（通信与信息系统专业论文）基于trfia的荧光信号检测与图像处理研究.pdf

摘要荧光分析技术在现代化学分析中占有重要的位置，特别是时间分辨荧光免疫分析( t i 心l a ) 的提出，使得荧光分析技术在生物检测方面更加重要。本文研究的内容是基于时间分辨荧光免疫分析的荧光信号的检测，及由此产生的生物芯片图像的处理分析。首先分析了荧光信号产生的机理，在此基础上考虑到荧光信号十分微弱的特点和在强噪声背景环境下检测，设计了基于数字b o x c a r 的信号检测系统。具体设计了由硬件电路和相应检测软件组成的检测系统。该系统由a d 采样芯片、f p g a芯片和u s b 2 0 协议控制芯片组成，并实现了各功能模块电路，以及对采集到的数据进行相应处理的算法设计。其次，把荧光信号检测扩展到生物芯片方面，主要研究生物芯片图像的处理，从而提取出芯片的反应信号点的亮度信息，获得有用的生物信息。根据以上原理，结合芯片图像特点，设计了生物芯片数字荧光图像检测和分析系统。关键词：时间分辨荧光免疫分析数字b o x c a r 生物芯片亮度提取a b s t r a c t1 1 1 ef l u o r e s c e n c ea n a l y s i st e c h n o l o g yi sv e r yi m p o r t a n ti nm o d e mc h e m i c a la n a l y s i s e s p e c i a l l yt h ep r o p o s a lo f t i m e - r e s o l v e df t u o r o l m m u n o - a s s a y ( t r f i a ) m a k e st h ef l u o r e s c e n c ea n a l y s i sm o r ei m p o r t a n ti nt h eb k ，- d e t e c t i o n t h i st h e s i si sf o c u so nt h ed e t e c t i o na n dp r o c e s s i n go ff l u o r e s c e n c es i 鲫a 1b a s e do l ln 心认，t h es i g r l a li n c l u d e ss i n g l e s i g n a la n dm u l t i d r o ps i g n a lw h i c hi sb i o l o g i c a lc h i p f i r s t l y , w ea n a l y s i st h ep r i n c i p l eo ff l u o r e s c e n c ee m i t t i n g s e c o n d l yw ed e s i g nas i g n a ld e t e c t i o ns y s t e mb a s e do nd i g i t a lb o x c a r , c o n s i d e r i n gw i t ht h ef e a t u r eo f t h ef l u o r e s c e n c es i 鲫l a la n dt h en o i s eb a c k g r o u n d t h es y s t e mi sc o m p o s e dw i t hh a r d w a r ec i r c u i ta n dd e t e c t i n gs o f t w a r e ，a n di sm a d eo f t h eh i g h - s p e e da d ，f p g ac h i p t h eu s bp r o t o c o lc o n t r o l l e rc h i p t h e nw ea n a l y s i so fd a t ac o l l e c t e dw i t ht h ea l g o r i t h mo f s p e c t r u me s t i m a t i o n f u r t h e n u o r e ，w ee x t e n dt h es i n g l ed e t e c t i o nt ot h eb i o l o g i cc h i pd o m a i n ,w es t u d ym a i n l yt h em e t h o d so f b i o c h i pi m a g ep r o c e s s i n g ，w i t c hc a ne x t r a c tt h eh y b r i d i z i n gi n t e n s i t ya n do b t a i nt h eu s e f u lb i o l o g i c a li n f o r m a t i o n f i n a l l yw ec a ng e tt h ei n t e n s i t yi n f o r m a t i o no ft h es i g n a lp o i n tb yd a t an o r m a l i z a t i o nw h i c hi sa p p l i c a