（生物化学与分子生物学专业论文）重组cambp10的表达、纯化与鉴定.pdf

南开大学硕士毕业( 学位) 论文 摘要 摘要 钙调素( c a m ) 是c a ”信号传导系统中极其重要的组成部分，其诸多调节功能是通过与其 结合蛋白( c a m b p ) 的相互作用而实现的。因此钙调素结合蛋白的研究对了解c a ”c a m 信号 转导系统有重要意义。c a m b p 1 0 为本研究组近年在中国大白菜中发现并分离得到的一种新 的具有重要生理意义的钙调素内源结合蛋白，在前期研究中已经克隆得到了c a m b p i 0 成 熟蛋白的e d n a 全序列，通过各种比较确认c a m b p - i o 是植物非特异性转脂蛋白家族 ( n s l t p s ) 中的新成员，这是c a m b p s 与n s l t p 之间关系的首报。 为了深入研究c a m b p 1 0 的结构与功能，最终揭示其与c a m 之间的调节机制，本文根 据编码c a m b p i o 成熟蛋白n 端和c 端的氨基酸顺序设计表达引物，进行p c r ，通过鉴定后 将其克隆到表达载体p e t 一3 2 a 中，并在c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t r x b 宿主菌中实现了融合蛋白 的高表达。融合蛋白通过h i s b i n d 柱初步纯化后，用肠激酶进行酶切，酶切产物再次通 过该柱纯化，最终获得高纯度的重组c a m b p - i o 。免疫印迹鉴定和c a m 结合活性分析结果确 证重组c a m b p - i o 与大白菜中纯化的天然c a m b p 一1 0 具有相同的免疫识别功能和c a m 结合特 性。在此基础上，通过荧光脂质结合实验表明c a m b p 1 0 具有结合脂肪酸分子的活性，进 一步验证了c a m b p 一1 0 是一个n s l t p 。综上所述，本文通过分子生物学手段使c a m b p i 0 在 原核系统得到了高表达，重组c a m b p i 0 纯度高，并保持了天然c a m b p - i o 的活性，为今后 对c a m b p i 0 结构和功能的研究奠定了良好的基础。 关键词：c a m ，c a m b p 1 0 ，转脂蛋白，表达与鉴定 南开大学硕士毕业( 学位) 论文摘要 a b s t r a c t c a l m o d u l i n ( c a m ) i n i t i a t e s s i g n a lp a t h w a y s a n d u l t i m a t e l yr e g u l a t e s p h y s i o l o g i c a lp r o c e s sb yi t si n t e r a c t i o nw i t ha v a r i e t y o f p r o t e i n sc a l l e d c a m - b i n d i n gp r o t e i n s ( c a m b p s ) 4 i d e n t i f y i n gc a m b p sa n da n a l y z i n gt h ef u n c t i o n o ft h e s e p r o t e i n sh a v e b e e na na r e ao f i n t e r e s t c a m b i n d i n gp r o t e i nb p 1 0 ( d e s i g n a t e dc a m b p 一1 0 ) i s an o v e l p l a n te n d o g e n o u sc a m b pw i t h i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s i np r e l i m i n a r ys t u d y 。t h ef u l lc d n as e q u e n c eo fc a m b p 1 0 h a sb e e ni s o l a t e d a f t e rv a r i o u sc o m p a r i s o n s ，w em a d et h ec o n c l u s i o nt h a tc a m b p 1 0 i san e wm e m b e ro fp l a n tn o n s p e c i f i cl i p i dt r a n s f e rp r o t e i n s ( n s l t p ) t h i si s t h e f i r s tr e p o r tt h a tac a m b pi san s l t p f o r t h ep u r p o s eo fd e m o n s t r a t i n gt h es t r u c t u r ef e a t u r e so fc a m b p i 0 ，a n d c o n s e q u e n t l y ，e l u c i d a t i n gt h eb i n d i n gw a ya n dr e g u l a t i v em e c h a n i s m ，w ed e s i g n e d as e to f p r i m e r s ，a n db yu s i n gp c r ，t h ec d n as e q u e n c ee n c o d i n gc a m b p l ow a si s o l a t e d t h e nt h eo d n aw a si n s e r t e di n t oa ne x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 aa n dt h er e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s e x p r e s s e di ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t r x b a f t e rt h a t ，t h er e c o m b i n a n t p r o t e i n w a sp u r i f i e db yh i s b i n dc o l u m n ，t h e nd i g e s t e d b ye n t e r o k i n a s e b yp a s s i n gt h r o u g h h i s b i n dc o l u m n a g a i n ，t h e c l e a v a g ep r o d u c t ，c a m b p 1 0 ，w a s o b t a i n e d i m m u n o d e t e c t i o na n dc a m b i n d i n ga s s a yc o n f i r m e dt h a tt h er e c o m b i n a n tc a m b p 一1 0h a d t h es a m ei m m u n er e c o g n i t i o na n dc a m b i n d i n ga b i l i t ya st h a tp u r i f i e df r o mc h i n e s e c a b b a g e a c t i v i t yd e t e r m i n a t i o nb yf l u o r e s c e n tl i p i dp - 9 6s h o w e dt h a ti th a dl i p i d b i n d i n ga c t i v i t y ，w h i c hf u r t h e rp r o v e dt h a tc a m b p - 1 0i san s l t p a ss t a t e da b o v e 2 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 b yu s i n gp e ts y s t e mc a m b p 1 0w a se x p r e s s e di nl a r g ea m o u n ta n dw i t hh i g hp u r i t y f u r t h e rm o r e ，t h er e c o m b i n a n tc a m b p 1 0h a st h es a m ea c t i v i t ya st h ec o r r e s p o n d i n g p r o t e i ni s o l a t e df r o mc h i n e s ec a b b a g e t h e r e f o r e ，i tc a nb eu s e di nt h er e s e a r c h o ft h es t r u c t u r ea n df u n c t i o nf e a t u r e so fc a m b p - i o k e yw o r d s ：c a m ，c a m b p - i 0 ，n s l t p ，e x p r e s s i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n 3 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 一、钙离子钙调素信号转导系统 前言 钙离子作为细胞信号传导分子，在生物细胞中起的关键作用已得到广泛的认可 ( p o o v a i a h 等，1 9 8 7 ，r o b e r t s 和h a r m o n ，1 9 9 2 ，p o o v a i a h 和r e d d y ，1 9 9 3 ，b u s h1 9 9 5 ) 。 植物体内的许多生理活动都与c a ”密切相关，如离子平衡，细胞质流动、器官极性发育、 花粉管生长、碳水化合物代谢，有丝分裂、基因表达以及对生长素和损伤的反应 ( h e t h e r i n g t o n 和t r e w a v a s ，1 9 8 2 ) 。在静息条件下，植物细胞内c a ”浓度在 1 0 1 m o l l l o “m o l l 之间；细胞受到刺激后，导致胞内c a ”浓度的迅速上升，从而引发一 系列生理生化反应( r o b e r t s 和h a r m o n ，1 9 9 2 ，b u s h ，1 9 9 5 ) 。