（固体力学专业论文）基于光学读出的微悬臂梁生化传感技术研究.pdf

摘要 摘要 微悬臂梁生化传感技术是近年发展起来的新兴技术。当有生化反应在微悬臂 梁的单侧表面发生时，其表面应力的改变会导致微悬臂梁产生弯曲变形，通过光 学或电学读出方法可以测量变形值。由于其具有大比表面积，表面效应强，容易 实现阵列集成等优点，为生化传感器的研究提供了新的思路，成为研究的热点。 本文以微悬臂梁生化传感技术发展的两大核心提高检测灵敏度和高通 量检测为出发点，对基于光杠杆原理的单悬臂梁检测系统进行改进，利用改进后 的实验系统研究了大分子在界面的自组装过程以及在不同的抗体修饰方法下，抗 原抗体的特异性结合，并提出了两种微悬臂梁阵列检测的方案。 通过使用聚焦处半径较小的激光器，稳定激光器的输出强度，使实验系统的 可重复性得到提高。通过实验和理论分析，在反射光路中加入凸透镜以及优化微 悬臂梁尺寸，可以使系统检测灵敏度分别提高4 倍和2 0 倍。通过使用高精度的恒 温器( 温控精度士o 0 1 k ) ，消除了微悬臂梁的热变形影响，同时使本底噪音保持 在合理的范围，而且确保样品温度和容器池的温差不会对系统检测造成影响，提 高了系统的信噪比。通过对传统光路参数的理论分析，得到在特定的光路参数下， 可以完全消除溶液折射率改变对系统检测的影响，而且不改变系统的检测灵敏 度。理论分析得到实验结果的验证。利用溶液折射率变化对系统检测的影响，提 出了一种通过检测液体折射率来检测液体浓度的方案。 研究了不同分子量的巯基化的聚n 异丙基丙烯酰胺( h s p n i p a m ) 在金表面 自组装的动力学过程。实验结果表明h s p n i p a m 在自组装过程中存在三个阶段， 分别对应不同的分子构象。第一阶段为物理吸附阶段，第二、三阶段为伴随着分 子构象变化的化学吸附阶段。化学吸附曲线符合l a n g m u i r 等温吸附。分析结果 还显示h s p n i p a m 的表面吸附速率k 远小于小分子的吸附速率，并与分子量成 负指数关系；h s p n i 州的自组装时间远大于小分子的自组装时间，并与分子 量成正比：底物表面应力的改变与分子量成正线性关系。 研究了在三种抗体修饰方法下，抗原抗体的特异性结合。将抗体修饰在微悬 臂梁的金面，检测不同浓度的标准样品下微悬臂梁的弯曲变形，包括抗体巯基化 修饰方法检测瘦肉精、s p a 修饰抗体的方法检测瘦肉精和氯霉素以及二抗修饰抗 体的方法检测青蒿素和马兜铃酸。抗体的活性以及在微悬臂梁上进行抗原抗体结 合的可行性得到了e l i s a 实验的验证。实验结果表明：抗原抗体的结合具有很 强的选择性。结合产生了压应力，且与浓度成正比。二抗修饰方法是三种方法中 效果最差的，检测极限比标准曲线对应的i c 2 0 低于两个数量级。s p a 修饰方法与 摘要 巯基化修饰方法的检测效果大体一致，检测极限都要优于l n g m l ，与标准曲线对 应的i c 2 0 相当。分析认为，检测极限与抗体活性和抗原抗体结合位置到微悬臂梁 表面的距离有宣接的关系。 提出了两种检测微悬臂梁阵列变形的光路方案。第一，在u cb e r k c l e y 的光 路基础之上进行改进，将偏振光引入检测系统，通过对光束偏振态的控制，降低 了测量信号的背景噪声，提高了系统信噪比；通过对微悬臂梁的优化设计( 初始 转角和反光板) ，提高光学检测灵敏度。第二，将光学滤波方法引入到生化检测 当中。 关键词：微悬臂梁传感，自组装，聚n 异丙基丙烯酰胺，抗原抗体，瘦肉精， 氯霉素，青蒿素，马兜铃酸 a b s 仃a c t a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，a san e wt e c h n o l o g y ，m i c r o c a n t i l e v e rb i o c h e m i c a ls e n s i n g t e c h n i q u e ( m c s ) i sd e v e l o p i n gq u i c k i y w h e ns p e c i f i c b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n s 0 c c u r0 n0 n es u r f a c e0 fm i c r o c a n t i i e v e r ，ad i f f e r e n t i a ls t r e s sb e t w e e nt h et o pa n d b o t t o ms u r f a c e so ft h ec a n t j j e v e rw i l lc a u s et h e 脚i c f o c a n t i l e v e rb e n d j n g t h e d e n e c t i o nc a nb em e a s u r e db yb o t ho p t i c a ia n de l e c t “c a lr e a d o u tm e t h o d s i th a s b r o u g h ts o m en e wi d e a