,yeast,redyeast,61,Differencebetweenyeastandbacterium,62,Virusestructure病毒的构造,核衣壳,envelop,63,Thenucleocapsid(arrows)canbeseenwithintheenvelope.,64,65,66,PhageT4infectingitshostE.colicell,67,plaque(噬菌斑),Pseudomonasfluorescens,plaque,68,（2）.新菌株分离与筛选的步骤,定方案,采样,发酵性能测定,增殖,分离,菌种的保藏,(1)斜面【短期：13个月】；(2)沙土管【适合放线菌或霉菌的孢子,保藏几年】；(3)冷冻【液氮超低温，196度，保藏20年】。,69,种子质量对发酵的影响？,种子质量好：1.缩短发酵时间、保证生产水平.2.无杂菌污染.3.移种至发酵后，能够迅速生长.4.泡沫产生少.5.产物生成速率大.6.副产物合成少.7.对下游分离纯化有利,用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株,70,Thepurecultureofmicroorganisms,Dilute,dilutesample,71,SpreadPlate,72,培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长促进产物的形成,2.培养基的配制（Nutrientsavailable）,微生物需要的营养物质及功能：1化学组成：C、H、O、N、P、S及其他元素2营养要素物质(五大类)：碳源、氮源、生长因子、水、无机盐,73,（1）、碳源和氮源。,碳源氮源,无机碳源：有机碳源：无机氮源：有机氮源：,糖类尤其是葡萄糖,主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物异养微生物的主要能源物质,不同种类的微生物，对碳源需要差别大。例：甲烷氧化菌：只利用甲醇、甲烷假单胞菌：利用90多种含碳化合物异养微生物：含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源,CO2、NaHCO3等,糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等,N2、氨、铵盐、硝酸盐等,尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,铵盐、硝酸盐,主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物,74,关于自养微生物和异养微生物碳源的利用和能量的来源自养微生物以二氧化碳或碳酸盐为唯一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。自养微生物生命活动所需的能源：一种类型是利用光能，如蓝细菌等着色细菌；一种类型是依靠物质氧化过程释放能量，如硝化细菌。,75,1.碳源,凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。,来源,糖类有单糖（葡萄糖，果糖）、双糖（蔗糖、乳糖）、多糖（淀粉、糊精），常用葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜。糖蜜是制糖的副产物，主要成分为蔗糖，是价廉物美的碳源。脂肪有豆油、棉籽油和猪油，醇类有甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇，长链碳氢化合物以石油产品的正烷烃，14-18碳的混合物。以脂肪作为碳源时，必须提供足够的氧气，否则会引起有机酸积累。,糖类、醇类、脂肪、有机酸等。,76,糖蜜,77,2.氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸，蛋白质、核酸等)和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,（1）无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO42NH3+2H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH,78,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH,所以选择合适的无机氮源有两层意义：,79,（2）有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。,例玉米浆：可溶性蛋白、生长因子(生物素)、苯乙酸较多的乳酸硫、磷、微量元素等,80,作用：构成菌体原生质体的成分（如P、S)；作为酶的组成部分和维持酶的活性(如：Mg、Zn、Fe、Ca、P）；调节细胞的渗透压（NaCl、KCl）；参与产物的合成（P、S）,3.无机盐和微量元素,无机盐（mineralsalt）和微量元素(traceelement,microelement)是生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用，磷（核酸）、硫、铁（细胞色素）、镁、钙（调节细胞膜透性）、锰、铜、锌（辅酶或激活剂）、钴、钾、钠（调节渗透压）、氯。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。,81,4.生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。,（growthfactor）,一般天然成分中含有，无需添加。但对于营养缺陷型（氨基酸、核苷酸）菌株，必需添加。,82,指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,在抗生素等次级代谢产物的发酵中，经常添加前体(precursor)和促进剂(accelerant)，以提高产量。前体可以是产物的中间体，也可以是其中的一部分。,2.前体,83,3、产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,84,五.水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，要求可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,85,判断题：（1）同一种物质不可能既作碳源又作氮源（2）凡是碳源都能提供能量。（3）除水以外的无机物仅提供无机盐。