真核生物中钙离子浓度的瞬 时提高刺激一系列钙离子感受器( 钙离子结合蛋白) ( r o b e r t s 和h a r m o n ，1 9 9 2 ) 。在植物 中大量的钙离子感受器已被发现，钙离子感受器分为四类，包括钙调素( c a m ) ，类似钙调 素和其他含e f 手结构域的钙离子结合蛋白，钙离子调控蛋白激酶和无e f 手结构域的钙离 子结合蛋白。其中前三类钙离子感受器含有h e l i x l o o p h e l i x 结构域，即e f 手结构，此 结构对钙离子有高亲和性。不同的钙离子结合蛋白e f 手结构域数量不同，因此对钙离子 的亲和性也不同。钙离子结合蛋白结合c a ”以后，构象发生变化，暴露出结合位点，通过 与各种靶蛋白的结合，参与众多细胞过程和生理功能的调节( a s n r e d d y 。2 0 0 1 ) 。 1 9 6 7 年c h e u n g 发现的钙调素( c a l m o d u l i n , c a m ) 具有最广泛、最重要的调节功能， 它作为主要的钙受体蛋白参与多种酶和众多细胞过程的调节，是钙离子信号转导系统中的 基本组分( r o b e r t s 和h a r m o n ，1 9 9 2 ) 。c a m 是一种耐热的、酸性的小分子蛋白，由1 4 8 个 氨基酸组成。对不同来源的c a m 分析表明其氨基酸组成具有高度保守性。钙调素晶体结 构表明c a m 具有两个球形结构域( 氨基末端结构域和羧基末端结构域) ，每个球形结构域 含有两个e f 手性结构，结合了两个c a 2 + ，由中间一松散的a 螺旋连接两个球状结构域， 整个分子成哑铃形状。( j a m e s 等，1 9 9 5 ；z h a n g 等，1 9 9 5 ；孙大业等，1 9 8 4 ) ( 图1 ) ( 图2 ) 。 在钙调素结构中两端球形结构域在不与c a 2 + 结合时有一较浅的疏水穴，其周围是一些带负 电荷的酸性氨基酸残基，如g l u ，同时在其表面常分布有几个甲硫氨酸残基，c a 2 + 与c a m 的结合能诱导c a m 的构象发生较大变化，主要表现为疏水穴的扩大与加深，分子延长。 ( z h a n g 等，1 9 9 5 ) 4 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 前言 图l 牛脑钙调素的级结构 辑了。：、 强- ，“漱。 毫c 汜黧i 。 图2 钙调素晶体结构示意图 5 堕墅查兰堡主望些! 兰堡! 丝苎! ! 童_ 二、钙调素结合蛋白 钙调素本身并没有任何酶活性，它在生物体内的诸多调节功能是通过与其结合蛋白的 相互作用而实现的。钙调素结合蛋白( c a m b p s ) 从广义上说是指能和c a m 结合的所有蛋白， 包括已经确定其活性直接受c a m 控制的各种酶类，以及在体外或体内能和c a m 结合，但功 能和性质都有待深入探讨的各种未知蛋白；从狭义上说，钙调素结合蛋白仅指那些能和c a m 结合但功能尚未确证的蛋白质( 唐军等，1 9 9 5 ) 。钙调素与不同c a m b p 的相互识别相互作 用，产生不同的生理效应。免疫细胞化学研究结果表明，钙调素作为重要的多功能调节蛋 白在组织细胞中的分布和含量变化与细胞类型、细胞周期和细胞功能状态直接相关，与之 特异结合的c a m b p 也随之发生相应改变( z i e l i n s k i ，1 9 9 8 ) 。近年来人们对植物c a ”c a m 信 号转导系统的研究主要集中于对钙调素结合蛋白的分离和鉴定( a s n r e d d y ，2 0 0 1 ) 。 目前，有关动物细胞中的钙调素结合蛋白的信息较多。到1 9 9 8 年为止，已经发现3 0 余类钙调素结合蛋白，其中包括各种代谢酶，蛋白激酶、膜载体、转录因子、细胞骨架蛋 白等等( d a s h 等，1 9 9 7 ，z i e l i n s k i ，1 9 9 8 ) ，涉及动物细胞中的许多生理过程。近年来越 来越多的植物钙调素结合蛋白被发现，包括n a d 激酶( a n d e r s o n 和c o r m i e r ，1 9 7 8 ，r o b e r t s 等，1 9 8 5 ) 、c a - a t p a s e ( d i e t e r 和m a r m e ，1 9 8 1 ，m a l a t i a l y 等，1 9 8 8 ) 、细胞核n t p a s e ( c h e n 等，1 9 8 7 ) 、谷氨酸脱羧酶( l i n g 等，1 9 9 4 ) ，驱动蛋白( r e d d y 等，1 9 9 6 ) ，叶绿体伴侣蛋 白( y a n g 等，2 0 0 0 ) 鳌和钙钙调素依赖性蛋白( p a t i l 等，1 9 9 5 ) 等等。已知的钙调素 结合蛋白表明参与许多生理过程包括离子运输，基因调控、细胞骨架组织，细胞分化和疾 病抵抗的众多蛋白都与钙调素相互作用。这种钙调素结合蛋白功能的多样性意味着他们可 能参与植物中多种功能的调节( s n e d d e n 等，1 9 9 8 ) 。