sf o r b i o c h e m i c a ls e n s i n gt e c h n i q u ea n db e c o m e s ah o t s p o to f r e s e a r c hb e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e s ，s u c ha si a r g es u r f | a c e - a r e a t o v 0 1 u m er a t i o ，v e 9 s e n s i t i v et os u i - f a c ee f ! e e c t ，e a s yt or e 甜i z ea r r a yc o m p a c t i nt h i s p a p e r ，t 、o c o r eo fd e v e l o p m e n to fm c s i m p r o v i n gd e t e c t i n g s e n s i t i v i 够2 l r l dh i g h - t h r o u 曲p u td e t e c t i o nw e r et a k e na st h es t a f t i n gp o i n t f i r s t ，a s i n g l ec a n t j l e v e rd e t e c t i o ns y s t e mb a s e do no p t i c a l l e v e rt e c h n i q u ew a si m p r o v e d s e c o n d ，t h ei m p r o v e de x p e r i m e n t a ls y s t e mw a su s e dt 0s t u d ys e l f a s s e m b i yo f m a c r o m o l e c u i e so ng o l ds u r f a c ea n dt h es p e c i f i c i t ) ，o fa n t 培e n - a n t i b o d yb i n d i n gi nt h e d i f f c r e n ta n t i b o d y m o d i 6 e dm e t h o d s f i n a l l y ，t w or e a d o u t m e t h o d sb a s e do n m i c r o c a n t j l e v e ra r r a yw e r ep r o p o s e d t h ed e t e c t i n gr e p r o d u c i b i l 毋o fs y s t e mc a nb ei m p r o v e db y 啪yo fu s i n gt h e l a s e rw i t ht h es m a l l e rf o c u sr a d i u sa n ds t e a d yo u t p u ti n t e n s i t ) ，t h r o u g he x p e r i m e n t s a n dt h e o r e t i c a la n a l y s i s ，b ya d d i n gc o n v e xi e n si nt h ep a t ho fr e n e c t e d “g h ta n d o p t i m i z i n gt h ed i m e n s i o np a u r a m e t e r so fm i c r o c a n t i l e v e r ，t h ed e t e c t i n gs e n s i t i v i t ) ，o f s y s t e mc a n b ei m p r o v e d4a n d2 0t i m e s ，s e p a r a t e l y t h r o u 曲t h eu s eo f h i g h - p r e c i s i o n t h e r m o s t a t ，t h et h e f m a ld e f o f m a t i o n0 fm i c r o c a n t i l e v e fc a nb ee l i m i n a t e d ，w h i l et h e b a c k g r o u n dn o i s ei sk e p tw i t h i nr e a s o n a b l es c o p e ，a n dt h et e m p e r a t l 衄ed i 疗e r e n c e b e “ ，e e nt h es a m p l ea n dt h ec e l lw i i ln o ti m p a c to nt h es y s t e md e t e c t i o n t h e t h e o r e t i c a la n a l y s i ss h o w e dt h a tb yc o n d i t