（生物物理学专业论文）50hz低频弱磁场诱导egf受体聚集效应的研究.pdf

摘要 在配体缺或的情况下，极低频弱磁场( e l f m f ) ( 0 4 r o t ，5 0 h z ) 作用于中 国仓鼠肺成纤维( c h l ) 细胞，观察到细胞膜表皮生长因子受体( e g f r ) 发生 了同配体诱导类似的、能激活e g f r 信号通路的、时间依赖性的磁场诱导的聚集 ( c l u s t e r i n g ) 现象。利用原子力显微镜( a f m ) 、透射电子显微镜( t e m ) 以及 激光共聚焦扫描荧光显微镜观察了磁场对离体受体聚集和对c h l 细胞上受体聚 集的影响。 由a f m 得到的结果显示，浓度为5 u g m l 离体e g f r 蛋白在工频磁场作用下 发生聚集，在两维尺度上出现二倍体、三倍体甚至更高程度的聚集，场作用后蛋 白聚集颗粒的平均半高宽由2 1 7 2 2 r i m 增大到3 3 0 + 4 0 n m ，最可几高度由 1 ，4 2 + 0 1 8 n m 增加到3 0 8 + 0 1 7 r i m 。利用透射电镜( t e m ) 也得到类似结果：e g f r 颗粒的平均直径由1 1 6 3 + i 1 1 增大到1 9 8 8 + 2 5 3 n m 。而且这种由磁场引起的聚 集效应明显呈时间依赖性，磁场作用9 0 分钟e g f r 蛋白的高度和大小变化逐渐 趋于饱和甚至减弱。利用a l e x a - 4 8 8 一e g f e g f r 结合实验以及共聚焦荧光显微镜 考察了磁场辐射对e g f e g f r 结合的影响，结果显示受配体平均结合能力稍有 提高，但没有显著性差异；利用还原态谷胱甘肽( g s h ) 还原离体e g f r 约一半 二硫键，结果显示没有影响磁场诱导的受体聚集；但是细胞实验和离体e g f r 实 验同时显示，e g f r 的特异性酪氨酸激酶抑制剂p d l 5 3 0 3 5 ( p d ) 显著地抑制了 磁场诱导的受体聚集。 上述结果表明磁场直接作用于e g f r 使其聚集，提示磁场作用的关键部位是 胞内酪氨酸激酶域，因此膜上受体也是低频弱磁场的可能作用位点之一。 关键词：e g f r ；聚集；极低频弱磁场；a f m ；时间依赖性；p d ；g s h + 国家自然科学基金资助，批准号：5 0 1 3 7 0 3 0 。 。2 0 0 4 年国家教育部留学回国人员基金资助。 a b s t r a c t e x t r e m e l yl o wf r e q u e n c ym a g n e t i cf i e l d s ( e l f m f ) o f 5 0 h zw i t l las t r e n g t ho f 0 4 m th a v e b e e ne v i d e n c e dt oi n d u c e c l u s t e r i n g o fe p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r r e c e p t o r 饵a f a ) o nc h i n e s eh a m s t e rl u n g ( c h l ) c e l l m e m b r a n e si n d e p e n d e n tt o e g f b i n d i n g ，a ne f f e c ts i m i l a rt ot h ee g f ro l i g o m e r i z a f i o nt r i g g e r e db yb i n d i n go f e g ft ot h er e c e p t o r , a ne f f e c td e p e n d e n tt ot h ee x p o s u r et i m eo fm fa n da ne f f e c t w h i c hw i l la c t i v a t et h ee g f r p a t h w a y b yu s i n ga t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ( a f m ) ， t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) ，a