（4）无机氮源也能提供能量。,（错）,（错）,（错）,（对）,常用碳源有哪些？常用糖类有哪些，各自有何特点？,碳源:糖类（淀粉、葡萄糖、蔗糖等）、油脂（动、植物油）、有机酸（琥珀酸、柠檬酸、乳酸、乙酸等）和低碳醇（甲醇、乙醇等）。葡萄糖，所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应糖蜜，是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。淀粉、糊精，缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应。,86,（二）培养基的配制原则,1、目的要明确（培养的种类和目的）-（生产或实验）目的包含两层含义，一指培养的微生物种类，因为不同的微生物营养需要不同，培养基中要求的营养成分不同。二指培养的目的，是用于生产还是科学研究，因为二者对培养基的化学成分、物理状态等方面要求不同。2、营养要协调（注意各种营养物质的浓度和比例）营养要协调：它表现在两个方面，一是营养物质的浓度要适宜，二是营养物质间的浓度比例要适宜。3、pH要适宜（细菌的最适PH为6.57.5；放线菌的最适PH为7.58.5)pH要适宜：由于微生物在生长代谢过程中营养物质利用和代谢产物的形成往往会改变环境中的pH，为了维持培养基中出的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，最常用的缓冲剂是磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。,87,(三）培养基的种类。按照物理性质划分培养基：（液体、半固体、固体培养基）按照化学成分划分培养基：（合成培养基、天然培养基）按照培养基的用途：1.（选择培养基、鉴别培养基）2.发酵生产应用考虑：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。3.按发酵过程中所处位置和作用分为：,斜面固体培养基（solidmedium）种子培养基（seedmedium）发酵培养基(fermentationmedium)补料培养基(fedmedium),88,89,90,Cultivationofmicroorganisms:microorganismsgrowinthreekindsofmedium,Thesemi-solidmedium:thetestformotilitytestandforshort-timepreserve,Theliquidmedium:fortheenrichmentofthebacteria,Thesolidmedium:fortheselectionandpurificationofthebacteria,91,92,利用某些微生物碳源的特殊性解决环境污染、粮食危机等问题。归纳：利用某些细菌、放线菌、酵母菌以石油作为碳源的原理，消除石油污染；运用某些细菌可以分解、利用氰化物、酚等有毒物质的原理处理有害物质；研究开发以纤维素、石油、二氧化碳等作为碳源和能源的工业微生物，解决工业发酵用粮与人们日常用粮的矛盾。,93,配制好培养液后，是否可以立即加入菌种？,方法：将培养液投放到发酵罐中，通入98kPa的蒸汽进行灭菌，大型发酵罐用CIP清洗系统,为什么要灭菌？,如何灭菌算彻底？,杀死所有杂菌的细胞体、芽孢和孢子,防止杂菌污染，对发酵过程造成不良影响；,不能，需要进行灭菌,3.培养基和设备的灭菌,94,4.扩大培养和接种,95,细菌的生长曲线：描述了细菌群体从开始生长到死亡的动态变化过程。,1,2,3,4,1.调整期2.对数期3.稳定期4.衰亡期,(时间),(细菌数目对数),96,97,（二）影响微生物生长的环境因素1、温度（1）微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度。（2）绝大多数微生物最适生长温度为2537；（3）依据最适生长温度，可以将微生物分为低温型、低温型、中温型。,2、PH3、氧依据对氧的需求，微生物分为好氧型微生物、厌氧型微生物、兼性厌氧型微生物,98,医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业,基因工程药物、疫苗及抗体产品,化学工程生物化工生物加工行业,传统生物技术,现代生物技术基因工程菌发酵,抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等,99,100,杯式补料系统,101,大型空气压缩机,102,103,发酵工业的范围,1、以微生物细胞为产物的发酵工业2、以微生物代谢产物为产品的发酵工业3、以微生物酶为产品的发酵工业4、生物转化或修饰化合物的发酵工业5、微生物废水处理和其他,104,微生物产物：微生物细胞，酶，药物活性物质，特殊化学物质和食品添加剂,105,1、生产微生物细胞物质,定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。,106,2、微生物酶发酵,酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。分类：胞内酶和胞外酶生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,3、微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。,107,4、微生物的生物转化,定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。,5、微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保持生态平衡微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。,108,发酵工业简介发酵食品有机酸氨基酸核酸类物质酶制剂医药工业（抗生素）饲料工业（单细胞蛋白环境工程（废物处理）其它（冶金工业）,FermentationIndustryFermentedFoodsOrganicAcidsAminoAcidsNucleotidesEnzymesPharmaceutical(Antibiotics)Feedstuff(eg.SCP)EnvironmentalApplication(WasteTreatment)Others(eg.Metallurgicalindustry),109,五、发酵工业的特征,发酵过程中离不开微生物的作用1、发酵原料的选择及预处理：发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。