i o n i n gt h ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r ，t h e i n n u e n c eo fr e f r a c t i v ei n d e xc h a n g eo nt h ed e t e c t i o ns i g n a lc a nb ee f f e c t i v e i y e l i m i n a t e dw i t h o u tr e d u c i n gt h ed e t e c t i n gs e n s i t i v i 够o ft h es y s t e m t h et h e o r e t i c a l r e s u l t sw e r ev a l i d a t e db yt h ee x p e r i m e n t s b a s e d0 nt h i s ，am e t h o do fd e t e c t i n gl i q u i d c o n c e n t r a t i o nb yd e t e c t i n gt h er e f r a c t i v ei n d e xo fl i q u i dw a sp r o p o s e d t h es e i f a s s e m b i yo fd i 虢r e n tm o l e c u l a rw e 唔h to fp o i y ( n i s o p r o p y i a c 巧i 锄i d e ) ( h s p n i p a m ) o ng o l ds u r f a c e 、v a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o 、v e dt h a tt h ek i n e t i c c u r v e sc a nb ed i v i d e di n t ot h r e es t a g e sc o r r e s p o n d i n gt od i 丘e r e n tc o n f o r m a t i o n s ， r e s p e c t i v e l y t h ef i r s ts t a g er e s p o n d e dt op h y s i c a la d s o r p t i o no fh s - p 全n p a mt 0 a b s t r a c t g o l d c o a t e ds i d e t h e s e c o n da n dt h i r d s t a g e s w e r er e s p o n s i b l ef o rc h e m i c a l a d s o r p t i o nt og o l d - c o a t e ds i d ew c o n f o r n l a t i o nt r 彻s i t i o n t h ek i n e t i cc u r v e sf i t s l a n g m u i ra d s o 巾t i o ni s o t h e r mw e l l t h er e s u l t sa l s os h o wt h a tt h er e a c t i o nr a t e ko f h s f i n i p a mi sf a rl e s st h a nt h a to fs m a j lm o l e c u i e sa n dd e c r e a s e se x p o n e n t i a l l yw i t l l t h em o l e c u l a r 、e i g h t ；w h i l et h et i m eo fh s p n i p a m ss e i f - a s s e m b l yi sf a rm o r ct h 矾 t h a to fs m a l lm o l e c u l e sa n dp r o p o r t i o n a l t ot h em o l e c u l a rw e i g h t 。t h ec h a n g eo ft h e s u r f a c es t r e s si sl i n e a rt ot h em o l e c u l a rw e i g h to fh s p n i p a m t h es p e c i f i c i 妙o fa n t i g e n - a n t i b o d yb i n d i n gi nt h r e ed i f 佗r e n ta n t i b o d y m o d i n e d m e m o d sw a si n v e s t i g a t c d a n t i b o d yw a si m m o b i l i z e do nt h eg o l d c o a t e ds i d eo ft h e m i c r o c a n t