n dc o n f o c a ll a s e rs c m m i n gf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e ，t h e e f f e c t so fe l f m fo nt h ec l u s t e r i n go f p u r i f i e dr e c e p t o r s ，a n do f t h e r e c e p t o r si nc i t l c e l lm e m b r a n eh a v e i n v e s t i g a t e d r e s u l t sf r o ma f mi n d i c a t e dt h a t 5 u g n f lp u r i f i e de g f re x p o s e dt om ff o r 3 0 m i nw e r ei n d u c e dd o u b l e d ，t r i p l e da n de v e nh i g h e rd e g r e ep r o t e i nc l u s t e r i n gi n2 d i m e n s i o n s t h ea v e r a g eh e i g h to fa p p a r e n tc l u s t e r si n c r e a s ef r o m1 4 2 + 0 18 n l n f s h a m ) t o3 0 8 _ + 0 3 8n n l ( e x p o s e d ) a n dt h ea v e r a g eh a l f - w i d t hf r o m2 1 7 2 2 n mt o 3 3 o 4 0 r a n as i m i l a re f f e c to f2 - di n c r e a s ei nc l u s t e rs i z e sw a sa l s oo b s e r v e db y t e mw i t ht h e a v e r a g e d i a m e t e ri n c r e a s e df r o m11 6 3 + 1 1l n mt o19 8 8 + 2 5 3 n m f u r t h e r m o r e ，t h ec l u s t e r i n gw a st i m e d e p e n d e n tw i t ha s a t u r a t i o nt i m ea s9 0m i n u t e s t h et r e a t m e n t so fp u r i f i e de g f rb yr e d u c e dg l u t a t h i o l ( g s h ) d i dn o ta f f e c tt h e c l u s t e r i n gi n as t a t i s t i cl e v e l ，a n dt h ee g f e g f rb i n d i n ga b i l i t yw a sn o ta f f e c t e d s i g n i f i c a n t l yb yt h e i n t e r a c t i o no ft h ee l f m f , b u tp d l 5 3 0 3 5 ( p d ) ，a ne g f r s p e c i f i ct y r o s i n ek i n a s ei n h i b i t o r , i n h i b i t e dt h ee l f m f i n d u c e dc l u s t e r i n go fe o f r e i t h e ro f t h e p u r i f i e dp r o t e i n so ro f t h a ti nt h ec e l lm e m b r a n e s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee l f m fi n d u c e de g f r c l u s t e r i n gb yi n t e r f e r i n g d i r e c t l yw i t he g f r a n