b l ei nt h eb i o l o g i ca n a l y s i sb yd e s i g n e dab i o c h i p si m a g ed e t e c t i n g - a n a l y s i ss y s t e m k e yw o r d s ：t r f i ad i i 醇a lb o x c a rb i o l o g i cc h i pi n t e n s i t ye x t r a c t i o n长春理工大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，基于t r f i a 的荧光信号检测与图像处理研究是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：封车辱4 年垒_ 月上日长春理工大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士、博士学位论文版权使用规定”，同意长春理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数掘库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。作者签名：囡拯导一蛆年盈月互一日指导导师签名：竭n j 辇鼬锰月上日1 1 课题背景第一章绪论1 1 1 时间分辨荧光免疫分析简介随着基因组的破译，基因、蛋白质组学研究的进程使得高灵敏度、高特异性、高稳定性的荧光检测技术研究已成为现代生物分析研究的前沿。荧光是物质受到光照射后产生的发光的现象。在很多医学诊断中，都是通过荧光强度来获得信息的。荧光强度测定十分简单，只要选择合适的激发和发射波长，就可以直接测试。荧光物质具有典型的激发和发射光谱，荧光强度的测量都是在确定光谱之后进行的。荧光测试技术之所以得到广泛的应用，是与其固有的高灵敏度分不开的。一般而言，荧光测定的灵敏度比吸光度测定高出1 3 个数量级。这是因为，同其他分子发光检测技术一样，荧光检测实际上是一个光学的“暗背景”测定。当然在实际测定中，荧光测定的灵敏度常常因为来自样品的干扰，各种杂散光的干扰等因素而有所降低。根据荧光的上述特性，提出了时间分辨荧光免疫分析法“”。时间分辨荧光免疫分析法( t i m e - r e s o l v e df l u o r o l m m u n o a s s a y ,t r f i a ) 是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，标记蛋白质、激素、抗体或生物活性细胞，待反应体系( 如：抗原抗体免疫反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生后，用时间分辨荧光技术测定反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。稀土离子作为荧光探针，它量子产率高，s t o c k 位移大，发射峰窄，激发和发射波长理想，荧光寿命长( 1 0 1 0 0 0 z s ) 。采用时间分辨技术，可消除激光发光源的光、电干扰及样品本身等发出的短寿命荧光( 1 l o z s ) ，极大地提高了信噪比”1 。如图1 1 所示。t r f i a 利用波长和时间两种分辨，是指用氮分子激光器发出的高能量单色光激发带有标记物的螫合物，螯合物将在不同的时间段发出不同波长的辐射光。辐射光载荷着待分析物的信息，通过测量不同波长的辐射光便可分析“1 。图1 1螯合物与配位体的吸收光谱和发光光谱激光诱导荧光的方法作为一项新技术，受到了各个领域的重视。特别是高能量、高分辨、短脉冲激光的出现，尤为光谱分析工作者所关注。对荧光分子的分析研究表明，荧光的强度，在分子吸收光接近饱和以下的范围与激发光的强度成正比。因此，采用强度大的激光作为荧光测定光源是有利的。激光和门检测系统相结合，产生了新的分析手段时间分辨激光荧光光谱分析法。时间分辨光谱是一种多参数测量技术。时间分辨光谱法利用了第三个参数，即荧光寿命。这样分析样品时，可根据其荧光寿命值，适当地选择门宽及延迟，以限制噪声及尽可能地消除激发光源等干扰。当去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发光时最大荧光强度的l ，e 所需的时间，称为荧光寿命，常用f 表示。如果荧光曲线是以单指数数形式衰减，则r 值与该曲线最大强度的高度选取无关。激发光刚刚结束的时刻，在最初很短的时间内，短寿命荧光很快结束，长寿命荧光也会在4 0 0 n s 的时间内消失或降低到很低的程度，而有用的荧光出现在4 0 0 8 0 0 n s 之间段内。在8 0 0 10 0 0 n s 时间段内有用的荧光将到零，至少要l0 0 0 n s 后开始新的循环”1 。如图1 2 所示。t r f i a 同时用波长分辨极其有效地排除了非特异性荧光的干扰，大大提高了分析灵敏度。荧光强度i 卜胤懒m s ) 一o4 0 08 0 0l o o o时问( p s )图1 2载荷配位体的螯合物荧光时问特性1 1 2t r f i a 生物芯片如果把n 谭i a 荧光检测技术应用于检测生物芯片，运用图像处理的手段，将会有更好的发展前景。