i l e v e ra n dm ed e n e c t i o n so ft h em i c r o c a n t i l e v e rc o r r e s p o n d i n gt 0t 1 1 e p r o c e s so fi n j e c t i n gd i f l f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fa n t i g e n 、v e r er e a l - t i m em o n i t o r e d ， i n c i u d i n gt h ec l e n b u t e r o lw a sd e t e c t e di nt h em o d i f i e dm e t h o do fm i o l a t e da n t i b o d y ， t h ec l e n b u t e r o la n dc h l o r a n l p h e n i c o lw e r ed e t e c t e di nt h em o d i n e dm e m o do f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sp r o t e i na ( s p a ) ，t h ea r t e m i s i n i na n da r i s t o l o c h i ca c i dw e r e d c t e c t e di nt h em o d i f i e dm e t h o do fs e c o n d 枷b o d y ( g o a ta n t i - m o u s ei g g ) t h e a c t i v i 够o fa n t i b o d ya n da n t i g e n a n t i b o d yb i n d i n go nt h eg o k i c o a t e ds i d eo fm e m i c r o c 锄t i l e v e rw e r ec o n n r m e db ya ne n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) t h er e s u j t ss h o w e d t h a ta n t j g e n a n t i b o d yb i n d i n go nm i c r o c a n t i i e v e r g e n e r a t e sac o m p r e s s i v es u 渤c es 仃e s sa n dt h es u m c es 骶s si sl i n e a rt ol o g a r i t h mo f c o n c e n t r a t i o n t h ed e t e c t i n gs e n s i t i v i t yi nt h em o d i f i e dm e t h o do fs e c o n da n t i b o d yi s t h ew o r s ti nt h r e em e t h o d sa n dt h ed e t e c t i n gl i m i ti st w oo r d e r so fm a g n i t u d el o w e r t h a ni c 2 0 t h ed e t e c t i n gs e n s i t i v i 妙i nt h em o d i 丘e dm e t h o do fs p aa n dt h i o l a t c d a n t i b o d yi st h es a m e t h ed e t e c t i n gs e n s i t i v i 妙i nb o t hm o d i n e dm e t h o d sc a n r c a c ha t l e a s tln g m la n da r ee q u i v a i e n tw i t hi c 2 0 b ya i l a l y s i s ，t h ed e t e c t i n gs e n s i t i v 时i s d i r e c t l yr c l a t e dt ot h ea c t i v 时o fa n t i b o d ya n dt h ed i s t a n c ef r o mt h ep o s i t i o nw h e r e a n t i g e n - a n t i b o d yb i n d i n gt og o i d c o a t e ds i d e t w or e a d o u tm e t h o d sb a s e do nm i c r o c a n t i l e v e ra r r a yw e r cp r o p o s e d f i r s t ，t 1 1 e 0 p t i c a lp a t ho fu