ds u g g e s t e dt h a tt h ec l u s t e r i n gw a sd u et ot h ei n t e r a c t i o no f t h e f i e l dt ot h ec y t o p l a s m i ck i n a s ed o m a i n i nc o n c l u s i o n ，t h em e m b r a n er e c e p t o rw a s a l s oo n e p o s s i b l ei n t e r a c t i o ns i t eo f e l f m f k e yw o r d s ：e g f r ；c l u s t e r i n g ；e l fm f ；a f m ；t i m e d e p e n d e n t ；p d ；g s h 贾彩丽硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 陈家森教授华东师范大学主席 乔登江教授华东师范大学 施永德教授复旦大学 孙洁林副教授上海交通大学 陈树德教授华东师范大学 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：避盈 日期： 学位论文授权使用声明 土。o j ：缸s _ 习a d 曰 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：睫_ 彩翮导师签名： 日期：三旦! 皇垒三塑立! 目日期： 垂钞 妒p f 。s j 华东师范大学硕士论文 第一章前言 随着不同频谱波段的新的应用，人类所处的电磁场( e l e c t r o m a g n e t i cf i e l d ，e m f ) 环境越来越复杂。微波炉、高压输电线、手机、电磁治疗仪等生产、生活及医疗器 械产生的高频电磁波可能给生物体带来的危害已经引起人们的广泛关注。但是，低 频弱电磁场如低频环境电磁场频率低( 0 - l k h z ) ，强度弱( o - 1 0 m t ) ，能量通量小， 不足以引起生物体内或受辐射细胞内的温度明显上升，引发的是非热生物效应 1 3 1 ， 因此低频弱电磁场对生物体的潜在危害还未能引起人们足够的重视。 已有研究结果表明，低频弱电磁场能在分子水平影响生物体功能，如引起d n a 的断裂 2 、改变某些酶的活性【4 。如今，无论是在发达国家还是非发达国家，低频 弱电磁场可能导致的各种健康效应正受到人们越来越多的关注，特别是对暴露于电 磁场中是否具有导致生物特性变异，比如癌变、行为改变、记忆丧失、帕金森症和 a l z h e i m e r 症等效应的问题的回答尤为迫切。这些疾病的临床症状所具有的更深度的 原因，例如电磁场辐射是否可通过影响细胞内信号通路、改变功能蛋白的表达和遗 传特性等方式从而导致细胞性态的变化；电磁场信号是如何作用于细胞，以及作用 靶点位于何处等，均迫切需要得到科学性解释。 然而，常规的流行病学研究方法敏感性低，对低频电磁场生物效应机制的研究 确定是不完善和不准确的。而将细胞信号转导的研究成果和方法用于解决电磁场非 热效应的机理问题更为合适。一般认为，膜系统( 包括膜、膜上离子通道、膜上受 体等) 作为信号通路中的起始点是最先感受电磁场的位点。有理论认为，细胞膜上 离子运动 5 、受配体结合参数 6 以及膜的组织、结构 7 的变化是低频弱电磁场作用 于生物体引起信号传导的重要原因。已有大量研究工作就低频弱电磁场对信号通路 的影响展开。有报道称，低频电磁场会引起胞内重要的第二信使钙离子的信号传导 的变化，5 0 h z 磁场可以激发p 3 8m a p 激酶信号通路【4 ，8 。我们前期的工作也表明， 胞外信号分子胰岛素在低频脉冲电场的作用下，分子构象发生改变( 参看附录i 中 圆二色谱法检测5 0 h z 脉冲电场对胰岛素二级结构的影响) ；经低频脉冲电场作用的 胰岛素与受体的结合能力降低，由此引起的酪氨酸化水平也降低，影响了胰岛素信 号通路的某些基因表达f 9 1 ，证明细胞外信号分子是电磁场的作用位点。 最近，孙文均等人发现o 4 m t5 0 h z 正弦磁场( m a g n e t i cf i e l d ，m f ) 作用于中国 仓鼠肺成纤维细胞诱导细胞膜表皮生长因子( e o f ) 受体发生聚集 1 0 1 ，提示细胞 膜上受体是低频电磁场信号传导的可能位点之一。