生物芯片的创意来自于计算机芯片。它和计算机芯片一样，具有超微化、高度集成、信息贮存量大等特点，所不同的是，计算机芯片采用的是半导体集成电路，而生物芯片是以基因片段作为“探针”进行工作。所谓“探针”，是利用碱基配对的原理检测基因的一种技术。它就好比是用鱼杆钓鱼。以前的基因检测技术均只有一个“鱼钩”，一次只能钓到一条鱼( 即找到一种基因) 。而生物芯片突出的优点是能在庞大的基因库中，一次发现众多的异常基因，就好比在一根鱼杆上垂有成千上万个钓钩，可同时捕捉许多不同的鱼，从而实现快速多样化检测。生物芯片是指通过机器人自动打印或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列探针。生物芯片上的探针在与经过荧光标记的目标样品杂交后，产生荧光图像。以实现对细胞、蛋白质、d n a 以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。常用的生物芯片分为三大类：即基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。它将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。生物芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测及生物信息分析“。生物芯片分析过程如图1 3 所示。样品处理- 目标富芯片制作+ 萋蔷l 增哧j分子间反应或杂交洗涤化学反应 检测综合信息分析+ 一数据处理图1 3生物芯片分析过程1 1 3t r f i a 的发展过程及国内外研究现状1 9 5 9 年y a l o w 和b e r s o n 根据抗原和抗体反应的特点创立的放射免疫分析法是生化分析发生了一场革命，因此y a l o w 获得了1 9 7 7 年诺贝尔医学奖。1 9 8 3 年，p c t t c r s s o n 和e s k o l a 等人提出了用时间分辨免疫分析( t i m e r e s o l v e df l u o r l m m u n o a s s a y ，t r f i a ) 法测定人绒毛膜促性腺激素和胰磷脂酶在临床医学研究中的应用课题，在随后的1 0 多年中，获得迅速发展，成为最有发展前途的一种全新的非同位素免疫分析技术。直至今日，时间分辨荧光免疫分析系统已有四种系统- d e l f i a 系统、f i a g e n 系统、r m p 系统、e a l l 系统。但大多数都是液态荧光检测，免疫反应后需用酸性增强液将螫合物解离下来进行检测，这样势必使得检验灵敏度降低，而且实时性不好。此时，固相检测系统体现了其优势。2 0 0 0 年，e p d i a m a n d i s 等报道了将聚乙烯胺用于b c p d a 的多标记研究，使该体系( p s a ) 检测限达到7 ( 1 0 1 4 m o l l ) ，与液相体系相当，加速了其商品化进程，展示了该体系的潜在优势。建立液相t r f i a 体系的芬兰w a l l a c 公司，近年来已转向固相t r f i a 体系研究。随着电脑技术的发展，国外t r f i a 的测量仪器已经实现了高度自动化，操作软件也逐步人性化，界面简单易懂。国内也有几种仪器推出，实现了硬件的国产化，此外，光纤技术的引入，使得时间分辨荧光免疫4分析成为一种名副其实的新型超微量分析技术。1 2 本文研究的主要内容通过查阅相关文献，了解t r f i a 荧光发光机理，并设计方案进行微弱的荧光信号检测，最后探讨荧光生物芯片的图像处理方法。本文的结构安排：第一章，首先介绍了本文的课题背景和国内外研究现状，解释了时间分辨荧光分析的基本原理和生物芯片的含义。第二章，讨论了时间分辨荧光免疫分析中荧光的发光机理，t r f i a荧光产生的过程，及信号检测的基本原理。探讨了在荧光信号检测中可能存在的各种问题，并提出了解决方案。第三章，介绍了荧光的接收和检测。设计了t r f i a 荧光检测的方案，包括荧光接收，和得到的微弱信号的检测系统的整体设计框图。第四章，设计了高速数字b o x c a r 的数据检测系统，用于检测微弱的荧光信号。之后根据第二章的讨论，设计了荧光信号检测的后续数据处理部分。第五章，将时间分辨荧光免疫分析的方法扩展到生物芯片方向。用图像处理的方法，获取和处理生物芯片数字荧光图像，其中包括模拟各种可能出现的噪声和相应采用的滤波器，之后用边缘检测的方法，提取信号点的亮度信息，最后设计了生物芯片数字荧光图像的分析检测系统框图。第二章荧光检测原理及方案探讨2 1 荧光发光机理2 1 1 光学分析法在近代分析化学中，凡是根掘物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用而建立起来的一类分析化学的方法，广义上均称为光学分析法。最常用的一类光学分析法是光谱分析法，当物质与辐射能作用时内部发生量子化的能级跃迁，并测量由此产生的发射、吸收或散射的波长和强度，这类方法称为光谱法。t r f i a 研究的是激光器激发样品后产生的荧光光谱。荧光的激发态分子在吸收和再发射之间的停留时间为1 0 4 1 0 4 秒，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止。