cb e r k e l e yw a si m p r 0 v e d t h es i g n a j - t 0 - n o i s er a t i oo fs y s t e m 嗽s i n c r e a s e db yc o n t r o l l i n gp o l a r i z a t i o no ft h el a s e r t h eo p t i c a ld e t e c t i o ns e n s i t i v i t yc a n b ei n c r e a s e db yo p t i m a ld e s i g no fm i c r o c a n m e v e r s e c o n d ，叩t i c a lf i l t c rr e a d o u t t e c h n i q u ew a si n t r o d u c e dt 0m c s k e yw o r d s ：m i c r o c a n t i l e v e rs e n s i n g ，s e l 仁a s s e m b l y ，p o l y ( n i s o p r o p y l a c 可l 锄i d e ) ， a n t i g e n - a n t i b o d y ，c l e n b u t e r o l ，c h l o r a m p h e n i c o l ，a r t e m i s i n i n ，a r i s t o l o c h i ca c i d 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名：薹斗 签字日期：2 卫丛二! l 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人 提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 磁开口保密( 年) 作者签名：盔：鲨l导师签名：蝉 盘字同期：! 旱： ! ! ：! j 签字日期：q5 ：翌厶：里l 第章绪论 1 1 引言 第一章绪论 传感器是获取信息的工具。传感技术是关于传感器设计、制造及应用的综合 技术。传感技术的研究一直是人类所关注的焦点领域之一。在人类进入信息时代 后的今天，它更是占有着相当重要的地位【1 】。 产业革命以来，发明了各种各样的机器用来代替入力劳动，人类的生产活动 逐步进入工业社会时代。人们为了改善机器性能和提高机器的自动化程度，需要 实时地测量反映机器工作状态的信息，并利用这些信息去控制机器，使之处于最 佳工作状态。为了便于测量和控制，传感器就应运而生了，它能将各种被测控量 ( 信息) 检出并转化称便于传输、处理、记录、显示和控制的可用信号( 一般为 电信号) 。传感器一般由敏感元件，转换元件，基本转换电路三部分组成( 图 1 1 【2 】) 。 ( 1 )敏感元件：也称为识别元件，它是直接感受被测量，并输出与被测量成确 定关系的某一物理量的元件。 ( 2 )转换元件：敏感元件的输出就是它的输入，它把输入转换成电路参数。 ( 3 )基本转换电路：将上述电路参数接入转换电路，便可转换成电量输出。 敏感转换基本转 元件 - - _ 元件 换电路 图1 1传感器组成框图 随着测量、控制和自动化技术等现代科学技术的迅速发展，极大的推动了信 息技术的进步。2 1 世纪人类社会进入了信息时代，信息技术必将产生新的革命， 科学技术必将得到更大的发展。现代信息技术的三大基础是信息的拾取、信息的 传输和信息的处理，及传感技术、通讯技术和计算机技术，它们构成了信息技术 系统的“感官”、“神经”和“大脑”。而传感技术位于信息技术之首，是信息技 术之源，是获取信息的前端基础。由于科学技术、经济发展及生态平衡的需要， 传感技术在各个领域的作用日益显著，它不仅代表人的五官功能，而且还能检测 到人的五官所不能感受的各种参数。因此可以这样说，没有传感技术，就没有现 代信息技术。如果传感技术不发达，即使通讯技术和计算机技术再发达，也只能 第一章绪论 是一个头脑聪明、感官不灵敏的“残疾人”。所以，国内外都将传感器列为高技 术。 目前，传感器技术己广泛应用于各个学科领域，如现代工农业生产、交通运 输、航空航天技术、军事工程、资源探测、海洋开发、环境监控、安全保护、医 疗诊断、生物工程、家用电器等，而且传感器的应用促进了上述各个领域的发展。 例如：“阿波罗1 0 ”的运载火箭部分共有2 0 7 7 个传感器，宇宙飞船部分共有各 种传感器1 2 1 8 个，保证了宇宙飞船的精密测控。因此，从茫茫太空到浩瀚海洋， 从各种复杂工程系统到日常生活的衣食住行，几乎每一个领域都离不开各种各样 的传感器。可以毫不夸张地说，2 l 世纪的社会，将是充满传感器的世界 3 。 当然，由于现代科学技术的发展也促进了传感器与传感器技术的发展。特别 是微电子加工技术、微计算机技术、信息处理技术、材料科学与技术的发展，使 传感器技术得到飞速发展，传感器的体积越来越小，精度越来越高，数字化、多 功能化、智能化、集成化等已成趋势 1 。 