本文从此现象出发，展开对低频 电磁场的可能的作用位点的研究。在此现象中，e g f e g f r 上游信号通路中的e g f 配体不存在( 不排除少量的自分泌的e g f ) ，磁场的作用位点可能是细胞膜和e g f 受体，因此本文以细胞膜和离体的e o f 受体为研究对象，从磁场对膜的流动性和对 第l 页共4 3 页 华东师范大学硕士论文 离体受体的分布状态的影响的角度，探讨磁场诱导受体聚集现象中磁场的作用位点 和作用机理。 众多显著的结果显示，生物膜在低频电磁场的非热生物效应中起着重要的作用， 如：5 0 h z 磁场诱导细胞膜结构和生物物理特性发生改变【1 1 ；5 0 h z0 2 5 n 1 t 低频电 磁场作用下，在膜环境中的腺苷酸激酶活性降低了5 5 ，而处于溶解状态的腺苷酸 激酶其活性不受此电磁场的影n 向 1 2 ，提示膜环境在磁场的生物效应中具有关键作 用。膜蛋白( 包括受体) 的功能活性又与生物膜的结构、功能有密切的联系1 1 ，1 2 ， 13 。膜蛋白的运动要受其周围的膜脂性质和相态的制约，质膜的流动性是保证其正 常功能的必要条件。当膜的流动性低于一定的阈值时，许多酶的活动和跨膜运输将 停止，反之如果流动性过高，又会造成膜通透性改变并影响膜蛋白功能的溶解。低 频电磁场对膜的流动性的影响也将直接影响膜上受体的聚集趋势，检测0 4 m t 5 0 h z 正弦磁场对膜流动性的影响将有助于探讨磁场诱导的e g f 受体聚集是否是膜 诱导性聚集。 对表皮生长因子( e g f ) e g f r 及其家族分子的研究近年来成为人们关注的热 点。一些癌症如乳腺癌、宫颈癌的发生被认为与e g f e g f r 信号的异常传导有关 1 4 】，因此可以通过研究e g f e g f r 的信号传导通路是否受到电磁场干扰来探讨电 磁场的生物学非热效应。e g f e g f r 信号传导系统是典型的信号跨膜传导系统。信 号跨膜传导系统具有信号级联放大的特点，有效地解释了低频弱电磁场能量小却效 应显著的现象。 就e g f e g f r 信号系统f 1 5 - 1 6 1 而言，位于细胞膜上的e g f 受体感受到胞外配体 e g f ，结合e g f 后受体构象改变，发生二聚化，经跨膜的c 【螺旋将信号传递到胞内， 受体的胞内酪氨酸激酶域激活即发生自磷酸化，进而结合大量底物包括p i 3 k 以及 g r b 2s h c ( 图l 蓝色箭头所指) ，使p i 一3 以及r a s 蛋白激活，并进一步激活 r a t - m e k e r i c 和p d k l 一a k t 两条通路，使e g f 的信号通过这两条通路级联传导 到细胞核内，引起基因调控和蛋白表达的改变，最终影响到细胞的增殖、死亡、分 化、有丝分裂以及细胞间粘连作用( 图1 ) 。整个信号传导过程呈现出一种级联放大 效应( 对某一条通路来讲是一种多米诺效应) ，其中受体二聚化是启动此信号系统、 激活e g f r 激酶活性的最初和关键一步 1 7 1 。因此，在配体缺或的情况下，可以通 过研究磁场诱导e g f r 聚集的机制，来帮助理解磁场是否和如何对e g f r 信号通路 产生影响的。 e g f r 对细胞的增值和生长具有重要作用，是细胞信号系统的一个重要成员， 与胰岛素受体类似，e g f r 属酪氨酸激酶家族，分子量约为1 7 0 k d a ，蛋白由1 1 8 6 个氨基酸残基组成，其中6 2 2 个位于膜外，2 3 个构成a h e l i x 跨膜域 1 8 。如图2a ， e g f r 分为三部分：胞外糖基化结构域、伍一h e l i x 跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。其中 第2 页共4 3 页 华东师范大学硕士论文 胞外结构域又分为四个子域 1 4 ，1 8 2 0 1 ( 图2b ，c ) ，其中d o m a i ni 和d o m a i n i i i 是配 体与受体结合的主要部位，是考查受配体结合参数的重要区域；d o m a i n i i 和 d o m a i n i v 含有2 1 个二硫键，起着支撑蛋白结构的作用，同时也是参与受体二聚化中 受体间结合的重要部位；u h e l i x 跨膜域起着将胞外结构域的构象改变传递到胞内引 起酪氨酸磷酸化的重要作用；而胞内部分则是信号传递链中受体与胞内各种蛋白相 互作用的重要部位。