故鉴别和发现新的植物c a m 内源结合 蛋白，研究其性质和结构特点，阐述其在c a ”c a m 调节体系中的功能作用是目前极其重要、 极具有挑战性的研究领域( z i e l i n s k i ，1 9 9 8 ) 。 尽管c a m 的一级结构在植物、动物和酵母间是高度保守的，但近年来，对这一些c a m b p s 的氨基酸顺序的阐明，发现不同的c a m b p 其氨基酸顺序并不保守。但不同的钙调素结合蛋 白的钙调素结构域大都形成结构保守的碱性双亲a 一螺旋( b a s i ca m p h i p h i l i c h e l i x b a a ) 结构( d a s h 等，1 9 9 7 ，z i e l i n s k i ，1 9 9 8 ) ，并己确认这种b a a 结构为c a m 结合结构域 6 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 前言 的结构特点( d a s g u p t a ，1 9 8 9 ，0 n e l l 和d e g r a d e ，1 9 9 0 ，l u 和h a r r i n g t o n ，1 9 9 4 ，l u 等 1 9 9 5 。d a s h 等，1 9 9 7 ) 。该结构域的特征为1 2 2 0 个或者更多的氨基酸形成一个一侧主要为 亲水残基，另一侧为疏水残基的螺旋轮状投影( 图3 ) 。b a ac a m 结合结构域的另一个共同 特点是色氨酸的存在，它使b a a 结构有一定的柔性，因而有利于结合蛋白和c a m 的高亲和 性可逆结合( s t e v e n s o n 和c a l d e r w o o d ，1 9 9 0 ) 。有几项研究利用合成的b a a 结构及c a n 3 p s 的水解片断证明c a m 与b a a 结构的结合有高度的亲和性和广泛的特异性( 0 n e i l 和 d e g r a d o ，1 9 9 0 ) 。l u 和h a r r i n g t o n 的首次证明了植物c a m b p s 也存在b a a 结构。 图3 血影蛋白c a m - 结合结构域的典型b a a 结构 通过研究c a m 与其结合蛋白的结合方式发现，c a m 与其结合蛋白以不同方式结合，其 中大多数遵循钙依赖性的f l i p f l o p 模式，也有部分为钙不依赖性结合。不依赖于钙离子 的钙调素结合蛋白具有特殊的钙调素结合结构域，称为i q 结构域。此结构域具有保守序 列“i q x x x r g x x x r ”( r e d d y 等，2 0 0 1 ) 。尤为引人注目的是，a n d r e a s o n 等人在动物中发 现n e u r o m o d u l i n ( g a p _ 4 3 ) 与c a m 的结合受钙的抑制，因此，v a ne l d i k 等人认为c a m 分子 具有多个与c a m b p 相互作用的功能区。使得c a m 在细胞中区域化( c o m p a r t m e n t a l i z e d ) ， 其中不依赖于钙的结合起到掩蔽和锚定c a m 的作用，从而消除其在胞浆中的自由扩散，抑 制其对靶酶的钙依赖性激活。这一发现提出了一种新的c a m 结合模式( g e r e n d a s v 等，1 9 9 4 ) 。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 三、钙调素结合蛋白b p _ 1 0 的研究进展 本研究组经过多年努力，从植物中分离得到了一种全新的钙调素结合蛋白( 尚克进等， 1 9 9 1 ) 。这一蛋白具有较好的热稳定性，s d s p a g e 表观分子量为l o k d ，故暂命名为 c a m b p - 1 0 。它通过与c a m 的结合而抑制靶酶p d e i 的激活。它与钙调素的结合特性十分特 殊，非但不依赖于钙离子，反而在钙离子螯合剂e g t a 的存在下与钙调素有更大的亲和力。 这一发现打破了一般钙调素结合蛋白与钙调素结合时遵循的依赖于c a ”的f l i p f l o p 模式， 预示存在着一种新的结合模式。 通过对c a m b p 1 0 进一步比较全面和深入的研究，发现c a m b p - i o 通过与c a m 的特异结 合对生长素诱导的细胞伸长和酸分泌( 凌启阆等，1 9 9 3 ) ，质膜h - a t p a s e 活性及磷酸化作 用的调节( 刘华等，1 9 9 8 ，向左云等，1 9 9 8 ) ，n a d 激酶的激活活性( 凌启阆等，1 9 9 6 ) ， 光合电子传递和光合磷酸化( 尚克进等，1 9 9 4 ) 以及类囊体膜蛋白的磷酸化( 李翠凤等， 1 9 9 7 ) 均有显著影响。这表明c a m b p 1 0 在植物应答、光合作用的调节等诸方面具有重要 功能。c a m b p 1 0 作为c a m 的内源结合蛋白，就其与c a m 结合性质的特殊性、分子量的大小、 热稳定性质及所显示的重要细胞功能等来看，均不同于已知的植物c a m 靶酶或结合蛋白， 为一种新的国内外均未见报道的具有重要生理意义的c a m 结合蛋白。 本实验组近年来分离纯化了少量c a m b p - i o 纯净样品，通过氨基酸分析获得了其部分 氨基酸序列，据此设计简并引物，利用r t p c r 法已经克隆n tc a m b p 1 0 成熟蛋白的a d n a 全序列。