2 1 2 紫外线激发产生荧光的物理过程时间分辨荧光免疫分析方法，是用稀土离子( 实验用镧系铕离子)作为载荷配位体的螫合物。在紫外线等高能射线的激发下，处在溶液或化合物中的三价稀土离子被激发，从基态跃迁到激发态，然后再从激发态返回到能量较低的能态时，放出辐射能而发光，这种光即为荧光。一般荧光的光强与稀士离子的浓度成正比。通过测荧光强度，可知道稀土离子的浓度，继而得知配位体的浓度，达到定量分析的目的。螯合物荧光的能量跃迁过程，一般可分三步来说明“1 ，跃迁过程见图2 1 。( 1 ) 先由配体吸收辐射能，从单重态的基态晶跃迁至激发态s ，其激发能可以用辐射方式回到基态( 配体荧光) ，也可以用非辐射方式传递给三重态的激发态z 或五；( 2 ) 三重态的激发能也可以辐射方式失去能量，回到基态，或以非辐射方式将能量转移给稀土离子；( 3 ) 处于激发态的稀土离子的能量跃迁也有两种方式，以非辐射方式或辐射方式跃迁到较低能态，再至基态，或以辐射方式跃迁到较低能态，此时就产生荧光。6一辐射跃迁 事辐射跃迁图2 1 激发态的能量转换过程能级图前人在研究t r f i a 的过程中，观察了溶液中形成的铕离子螯合物的吸收及荧光谱，发现吸收带在紫外区。荧光增强铕离子螯合物的吸收在3 0 0 3 5 0 n m 区间表现出特殊的趋势。连续改变激发波长进行观察，在3 3 6 3 3 7 n m 处得到了特征荧光峰( 6 1 0 6 2 0 n m ) 的最大值，即获得了最佳增强效果“1 ，如图2 2 。暑丽里量3 4 04 4 05 4 06 4 0w a v e l e n g t h ，n m图2 2 铕离子螯合物荧光增强最佳效果稀土螯合物经紫外激发后产生的荧光，不但强度高，而且荧光衰变时间也长，大约1 0 10 0 0 9 s ，一般生物类样品的自然本底荧光的衰变时间只有几微秒，荧光寿命的这种大的差异，为采用时间分辨光谱技术提供了必要的条件。知衢加佰伯002 2t r f i a 荧光产生过程及检测原理2 2 1t r f i a 荧光产生过程荧光检测系统的前置部分是由一台氮分子激光器q j d 9 n 2 作为激发光源，脉冲宽度5 1 0 n s ，重复频率在l 5 0 h z ，输出能量5 m j 左右，它会发出3 3 7 1 n m ，形状为2 5 m m x5 m m 的矩形光斑。用此激光器激发在光程为l c m 的石英池中所放的样品，经激发产生的荧光照射在垂直放置于激发光源方向上o 3 m 光栅单色仪的入口狭缝处，在单色仪出口处用光电倍增管接收荧光信号。调试氮分子激光器的同时应该调节光路，使光斑聚焦，并准确的打在样品池中，才能更好的激发出荧光。调节光路图如图2 3 所示。由激光器发射出来的激光由透镜a 先扩展成直径较粗的光柱，经激发窄带干涉滤光片b ，过滤除去其它波长的光，这样可大大降低检测的背景，再由透镜c 重新聚焦后，由二色分光镜d 反射至物镜组e ，物镜组e将激光聚焦样品池上，标记有铕离子的靶分子在激光激发下产生的荧光由物镜e 捕获后变成平行光，再通过二色分光镜d 、反射镜f 使发射的荧光进入到干涉滤光片组g ，以滤除发射荧光以外的光，再由透镜h 聚焦在共聚焦光阑上，通过光阑的光均匀地照亮在光栅单色仪的入射狭缝上，由于光栅的分光作用，从出射狭缝出射的光为单色光。通过步进电机带动转动轴转动。当光栅转动时，从出射狭缝出射的光由短波到长波依次出现。若扫描的波长和荧光波长相同时，则光栅单色仪的出射狭缝中发出荧光信号。2 2 2t r f i a 荧光检测原理一般荧光检测是利用激发波长丸和发射波长彳。的变化，进行对各种物质选择性地测量。而时间分辨荧光免疫分析利用了第三个参数，即荧光寿命r 。荧光强度可表示为f ( 丸，无。，f ) 。这样在分析样品时，对于含单一待测元素样品，可根据其荧光寿命值，选择适当的门宽及延迟，以限制噪声及尽可能消除激发光源等干扰。对于含两种以上待测元素的样品，可以利用所含元素的荧光寿命的明显差别，合理地选择门宽和延迟而分别加以测定，使之在处理样品时，无须预分离。总体来说，t r f i a 荧光检测是从时间、空间域上提取信号，极大地增强了分析的灵敏度。8afh反射镜d- 卜心心3 分光c6 、”、j lil样品池i图2 3 激发荧光光路图2 3t r f i a 荧光接收检测总体方案讨论t r f i a 荧光接收检测系统属于微弱信号检测范畴。因为激发样品后产生的荧光属于脉冲瞬态光谱，必须从激发光、短寿命荧光和背景噪声中提取有用的荧光信号。用常规检测方法，有用信号常常被噪声淹没，所以采用了微弱信号检测的方法( w e a ks i g n a l d e t e c t i o n ) 。这样可大大提高检测灵敏度，常规检测方法的信噪改善比为1 0 左右，而通过微弱信号检测技术则信噪改善比可达1 0 4 1 0 5 ，检测灵敏度可1 0 m o l 。有资料表明，t r f i a 的检测极限( p s a ) 已经达到l o s m o l a s s a y ( 0 0 1 9 9 m 1 ) 。因此，t r f i a 荧光检测系统设计必然围绕如何在强噪声中提取有用的微弱信号。需要讨论以下几个问题：第一，讨论弱光信号的接收。光子既有波动性又具有粒子性。此处是以光子的粒子性为基础设计弱光光强检测，检测光子离敞的微弱荧光信号。