（光学专业论文）光动力疗法中核壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究.pdf

光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 设计的p d t 光照室具有性能稳定，干扰因素小的特点，适合p d t 的体外研究； ( 4 ) 在p d t 疗法中，量子点对h l 6 0 细胞和p b m c 细胞都有灭活效果，但灭活 效率不同，对p b m c 细胞的灭活率小于h l 6 0 细胞，说明量子点具有一定的特异 性结合；( 5 ) 改造了单细胞凝胶电泳的实验过程，设计了微型电泳槽，结果表明 实验的重复性好，易于操作；( 6 ) 在p d t 未光照情况下，核壳结构的量子点对 正常细胞仍然具有暗室毒性效应，所以量子点与靶细胞的特异性结合是在p d t 中减少对正常细胞毒性的解决途径，方法是改善量子点表面的修饰基团。 关键词：c d s e z n s ，光动力疗法，细胞毒性，d n a 损伤，b s a ，p b m c 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的霍 l i i ll lii i l lli l lil llu l y 17 6 8 3 8 8 e x p e rim e n tr e s e a r c ho fc y t o t o x lcit yo fc o r e s h e l lq u a n t u m a b s t r a c t d o t swit hp b m cinp d t m a j o r ：o p t i c s n a m e ：k u nl i u s u p e r v i s o r ：j i a n - w e nx i o n g w i t hs i z ee f f e c ta n dt h eu n i q u eo p t i c a lp r o p e r t i e s ，q u a n t u md o t s ( q d s ) h a sb r o a d a p p l i c a t i o np r o s p e c t si nb i o m e d i c a lf i e l d ，s u c ha sc e l lm a r k e r si nv i t r o ，i m a g ei nv i v o ， p h o t od y n a m i ct h e r 印nl a b e l i n gi ni m m u n o f l u o r e s c e n c ea n dd r u g st a r g e t i n g a st h e s i n g l eq u a n t u md o tp a r t i c l e sa r ev u l n e r a b l et ot h ei m p a c to fl a t t i c ed e f e c t sa n d i m p u r i t i e s ，w h i c hl e a dt ov e r yl o wf l u o r e s c e n c ey i e l d s oi ti sc a p p e dw i t ho t h e r s e m i c o n d u c t o rm a t e r i a l s ，w h i c hf o r mac o r e s h e l lq d s w i t ht h ec o m p o s i t i o n ，t h e q u a n t u my i e l da n dt h ee x t i n c t i o nc o e f f i c i e n ti se n h a n c e d ，t h ec y t o t o x i c i wo ft h a ti s s i g n i f i c a n t l yl o w e r t h ef i r s t ，a st h er e s e a r c ho b je c to ft h eq u a n t u md o t sw i t hc o r e s h e l ls t r u c t u r e ， t h ef l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i c sa n ds i z ee f f e c to fc d s ec a p p e dw i t hz n s ( c d s e z n s ) w a ss t u d i e d ，a n dt h e nt h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nq u a n t u md o t sa n db l o o ds e r u m p r o t e i n ( b s a ) w e r es t u d i e d ，w h i c hc o u l db eu s e df o rc o n c l u d i n gt h a tt h et o x i c i t y m e c h a n i s mo fq u a n t u md o t so nb s a w i t ht h ec a r b o nd i o x i d ei n c u b a t o ra st h ec a r r i e r , t h el i g h tr o o mi nv i t r of o rp d tw a sd e s