1 2 生物化学传感技术概述 生物化学传感技术是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多学科相 互渗透成长起来的高新技术，在生物医学，环境监测，食品，医药及军事等领域 都有着重要的应用价值。2 1 世纪是生命科学的时代，生物化学传感技术的重要 性尤为突出，是人们研究的热门领域之一。 化学传感器和生物传感器的关系是很密切的。实际上，很多传感器既可以看 作是化学传感器也可以看作是生物传感器。人们通常把生物传感器和化学传感器 合在一起统称之为生化传感器。给它们一个统一的定义就是：能感应( 或响应) 生物、化学量，并按一定规律将其转换成可用信号( 包括电信号、光信号等) 输出 的器件或装置。生化传感器有两个组成部分，其一是生化分子识别元件( 即敏感 元件) ，由对生化分子具有特异性识别能力的敏感材料( 如由电活性物质、半导体 材料等构成的化学敏感膜和由酶、微生物、d n a 等形成的生物敏感膜) 组成； 其二是信号转换器( 即转换元件) ，主要是由电化学或光学检测元件( 如电流，电 位测量电极，离子敏场效应晶体管，压电晶体等) 。下面，对两种传感器分别予 以介绍。 1 。2 。1 化学传感器 化学传感器的工作原理如图1 2 所示 4 】。特异性的敏感层吸附特定的待感知 分子后，转换元件将这一信息转化为外界的接收信号传输出来，从而实现传感。 按照转换的方式，可以把它们分为不同的类型( 图1 f 3 ) ： 第章绪论 光学方式 庙谱方式 声学方式 冒12 化学传感器的工作原理示意囤图1 3 化学传感器的小同类型 1211 光学检测方式 光学检测方式的传感，是通过检测敏感层与待分析物发生相互作用时伴随的 光学信号( 比如，吸光率，荧光，偏振态折射率，反射率和散射系数等) 变化 米实现传感的 5 】。荧光( f 1 u o r e s c e n c e ) 检测方法是一种最为常见的光学检测方 式，待分析物质与荧光物质结合时，影响了荧光基团周围的局部环境。这种局部 环境的改变导致它们所发射的荧光光谱发生变化，监测发射光谱的这种变化即可 实现传感【6 】。表面等离子体共振( s u 而c ep l a s m o nn s o n a 眦e ，s p r ) 是另一种 常见的光学检铡方式，当样品媒介与电介质接触并发生吸附或化学反应时，电介 质的折射率会发生相应的变化，由此导致共振吸收角的改变，通过检测这一角度 改变既可实现伟感，工作原理如图j4 所示【7 k 幢匹 ：巴互 图1 4表面等高子悻共振( s p r ) 的传感原理 l212 声学检测方式( c o u s t l c 抛v es e n s o r s ， w s ) 声学检测化学传感器的原理【8 】在于：当有化学反应在传感器的表面发生( 或 者是分析物吸附到侍感器的表面。有些情况下，分子也可能扩散到表面以下) 时， 引起传感器的声学性质发生变化，测量这种变化即可实现传感。这些传感器都包 括一个表面经过修饰的压电基底，压电基底负责将电能转化为机械振动渡，而修 饰在它表面的敏感层则负责与分析物的结合。扶基底的机械振动模式上来看，可 以把它们分为横向剪切模式( t r a n s v e r s es h e a r m o d e ，t s m ) 和表面波模式( s u r 缸e 蝴十一 l 一 一 第一章绪论 a c o u s t i cw a v e ，s a w ) 两种类型。t s m 的代表就是石英晶体微天平( q u a n zc 珂s t a l m i c r o b a l a n c e ，q c m ) ，如图1 5 所示，当有分子吸附到基底表面的敏感层上时， 由于有效质量的增加，基底的共振频率会发生改变，检测这种变化就可实现传感 【9 】。表面波也称为瑞利波，这是一种沿着媒质表面传播，振幅随深度迅速减弱 的弹性波【1 0 】。当有分子吸附到基底表面的敏感层上时，这一表面波受到影响， 检测这种变化即可实现传感，工作原理如图1 6 所示。 图1 5q c m 的工作原理示意图图1 6s a w 的工作原理示意图 1 2 1 3 质谱检测方式( m a s ss p e c t r 伽e t r y ) 质谱是一种用来确定未知的化合物成分，辨明物质的结构以及化学性质的化 学分析技术【l l 】。在气态传感中，分析物电离以后经过电场加速并通过一个合适 的磁场后，不同离子按照他们本身的质量和带电量被区分开来。虽然质谱是一种 极为强大的分析手段，但这一复杂的装置不可能实现实地的检测。另外，它也难 以得到浓度等定量的信息。所以，质谱更适合被看作是一种对物质进行化学鉴定 的手段，而非一种可以检测分析物浓度的传感技术【1 2 】。 1 2 1 4 电学检测方式( e i e c t r i c a i ) 电学的检测方式是通过测量由于传感器的敏感部分与分析物发生相互作用 时导致的电信号变化而实现传感的。由于电信号处理起来比较直接，传输比较方 便，此方法的使用十分广泛。它是通过检测化学反应后电阻、电容或电位等的变 化【1 3 】。图1 7 是电容化学的传感原理示意图。 ( a ) 图1 7化学电容的传感原理示意图 4 ；。h1 一 妒，。卜 晰醴一 删 忡 r 忏j 审矿0 审m。 