（分析化学专业论文）微生物发酵过程控制分析.pdf

嚣燕大学硕士攀位论文 摘要 本论文主要包括两部分：第一部分尧“玉米秸秆微生物 降解研究及红外光谱的应用”；第二部分为“薄层色谱法 ( t l c ) 在祟蔬罐头矮量控制避疆中豹应用”。 第一部分： 研究了玉米秸秆微生物发酵条件及过程，测定了降解前 后纯学成分并分辑冀变位媾况。实验表明，混合玉米穰秆不 同部位，能提高发酵降解的转化系数；尿素的加入促进了降 解过程，使干物质的损失量大大增加。 对多秘菌株送行了适应惶选择，对选择静萤株g m 9 8 2 3 送 行了玉米秸秆降解试验，得到了适宜条件为接种量1 2 、加 水量7 5 、发酵温度3 0 1 、发酵时间1 5 天。在优化条 件下发酵获得静饲料蛋自含量较高，可俸淹普通蛋自饲料酶 代用品，也可作为鬣白饲料新的开发来源。该项工作达到了 国内同类缮究的先进水平。 将红外技术应用到发酵过稷研究中，辩玉米秸秆进行红 外跟踪，根据谱图随时间的变化推测主要物质的降解历程。 透过对玉米穗秆簿勰装基i 遴粒强震及对靖薤碧图避行分 析，可以标示其降解程度，建立了纤维素、木质素、鬣白质 的降解进行定性或半定量分析方法。揭示玉米秸秆微生物降 解过程及转纯穗割，必该徽生携 弋漆的过糕控翱提供姿瓣， 建立了利用红外光谱技术监测纛米秸秆降解的方法。 郑州大学硕士学位论文 第二部分： 应用薄层色谱法( t l c ) 测定己受到微生物污染的野生果 蔬罐头，经过实验优化和，选择了展开剂为乙酸乙酯、乙醇、 环己烷、和2 5 氨水的混合物，体积比为4 ：1 0 5 ：8 ：1 ， 显色剂用4 ，4 一双( 二甲胺基) 二苯基甲醇，深蓝色的显 色斑点在暗处能稳定1 2 小时。该方法与常规的微生物镜检 测定法、菌种培养法和p h 测定法相比具有快速方便等优势。 利用上述方法，对三中实际样品进行了分析，对于己知 结果的样品进行分析，t l c 法的检测均为阳性，而其它几种 方法有的为阳性，有的为阴性，表明了t l c 法具有更高的准 确度，准确率达到9 9 嘶；而且t l c 一般在2 h 内可测得结果， 比微生物培养法迅速，也不需要微生物镜检测定法和p h 测 定法所涉及的特殊仪器。该方法在实际应用中，在2 0 c a x 2 0 c m 的层析板上每批可以点2 0 个样品，适用于多样品、同时、 同位常规无菌检验。从而建立了方便使用的果蔬罐头微生物 腐败监测方法，填补了该方面的一个空白。 关键词：玉米秸秆，微生物降解，红外光谱技术，薄层色谱，果蔬 罐头，微生物， 郑期大擎硕士学位论文 t h e r ea r et w op a n si nt h i sp a p e r ，t h ef i r s tp a r ti s t h a tt h er e s e a r c ha b o u tt h ec o r ns t r a wi sd i v e r t e db ym i c r o b e a n dt h eu t i l i z a t i o no fi n f r a r e ds p e c t r u mi n f r a r e dt e c h n i q u e ( i s t li nt h ec o u r s ew h i c ht h ec o r ns t r a wi sd i v e r t e db y m i c r o b e ；t h es e c o n dp a r ti st h a tr e s e a r c h e r so ft h i n - l a y e r c h r o m a t og r a p h y ( t l c ) m e a s u r e m e n t st e c h n i q u e si nm i l d f r u i ta n dv e g e t a b l et i nb ym i c r o b e t h ef i r s tp a r th a sm a i n l ys t u d i e do nt h eu t i t i z a t i o no f i s ta b o u tt h ea n a l y s i so nt h eb i o c h e m i s t r yp r o c e s sw h i c h t h ec o r ns t r a wi sd i v e r t e db ym i c r o b e t h ei s tc a no b s e r v e t h ec h a n g eo ff u n c t i o n a lg r o u pi nm a i ns u b s t a n c ea n db a s i n f e r r e dt h ed i v e r t e dc o u r s eb ym i c r o b ei nt h ec o m p o s i t i o n o fm a i ns u b s t a n c ei nc o r ns t r a ws ot h a tt h em e c h a n i s m w h i c ht h ec o r ns t r a wi sd i v e r t e db ym i c r o b ew o u l db e r e v e a l e da n dt h ed a t aa b o u tw h i c ht h ec o u r s eo fd i v e r t e d c o r ns t r a wi sc o n t r o l l e dw o u l db eg i v e n 。 