i g n e da n dt h ea n a l y s i sm e t h o do ft h eb e s t e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw a se s t a b l i s h e di np d tu n d e rm u l t i v a r i a t ef a c t o r sw i t hs p s s t h ee x p e r i m e n t a lm e t h o do fs i n g l ec e l l g e le l e c t r o p h o r e s i s ( s c g e ) w a si m p r o v e d ， w h i c hw a su s e df o rs t u d y i n gt h et o x i c i t yo fq d so np b m cu n d e rd a r l ( r o o ma n d p d t ， a n dh l 6 0 t h ec c k 一8w a sa l s ou s e df o rt h es t u d y t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：( 1 ) w i t hi n c r e a s i n go ft h eq u a n t u m d o t s d i a m e t e r , f o rt h ec d s e - z n sq d s ，t h eq u a n t u md o t se m i s s i o np e a kw a sd e c i s i o nb yt h e i i i 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 “c o r e ”s i z e 。( 2 ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb s ao c c u r r e ds t a t i cq u e n c h i n gw i t h i n i n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fq d s ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h eq d sg r a d u a l l y e n h a n c e dw i t hi n c r e a s i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fb s a ，w h i c hi sb e c a u s eo ff o r m a t i o no f c o r e s h e l ls t r u c t u r e ( 3 ) w i t hc a r b o nd i o x i d ei n c u b a t o ra n dl e d a st h el i g h ts o u r c e ， t h el i g h tr o o mh a ds t a b l ep e r f o r m a n c ef o rv i t r op d t ( 4 ) t h ei n a c t i v a t i o nw a sf o u n d o nb o t hh l 6 0a n dp b m ci np d t ，b u tt h ei n a c t i v a t i o ne f f i c i e n c yw a sd i f f e r e n t ，w h i c h w a sd e c i d e db yt h es p e c i f i cb i n d i n gb e t w e e nd i f f e r e n tc e l l s ( 5 ) t h ee x p e r i m e n t s h o w e dt h a tt h eo p t i m i z a t i o no fs c g ee x p e r i m e n ta n dm i c r o e l e c t r o p h o r e s i st a n k d e s i g n e dp l a y e dag o o dr o l ei ns c g e ( 6 ) t h ec o r e - s h e l lq u a n t u md o t sa l s oh a d d a r k r o o mt o x i ce f f e c t sc o m p a r e dw i t ht h es i n g l eq u a n t u md o tp a r t i c l e sw i t h o u tl i g h t ， t h ew a yt or e s o l v et h ec y t o t o x i c i t yo nh u m a nn o r m a lc e l l si np d t w a st oi m p r o v et h e q u a n t u md o t so ft h e s u r f a c em o d i f i c a t i o ng r o u pt oi m p r o v et h es p e c i f i cb i n d i n g b e t w e e nq u a n t u md o t sa n dt a r g e t