t r f i a 要检测的荧光信号是在一个周期内的固定时间被激发的，要求接收系统的探测灵敏度高，抗噪声能力强。并将此微弱的光信号转换成电信号。目前有多种光电传感器可以把光信号转换为电信号。比较普遍的是9光电倍增管( p h o t o m u l t i p l et u b e , p m t ) 和电耦合器件( c h a r g ec o u p l e dd e v i c e ，c c d ) 。光电倍增管在可见光范围内是灵敏度最高的探测器，可探测到一个光子的存在，光电倍增管内的功率放大器可将光信号转化为电信号并放大百万倍，通过改变光电倍增管的电压可以很方便地改变光电倍增管的增益灵敏度。c c d 对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，在低亮度背景下，限制了微弱信号的检测。第二，讨论提取或复现噪声中的信号波形。微弱信号检测的目的乃是利用电子学的、信息论的和物理学的方法，分析噪声产生的原因和规律，研究被测信号的特点和相关性，检测被背景噪声覆盖的弱信号。从某种意义上来说，它是一种专门与噪声作斗争的技术：只有抑制噪声，才能取出有用信号。而信噪比的改善则标志着微弱信号检测技术的进步。通常采用的微弱信号检测的方法是时域平均技术来实现对被测信号波形的恢复。这种技术利用同步相关检测原理对被测信号多次取样并叠加平均，周期性的有用信号不断得到加强，而无规律的噪声在多次平均中由于其本质的非相关性会趋于零，这样就达到了抑制噪声的目的。相关检测是从噪声中提取有用信号的有效方法，由于噪声与噪声、噪声与信号均不相关，而信号与信号则完全相关。根据这一特性，设计的系统应该完成信号与参考信号的互相关运算，从而达到将强噪声中的信号振幅相位信息检测出来，达到满意的效果。t r f i a 发送的荧光信号是每个周期固定时间段内被激发出来的，转换成电信号的重复周期同样是固定的。因此，它的重复周期已知，则可以在接收端发出一重复的周期与发送信号相同的“干净的”本地信号，将本地信号与混有噪声的输入信号进行相关，如图2 4 所示，就能提高系统的抗干扰性能。石( r )图2 4 互相关检测方框输入信号是混有噪声的荧光信号，设为z ( f ) = s l ( f ) + n ( t )o( 2 1 )本地信号是由灭光信号得到的参考信号，设为a ( t ) = 最( ，)( 2 2 )则输入信号与本地信号的互相关函数为蜀：( r ) = 寺石( f ) 五( 卜r ) a t= l i m ：i _ l 。， r s j ( r ) s a h ) 面+ 刍e 挖( f ) s a f f ) 刎= 民品( f ) + 8 喝( r )。( 7 )( 2 3 )因为本地信号曼( f ) 与噪声问没有依附性，故尼。( f ) 为零，但值得注意的是，这种情况只有在计算相关函数求平均值的时间比较长时，b s ，( r ) 才趋近于零，才有可能得到较高的输出信噪比，而求平均时间比较长时，又要求s ( f ) 和s ( f ) 的重复周期严格致。基于相关检测的时域信号平均，是将待测的重复信号多次取样进行积累，从而从噪声中恢复信号波形。第三，与其他微弱信号提取不同的是，时间分辨荧光免疫分析还强调了时间特性。即在空间域提取信号的同时，还考虑时间域。时间分辨光谱一般是指激发停止后不同延迟时刻的发射光谱，即衰减过程中不同时刻的发射光谱。t r f i a 激发出的荧光特点是：激发光结束时刻，在4 0 0 n s 时刻之前，短寿命荧光几乎衰减为0 ，长寿命荧光也会在4 0 0 n s 的时间内消失或衰减到很低的程度，而实际要提取的有用的荧光信号出现在4 0 0 8 0 0 n s 之间。至少1 0 0 0 n s 之后开始新的循环( 一个荧光信号检测周期) 。在一个测量周期内，为了使检测恰好在需要的时间段内进行，必须在激发光源处进行处理，使激发光源在检测周期开始时刻激发样品产生荧光，在激发后要求的时间段内检测被激发出来的荧光信号，以保证测量的准确性。第四，讨论采用数据后继处理。对于具有各态历经性的平稳随机信号来说，其总体统计平均可用样本时间平均来表达，从而可用时间平均求其均值和相关函数。相关函数的傅里叶变换就是随机信号的功率谱密度函数，简称功率谱。因此，对随机信号的分析主要是求其自相关函数和功率谱估计。传统方法的典型代表是相关函数( b l a c k m a n - t u k o g ) 法和周期图法。其共同特点是对观测数据进行线性运算，通过加窗、分段和平均处理；另外还有观测区间以外的数据假设为零的不合理假设，从而不可避免地存在分辨率低、傍瓣出现、谱线泄漏、弱信号被淹没等固有缺陷。对于传统谱估计，只有观测数较长即数据采样点数较多时，才能得到较高的谱估计精度。加窗可减小泄漏，但也降低了频率谱分辨率。这样一来，不仅增加了数据处理的工作量，而且对于工程技术及科学研究中记录数据或瞬变信号，传统谱估计方法显然是无能为力了。b u r g把信息熵的概念引入信号处理，于1 9 6 7 年首先提出了最大熵( m a x i m u me n t r o p ym e t h o d ，m e m ) 谱估计法。最大熵谱估计是频率谱分析发展史上的里程碑1 6 11 7 1 。从以上讨论可以得出设计的总体方案：t r f i a 荧光检测系统大体可以分为两个部分：荧光检测部分和后继数据处理部分。最后，荧光检测系统如果扩展到生物芯片检测上，将会有更好的发展| j i 景。