t h es e c o n dp a r th a sd e t e r r e dt h ew i l df r u i ta n d v e g e t a b l et i nf o o dw h i c hi sc o n t a m i n a t e db ym i c r o b ea n d c o m p a r e d i tw i t ht h em i c r o b ec u l t u r ec h e c km e t h o d ， m i c r o b ec h e c km e t h o dw i t hm i c r o s c o p ea n dp hc h e c k m e t h o d t h er e s u l t s h o w e d t h a t t l c ( t h i n 1 a y e r c h r o m a t o g r a p h y ) c o u l dq u i c k l yg e tt h ea c c u r a t er e s u l ti n t w oh o u r s b u tt h em i c r o b ec h e c km e t h o dn e e d st h es s p e c i a l w o r kc o n d i t i o n ( 2 8 ，6 d ) ，m i c r o b ec h e e km e t h o d w i t h m i c r o s c o p e a n dp hc h e c km e t h o dn e e d s s p e c i a l a p p a r a t u s ，t l cm e t h o di ss u i t a b l eq u i c ka n dc h e a pm e t h o d ， w h i c hm e a s u r e sst h eg r o w t ho fm i c r o b ei nt h ew i l df r u i t 掇 郑州大学硕士学位论文 a n dv e g e t a b l et i n k e yw o r d s ： c o ms t r a w , d i v e r t e db ym i c r o b e ,i n f r a - r e d s p e c m m at e c h n i q u e ( i s t ) ，t i nf o o d ，m i c r o b e , t h i n - l a y e r c h r o m a t o g a p h yo n - c ) 郊鲻太学硕女学蕴论文 第部分弧米秸秆微生物降解研究及数外光谱的应用 第章微生秘降解纛米秸秆翦研究综述 1 1 作物穑秆降解研究r 移冠 乍甥噱释一半以上的鼍嘞暖壶纾维帮强半绎绻蠡组戏，其余是本羁豢、寨纯 合物帮灰分( 主要是硅) 。秸秆大多用俸建筑末孝料、缓簿维素以及动物缝辩 等，秸秆的其他用途见表1 1 。 据有关铤料显示，整个地球上每年由光合作用所生成的作物秸秆可迭2 0 0 0 一 3 三霎毫，鳆溯逮区生产麴翟摹，每年霹达5 6 1 蟊楚。我国是一个农1 2 大国， 椐粗略佶计，每年约产农作物秸秆6 亿吨。因此可以说，每年由光合作用所生成 的作物秸秆是地球上最丰辫的取之不尽的天然、可再生资源。因此，加大农作物 秸秆综台剥周自0 研究对孵1 伏人类的能源危枫的意义是非常大的。 表1 1 稽秆的用途 使用方法产物 壹接运攫 濑辩、蟪覆覆姜耪、基瓣、改良壤、色装耪辩、动物i 霉草 机械转化纸浆和纸、颗粒板、鹰缩稻草 一霎：黧蔫亲黧糅姓凯眦纳沫质 生物学转化 蒸词料、堆艇、糖、簿、犟细胞蛋融、酶、发酵锕辩和甲 驭| 塔4 年开重量，美军潍文实验室藏开始赣突激生物薄解馋黼f 瓣阉邃。 到目前为止，作物秸秆的降解研究已取得了很大的进步。张博润在农f 留物秸秆发 酵齐嘶究中敬得了重要进鼹；砬【n j m 已实现了农作物秸秆主要成分转化成葡 萄糖的工厂化 裁佥，珏浞绶霹真萤纾缕豢酶豹接雳方式遴 亏：了深入鹣臻港，取 得了一系歹0 突跛性的成燕m 鞲曲等稀黝渤降解俸猢衙生产乙醇稠译烷骰了 报道。 郑州大学硕士学位论文 我国是一个农业大国，据粗略统计，每年约产农作物秸秆6 亿吨。但是目 前这些资源并没有被合理充分利用。除用作造纸外，大部分当作燃料。有些甚至 任其腐烂而白白浪费。作物秸秆的燃值非制氐，只有4 2 1 3 0 卡琬，只有甲烷气的 3 2 ，乙醇的5 5 ，因此，直接作为燃料浪费是非常大的，并且也污染环境。而 直接用作饲料，由于木质素、纤维素和半纤维素构成的细胞壁难以被胃液消化， 其消化性也不好。