、妙c 嚣稚匹 第一章绪论 1 ，22 生物传黪器 在前面的分析中已经指出生物传感器可以算作是化学传感嚣中的一个子系 统。不同之处在于它是以生物活性单元作为敏感基元( 如酶抗体，蛋白等) 的。 由于这些敏感基元相对化学传感器中的无机物敏感基元( 或是高分子集合物) 来 说要复杂得多，而且使用的条件也较为苛刻所以它们在传感器上的固定( 或者 说是敏感元件与转换元件之间的连接) 就成为个比较关键的拄术。下面的几种 固定方法f 1 4 】是比较常用的；( 1 ) 物理吸附法，图l8 0 ) 。此方法主要通过极性键- 氢键或疏水力等的相互作用将生物组分吸附在不溶性的惰性载体上。( 2 ) 物理包 埋法，目1 8 ( b ) 。此方法是将生物组分包埋于高分子三维空间网络结构中，形成 稳定的生物组分膜。( 3 ) 共价结合法，图l8 ( c ) 。对基底处理使之功能化( 一0 h n 2 ，c o o h 等) ，再通过弛价作用和生物组分结台。近年来，利用分子自组装 技术固是生物活性基元是人们研宄的热点【i s ，如图l9 所示。 i 三 j 勃理q w 挂b 物理包埋接c 茹* 镕台 雷1 8 常用的生物敏皤基元固定方法圈i 9自组装技术固定生物基元 按照生物传感的方法，可以把生物传感嚣分为两大类：需要标记的检测方式 和无需标记的检涮方式- 根据具体使用的传感技术可将它们作进一步的细分，如 图1 1 0 所示。 生舒仲暮 田1 1 0 生物传蓐器的不同共型 22l 无需标记的检测方式 第一章绪论 这类检测方法包括表面等离子体共振( s p r ) 、声学检测方式( a w s ) 和电 化学( e l e c t r o c h e m i c a l ) 等。其检测原理与前面在化学传感器介绍的类似。 1 2 2 2 需要标记的检测方式 这类检测方法包括荧光( f l u o r e s c e n c e ) 、化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 和 放射性( r a d i o a c t i v e ) 。在生物领域，荧光检测的原理【1 6 】如图1 1 1 所示：通过 生物固定技术，先把探针分子( 比如某种抗体) 固定到基底的表面。然后，将事 先经过荧光标记的待检测分子的混合溶液流经此表面( 图1 1l ( a ) ) ，其中的目标分 子与固定探针发生特异性结合( 图1 1 l ( b ) ) ，最后用荧光方法检测即可。酶联免疫 吸附法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 是最常用的一种化学发光检 测方式 1 7 】，其工作原理如图1 1 2 所示。抗原和基底表面的抗体发生特异性结合 后被固定一卜来。经过酶标记的二抗通过此表面时与抗原结合，最后，加入显色试 剂( 它可以和所标记的酶发生作用并显色) 显色。通过分析仪器还可以将显色的结 果进行定量化。基于放射性的检测方法和荧光方法是类似的，只不过它使用的标 记物是放射性的同位素而非荧光基团。 矿惴 一两 z 要乏曼。少 哪”嗍 。妇吣4 j 鼬蝴嚏p r o d 吲 伊s 睇斟吐町醐曲畸稍幽e 佗 葛 p ? 镑 麓二厶赢粕：；：。二 图1 1 1 生物领域中荧光检测的原理图1 。1 2 酶联免疫吸附法的检测原理 至今，生化传感器已经经历了一段较长的发展历程，提高传感器的灵敏度， 增强传感器探测目标的特异性以及实现高通量的并行检测一直是人们努力的方 向。然而，传统的传感方法在这些问题上都显示出瓶颈效应。近年来，微电子机 械系统( m i c r o e 1 e c t r o m e c h a n i c a l s y s t e m ，m e m s ) 技术的出现为此带来了转机， 同时也为生化传感器的研制注入了新的活力 1 8 。m e m s 是在微电子技术基础上 发展起来的一个多学科交叉新兴领域，它以微电子及机械加工技术为依托，涉及 微电子学、力学、自动控制学、材料科学等多种工程技术和学科。m e m s 集成了 多种学科发展的尖端成果。具有许多优点【1 9 】： ( 1 ) 微型化：m e m s 器件体积小，比表面积大，重量轻，耗能低，惯性小， 谐振频率高，响应时间短。 ( 2 )以硅为主要材料，机械、电器性能优良：硅材料的强度，硬度和杨氏模量 与铁相当，密度类似铝，热传导率接近钨。 ( 3 ) 批量生产：用硅微加工工艺在一片硅片上可以同时制造成百上千的微机械 第章绪论 部件或完整的m e m s ，批量生产可以大大降低生产成本。 ( 4 ) 集成化：可以把不同功能，不同敏感性的多个传感器集成于一体，形成为 传感阵列，甚至把后续的信息采集和处理都集成到一起，形成所谓的“l a b o n a c h i p ”【2 0 】。 由于以上的众多优点，m e m s 技术一经出现就引起了世界各国科学家，产业 部门和政府部门的高度重视，被列入各国高技术发展规划，已经成为未来世界十 大科技之一，它是微电子、材料、机械、化学、传感器、自动控制等多学科交叉 的产物【2 i 】。而围绕着m e m s 进行的生化传感研究更是成为当前生化传感技术的 前沿和热点。