这就是说把各个样品都集中有序地排列到一个面上，即把单点检测扩展到多点，甚至上百上千点同时检测。检测效率的提高，势必会有灵敏度的降低作为代价。但是用图像处理技术，消除参杂在有用信号中的噪声，尽可能多地提取出需要的信息，这种方法是可行的，而且是t r f i a 检测未来发展的方向。2第三章t r f i a 荧光检测系统的基本原理及总体设计时间分辨荧光免疫分析的荧光光谱检测的精髓在于“从噪声中提取微弱信号”，即所设计的检测系统的主要工作就是检测被噪声淹没的有用信号。根据第二章讨论的几个问题，首先要将微弱的荧光信号转换为电信号。其次是将电信号从噪声中提取出来。3 1 光电倍增管工作原理与分压电路将光信号转换为电信号，需要一个光电式传感器，根据光量的变化转换为电量的变化。在各种光传感器件中，光电倍增管( p m t ，p h o t om u l t i p l i e rt u b e )是性能最好的一种，无论在灵敏度、响应速度、噪声系数还是动态范围上都遥遥领先于其他的光传感器件，更难能可贵的是它的输出信号在相当大范围内保持着高度的线性输出。它在许多领域中都有应用，特别是在需要测量微弱光信号的生命科学仪器中，它是首选的光传感器。光电倍增管是一种真空光电发射器件，主要由光入射窗、光电阴极、电子光学系统、倍增极和阳极等部分组成。它利用二次电子释放效应，将光电流在管内进行放大。所谓二次释放是指，高速电子撞击固体表面，再发出二次电子的现象。光电倍增管的光阴极和阳极之间被加了许多倍增极( 1 0 个左右) ，在阳极和阴极之间加有几百伏到上千伏的高压，每个倍增极电流逐渐升高，使电子加速，每个极间有1 0 0 2 0 0 v 高压，电流增益在1 0 5 数量极，相当一个电子激发出1 0 万个电子数目。倍增极外加电压u d 与增益g 的关系近似为g = k 叫( 3 1 )式中k 为常数，n 为光电倍增管倍增极数。增益变化为a g g = n ( a u a u d l( 3 2 )由上式可见，外加电压u d 的变化引起光电倍增管增益的变化，对输出的影响很大，因此对供给光电倍增管的工作电源电压要求较高，必须有极好的稳定性“”。f渤箸劁i一lj 一高压e ir 2r 3r 4h图3 1 光电倍增管工作原理i - - 葡- 置- 艘文荧光接收是用光电倍增管接收。荧光信号从光栅单色仪出射狭缝中发出，直接打到光电倍增管的镜头上。实验用的光电倍增管是日本滨松公司的r 4 5 6 型光电倍增管。为了使光电倍增管正常工作，通常在阴极和阳极之间加上千伏的高压，同时还需在阴极、聚焦极、倍增极和阳极之间分配一定的极间电压，保证光电子能有效地收集，光电流通过倍增系统得到放大。r 4 5 6 型光电倍增管的分压电路如图3 ，2 所示。图3 2r 4 5 6 型光电倍增管的分压电路r r = r = 2 2 0 k o c l 吒= c 3 = 33 0 0 i tf ，r l = i 2 0 0 k 0 可调1 4i - - 辅r l 出3 2 微弱信号检测原理即使采用了暗背景操作，还是不能避免有杂光的进入，还有暗电流等噪声的影响。如第二章讨论，采用相关检测的方法提取有用信号。因为噪声与噪声、噪声与信号均不相关，而信号与信号则完全相关。因此，应该完成信号与参考信号的互相关运算。3 2 1 被测信号特点实验中，由一台氮分子激光器q j d - 9 n ：作为激发光源，脉冲宽度5 1 0 n s ，重复频率在l 5 0 h z ，即最小重复周期为2 0 m s 。每次激发样品池后，产生的荧光立即达到光电倍增管得到相应的电信号。因为荧光寿命的影响，得到的一个周期的信号是呈指数衰减的，重复周期是与激发光源的周期相同的。这个信号是微弱的，由于受接收器件噪声的影响，表现出来的总效果是，有用的被测信号被大量的噪声和干扰所淹没，使得测量变得十分困难。由第二章分析可知，基于本实验被测信号的特殊性，常规的信号检测方法已达不到所需的性能要求，只有采用专门的弱信号检测技术才能在强噪声中提取该微弱信号。下面介绍微弱信号检测的基本原理和方法。3 2 2 微弱信号检测的基本原理通过分析本实验的被测信号特点，必须在信号出现的周期内将时间分成若干个间隔，时间间隔的大小取决于要求恢复信号的精度。然后对这些时间间隔的信号进行多次测量，并加以平均。某一时间间隔的信号幅值通过取样方法获得，而信号的平均则可通过积分，或者利用计算机的数据处理来实现，这种方法称之为“取样积分”与“多点平均”。前者常用于模拟方法，后者适用于数字处理。一种恢复和记录深埋在噪声中的微弱信号波形技术称为b o x c a r 。1 9 6 2 年加利福尼亚大学劳伦兹实验室的k l e i n 用电子技术予以实现，称为b o x c a r 积分器( 或取样积分器) 。它的基本概念是取样和平均同时进行，随着取样门的移动而将波形慢速恢复并记录。只要信号是重复的，波形是不变的，产生时刻是已知的，就可以用它来检测，恢复和记录微弱信号n ”j i l l ob o x c a r 积分器输入的信号，每周期只取样一次，因此取样效率很低，对低重复频率的信号恢复需要极长时间，但是b o x c a r 积分器对恢复高重复频率的快速瞬变过程有十分理想的分辨率。随着计算机技术的发展和电子技术的提高，可以对一个周期内不只是取样一个点，是多点取样，例如2 5 6 点至1 0 2 4 点等，则可充分提高信号波形的利用率。