我国每年生产出的农作物秸秆达6 亿吨，利用率是非常低的。 如果能将这一丰富资源利用起来，其经济意义和社会效益肯定是非常明显的。 1 2 微生物降解秸秆的作用机理研究 微生物对作物秸秆的降解，其实质上是微生物及产生的纤维素酶对作物秸 秆的降解生物化学过程，该反应具有反应条件温和，副产物少或无副产物的特 点。所以近十多年来科学家们对纤维素酶的作用机理和反应条件进行了大量的研 究，发现纤维素酶实际上是由1 卜b 葡萄糖酶( e c 3 2 1 4 ) 、外l ，4 0 - d 葡萄 糖酶( e c 3 2 ，i 9 1 ) 和0 - d 葡萄糖苷酶( 盼2 l 2 1 ) 组成的复合酶系。内1 ，4 一 b 葡酶糖酶随机地作用于可溶性和不溶性的l ，卜b 葡萄糖。外1 ，牟_ b _ d 葡 聚糖酶包括1 ，卜b 葡聚糖水解酶( b 2 1 7 4 ) 和1 ，卜b d 葡聚糖纤维二糖 水解酶( e 口2 1 9 1 ) 两种。前者将d 葡萄糖从l ，卜且d 葡萄糖昔酶放出来， 并缓慢地对纤维二糖进行水解，后者则从葡聚糖中释放出纤维二糖。b - d 葡萄 糖苷酶则从纤维二糖币1 3 可溶性纤维糊精以及葡萄糖苷中释放葡萄糖。在这些酶的 协同作用下，不溶于水的晶状纤维素被分解成可溶| 生单糖。由于纤维二糖对内葡 聚糖酸都有反馈抑制作用，所以1 3 - d 葡糖苷酶成为纤维素水解过程中的主要限 速酶。在纤维素酶解系统中，内葡聚糖酶，外葡聚糖 i ：l 葡糖苷酶之间保挣晗当的 比咧是保证纤维素水解过程持续进行的关键。 酶解速度随着温度的升高而加快。但温度超过一定的范围后，酶容易变性失 活。所以筛选热稳定性高，对产物和底物浓度耐性好，专化性和活性的纤维素酶 成为研究纤维素酶解技术的核一0 领域。经过大量的研究，现e 蛹- 选出了许多耐高 温( 最适温度高达6 5 ) 对产物浓度不敏感( 在3 0 9 6 的糖液中仍能继续分解纤维 二糖) 、t i t 适应范围广的许多优良菌系，喜温菌系的发现和利用，不仅提高了 转化效率，而且减少了微生物污染，简化了纯化步骤，提高了生产量。 郑州大学硕士学位论文 半纤维素是五碳糖( 阿拉伯糖) 、六碳糖( 甘露糖) 和糖酸组成的杂聚体。 木聚糖是许多生物材料中半纤维素的主要成分。木聚糖中除含有木糖外，还含有 1 可拉伯糖、葡萄糖醛酸、乙醚、香豆酸、肉桂酸等。木聚糖的完全水解需要 内1 ，4 _ b 木聚糖酶( h e 3 2 1 8 ) 、b 木聚糖酶( 日。3 2 1 3 7 ) 和其它几种辅酶 ( 如阿拉伯糖苷酶，葡萄糖苷酸酶) 的协同作用。内1 ，4 _ b 木聚糖酶随机地 作用于木聚糖的主链产生低聚糖，b 木糖苷酶将这些低聚糖分解成木糖。阿拉伯 糖苷酶、葡萄苷酸酶等分别从木聚糖主链 除去相应的阿拉伯糖和葡糖苷酸等。 虽然木聚糖的结构比纤维素更复杂，完全水解所需的酶类也比纤维素多，但木糖 的结构没有纤维素那样紧密，各种酶容易与木聚糖结合，所以水解速度并不慢。 现已发现有些真菌如a 】鹏c b a s i d iu 【i 能分泌专化性极高的木聚糖酶，有些噬 热菌如t h e r t t m m a n o s l s o r - 4f u s a 能同时分泌木聚糖完全水解所需的各种酶类。但将 半纤维素水解产物转化成乙醇的酵母菌很不理想，它们大都对乙醇浓度和其它各 种抑制剂( 特别是木纤维素顶处理和水解过程中产生的各f 十底物) 非常敏感，所 以秸秆降解速度很慢。选择各种合适的降解酶成为该方面研究的一个重点之一。 1 3 作物秸秆降解过程中控制分析研究概况 1 3 1 生化过程中在线测控的现状及应用 近年来，伴随着研究利用微生物重组和细胞培养技术生产生物潘i 生物质的 发展过程，生化过程的控制和最优化也已从靠经验管理向用微机管理的方向发 展，而实现自动化控制的必要条件是要实珊连续的在线监控的生化过程。生化过 程是一个实时、非线性、多变量输入输出和随机性的动态过程，构成了个复杂 的被控对象。温度、溶氧、培养基成分以及产物形成、代谢过程中的气体组分的 变化、细胞浓度形态等均是生化过程的重要参数。以往测定这些参数采用离线分 析，但不能及时反映生化过程的状态，所得结果若作为调节工艺参数的数据已不 准确，又可能因取样操作不完善造成发酵染菌，所以不能频繁取样，这样就不能 连续跟踪其动态变化过程。应用在线测控系统，取样、检测、信号处理、反馈控 制等过程可连续、迅速、准确完成，取样与检测时间间隔只需几分钟，目连续取 样而不影响整个生化过程。所以，利用在线监控可以及时、准确、连续的反映并 控制生化过程的动态变化。生物细胞培养的在线监控更是成为过程分析的研究重 点。在线测控系统已不仅用于监测培养介质组分的变化和代谢产物的生成，而且 郑州大学硕士学位论文 还用于监测整个代谢过程中能量的变化、菌体的生长变化、原料的消耗过程和产 物的合成过程等。 1 32 作物秸秆生物降解转化过程分析 生物工程的过程分析是现在分析科学的个组成部分。作物秸秆降解是一个 比较复杂的生物降解过程，涉及到一系列的化学和生物化学的反应过程，因而作 物降解过程的化学分析和降解过程检测自然也成为从事生物技术和分析工作者所 共同关心的一个课题。