如图4 所示，e d n a 全序列具有2 7 6 b p 的开放读码框，编码9 2 个氨基酸，后面有 2 0 9 b p 的非编码序列和p o l ya 。蛋白质一级结构分析显示其分子量为9 3 8 4 8 d 。p l = 9 3 6 。 分子中富含a l a ( 1 3 ) ，含8 个c y s ，不含h i s ，t r p ，g l u 。碱性氨基酸、酸性氨基酸和疏水氨 基酸的含量分别为9 8 、1 1 和2 6 1 。 g c tc t ca c tt g tg g aa c tg t ta g cg g ta a ct t gg c ag c at g ca t t4 5 alt cgtvsgnlaa ci 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 前言 g g ct a ct t aa c cc a aa a tg g gc c cc t tc c ca g ag g gt g ct g ca c c9 0 gylt q ngplprgcct g g cg t ta c t 从tc t a 从ca a ca t gg c cc g ta c aa c ec c gg a cc g t1 3 5 g vt nlnnmarttpdr c a gc 触篮tt g cc g tt g tc t tg t ag g ag c cg c ta a ct c ct t cc c t1 8 0 qq a crclvgaansfp a c tc t ca a cg c tg c cc g ag c tg c tg g ac t tc c t 从gg c at g tg g a2 2 5 tln aaraaglpk acg g t ca a ta t tc c tt a ca a a 盯ca g ca aa g ca c ca a ct g ca a ca g c2 7 0 v nipykisk stncns g t ta g a 圆g c g g c g g t c gg a t g a a g a a ac t c a a g c g g a c g t a c g a a t c3 1 9 v r t a a t a t a a t g t a t g a g a g a g t a c t a a a t a ag a t g t t g t t tt t c t a g t g t t 3 6 9 t t a a a a t t t c a t g t t t c t c t t c t g t t g t g tc g t t c c t l u r ac t t t g g t t g t 4 1 9 a t g t a c t a t gt t c g t a a t c a a c g t c c g c t at a t g a a g t t c g t a a a a a a a a 4 6 9 图4c a m b p 1 0 的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列 注：方框标出的是终止密码子，斜体部位为p o l y ( a ) 尾巴 p r e d i cp r o t e i n 软件对蛋白= 级结构预测表明分子中螺旋区含量较高，占总结构的 2 9 4 。( 图5 ) 9 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 从a l t c g t v s g n l a a c i g y l t q n g p l p r g c c t g v t n l n n m a r t t p d r o q a c r c l v g a a n s f p p h ds e c e eh h h h h h h h h h h h hh h h h h h h h h h h h h h a a t l n 从r 从g l p k a c g v n i p y k i s k s t n c n s v r 图5 克隆c d n a 所编码的蛋白质的二级结构预测 注：从表示氨基酸顺序；p h d s e c 表示用肿预测的蛋白质= 级结构 h ( h e l i x ) 为螺旋结构，e ( e x t e n d e d ) 为伸展结构 其中第4 6 位到第5 9 为的氨基酸序列形成了一个由1 4 个氨基酸组成的碱性双亲a 一螺 旋，即b a a 结构( 图6 ) 。疏水氨基酸位于螺旋轮的一侧，亲水氨基酸和带正电荷的碱性氨 基酸位于螺旋轮的另一侧，这种结构是迄今发现的大多数c a m b p 的c a m 结合d o m a i n 的共 同特征( o n e i l 等，1 9 9 0 ) 。 图6c a m b p - 1 0 第4 6 - 5 5 位氨基酸形成的b a a 结构 1 0 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 用n c b i b l a s t 的同源搜寻系统分析表明，c a m b p 一1 0 核苷酸序列与非特异性转脂蛋白 b r a s s i c an a p u sg e r m i n a t i o n s p e c i f i cl i p i dt r a n s f e rp r o t e i n2m r n a 周源性高达9 7 ( 图7 ) 。