b o x c a r 积分器只有一个积分器，因此每个周期取样一次，但如果设置n 个积分器，则每个周期内的信号可以取样n 次，取样效率提高n 倍，这就是模拟多点平均的思想。鉴于b o x c a r 积分器与数字多点平均各自的优点，目前的发展己将两者融合一起，构成新的时域平均系统，这就是本论文讨论的数字b o x c a r 积分器。b o x c a r 检测是建立在同步相关检测的基础上，同步相关检测的原理已在第二章进行了分析。一、多点信号平均器基本原理多点信号平均器采用实时取样，多次对信号进行多点取样和平均，降低以至消除噪声的影响，提高信噪比，从而能够从强噪声背景中恢复整个被测信号的波形。它在信号的一个周期内要取样多点，并一一对应存储在相应的存储器内进行累积和平均，它等效于大量单点取样积分器在不同延时的情况下并联。通常多点信号平均器分模拟和数字两种1 1 2 1 。本设计采用数字存储器。下面，讨论数字式多点信号平均器中，信号与噪声的混合信号经过取样变换后信噪比的改善情况，如图3 3 所示。若m = l ，即第一次扫描的取样，未作平均，各取样的瞬时值均显示于图3 3 ( d ) ，第二次扫描后，则将两次相同点的取样瞬时值相加并除以2 ，依次类推。在图3 3 ( d ) 中可以明显看出，在第八次积累时，样品叠加结果基本上都落在周期信号的轨迹位置上了。这里，将信号和噪声的混合信号表示为( f ) = s ( t ) + 玎( f )( 3 3 )式中，s ( r ) 为周期信号，疗p ) 为噪声信号。如果以为起点，每隔r 秒取样一次，则第i 次的样品应该是( + i t ) = s ( t k + i t ) + n ( t k + f d( 3 4 )式中，i 为取样序号。对于周期信号来说，由于是在同步状态下进行取样，因此对每个起点可以认为屯= o ，这样，则有1 6s ( + i t ) = s ( i t )如果经过脚次重复后，第i 个样品的积累值为mmf ( t k + f 丁) = s ( f 丁) + ( 气+ f r )k = lk - ik = lt刚唑灿噬【雌幽雌幽m 必蛐i 必刚山岫 l i 【l l 雌l l i i | i 幽【| |( b )t( 3 5 )( 3 6 )t r l = lm = 2m = 3m = 4图3 3 多点平均工作示意图图( a ) 足周期信号与噪声的混合信号，即，= 翻_ ；图( b ) 是取样脉冲；图( c ) 是周期信号的同步脉冲，每一周期内共取样1 , 2 ，3 次；图( d ) 是样品的积累情况，用圆点标出如果经过m 次积累的周期信号为1 7( 3 7 )口3譬矗e西号为( 3 8 )式中门o ) 为噪声信号有效值，经过m 次积累后的信号与噪声混合信疗纯+ f r ) = 脚( f r ) + 石磊丽k = l( 3 9 )经过m 次积累后的信噪比为厶= ( * 器= 而等= 而( 刳 呐因此，经过m 此积累后的信噪比增益为f趴= l：磊( 3 1 1 )上式说明了经过m 次取样积累后，信噪比有所改善，它与重复积累的次数的平方根成正比。换言之，周期性或可重复信号经过多次取样积累后，其信噪比有所提高，积累次数越多，信噪比改善越好。如果将取样次数适当增加，就可以从强噪声的背景中提取极其微弱的信号。二、时域平均的频域描述现在从频域或滤波器的角度来研究多点平均的噪声抑制问题。为此需要求出多点平均的传递函数日( c o ) “”。在多点平均器中，触发脉冲起着同步信号的作用，每触发一次，扫描一次，各点取样一次并在相应点叠加。在时域中，可以将取样函数视为由一系列冲激函数组成，即 ( ，) = 8 ( 0 + 8 ( t 一丁) + 6 ( f - 2 t ) + + 占 f - ( m - 1 ) t + 8 ( t - m t )= 8 ( t k t )( 3 1 2 )i = 0根据拉氏变换有， j ( f 一刀f o ) 】= r j ( f 一仃f 0 ) p 一，毗击= 窆p w 口7( 3 1 3 )因此，( 3 1 2 ) 式的拉氏变换为h ( j e ) 、= 1 + p 一7 m t + p - j 2 盯+ + p j ( ”一1 ) 村两边乘以( 1 - e 。彬) ，则有月( ，) ( 1 一e 一神) = 1 一e 叫“川( 3 1 4 )( 3 1 5 )所以，驯= 研1 - e j r ) = 面s i n ( m o o 而t 2 ) e 一半( 3 1 6 )其幅度特性为) | _ ( 回= ( 弘) = f 1 - e 习s ”r ) = 面s i n ( m 丽o o t 2 )式中，t 为触发脉冲的基波周期，根掘极限l i m 塑：一mx - + os i n n x疗则i h ( o ) l = m ，或者当c o t 为2 n 的整数倍时，有( 3 1 7 )( 3 t 8 )i h ( j m ) l 。= m( 3 1 9 )图3 4 对应了m 取几个值时，式( 3 1 5 ) 的归一化传递特性。由图3 4 可知，多点平均器归一化函数具有梳状滤波器特性，每个“齿”为一个带通滤波器，其中心位置在扫描触发频率的谐波n t 处( 非周期触发时，梳状滤波器概念就失去意义) 。当m 值增加时，滤波器带宽缩小，而峰值增高。通过多次平均后梳状滤波器的每个“齿”可以得到很窄的通带。