对微生物降解作物秸秆过程的分析研究报到的文献不多， 这足以说明我们加强对比项研究的意义。因此，生物过程分析必将和环境分析一 样，成为推动现代分析化学发展的源动力。 为了能对农作物秸秆降解过程中程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进 行定期取样测定或进行连续测量。在农作物秸秆降解的分析方法已有一定的研 究，吉增福等人对秸秆的营养转化做了较详尽的研究分析，发现将纤维素分解菌 用于对玉米秸秆的营养转化，能使低营养水平的秸秆的营养成分得到明显改善。 其中，粗蛋白由5 2 2 提高到2 4 6 2 ，粗脂肪由瓢提高到1 2 5 2 ，成为可替 代1 5 0 0 - 2 0 的混合日粮用于猪饲料。 目前发现少数微生物能同时分解植物聚合物，如自腐真菌，该菌可产生分解 木质素的过氧化酶，因而能分解秸秆中的纤维素和木质素。据报道，白腐真菌糙 皮侧耳发酵切碎的玉米秸秆孓6 周后，不仅能提高蛋白围抬量，且秸秆消化率提 高2 _ 3 倍。张博润等用液体、固体不同培养方式，对异常汉逊酵母、白地霉、康 宁木霉、植物乳酸菌等四种菌进行分别培养然后按- - i ：p 例配成农作物秸秆发酵 剂，对小麦秸秆的发酵研究表明，添加跏发酵剂，室温条件下发酵7 天，发酵 产物的粗蛋白质含量提高倍左右：添加2 0 粕殳酵剂，发酵产物的粗蛋白含量提 高近三倍，发酵产物具有酒香味和弱酸味，适口性好。测等人在选择农作物秸 秆发酵降解微生物菌种方面做了一些有益的探索，他们研究发现双菌或多菌混合 发酵中，酶促作用生成的糖立即被发酵糖的微生物所利用，这样就维持了降解物 的浓度，消除了酶合成作用受到的降解物的阻遏作用，也解除了反应终产物对酶 的反馈抑制。徐坚平等采用固体及液体混合发酵方式，对绿色木霉和产朊假丝酵 母共发酵农作物秸秆生产单细胞蛋白质的条件进行了研究。研究结果表明，在接 种木霉培养9 6 小时后，再接种产脱假丝酵母，混合培养后，培养物中蛋白质含 4 郑州大学硕士学位论文 量提高2 0 - 2 5 0 o ，纤维素转化率达5 1 ，培养物富含多种酶类、氨基酸及维生素 等，从而提高了农作物秸秆的营养价值。 综e 所述，前 、对农作物秸秆的降解过程分析上主要集中在产物分柿扣环 节，而对过程分析以及对农作物秸秆过程的反应研究不多。嘶等人曾努力进 行了秸杆生物降解过程的化学检测，并取得了一定的成果；他们通过f 1 1 r 光谱 分析，对作物残体中纤维素、碳水化合物、蛋白质及木质素等纯物质降解过程进 行了元素跟踪测定。g l 姚眦用固定化毛孢子菌( t f i d f d sp 叫k 函盘) 载体膜与氧 电极耦联构成了测量系统，利用微生物降解作物秸秆过程中些挥发性化合物如 甲醇、甲酸、乙酸、丙酸和微生物的营养钉质糖、氨基酸及些离子均不响应的 性质，测量了反应过程中的乙醇，这是因为微生物电极用透气膜覆盖后只有挥化 性化合物能穿透膜，而同化乙醇的t t x a s s k a e 菌并不同化甲醇。 对微生物降解作物秸秆进行的分析主要是离线曲彰 析检测，其所报结果 绝大多数都是静态的非适时数据，研究建立有效而实用的原位( i 日i t a ) 在体 ( i v i v o ) 、实日寸f i 刚缸妫、在线f m 曲e 讦口高灵敏度、高选择| 生的新型动态分析检测 和无损探测方法检测方法是非常必要的。 1 4 红外光谱发展、仪器状况、特点及应用范围 自1 8 0 0 年英国物理学家w t b r s c h e l 发现i r 区域至今已有近2 0 0 年的历史。 a b n e y 和f e s t i n g 在i r 短波区域才首次记录了有机化合物的近红外光谱 ( i n g r a r e ls p e c t r o s c - o p h g , i r ) ，1 9 0 5 年c o b l e n t x z 发表了1 2 8 种有机和无棚让合 物的红外吸收光谱，1 9 2 8 年l h c k e t 测得第一张高分辨的i r 图，并对有关基团 的光谱特征进行了解释，红外吸收光谱与分子结构之间的特定关系才被确认，并 导致了化合物结构鉴定有效手段红外光谱法的诞生。 1 9 3 0 年前后，光的二象性和量子理论的提出，使得红外光谱的研究有了全面 深入的展开。依据所测得的大量物质的红外光谱，对其吸收谱带( 基频) 的归属 作了归纳和总结，并根据分子振动理论计算了多数简单分子的基频和力常数，进 而又利用基频和转动惯量计算了分子的键长、比热和其他热力学常数，红外光谱 法作为光谱学的一个分支己被光谱学家和化学家所公认。 目前红外光谱的应用范围日趋扩大，红外光谱法的应用已由有机化合物扩展 到络合物、高分子化合物、无机化合物的鉴定和分析上。i r 己成为谷物品质测 s 郑十i l 大学硕士学位论文 定的重要手段，而我国在小麦、菜豆、精米、糙米品质分析中也有应用，在红外 谱图解析方面，已开始应用电子计算圹渐光谱的贮存和检索以及= 进行光谱的自 动解析的探讨，尤其在高分子物质的结构的测定上，更具有独特的“指纹特 征”，成为研究高分子物质的有力手段。近n 年来红外光谱在微生物发酵工程、 作物育种利用及工业生产过程分析方面显示了强大的生命力。 