可以预见，在此基础上发展起来的新一代生化传感器，将会大大的 促进化学，生物等学科的发展，并为国防安全提供有力的保障【2 2 。 1 3 基于微悬臂梁的生物化学传感技术概述 微悬臂梁( 图1 1 3 ) 是最简单的m e m s 构件之一，围绕着它所进行的各种研 究是与扫描探针显微镜的发明和发展紧密相连的。上世纪8 0 年代，b i i u l i n g 和 r o h r e r 2 3 发明了扫描隧道显微镜( s t m ) 。它的发明使人类第一次观察到了单个 原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为，在人类认识微观世界的历史上具 有划时代的意义。其发明人b i n n i n g 和r o h r e r 也因此而获得了诺贝尔物理学奖。可 是，由于s t m 是通过探测样品与探针间的隧道电流来工作的，对于非导电物质这 种方法就收到了限制，这也成为当时面临的一个难题。在s t m 发明4 年以后， b i n n j n g 和q u a t e 2 4 发明了原子力显微镜。其不仅可以对导电样品可以工作，对 于非导体也同样可以实现原子量级的扫描成像。自此以后，一系列扫描式探针显 微镜被相续发明出来 2 5 】，比如，扫描热显微镜、磁力显微镜、化学力显微镜、 静电力显微镜和横向力显微镜等等。它们有着共同的工作特点，即都是通过一个 极其灵敏的探针，逐点的对样品表面进行原子量级的扫描，从而获得样品表面原 子尺度内的物理，化学和生物信息。 原子力显微镜是这类显微镜中最为典型的一个。如图1 1 4 所示：一个对微弱 力极其敏感的微悬臂梁一端固定，另一端带有一个微小的针尖。当针尖靠近样品 时，由于探针尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的相互作用力【2 6 】，引起微 悬臂粱产生弯曲变形。利用光杠杆方法或其他的一些检测方法 2 7 】可以测量出这 种变形，从而得到这一作用力的大小。接着，通过反馈技术控制悬臂梁( 或是样 品) 上下运动并保持扫描过程针尖与样品之间的相互作用力保持恒定，扫描运动 轨迹就反映了样品的表面形貌特性。此外，原子力显微镜还有一种动态的工作方 式：将微悬臂梁激振在它的固有频率上，而后靠近样品表面。由于原子之间微弱 第，章绪电 力的影响，傲悬臂梁振动的振幅会发生变化。通过反馈技术控制微悬梁扫描样品 表面，同时保持徽悬臂梁振动的振幅保持不变同样可以得到样品瞬表面三维形 貌。可以看出，原子力显微镜的个关键技术在于对原子间相互作用力的探测。 因为这个力是极其微弱的( 通常为1 0 4 n 1 0 4 n 【2 8 1 ) ，所以用来感知这个力的器 件必须非常灵敏。微悬臂粱作为这样一个力敏感元件其灵敏程度可想而之，而 这也正是它在此之后被应用到众多传感技术中的主要原因。 巴显圈目! 墨 图1 1 3 典型微恳臂粱的电镜圈图11 4 原子力显徽镜的工作原理 微悬臂梁生物化学传感技术正是在原子力显微镜( a f d 和微机电系统 ( m e m s ) 出现后迅速发展起来的种新的传感方法，是纳米传感技术研究的新热 点。实验中发现，当微悬臂粱单侧表面上有生化反应发生时，其表面应力的改变 会使微悬臂粱产生弯曲变形。虽近的研究表明这项技术可以不需要标记物并且容 易实现大尺度、高通量、平行阵列测量。微悬臂粱生化传感器可以对具有特异性 的生化反应参数进行实时测量。 a m 口等 2 9 】在2 0 0 3 年对下一代传蒋器提出了以下的要求：( 】) 利用物理或者 化学方法将生化的敏感分子修饰到传感器上。对特定或者一定质量的目标分子进 行检铡。f 2 ) 利用非标定的方法来检测生化反应。( 3 ) 可以利用传蘑嚣进行多种物 质进行平行测量。( 4 ) 在攫5 量灵敏度范围对目标分子进行实时测量。徽悬臂粱传 感器可以很好的满足这些需求。和石英晶体天平( q c m ) 和表面等离子体共振( s p r ) 等传感器相比，微悬臂梁传感器可以实现阵列化。 131 基于微悬臂粱生化传感技术的发展历史 利用氮化硅粱的弯曲作为传感器这种思想事实上很早就有了。旱在1 8 5 8 年， 人们就发现在对薄片金属基底进行镀膜时，基底本身会被发生弯陷变形。1 9 0 5 年，s i o n e y 【3 0 】对此现象进行了鞍为深入的研究，井推导出了基底弯曲变形的曲 率与表面应力之间的关系。尽管这种由于分子在界面上的吸附而导致的摹底变形 霆， 第一章绪论 现象很早就被发现，但在当时并为引起太多的注意。直到1 9 4 3 年n o n o n 在他申请 的一份专利中提出：利用氢气在金属钯表面的吸附效应来制造一种钯自金的双 金属片氢传感器。1 9 6 9 年s h a v e r 【3 l 】用一根长l o o m m ，宽5 m m ，厚1 2 5 “m 的钯 银双金属悬臂梁进行了实验，证实了n o r t o n 的想法。1 9 7 9 年美国橡树岭国家实验 室的t a y i o r 等人【3 2 用这一方法对更多的气体进行了实验：他们用一根长1 0 0 m m ， 单面镀有8 0 n m 金的镍材料悬臂梁研究了h e ，h 2 ，n h 3 ，和h 2 s 的吸附现象。虽