其氨基酸序列与非特异性转脂蛋白a c y l b i n d i n g l i p i d t r a n s f e rp r o t e i n i s o f o r mi i i ( a b l t pi i i ) r a p e 同源性高达9 7 ，与b r a s s i c a n a p u s g e r m i n a t i o n s p e c i f i cl i p i dt r a n s f e rp r o t e i n2 的同源性高达9 6 ( 图8 ) 。 b p 一1 01 g c t c t c a c t t g t g g a a c t g t t a g c g g t a a c t t g g c a g c a t g c a t t g g c t a c t t a a c c c a a6 0 i t p 2 13 4g c t c t g a g c t g t g g c a c c g t t a g c g g c t a c g t g g c a c c g t g c a t t g g c t a c t t a a c c c a a19 3 b p _ 1 06 1 a a t g g g c c c c t t c c c a g a g g g t g t t g t a c t g g c g t t a t t a a t t t a a a c a a c a t g g c c c g t1 2 0 l | i i i | i | l i | i i i | i l i | i i | i | | l l l i i l i l | | | | | | l 1 | i | l | | | i l i | i | i t p 2 19 4a a t g g 譬c c c c t t c c c a g a g g g t g c t g c a c c g g c 暑t t a c t a a t c t a a a c a a c a t g g c c c g t2 5 3 8 p - 1 01 2 1 i t p 2 2 5 4 a c a a c c c c g g a c c g t c a g o a a g c t t g c c g t t g t t t t g t a g g a g c c g c t a a c t c c t t c c c t18 0 | | i i | i | i i i | l l | l i l | | 1 | i | | i | | l | l | l | 1 | i i | | | | | i | | | | | 1 | | | i i a c a a c c c c g g a c c g t c a g c a a g c t t g c c g t t g t c t t g t a g g a g c c g c t a a c t c c t t c c c t3 13 b p _ 1018 1 a t t c t c a a c g c t g t e c g a g c t g c t g g a t t t c c t a a g g o a t g t g g a g t e a a t a t t c t t t g c2 4 0 i t p 2 3 14a c t c t c a a c g c t g c c c g a g c t g c t g g a t t t c c t a a g g c a t g t g g a g t o a a t a t t a c t t a c3 7 3 b p - 1 02 4 1a a a a t c a g c a a a a g c a c c a a c t g c a a c a g c g t t a g a t g a g c g g c g g t c g g a t g a a g a a a c3 0 0 i l i i i i i i l i l l i i i i i i i i i i i i l i i i i i i i i i i i i | l i | i i i i i i i i i i i i l i i i l | i i t p 2 3 7 4a a a a t t a g t a a a a g c a c o a a c t g c a a c a g c g t t a g a t g a g o g g c g g t c g g a t g a a g a a a c4 3 3 b p _ 1 03 0 1t c a a g c g g a c g t a c g a a t c t a a t a t a a t g t a t g a g a g a g t a c t a a a t a a g a t g t t - g t t3 5 8 i | i i i i l | i i i i i f i | l i l | l | i i l | i | i i | l | i | | i i i ii l l l | | i | li | l t