i n gc e l l k e yw o r d s ：c d s e z n s ，c y t o t o x i c i t y ，p h o t o d y n a m i ct h e r a p y ( p d t ) ，d n a d a m a g e ，b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( b s a ) ，n o r m a lh u m a n p e r i p h e r a lb l o o dm o n o r m c l e a rc e l l s ( p b m c ) i v 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 目录 摘要i a b s t r a c t 。iii 第一章绪论1 1 1 纳米材料的研究进展。1 1 2 量子点的研究进展2 1 3 光动力疗法中量子点毒性研究的意义1 l 参考文献。1 2 第二章z n s 包裹的c d s e 核一壳结构量子点荧光特性研究1 7 2 1c d s e 量子点粒径计算公式拟合，。1 8 2 2 动态光散射法测量z n s 包裹的c d s e 的粒径。1 9 2 3 核一壳结构的c d s e - z n s 量子点荧光光谱。2 3 2 4 小结。2 5 参考文献。2 5 第三章量子点和牛血清蛋白相互作用的实验研究。2 8 2 1 实验材料与方法。2 8 2 2 实验方法2 9 2 3 结果与讨论3 0 2 4 结论3 7 参考文献3 8 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 第四章基于大功率l e d 的p d t 反应室设计与实现4 0 3 1 量子点的吸收光谱4 0 3 2 体外灭活p d t 光反应室设计面临的主要问题。4 1 3 3 基于基于大功率l e d 的p d t 反应室设计与实现4 1 3 4p d t 光照室主要指标测试。4 3 3 5 结论4 7 参考文献4 8 第五章量子点对人正常外周血单核细胞的细胞毒性研究4 9 5 1 材料与方法4 9 5 2h l 6 0 细胞和p b m c 的生长观察。6 3 5 3q d s - p d t 体外灭活h l 6 0 细胞最佳参数实验。6 7 5 4 光照对细胞影响实验7 1 5 5 彗星实验方法的改良7 3 5 6 最佳p d t 灭活参数下量子点对h l 6 0 细胞和p b m c 细 胞毒性比较分析7 6 5 7s c g e 法检测量子点对p b m c 的暗室毒性。8 0 5 8 小结8 1 参考文献。8 2 第六章全文总结与展望。8 5 6 1 本文主要研究工作和结论8 5 6 2 本文的创新点8 6 6 3 全文展望8 7 v i 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 硕士期间发表论文。8 8 致谢。8 9 v i i 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 1 纳米材料的研究进展 第一章绪论 1 1 1 纳米材料概述 纳米材料是指几何尺寸达到纳米级水平，并具有一定特殊性能的材料。目前 对纳米材料的定义是：粒径大小范围为1 1 0 0n l n 的纳米颗粒、纳米线或者厚度 为1 1 0 0n l n 的纳米簿膜等【1 1 。当粒子的尺寸进入纳米量级别时，纳米粒子显示 出强烈的量子尺寸效应、体积效应、表面效应和宏观量子隧道效应【2 1 。所以纳米 材料在光学、电磁学、热学、力学、化学等方面显示出优异的特性，使纳米材料 在诸多领域都具有十分广泛的应用1 3 , 4 】。 1 1 2 纳米材料的安全性 1 1 2 1 纳米材料安全问题的研究背景 由于纳米技术的迅速发展，纳米材料被广泛应用到生产、生活的各个领域， 所以人们在生活中与纳米材料的接触几率也日益的增多。虽然纳米材料存在独特 的物理化学性质，但是对环境或人体健康可能存在的负面影响。2 0 0 3 年，s e r v i c e 在( s c i e n c e ) ) 上首先发表论文论述了纳米材料与生物环境的相互作用及可能产生 的生物效应【5 1 。 2 0 0 3 年，美国政府启动了纳米生物效应的研究工作。2 0 0 4 年英国皇家学会 和皇家工程院对纳米技术可能造成的伦理和社会问题，发布了研究报告【6 1 。同年， 欧盟公布了“纳米安全性综合研究计划，其研究内容包括纳米材料的生物、环 境和健康效应，纳米材料对人体健康的影响，纳米颗粒与生物体相互作用过程的 基础科学研究以及纳米颗粒的防护研究。2 0 0 4 年底，我国也召开了以“纳米尺 度物质的生物效应及毒性 为主题的香山科学会议。针对这个新兴的研究领域， 在2 0 0 5 英国正式创立了纳米毒理学专业杂志，收录有关纳米材料毒理学方 面的研究论文。总之，纳米毒理学已经成为一个前沿的研究领域。 1 1 2 2 纳米材料的毒理学特点 纳米材料独特的理化性质决定了其毒理学的特点。首先，纳米颗粒微小，能 够容易的进入机体，并能够穿过细胞膜，从而引起类似环境超微颗粒所致的炎症 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 反应，所以当颗粒尺寸减小到纳米级别时，原本无毒的材料开始出现毒性作用； 而且纳米材料在生物体内可能会出现特殊的代谢情况，产生特殊毒性【7 ，8 1 。 粒径大小是影响纳米材料毒性的一个因素，并不是唯一因素。