1 4 1 红外光谱技术在生物反应过程中的应用 生物反应过程的特点是组成复杂，有生物活性，且通常气、固、液三态并 存，其组分和含量具有时变陛，同时培养过程需保证密封和无菌。在线检测化学 组分的浓度对了解生物的生长规律和优化生产过程极为重要，但由于生化反应自 身的特点造成在线检测比铰困难，所以在实际过程分析中，多使用操作繁琐、费 时费力的离线化学分析。 参与生物发酵过程的许多物质对缈 线都有一定的吸收能力，且不同物质由 于其官能团的不同其有不同吸收特征。红外线被吸收的数量与吸收介质的浓度有 关，当其通过待测介质后，其强度按指数规律减弱，符合朗伯一比尔律。将光源 的连续谱辐射全部投射至4 被沏擀品上，根据样品吸收辐射能的情况来判定被测成 分的含量，目前在工业连续分析中应用较多。一直以来，原位过程监测中红外光 的传递和商| 生能红外探头的研制是难以解决的问题。近几年来通过研究取得了巨 大的突破，如借助光路系统或光导纤维传递缈 光，利用衰减全反射( a m ) 原 理，采用多次反射复合金刚石、锆等材料制作的红外探头，可适用于包括水溶液 或其他强红外吸收溶剂、固体粉末或红外强吸收的样品，红外，b 荭 样品的光程 恒定，样品只要与全反射晶体材料紧密结合即可。1 9 9 2 年，l a my u 等在线a 讯 探头跟踪了蔗糖水解、大肠杆菌发酵等过程，从蔗糖水解过程的红外谱图的变 化，研青楚的看到蔗糖吸收峰的吸收光度下降，葡萄糖和果糖吸收峰的吸光度增 加，变能判断完全水解所需要的时间，显示出a 1 r 佣职在生物发酵过程中广阔 的应用前景。 1 5 开展本课题研究的意义研究内容简述 我国是个农业大国，作物秸秆的燃值非常低，只有4 2 0 0 卡院，只有甲 烷气的3 2 ，乙醇的5 5 ，因此，直接作为燃料浪费是非常大的，并且也污染环 6 郑州大学硕士学位论文 境。而直接用作饲料，由于木质素、纤维素和半纤维素构成的细胞壁难以被胃液 消化，其消化| 生也不好。我国每年生产出的农作物秸秆达6 亿吨，利用率是非常 低的。如果能将这一丰富资源利用起来，其经济意义和社会效益肯定是非常明显 的。 近些年来，人们利用厌气性菌属的培养不仅可以得到单细胞蛋白( s 凹) ， 而且关于获得酒精、醋酸、甲醇及菌多糖的研究也取得进展。但是在发酵过程的 跟踪分析检测方面还缺乏深入的研究，对于生物发酵过程进行深入系统的研究成 为一个需要分析科学工作者努力解决的问题。 利用先进、实用的分析方法、分析工具对微生物反应过程进行快速分析和 检测，对于农作物秸秆的综合利用是十分必要的。 基于上述研究进展及现状，结合微生物发酵降解农作物秸秆的研究实际需 要，本课题主要涉及以下几个方面的工作： 1 _ 在系列化研究成果的基础匕，选用多种发酵嗷能鞍好的微生物 对农作物秸秆进行降解： 2 考察了缁r 生物降篇铱遗勿；f 舒节据中主要降解因子喜掰票物 质的影响： 3 利用红外光黼叟对农作物秸秆微生物降霸朔呈进行了全程、跟 踪记录；探讨了利用红外光谱作为降解程度的可能性 4 利用全程跟踪记录的红外光谱的变化，结合有关文献资料确定 降解过程中的主要有机物的变化情况： 5 根据主要有机物的变化情况推嘶旅作嘞黠秆降解过程中的有关 转化反应和机理； 郑州i 大学硕士学位论文 第二章玉米秸秆的微生物降解转化研究 在农作物秸秆的降解转化过程中，涉及到众多复杂的化学和生物化学过 程，菌种在这些转化过程起着关键f 生的作用。选择合适的菌种和发酵条件对农作 物秸秆进行降解是非常重要的；本部分工作对新发现的四株菌种和传统的菌种发 酵能力筛选，进行了发酵影响因素的探讨，考察了微生物降解农作物秸秆过程中 主要降解因子氮源物质的影响：探讨了玉米秸秆微生物降解过程化学成分的 变化，选择高活性四种菌株进行玉米秸杆降解研究。 2 1菌株的筛选与培养 2 1 1 实验部分 2 1 1 1 实验材料 作物秸秆为成熟的玉米秸秆。成熟的玉米秸秆，包括叶片和茎秆两部分，取 自河南省农业科学院试验农场( 1 9 9 8 - - 2 0 0 0 年) 微生物菌种农作物秸秆发酵剂( 友人赠送) ，主要成分是用液体、固体不 同培养方式，对异常汉逊酵母、白地霉、康宁木霉、植物乳酸菌、黑曲霉等五种 菌进行分别培养，然后按一定比例配成农作物秸秆发酵剂。 2 1 1 2 实验方法 ( 一) 作物秸秆的处理 把成熟的玉米秸秆按叶片、茎秆和秸秆三个部位分别进行风干，用铡草机 铡成l - 4 c r n 的碎段，然后在2 5 c 温度下鼓风干燥箱中干燥至恒重，最后用粉碎机 粉碎并过a3 f f a n 的筛子备用( 最后一步操作中要十分注意防止供试材料的重新 复水) 。 酶解前，先用球磨机等进行机械的破坏以及电子射线，使高结晶纤维素微 粉化，这是增大纤维素的非结晶程度和反应表面积，提高纤维素酶分解速度和分 郑州大学硕士学位论文 解效率的有效方法。粉碎了的纤维素没有膨张性，因而可以在高浓度的底物中进 行酶反应。 ( 二) 降解菌种的选择和复壮 菌种为植物乳酸菌( 1 5 - 4 9 、0 0 - 5 3 、f f ) - 5 4 、6 6 、0 0 6 8 ，均从河南省农科院 实验农场试验田的土壤样中分离，异常汉逊酵母9 6 4 5 、白地霉9 8 6 5 、黑曲霉 9 5 3 2 、康宁木霉9 7 8 2 ，由友人赠送。 