目前，对e g f r 的研究更多地集中在胞外结构域和胞内部分， 包括二聚化模型、受配体结合参数、激酶活性抑制剂等，而对跨膜部分的研究停留 在识别定位的阶段，还未找到有效的化学标记物和调控剂，因此本文对磁场作用 e g f r 的位点的研究主要考察胞外和胞内结构域。 图1e g f - e g f r 信号传导系统示意图 a e g f r 跨膜结构示意图 第3 页共4 3 页 胞外糖基化结构域 n 螺旋跨膜域 胞内激酶域 华东师范大学硕士论文 b 受体胞外区域二级结构示意图 c 受体介导的二聚化模型图 图2 e g f r 结构示意图。 总之，本文将主要探讨两个问题：磁场诱导受体聚集是膜介导的还是受体介导 的，磁场作用于e g f 受体的哪个功能域。为此本文考察了磁场对细胞膜朋旨质体囊 胞流动性影响以及磁场对离体e g f r 分布状态的影响，并进一步探讨受体上胞外结 构域和胞内酪氨酸激酶域受磁场的影响，以此作为后续有关磁场对e g f r 膜内通道 的研究基础。 第4 页共4 3 页 华东师范大学硕士论文 第二章材料与方法 1 材料与试剂 离体e g f r ( p u f i f i e de g f r ，e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ) 购自s i g m a 公司； 膜探针d p h ( 1 ，6 - d i p h e n y l 一1 ，3 ，4h e x a t r i e n c e ) 购自s i g m a 公司；四氢呋喃购自上海 实生生物公司；脂质体囊胞及插入e g f r 的脂质体囊胞( 上海交通大学药学院赠， 1 0 m g s p c + 3 m g 胆固醇溶于1 0 m l 氯仿中，旋转蒸发成膜，后用1 2 m l 双蒸水溶解脂 质体得到实验用样品，脂质体粒径约为1 7 3 4 7 r i m ，4 4 8 + 1 0 8 个m 1 ) ；中国仓鼠成纤 维细胞( l u n gf i b r o b l a s t so fc h i n e s eh a m s t e r , c h l ) ( 浙江医学院赠) ；云母片( 上海 交通大学b i o x 中心赠送) ；o 2 磷钨酸；镀有碳膜的铜网( 购自复旦医学院电镜 中心) ；还原态谷胱甘肽( g l u t a t h i i o n e ，g s h ) 购自s i g m a 公司；a l e x a 一4 8 8 l a b e l e de g f 购自m o l e c u l a rp r o b e s ，激发波长4 8 8 n m ，发射波长5 2 0 r m ：碘化丙啶( p r o p i d i n ei o d i d e ， p i ) 购自s i g m a 公司，激发波长5 4 3 n m ；e g f ( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ) 交通大学药学 院赠送：p d l 5 3 0 3 5 ( p d ) 购自s i g m a 公司。 2 实验仪器简介 2 1荧光分光光度计( 日立8 5 0 型) 2 2 原子力显微镜( 交通大学分析测试中心n a n os c o p e ri l i as c a n n i n gp r o b e m i c r o s c o p e c o n t r o l l e rr d i g i t a li n s t r u m e n t s ) ) 原子力显微镜( a f m ) 是利用被测表面与微力传感探针之间力的相互作用，对 被测表面进行扫描测量，其分辨率达到纳米量级，因此可较准确地获得被测表面的 形貌。原子力显微镜弥补了扫描隧道显微镜( s t m ) 不能观测非导电样品的缺陷， 应用范围不断扩大，尤其是对生物样品的测量，1 1 1 1 d n a 大分子 2 2 ，2 1 、蛋白质大分 子 2 3 ，2 4 1 、细胞显微结构等，应用范围也从对聚合物表面几何形貌的观测深入到研 究高分子的纳米级结构和表面性能、甚至用于生物大分子间相互作用力的测定等 2 5 1 新领域。 a f m 的测量方式有两种( 如图3 ) ：接触式( c o a c t m o d e ) 、共振式( t a p p i n g m o d e ) 。