2、微生物菌种的选育及扩大培养：微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种选育，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。,110,3、发酵设备选择及工艺条件控制：常温、常压。种子扩大培养和发酵采用不同的工艺。发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件简单。发酵对杂菌的污染的防治至关重要。反应必需在无菌条件下进行。4、发酵产物的分离提取：由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物。5、发酵废物的回收和利用：工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，并可以取得较显著的经济效益。除利用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的遗传工程菌进行反应。,111,按发酵工艺是否需氧划分：厌氧发酵：发酵是在厌氧条件下进行，如酒类发酵、酒精发酵、丙酮丁醇发酵、乳酸发酵和甲烷发酵；通风发酵：发酵是在通风条件下进行，如酵母菌生产、抗生素发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和酶制剂生产等。,1、发酵类型,按发酵工艺培养基的状态划分：固态发酵：发酵是在固体状态下进行，主要应用于传统酿造业；液态发酵：发酵是在液体状态下进行，是目前发酵工业所采用的主要工艺。,六、发酵方法的类别与流程,112,按发酵设备来划分：敞口发酵：主要应用于繁殖快并进行好氧发酵的菌株，一般对设备要求很少，如酵母生产；密闭发酵：发酵是在密闭条件下进行，对设备要求高，工艺复杂。浅盘发酵：发酵在一浅层培养液中进行，适合于好氧发酵。深层发酵：发酵是在培养基内部进行的。,113,液体深层发酵主要有三种类型分批发酵(batch-fermentation)补料分批发酵(fed-batchfermentation)连续发酵(continuousfermentation),114,115,发酵过程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。,116,2、发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,117,工业发酵步骤和工艺流程,(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水,118,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,119,3、发酵工艺控制,一类是可以直接采用特定的传感器监测的参数。它们包括各种反映物理环境和化学环境变化的参数，如：温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液粘度、浊度、pH、离子浓度、溶解度、基质浓度等，又被称为直接参数。另一类参数是到目前为止还没有可供使用的传感器监测的参数，它们包括细胞生长速率、产物合成速率和积累速率、呼吸商等。这些参数需要根据一些直接监测出来的参数，借助于电脑快速运算的功能和特定的数学模型才能得到。因此这类参数又被称为间接参数。,发酵过程变化的参数,120,温度,1、温度的影响及检测：影响发酵温度的因素Q发酵=Q生物+Q搅拌Q蒸发Q显热Q辐射2、温度对发酵的影响由于微生物反应是由各种生物酶参加的反应，所以从酶动力学来看，温度升高，反应速度加大，生长代谢加快，产物生产期提前。但酶本身很易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快。它表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，产物产量减少。通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,显热系指当此热量加入或移去后，会导致物质温度的变化，而不发生相变。,121,温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还会通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。如温度会影响基质和氧在发酵液中的溶氧和传递速率，菌体对某些物质的分解吸收速率等温度还会影响生物合成或代谢调节的方向和最终产物。这点不难理解，因为温度会影响生物体内的酶的活性。如，金色链霉菌能同时产生四环素和金霉素。在30以下时，该菌主要合成金霉素。35时，该菌只产生四环素而停止生成金霉素。,温度可以通过水银温度计、热电铝、热敏电阻和金属电阻温度计监测发酵系统中的温度，并通过与其相偶联的执行机构（如改变冷却水阀门的开度）对发酵温度进行自动控制。,122,任何微生物的生长都需要有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的生产现实意义。,温度一般为30-33；超过33时应该进行冷却,微生物可生长的温度范围较广,总体说在-1095,123,一般微生物的最适生长pH范围为：细菌：pH7.08.0放线菌：pH7.58.5酵母菌：pH3.86.0霉菌：pH4.05.8藻类：pH6.07.0原生动物：pH6.08.0,pH值,绝大多数微生物的最适pH是5.5-8.5，在发酵过程中，由于代谢物的不断释放，反应器中的pH可能发生变化，因而须对其进行检测，并根据结果调整；培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的pH范围。,124,微生物通过其活动也能改变环境的pH值。发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。,控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3，则pH上升；阳离子(如NH4、K+)被吸收或有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。,125,溶氧量,微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵，兼性厌气菌则两者兼而有之。,需氧方面：需氧量手菌体浓度，基质浓度和种类，培养条件有关。不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。