p 2 4 3 4t c a a g c g g a t g t a t g a a t c t a a t a t a a t g t a t g a g a g a g t a c t a a a t t a a g a t g t t a g t t4 9 3 b p 一1 03 5 9t t t c t a g t g t t t t a a a a t t t c a t g t t t t t c t t c t g t t g t g t c g t t c c t t t a c t t t g g t t g4 1 8 i i j j i ij i i j i ij j l jj jj jj j i i j | j j i l | l i t p 2 4 9 4t t t c t a g t g t t t t a a a a t t t c a t g t t t c t c t t c t g t t g t g t c g t t c c t t t a c t t t g g t t g5 5 3 堕茎盔兰里主兰些! 堂堡! 堕苎! ! 互 b p - i o4 19t a t g t a c t a t g t t c g t a a t c a a c g t c c g c t a t 8 t g a a g t t c4 5 9 i t p 2 5 5 4t a t g t a c t a t g t t c g t a a t c a a c g t c c g c t a t a t g a a g t t c5 9 4 图7c a m b p - i o 核苷酸序列与转脂蛋白的同源性比较 1 02 0 3 03 5 a l t c g t v s g n l a a cig y l t q n g p l p r g c c t g v t n l s + _ + s 4 05 06 07 0 n n m a r t t p d r 0 0 a c r c l v g a a n s f p t l n a a r a a g l + a + + 十+ 8 0o9 2 p k a c g v nip c kis k s t n c n s v r + + 图8c a m b p - o 氨基酸序列与转脂蛋白的同源性比较 通过核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较初步认为c a m b p l o 是非特异性转脂蛋白 家族的新成员。 转脂蛋白( 1 i p i d t r a n s f e rp r o t e i n ，l t p s ) 广泛存在于动物、植物和微生物。转脂 蛋白分为特异性转脂蛋白和非特异性转脂蛋白( n s l t p ) 两大类。特异性转脂蛋白对- - n 两种磷脂具有特异性结合，比如牛肝脏的卵磷脂转移蛋白( w r t z 等，1 9 9 i ) ：而非特异性 1 2 舯w c a 0咿 m啦删 卜 啪m 塑茎查堂堡主堡些! 堂堡! 兰苎! 旦一 转脂蛋白可以转移多种脂类。( k a d e r 等，1 9 9 6 ) 非特异性转脂蛋白在植物组织中含量丰富， 从不同植物组织中已经分离和鉴定了多种非特异性转脂蛋白。非特异性转脂蛋白具有一些 共同特征。它们都是碱性蛋白( 等电点在8 8 1 0 0 之间) 、都具有热稳定性，表观分子量 较小，约为9 - l o k d a ( k a d e r ，1 9 9 7 ) 。大量的研究表明，植物中非特异性转脂蛋白序列的 同源性不高，但具有很强的结构同源性( g o m a r 等，1 9 9 7 ) 。在植物非特异性转脂蛋白中都 含有8 个位置高度保守的c y s ( y a m a d a 等，1 9 9 2 ) ，其位置如图6 ，它们的分布模式为： 2 3 一c - 8 1 2 1 5 一c c 1 9 _ c 一1 一c - 2 1 2 3 一c 一1 3 一c 一4 8 ，它们两两配对形成二硫键，而且植物 非特异转脂蛋白中二硫碱的交连模式与其特定构象的形成和转脂功能的实现直接相关，受 到自然选择的保护( o s t e r g a a r d 等。1 9 9 5 1k a d e r 等，1 9 9 6 ：g r o s b o i s 等，1 9 9 3 ) 。核磁 共振、红外和拉曼光谱分析发现非特异性转脂蛋白主要由a 一螺旋组成 ( d e s o r m e a u x 。1 9 9 2 ) ，螺旋间通过二硫键连接，形成非常稳定的分子( k a d e r ，1 9 9 6 ) ( 图9 ) 。 在序列同源性和c y s 保守性的基础上g e n eb a n k 中有1 0 0 多个核苷酸序列鉴定为非特异性 转脂蛋白( g u e r b e t t e ，1 9 9 9 ) 。 图9 植物转脂蛋白晶体结构示意图 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 前言 近年来，虽然从许多植物中已经分离了编码非特异性转脂蛋白的基因，但其功能仍未 阐明清楚( l i n d o r f f - l a r s e n ，2 0 0 1 ) 。转脂蛋白在体外实验中可以与酰基链结合，在质膜间 转移磷酸脂。