本文利用a f m 在两种模式下分别观测离体e g f r 在5 0 h z 弱磁场的作用下大 小、形态的变化。 第5 页共4 3 页 华东师范大学硕士论文 图3 a f m 工作模式示意图。a ：t a p p i n g m o d e ，探针针尖上下振动按一定步长平移；b ：c o n t a c t m o d e ，探针针尖随样品高度连续平移。 2 3 透射电子显微镜( 上海复旦大学医学院，h i t a c h ih 一7 0 0 0 型) 透射电镜是电镜技术中应用最广泛的一种电子显微镜，透射电镜是以电子束透 过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。 透射电镜的分辨率为0 1 - - 0 2 n m ，放大倍数为几万几十万倍。使用透射电镜观察 样品能获得高分辨率的超微结构图像 2 6 1 。利用透射电子显微镜避免了原子力显微 镜带来的针尖压缩扩展效应，在绝对值测量方面更趋于真值，成为观察蛋白质结构 的有力工具 2 7 2 9 1 。因此本文利用t e m 观察磁场对离体e g f r 状态的影响，以此 验证由原予力显微镜得到的趋势。 2 4 流式细胞仪( 华东师范大学，河口海岸所) 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光 技术、流体理论于一体，是一种灵敏的细胞荧光信号检测分析仪器。流式细胞术 ( f l o wc y t o m e t e r , f c m ) 是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分 析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多 个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为 当代最先进的细胞定量分析技术。本文利用流式细胞仪检测c h l 细胞荧光强度，定 量分析细胞上e g f r 与e g f 的结合。 2 5 激光共聚焦( c o n ：f o c a l ) 显微镜( o l y m p u s 公司住沪代表处，新华医院) 。 c o n f o c a l 型号为o l y m p u sf v 5 0 0 ，z 轴分辩率为o 5 “m 。c h l 在贴壁后，形状 扁平，因此在这个分辨率的情况下，细胞膜上的受体基本上可以被显微镜采集到。 当调整焦距到细胞中间部分时，可以明显看到细胞除了周边之外，其它部分的荧光 强度变弱，因此我们选择了采集这面的细胞膜上的荧光分布照片。而采集到的荧光 可能是z 轴向一定高度内荧光的叠加，这种情况也会使荧光看起来更像是分布于整 第6 页共4 3 页 华东师范大学硕士论文 个面上。 3 磁场辐照系统 磁场辐照系统参考浙江大学医学院磁场辐照系统 1 0 设计( 如图4 ) ，由自组装 的对半径为2 0 c m ，高2 0 c m ，1 5 0 匝的h e l m h o l t z 线圈、信号发生装置和功率放大 器组成。其中线圈部分置于隔水式电热恒温培养箱( p y x d h s 一5 0 x 6 5 一b s i i 上海跃 进医疗器械) 中。经国产c t 3 一a 型交直流高斯计测定，在h e l m h o l t z 线圈中央区域 ( 半径为5 c m ，高为1 0 c m ) 形成恒温、均匀、强度在0 - 0 5 m t 之间可调的5 0 h z 正 弦磁场辐照区( 磁场分布差异 3 ) 左右，增大了约5 2 ，提示可能出现 了颗粒大小倍增现象。 图1 1 中明显看出，经磁场处理之后，分布数量最多的蛋白颗粒其峰位向右移动， 由对照的1 5 6 2 5 n m ( 4 6 4 5 ) 变为实验组的3 1 2 5 n m ( 3 1 2 2 ) ，由图1 1 中箭头所 指。2 3 4 3 8 n m 的颗粒有所减少( 但无显著差异) ，而3 1 2 5 n m 的颗粒则增加两倍以 上，并出现了达3 1 ，9 4 的3 9 0 6 3 n m 颗粒和约7 的4 6 8 7 5 n m 的颗粒，可见大颗粒 蛋白明显增多。图1 l 中2 3 4 3 8 n r n 位置的+ m f 组的误差很大，主要来源于样品间的 差异，但并不影响反映磁场作用后颗粒的半高宽向变大的方向移动的趋势。 