同时，每个谐波点的带宽相同，且峰值皆为n l 。这一结果表明，只要触发扫描速度与被测信号同步，则多点平均器就能把信号的每个高次谐波不失真地从噪声中提取出来，使其输出波形保存了原信号的各次谐波，从而使输出信号不失真。由于带宽极窄，故对噪声有很强的抑制能力，这也说明多点平均器是从噪声中提取弱信号的有力工具。可以求得信号3 d b 处的等效带宽，令叫篙箸愕m z 。，由于上式是超越函数，设x = ，m = 10 0 0 ，代入上式，可用逼1 9近法求得领：1 3 芒9 2 ：0 4 j 4 3 - 0 8( 3 2 1 )鱿2 磊i 2 ；万一峨上式为梳状滤波器一个“齿”的单边带宽，但每个“齿”是一个中心对称的带通滤波器，所以马：2 m ：0 8 磊8 6 _ 1 6( 3 2 2 )上式表明，当m 值增加时，一3 d b 处带宽马。也将线性减窄。151050012( a ) s i n x s i n x( b ) l ，2 ( s i n 2 x s i n x )( c ) 1 1 5 ( s i n 5 x s i r t x ) ( d ) 1 1 1o * ( s i n lo x s i n x )图3 4 多点平均器的梳状滤波器归一化特性t 的一- 时：t e ，”吒时；t 妒s 时；t 由n 一时其中，x = 警3 3 用于t r f i a 荧光信号检测信号平均的方案在3 2 1 中已经知道被测信号的特点，即为指数衰减的脉冲波。可以看出，采用时域信号平均技术是检测和处理这种信号的理想方法。由于多点检测的实时性强，故采用了多点检测的方法。因此，在该检测系统中采用多点信号平均，即在一个信号周期内对信号进行多点取样并平均，这样在获得同样信噪比增益的情况下，只需要单点信号平均器检测一点的时间，故速度可提高几百倍，提取波形快，大大提高了整个检测系统的响应速度。根据实际需要，从可行性考虑，提出具体的技术指标为：触发脉冲周期为1 产5 0 h z ，m - - 6 0 0 时，则总的测量时问是m t = 6 0 0 5 0 = 1 2s 。这时一个“齿”的信号带宽为马。= 2 兰：= ；兰= 7 3 9 x 1 0 。1 2 ；等效噪声所1带宽为：4 厂= = = 0 0 8 33 h z ；信噪改善比为2 4 5 ( 2 4 d b ) 。所设计的数据处理系统根据对信号处理的要求，将外部叠加和计算机软件累加相结合，充分利用当丽硬件电路和计算机的强大数据处理能力，兼顾系统性能和生产成本的一种方案。设每一信号采样6 4 个点，采样频率为3 k h z 。这种方案采用外部叠加6 4 帧数据后，计算机取样一次，然后再叠加6 4 帧，计算机再取样一次；每次取样间隙，计算机对取样的数据进行处理。这样将计算机与外部硬件结合起来，将大量的数据处理任务分流到系统的各个组成部分，各部分的利用率都很高，综合成本大大降低。而采用大规模可编程器件代替中小规模集成电路通过f p g a 芯片来实现大部分的叠加、处理、传输和控制功能，则大大降低了电路的规模，解决了系统需要器件太多、布线工作量大、逻辑设计复杂的问题。整体电路框图如图3 5 所示。图3 5 整体电路框图2 1第四章t r f i a 荧光信号检测系统的实现及信号处理t r f i a 荧光信号检测系统，整体上可以分为两大部分：第一部分是荧光信号产生部分，即激光器激发样品池产生荧光信号，包括使得荧光准确地传输到光电倍增管的光路调节；第二部分是荧光信号接收及处理部分，关键是数据处理系统。荧光信号检测系统组成框图如图4 1 所示。荧光信号接收检测及处理部分图4 1 荧光信号检测系统组成框图4 1 基于高速数字b o x c a r 的数据检测系统的设计思想t r f i a 荧光信号检测数据处理系统主要由高速数字b o x c a r 和计算机组成。其中，b o x c a r 主要是完成数据的高速采集、存储、硬件处理、传送，为系统的硬件部分。而计算机主要获得数据，分析得出有用的信息并显示输出保存，为系统的软件部分。系统如图4 2 所示，由高速a d 转换器、基于f p g a 的数字b o x c a r 、u s b 传输模块和计算机构成。高速a d 完成对模拟信号的a d 转换，得到的数字信号输入到高速b o x c a r 进行累加处理，处理好的数据由u s b 输入到计算机。由图4 2 分析可知，数据处理系统由以下几部分组成：a d 转换模块，实现模拟信号的采样、模数转换。高速数字b o x c a r ，实现数字信号的叠加及处理、存储，包括转换和传输。u s b 模块，实现计算机与外设的数据通讯。计算机，实现数据软件处理。信号数据数据图4 2 基于高速数字b o x c a r 的数据处理系统4 1 1a d 转换器这里a d 选用a d 7 7 0 5 芯片，它是a d 公司出品的适用于低频测量的a d 转换器。它能将从传感器接收到的很弱的输入信号直接转换成串行数字信号输出，而无需外部放大器。采用的a d c ，实现1 6 位无误码的良好性能，片内可编程放大器可设置输入信号增益。在+ 3 v 电源和1 m h z 主时钟时，a d 7 7 0 5 功耗仅是l m w 。a d 7 7 0 5 是基于微控制器( m c u ) 系统的理想芯片，能够进一步节省成本、缩小体积、减小系统的复杂性” 1 4 1 0a d 7 7 0 5 的输入通道是2 个全差分