基于这点性质，它过去被认为参与质膜的生物合成和胞内脂肪酸库的调节 ( k a d e r ，1 9 9 6 ) 。但是，序列分析表明转脂蛋白合成一段信号肽，这段信号肽在体外能够指 导蛋白插入内质网腔内。由于他们没有使蛋白固定于内质网内的信号k d e l ，转脂蛋白应该 进入了分泌途径( s t e r k 等，1 9 9 1 ；c o u t o s 等，1 9 9 3 ；s o s s o u n t z o v l 等，1 9 9 1 ：t h o m a 等， 1 9 9 3 ；m a d r i d 等，1 9 9 1 ) 。也就是说，转脂蛋白是胞外定位的分泌性蛋白。这就暗示l t p s 可能具有更多的功能，比如参与种子胚胎的发育，角质屏障的形成、对病原体的防御及对 环境条件的适应等。对这些功能的确定以及它们如何行使这些功能，是目前转脂蛋白亟待 研究的课题( k a d e r 等，1 9 9 6 ) 。 四、 c a m b p 一1 0 与植物非特异性转脂蛋白的进一步比较 比较c a m b p 1 0 与n s l t p ，不仅在核苷酸和氨基酸序列同源性高达9 7 ，而且具有极 为相似的生物化学和生物物理性质。如根据序列测得c a m b p - i o 的分子量何等点电分别为 9 3 8 4 8 k d a 和9 3 6 ，与n s l t p 一致；c a m b p 一1 0 分子中缺乏t r p 和h i s ：m e t ，t y r 和p h e 的 含量极低( 皆为1 1 ) ，而复含a l a ( 1 3 ) 。此氨基酸组成特点也与n s l t p 一致( o s e r g a a r d 等，1 9 9 5 ) ：特别是c a m b p 一1 0 具有8 个位置与n s l t p 完全一致的c y s ( 图1 0 ) 。 此外，我们还对大白菜c b m b p - i o 与非特异性转脂蛋白在生化性质及层析行为等方面 作了细致的比较，结果( 表一) 发现两者在生化性质的许多方面有惊人的相似之处 ( t s u b o i ，1 9 9 1 ，k a d e r ，1 9 9 6 ) 。总之，c a i 衄p 一1 0 除了在氨基酸序列上与植物非特异性转脂 蛋白高度同源外，在分子量大小，氨基酸，蛋8 - 级结构，生化性质及层析行为等方面都 与植物非特异性转脂蛋白惊人的相似。 1 4 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 n s l t p 41 42 9 3 05 0 5 27 58 9 c a m b p - i o 41 42 9 3 05 0 5 27 5 图1 0植物n s l t p s 和c a m b p 1 0 中的c y s 的分布 植物中大部分转脂蛋白c a m b p 一1 0 表观分子量 9 - 1 0 k d ai o k d a 等点电碱性蛋白质，等电点9 左右碱性蛋白质，等点电在8 左右 热稳定性 9 0 。c3 0 分钟，活性不变沸水浴3 1 0 分钟，活性不变 使用硫铵沉淀( 7 6 饱和度) 、使用硫铵沉淀( 7 0 - 8 0 饱和 纯化手段d e a e - 纤维索柱( 不结合部分) 、度) 、d e a e - 纤维素柱( 不结合 凝胶过滤和反向高压液相层析部分) 及s e p h a d e xg - 1 0 0 从可 从可溶性蛋白中分离溶蛋白中分离纯化 表1c a m b p - i o 和植物中大部分转脂蛋白的生化性质比较 综上所述，c a m b p - i o 是n s l t p 家族中的新成员。迄今为止，没有关于转脂蛋白与钙调 素及其结合蛋白相关性的报道，本实验室首次报道了一个c o m l b p 是n s l t p ，这一结果将有 助于拓宽对c a 2 + c a m 调节体系的全面认识。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 五、p e t 原核表达系统 p e t 表达系统是在大肠杆菌中克隆和表达融合蛋白的最有效的系统之一。目的基因被 克隆到不为大肠杆菌r n a 聚合酶识别的t 7 启动子下游，因此在加入t 7r n a 聚合酶之前几 乎没有表达发生，克隆到p e t 载体的基因实际上是被封闭的，不会由于产生的蛋白对细胞 有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转化到 d e 3 噬菌体溶源化的大肠杆菌中，xd e 3 噬 菌体基因组中含有由l a c u v 5 控制的t 7r n a 聚合酶基因。加入i p t g 诱导表达后，大肠杆 菌聚合酶从 d e 3 基因组上转录出t 7 r n a 聚合酶，后者再转录出目的基因( 图1 1 ) 。t 7r n a 聚合酶的选择性和活性使几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产 物就可超过细胞总蛋白的5 0 。这个表达系统有几个优点：( 1 ) t 7r n a 聚合酶的转录效率 非常高，它识别的启动子是强启动子；( 2 ) 不会与宿主基因争夺r n a 聚合酶和其他转录因 子；( 3 ) 在所有大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低，防止