土壤中微生物的分离方法：取2 克自然土加2 0 毫升水混合制成土壤悬液； 取0 1 毫升土壤悬液加49 毫升基础培养液；稀释液每隔1 小时用5 8 。c 2 0 分钟振 荡处理一次，共8 次；共选择出有益土壤分离菌( i 0 4 9 、0 0 - 5 3 、0 0 - 5 4 、0 0 6 6 、0 0 - 6 8 五个菌株。 纤维素基i 出营养液 h 7 2 ) ：k 岛p 0 41 0 克、n 啦- 10 1 克、m 醴0 47 h 2 00 3 克、 n a n o s 2 5 克、f e c l 3 0 0 1 克、c a c l 2 0 1 克、托o1 0 0 0 彰+ 。 三角瓶固体培养基：麸皮2 克、玉米秸秆3 克旺米秸秆用3 0 d , i t ) h 溶液浸泡 勰后用自来水冲洗至中性，8 0 烘干，粉碎过公咖筛) 、营养液1 0 毫升 ( 1 0 m ；、n x 臼s q 、蹦国蒯) 0 。 大试管培养：取纤维素基础营养液1 0 毫升于1 8 1 5 0 毫米试管，将滤纸条 浸入营养液中，包扎灭菌，液面接种供试菌株，2 8 培养1 0 天，观察菌株长 势，滤纸降解程度。 三解瓶培养：称取三解瓶固体培养基1 5 克于2 5 0 毫升三解瓶中，灭菌后接 6 珊量接种，2 8 培养6 天，测定酶活。 酶液制备：培养6 天固体，加1 0 0 毫升水，4 0 恒温水浴保温4 5 分钟，后 用定陛滤纸过滤，滤液用3 0 0 0 转侄惭离心5 分钟，e 清液就是酶液。 0 舡酶活力测定：取酶液o 旨1 1 1 ，适当稀释，加入2 毫升0 1 3 钠盐，在4 0 水浴中反应3 0 分钟后加入35 一二硝基水扬酸2 5 毫升终止反应，煮沸5 分钟， 冷却至室温，测定。值，酶活单位定义为在e 述反应条件下，1 克纤维素酶由 在1 分钟酶解1 微克葡萄糖，称作个纤维素活力单位。 微生物菌种的复壮：取该菌种一环，接入新鲜培养基斜面内，置2 8 培养 1 8 - 2 0 小时后，制成l5 l ( y 个细胞n d 的菌悬液。 郑州大学硕士学位论文 培养基和培养条件：每升培养基组分为j u n s h e k c r 等所述a 液的组分，其氮 源则以q 鹋克尿素代替。 培养基用p a l lu t i p o r 活动式过滤装置过滤灭菌，用有效体积为4 升的生化 反应器作连续培养，搅拌、通气和稀释速率分别为6 0 0 r mn5 v m 和0 0 9 小时或 n 1 8 小时。 在2 0 捌的三角烧瓶、大气氧、静止赫的矧牛揪熟孟惭的分解 情况。按瞄k 等人所述方法充气，直接从衡化器中取菌丝体0 4 6 咖作种子用。粉 碎的玉米秸秆用乙醚灭菌，加入灭菌k o h ( 0 2 m ) 中，将此玉米秸秆料液6 a n l 分 装入三个三角烧瓶中t a r a ) ，并使影冬浓度为1 窖l 。用 啪 将培养基的州调到 4 5 。培养物不需再进行缓冲。烧瓶配有橡皮塞和带棉花塞的玻璃管来充分。每 天用过滤灭菌的纯氧充气3 次，在3 8 - 3 9 。c 下进行微生物发酵剂的培养和玉米秸 秆的降解。 2 2 实验结果与讨论 2 2 1 菌株产酶能力比较 对不同来源的1 0 株菌进行液体试管培养，观察其生长睛况及降解隋况。 结果见表l ，嘶6 、8 ，绿色木霉9 7 8 2 和黑曲霉9 5 3 2 不仅降解滤纸能力强于 其它菌株，而且生长隋况也好于其它菌株，说明这4 株菌分解利用纤维素的能力 较高，【困此选择o o - 6 6 、8 绿色木霉9 8 7 2 和黑曲霉9 5 3 2 进一步培养并且测定 其酶活。测定结果如表2 - 1 、拢所示。 表2 - 1 菌株产酶能力比较 菌种代号 长势隋况降孵f 青况菌种代号长势隋况降解情况 ( ) 0 - 4 9 + + 4 9 6 4 5 + 0 0 蜀 + + $9 5 3 2 h 料 0 0 _ 5 4 + _ 6 5 + o o - 6 6 h +粹僦卅擀 瑚卅 料 帐势弱；+ 怅势中等+ h 长势强；降解豫* 降解中等一降解强 1 0 郑州大学硕士学位论文 表2 - 2 各种菌株降解活力 菌株代码 町8 29 5 3 20 0 - 6 80 0 6 4 菌株酶活( 1 0 0 0 1 1g g m i n ) 7 g 6 84 0 27 为了准确反映上述4 株菌降解秸秆的能力，将其接种到玉米秸秆进行固体发 酵钡啶酶活。由图2 - 1 可见，霉菌酶活明显高于放线菌( 2 0 0 12 a ：) ，植物乳酸 菌降解玉米秸秆能力低，因此，该研究仅用霉菌9 5 3 2 、9 7 8 2 迸一步做降解玉米 秸秆的条带式验。 表2 - 3p h 对菌株活性的影响 p h 245678 9 7 8 23 8323 33 43 5o 7 菌株酶活( 1 0 0 0 9 9 g r a i n ) 9 5 3 20 71 2l _ 73 0l 6n7 图2 - l 各种菌株降解活力的影响 郑州大学硕士学位论文 4 5 4 3 5 i 3 粤z 5 ：2 l5 】 0 5 0 图2 2p h 对菌株衙| 生的影响 将固体曲p h 调 至所需酸度唧讲4 5 、 5 0 、5 5 、6 0 、孤呶老彳亍 制曲试验，试验结果 ( 图2 2 ) 表明，9 7 8 2 、 9 5 3 2 产生纤维素酶的虽 适p h 5 5 6 0 。