第1 6 页共4 3 页 2 o 8 6 4 2 0 一e u)o!i：鲁jl!p f 西面l | _ l o m n | 日 卫n o l j - 华东师范大学硕士论文 h a l f - w i d t h ( n m ) 图11 利用a f m 测量的磁场作用前后e g f r 蛋白颗粒大小百分比分布。- m f 磁场作用前的对照 组：+ m f 作用的实验组。根据测试软件分辨率，蛋白主要有5 个尺度：1 5 6 2 5 n m 、2 3 4 3 8 r a n 、 3 1 ，2 5 n m 、3 9 0 6 3 n m 和4 6 8 7 5 n m 。n 6 0 0 。 2 3 磁场暴露后e g f r 聚集程度统计 实验发现，经磁场作用后，不仅观察到有e g f r 单体和二聚体存在，而且这些 单体和多聚体还有明显的进一步聚集的趋势( 图9d ，f ) ，为揭示这种现象潜在的 规律，我们对e g f r 的聚集程度进行进一步的统计。数据来源于两张2 t m l x 2 u m 磁 场作用过得e g f r 图片( 如图1 2 a ，b ) ，这些蛋白颗粒没有聚集成为有光滑边缘的 多聚体，而是表现出一种聚集趋势。统计中，如图1 2a ，b 白色箭头所指 分别作为处于单颗粒状态、具有再二聚化趋势、再三聚体趋势和再四聚体趋势来统 计。 统计结果显示，2 3 1 的e g f r 处于单颗粒状态，而具有再二聚化趋势的蛋白颗 粒百分比高达3 8 4 ，由三聚化趋势的颗粒占2 6 2 ，还有1 2 2 的具有四聚化趋势 的e g f r 蛋白( 图1 2 c ) 。由高度和半高宽分析知道，经磁场作用后蛋白发生二聚体， 图1 2 a 中所指蛋白在高度和半高宽尺度上与对照组的具有两倍化关系。而这种具 有同对照组相比两倍高度和半高宽的颗粒，还有进一步聚集的趋势，且两两相聚的 情况所占百分比最大，3 8 4 ，即e g f r 单体形成四聚体的趋势最大。这种现象是 否具有潜在物理原理( 如吸收能量自由熵增加，趋于混沌状态) 存在还有待进一步 探讨。 第1 7 页共4 3 页 一掌一oogco。jm乱 华东师范大学硕士论文 0 n u m b e ro fe g f rl no n ec l u s t e r 图1 2 磁场作用下e g f r 聚集程度统计。a 为对照组，b 为磁场作用3 0 分钟得到的e g f r 的图 ) # ( a u r a z u m ) 。c 横轴中1 、2 、3 和4 分别代表处于单颗粒、二聚颗粒体、三聚颗粒体、四聚 颗粒体状态的颗粒，对应b 图中白色箭头所指，纵轴是对应蛋白颗粒数目占总数的百 分比。 由于a f m 测量的结果具有“压缩扩展效应” 3 3 n “边缘光滑性效应”等针尖效 应，使在物质表面宽度测量时数值偏大，高度变低和图像边缘变光滑。我们测锝到 的e g f r 的大小和高度也存在针尖效应( 例如图9d ) ，但是我们的研究是在同一效 应下的对照和实验样品平行比较，可以尽量避免上述效应给实验结果带来的误差。 总之，由a f m 观察磁场对离体e g f r 分布影响的结果显示，离体e g f r 的高 第1 8 页共4 3 页 一术一尘功口凸l10曲ro lu。j粤皂口l叱山。山芑agc。jo正 华东师范大学硕士论文 度和大小都随磁场的作用产生二倍化趋势，提示磁场诱导离体e g f 受体二聚化，在 作用对象只有受体的情况下，我们推测受体是磁场的作用位点，磁场通过引起受体 构象改变使受体( 细胞膜上或离体状态) 发生聚集。 3 透射电子显微镜观察磁场对离体e g f r 的影响 透射电子显微镜( t e m ) 避免了原子力显微镜带来的针尖压缩扩展效应，因此 本文利用t e m 观察磁场对离体e g f r 状态的影响，以此验证由原子力显微镜观察 得到的聚集趋势。 利用t e m 观察负染后的e g f r 蛋白( 图1 3 ) ，结果显示，对照组中蛋白边界模 糊颗粒较小，而实验组基本呈圆形，且颗粒变大变清晰( 图1 3 b ) 。对照片中蛋白 颗粒进行相对量化统计测算，并换算成实际线宽。计算结果显示，对照组中的颗粒 几何平均直径为1 1 6 3 + 1 1 1 姗，实验组的颗粒几何平均直径是对照组的约1 7 1 倍， 为1 9 8 8 监5 3n n l 。实验组的平均直径将近是对照组组的两倍，并具有显著性差异。 图1 4 为统计中的一组数据，可以看出，经磁场作用后，经统计拟合得到的e g f r 直径分布的峰值明显右移，e