供氧方面：提高氧的传递推动力和液相体积氧的传递系数KLa速率；生产中常采用加大通气速率，或提高搅拌转速，或适当增加罐压；,供氧需氧,溶氧浓度的控制可从供氧和需氧两方面考虑：,126,耐氧性微生物：主要是乳酸菌,127,搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有助于搅拌，使其效果更好。,气升式发酵罐,128,种龄与接种量,种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接入培养成熟的菌种的优点：1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，2.节约了发酵培养的动力消耗，3.并有利于减少染菌机会，一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移人代谢废物，反而会影响正常发酵。,129,4、生物反应器-发酵设备,生物反应器(Bioreactor)指用于完成生物催化反应的核心设备，通常分为细胞反应器和酶反应器。一般讲，反应器的容量越大，生产效率就越高。,发酵采用的主要设备是发酵罐。根据操作方式分为好氧发酵罐和厌氧发酵罐，好氧发酵罐又进一步分为机械搅拌式发酵罐和通气搅拌式发酵罐。发酵罐是一种圆柱形的容器，容量从几升到几百万升不等，上面连接有通气、搅拌、接种、加料、冷却等装置；此外，还有对温度、pH、通气量与转速等发酵条件进行检测和控制的装置(如图)。,P109-112,130,生物反应器的分类,131,132,133,134,大型发酵罐搅拌装置,135,大型空气压缩机,180M3发酵罐车间,136,5.Scale-up（比拟放大）,models,ELGaddenJr,模拟,137,-发酵产品的下游处理,发酵产物的提取与精制过程，又称后处理过程或下游加工过程(downstreamprocessing)；下游处理费用占总生产成本的60%以上，对于精细和药用的产品，提取费用所占比例更高。下游处理工艺是否先进合理，对于整个发酵生产来说至关重要。,发酵工程（下游）工程,138,下游加工的一般步骤,上游过程,收获细胞,胞外产物,胞内产物,去除固体杂质,产物的初步分离、浓缩,纯化,产物的最终分离、纯化,细胞破碎,化学方法机械方法酶处理,离心、过滤、萃取,蒸发、吸附、沉淀、超离心,各种层析,冷冻干燥、喷雾干燥、结晶,139,利用菌体：离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分开，也可以用喷雾干燥法直接做成粉剂。酒精发酵醪蒸馏塔蒸馏；抗菌素及有机酸根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。,140,发酵工业的意义与展望,利用遗传工程等先进技术，人工选育和改良菌种采用发酵技术进行高等动动植物细胞培养固定化技术广泛应用开发和采用大型节能高效的发酵装置，自动控制将成为发酵生产控制的主要手段应用代谢控制技术，发酵生产氨基酸将生物技术理广泛地用于环境工程,141,抗生素-是生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物。,青霉素生产工艺,CH2-CO-,142,-内酰胺类抗生素的作用机理,青霉素作用于细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段，线性肽多糖在转肽酶的催化下进行交联，肽多糖链之间每两条肽链结合时均释放出一个D丙氨酸，青霉素中与肽多糖的D丙胺酰D丙氨酸二肽相似，竞争性的与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。,143,Agardiffusionassay,agarplate琼脂培养基,抗生素产生菌筛选,检定菌培养，加上发酵液,抑菌圈分离法,144,StrainImprovementScale-up,Strain出发菌株,Agarplate平板技术,PrimaryshakeflaskEvaluation摇瓶培养,Secondaryshakeflaskevaluationdifferentmedia二级摇瓶培养各种培养基,LabfermentorevaluationProductionCondition小型发酵罐模拟生产条件,Mastercellbank,Workingcellbank,InoculumDevelopment菌种扩大培养,PilotplantEvaluation中试生产,ProductionEvaluation生产,6000,300,30,3,1,Possiblerecycle,145,青霉素的生产工艺,生产菌的生物学特性发酵工艺过程提炼工艺过程,146,(一)青霉素生产菌的生物学特性,目前常用形成绿色孢子和黄色孢子的两种产黄青霉（Penicilliumchrosogenum菌株；孢子：孢子黄绿至棕灰色。圆形或圆柱形。,147,发酵培养下生长过程及细胞学变化,第1期：分生孢子萌发，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒，适于作发酵用种子。第3期：脂肪包涵体，储藏物，嗜碱性很强。第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产抗生素。第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：个别细胞自溶，细胞内无颗粒，释放氨，pH上升，应放罐。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,148,青霉素生产流程图,冷冻干孢子,琼脂斜面,米孢子,种子罐1和2,发酵罐,预处理罐,过滤器,萃取器,蒸发器,结晶器,工业盐,冷至150C,培养基制备，补料流加,米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25oC,149,发酵工艺,150,加糖控制补氮及加前体pH控制温度控制通气和搅拌泡沫和消泡,一般在残糖将至0.6左右，pH上升时开始加糖。,加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氮源控制在0.010.05。,加酸或碱自动控制pH，一般为6.46.6。,一般前期2526，后期23，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。,抗生素深层培养需要通气与搅拌。,可用天然油脂如豆油、玉米油或用化学合成消泡剂“泡敌”（环氧丙稀环氧乙烯聚醚类）来消泡。应当控制其用量并少量多次加