即酶解 玉米秸秆的适宜州为 5 5 - - - 6 0 ，p h 过高、过 低都不利于玉米秸秆纤 维素的彻底降解。 2 2 3 温度对酶活的影响 不同温度下( 2 8 、3 5 、4 2 ) 固体曲培养 式验如图2 - 3 所示，结果表明， 9 5 3 2 、9 7 8 2 产酶温尉圃芋为4 2 。c 3 5 。c 2 8 。c ，因此，降解玉米秸秆的最i 置温度 为4 2 。 表2 4 温度对菌株活性的影响 温度( ) 2 8 3 5 4 2 菌株酶活( 1 0 0 0ug g r a i n ) 9 7 8 2o 5 3 15 2 9 5 3 2o 92 532 2 2 4 产酶高峰期比铰 在不同培养时间对9 7 8 2 、9 5 3 2 的固体曲进行酶活测定，结果如图4 所示，表明随 培养时间的延长，9 7 8 2 纤维素酶升值较决，第4 天酶活达6 l 啁屺信n n ，而 郑强大学硬圭擎位论文 图2 3 漫度对予蕊撩活缝匏影姨 9 5 3 2 纤维素酶升盥蹬隘，第6 天仅为4 4 1 创函僖m i n 。糊此，从降解遵度和酶 活高低两方鳓均说明l a 解- i 米秸秆最优麓株为绿色木霉9 7 8 2 ，黑曲霉9 5 3 2 次 之。 表5 时间对产酶离峰期的影晌 时间( 天) 234567 l 菌p 隧活( 1 。“如越n ) 孵8 2o 52 93 ，3 重o1 72 0 9 5 3 2n5o 81 82o2 5 2 6 图z 4 产酶高峰期比较 1 3 郑州大学硕士学位论文 2 3 玉米秸杆降解过程研究 2 3 。1 实验部分 实验材料 实验中的玉晰同薷。节，实验中的菌种按照第# 中的方溺趟弱特和 复鞋。 玉米秸秆的预处理 把成熟的玉米秸秆按叶片、茎秆和秸 于三个部位分别进行风干，用铡草积铡 戒l - 电e 斡礤浚，然螽在露溢凌下鼓晟： 燃中子：凝娶囊重，最轰焉粉簿馥粉 碎并过o 3 0 h n 的筛子备用( 最后一步操作中要十分注意防止供试材料的重新复 水) 。 酶解簸，先蠲黥褰撬镣迸 亍枧槭豹破塔以及电子射线，使高结晶纾维豢微 耢纯，这是爝大纤维素的嚣结晶程度和反藏表面积，提离纤维素酶分解遴凄和分 解效率的有效方法。粉碎了的纤维素没有膨张| 生，因而可以在高浓度的械物中进 行酶反应。 实验方法 将烘干至恒重并被粉碎了的玉米秸秆分为加尿素处理和不加尿素处理，然后 分别称取1 5 睨放入3 0 ( k n l 的广口玻璃瓶中。抽尿素态n 的处理的c n 比在2 0 i 。在培养簇中 二2 8 圭2 豹淤窿下珞养? 天。每拿楚瑾设五次重复。每个耋复魏 误差不能超避鼢，e 述五次重复中的两次用于干物质损失量和二氧化碳生成量 的测定。在培养开始时，撵个处理加入复壮微生物菌种液2 0 毫升，并搅拌均 匀。然后女r 入是量静灭蓥泰绽粉碎玉米稳翳自徽这至l 毁六持墩量的话熟 在开始培养的第天内，每8 个小时甩灭麓求调整一次凝度，以看受晦2 唾个小 时调整一次浓度，自培养开始每隔2 4 个小时取次培养样品，在取样时尽量在 灭菌状态下，以免其他杂麓污染丽影响实验结果的准确性，取出的培养样品应立 l 弱真空子潦至选重噬蚕震予多渐蒺l 定。 2 2 结果岛讨论 1 4 郑州大学硕士学位论文 2 2 1 降解前玉米秸秆化学组成分析 采用g e 嘧罂和v a ns o e s t 的方法对供试玉米秸秆的组成进行分析。元素组成 测定用意大利产的m o d 1 1 0 6 型元素分析仪。灰分的测定采用干灰化法( 5 5 0 ，2 h ) 。干物质损失量及生成水的测定用差减法，c 0 2 生成量的测定采用碱 吸收法。 由化学成分的分析可知，供试玉米秸秆的主要成分为纤维素、半纤维素、木 质素、灰分物质及一些中性洗涤剂溶解物。中性洗涤剂溶解物主要为脂肪、蜡 质、淀粉、糖和蛋白质等所测三个组分中各成分的含量列于表加，与文献报道 的结果基本一致。 2 2 2 降解后玉米秸秆化学组成分析 对于玉米秸杆按照匕述的方法在不同条件下进行了降解，测定了不同秸杆部 表2 _ 6 玉米秸秆的化学组成( g k g ) 位在有尿素和不添加尿素两种情况下的主要物质含量测定结果如表2 3 所示表 明了三个组成发酵降解前后的干物质及灰分含量的变化情况。 表2 _ 7 玉米秸秆各组分降解前后灰分和干物质的变化( ) 1 5 郑州大学硕士学位论文 2 2 3 尿素加入对降解结果的影响 对损失的物质化学分析表明，其中大部分生成和h 2 0 。由表2 - 7 中数据 可见，三个组分在发酵降解过程中干物质的损失量不尽相同，对于加尿素处理， 叶片和茎秆的干物质损失量相近，但不加尿素处理，茎秆发酵降解过程的损失量 显著高于叶片。 而二者的混合物即秸秆发酵降解过程中的干物质损失量则大大低于二者单 独发酵降解的损失量。这说明玉米植株的不同器官残体混合发酵降解能提高其转 化系数，其原因可能是由于不同器官残体所含化学成分不同，在一起发酵降解 后，更有利于其中间产物的聚合，其原因可能是，防止了他们进一步氧化生成 和 b 0 而损失掉。 通过对比加入尿素和不加尿素的降解实验分析结果，可以发现尿素的加入 使干物质的损失量大大增加，这表明，尿素的加入促进了有机体的分解过程。 1 6 郑州大学硕士学位论文 第三章玉米秸秆生产蛋白质饲料的应用研究 绿色植物占地球陆地生物的9 5 ，其化学组成主要是纤维素、半纤维素和 木质素，它们占随物干重的比率分别为4 5 、2 0 和1 5 2 0 。农作物秸秆是 这类生物质资源的重要组成部分。据统计，我国年产农作物秸秆约6 亿吨。因此， 加强对农作物秸秆生产蛋白质饲料的应用研究，能缓解蛋白质资源紧缺，并可开 辟饲料、发酵工业原料、人类食品的新来源，同时还可以处理废物，消除公害， 保护环境等。 1 实验部分 1 1 原料 1 1 1 菌株绿懈菌( t r i c h o d e r r mv i r i d e ) 菌睐_ 堋a 和g m 9 8 2 3 。 其中g m 6 a 购自中科院微生物研究所，c 珈9 8 2 3 由作者自g m 6 a 诱变所获。 1 1 2 原料成熟的玉米秸秆取自河南省农科院实验农场。要求贮存期间无 霉变( 成分见表3 - 1 ) ，剪切后经植物微型粉碎机粉碎为3 5 目试样，贮存备用。 表3 - 1 原料成分 1 1 3 培养基供试培养基为2 9 6 草粉察氏培养基、发酵培养基( 玉米秸秆加1 玉米粉，o 2 5 v ，z 4 n h g s o , ，0 2 k h 尹0 4 ，7 5 水) 。其中2 草粉察 氏培养基用于菌株的活化，发酵培养基用于菌株的扩培。 1 7 郑州大学硕士学位论文 1 2 方法 1 2 1 工艺流程原料一粉碎一配料一接种一产品 1 ，2 2 测定项目及方法 原料组成分析按饲料工业国家标准：粗纤维的测定采 用d n s 法：粗蛋白质的测定采用凯氏定氮法；粗脂肪的测定采用索氏提取法。 2 结果与分析 2 1 菌株筛选 g m 6 a 年l l 诱变后的g m 9 8 2 3 经扩大培养后分别接种在删上，其结果如表 3 - 2 所示。 表3 - 2 菌株g 1 6 a 和g m 9 8 2 3 发酵饲料主要成分比较 由表3 - 2 可知，诱变菌株g m 9 8 2 3 所获饲料中粗蛋白含量为2 8 d ，明显高 于菌株g m 6 a 的含量( 1 2 呦：粗纤维含量为1 3 6 ( g m 9 8 2 3 ) 又明显低于g m 6 a 所获饲料的粗纤维含量( 2 23 ) 。 2 2 接种量的确定 作物秸秆生产单细胞蛋白饲料时，产品的粗蛋白及粗纤维含量与原料中加入 的菌种量有很大的关系。表3 - 3 列出了不同接种量对产品成分的影响。 表3 3 不同接种量对饲料成分的影响 项目1 丁、 警1 而 粗纤维含量 1 8 91 8 21 6 41 3 81 3 61 3 01 251 0 6 粗蛋白含黝1 9 8 2 0 32 3 62 5 02 8 02 8 22 8 42 9 0 , y a t 槲干中的粗纤维含量较高，经绿色木霉菌所分解的纤维素酶分解，降低 了玉米秸秆中的粗纤维含量。从表3 - 3 可以看出，不同的接种量得到不同的粗纤 郑州大学硕士学位论文 维和粗蛋白的含量，从高粗蛋白、低粗纤维含量以及饲料成本n 方面来考虑，接 种量以1 2 为好。 2 3 加水量的确定 水分的控制在饲料发酵过程中是很重要的，若原料过干，则绿色木霉菌生 长缓慢，得到的产品干枯，无酸香味：若原料过湿，则造向蕴气困难，易使原料 腐败变质。采用不同的加水量进行发酵实验，其结果见表3 _ 4 。 由表3 4 可以看出，7 5 的自水量赦果好，其产品外观质量好，且雍瑷白含 量高，粗纤维含量低。 表3 4 加水量对饲料外观及营养成分的影响 项目1 百? 势飞_ _ 一 2 4 温度的影响和发酵时间的确定 2 4 1 温度的确定 温度是影响有机体存活和生长的重要因素之一。它对生物机体的影响，主要 表现在两个方面：一方面随温度t 升，细胞中的生物化学反应速率和生长速度加 快；另一方面机体的重要组分，如蛋白质、核酸等对温度都铰敏感，若温度升高， 它们可能受到不可j 萱的破坏。因此只有在定的温度范围内，柳体代谢括动与生 长繁殖才能随温度的上升而增加，当温度t 升到一定程度，开始对机体产生不利 影响。 表3 - 5 温度对蛋白质得率的影响 温度( ) 2 0 3 14 0 4 5 蛋白质含量( ) c , 8 2 31 32 5 2 0 1 4 l 漱1 32 。1 71 4 郑州大学硕士学位论文 如果温度继续升高，则细胞功 能急剧下降或死亡。通过发酵 试验可知发酵温度在2 9 3 1 范围内时，饲料蛋白质含 量较高，温度偏高( 4 5 以 上) 、偏低( 2 0 以下) 都不 利于绿色木霉菌的繁殖和生长 ( 见图3 _ 1 ) 。 2 4 2 发酵时间的确定 微生物群体生长随着时间的延长，呈现有规律的变化。根据其生长速率的不 同，而将菌体生长划分为4 个时间，在匣定期( 亦称稳定期) 或最高生长期，菌 量最多，此时粗蛋白 含量最高。从图3 - 2 可见，本试验条件 下，蛋白质含量在发 酵1 5 天左右出现高 峰。 3 结论 1 ) 试验结