纳米材料的毒 性也取决于其自身的物理化学特性，如：电荷、包被物、表面修饰物、粒子组成 等、细胞的种类、所处的微环境( p h 、氧化环境等) 1 0 , 1 1 , 1 2 】。通过对纳米材料表 面进行化学修饰可以降低颗粒的聚集倾向和毒性。例如：a u f f a n 等【1 3 1 的研究表 明，经二巯基丁二酸修饰的f e 2 0 3 纳米粒子对人皮肤纤维原细胞没有遗传毒性， 细胞毒性也很小，因为d m s a 阻隔了f e 2 0 3 纳米粒子与细胞的接触，抑制了其 毒性作用的发生。 其次，纳米材料的比表面积大，具有高度的表面活性，该特性一方面有利于 将其用于环境污染物的化学或生物降解，另一方面也可能会导致其对生物体毒效 应的放大。 纳米材料毒性研究的快速发展，为纳米材料生物安全性评价体系的建立积累 了重要的数据资料。然而，目前世界范围内纳米毒理学的研究均处于起步阶段。 同时纳米材料的自身理化性质发生改变也可会影响其毒性。因此，加强对纳米材 料的毒理学机理研究，建立相关的纳米毒理学安全性评价程序以及纳米材料安全 性标准，是目前从事纳米毒理学研究者迫在眉睫的工作。 1 2 量子点的研究进展 1 2 1 量子点概述 量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 是一种直径在1 - 1 0 0n n l ，能够接受激发光产 生荧光的半导体纳米晶粒，一般是由半导体内核和有或无钝化的外壳组成。其中， 内核多是由i i 一族( 如c d s e ，c d t e ) 、i v 族( 如g a a s ，i n p ) 及一族 ( 如p b s ，p b s e ) 的元素构成【1 4 , 1 5 】。生物学研究领域中所用的量子点主要是c d s e 或c d t e 量子点。量子点根据在生物学中的具体应用，常常对其进行表面修饰( 如： 抗体、肽或药物的连接) 。 1 2 2 量子点的光学特性 量子点的物理尺寸小于激子的波尔半径，从而导致了一种量子限制效应，使 量子点具有独特的光学特性，具体表现为： 2 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 ( 1 ) 量子点具有连续而宽的激发光谱，同时荧光发射光谱的半宽峰高( f w h m ) 窄且对称分布，即可以使用小于其发射波长1 0n m 的任意波长的激发光进行激 发，并且荧光发射谱峰的位置可以通过改变量子点的物理尺寸进行调控，这样就 可以使用同一种激发光同时激发多种量子点，发射出不同波长的荧光，可以进行 多元荧光检测1 1 6 1 7 1 。 ( 2 ) 量子点的s t o k e s 位移( 激发波长和发射波长峰值的差值) 较大( 3 0 0 - 4 0 0 n m ) ， 能够避免发射光谱与激发光谱的重叠，从而允许在低信号强度的情况下进行光谱 学检测【1 8 19 1 。 ( 3 ) 量子点的荧光发射波长可充分利用其“量子限制”( q u a n t u mc o n f i n e m e n t ) 效应，通过控制其合成时的直径大小和各组分来进行连续调谐【2 0 1 ，因此可以任意 合成所需波长的q d s 。 ( 4 ) 量子点的抗光漂白能力强，量子点的荧光强度及稳定性是普通荧光染料的 数倍，几乎没有光褪色现象，可以对所标记的物体进行长时期的观察1 1 9 , 2 1 。 毽 ( 5 ) 量子点荧光寿命长，可持续长达数十纳秒( n s ) ，使量子点的荧光能够从背 景荧光中分离出来【2 2 2 3 1 。 1 2 3 量子点的合成方法及生物学特性 目前q d s 合成方法概括起来有两大类：有机相合成法和水相合成法【2 4 1 。有机 相合成法操作复杂，实验条件要求苛刻，合成的q d s 荧光产率高、尺寸均匀、 稳定性好、种类多，通过表面修饰可以和生物分子链接。水相合成方法操作简单， 合成出的q d s 可以直接用于标记生物分子，但是合成的q d s 荧光效率较低，尺 寸分布较宽。 通常合成的量子点水溶性较差，不能直接与生物分子结合，而在生物医学领 域中应用的量子点大多需要水溶性的量子点。因此，量子点制备后要对其进行修 饰，以改善其水溶性。可以用亲水层取代疏水层或用亲水聚合物包覆量子点，具 体方法有3 种：用带有功能性基团的配体分子交换疏水层，这些配体通常一端 有能与量子点结合的功能性基团( 如巯基s h ) ，而另一端具有亲水性的基团( 如 羧基c o o h ) 【2 5 】。这种方法简单方便，但问题是功能性基团与量子点结合并不 牢固，这样形成的亲水层易于分解。通过表面硅烷化，将量子点用亲水的多孔 硅胶包覆，所得到的量子点在电解质溶液中较稳定，但问题是包覆过程复杂，耗 3 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 时长。用两亲聚合物包覆量子点，这种方法能克服上述两种方法存在的问题【1 8 】。 两亲聚合物包含亲水基团和疏水末端，如聚乙二醇，其中疏水端能插入量子点表 面的表面活性分子，从而包覆量子点，亲水基团可以使其具有水溶性。 生物分子与量子点结合用于生物医学研究中，其结合方式有静电作用、被动 吸附、共价键合、交联反应等。由于多数量子点表面带负电荷，可以通过静电作 用与带正电荷的生物分子结合，具体方式有：在量子点外层修饰一层二氢硫辛酸 ( d i h y d r o x y l i p o i ca c i d ，d h l a ) ，通过静电作用连接上亲和素，可以根据需要将 核酸、蛋白甚至细胞膜生物素化。由于生物素和亲和素之间的高度特异性结合， 最终将量子点标记于目标分子上；或通过一个带正电荷的亮氨酸拉链肽段 ( 1 e u c i n e z i p p e r p r o t e i n ) z b 2 6 】为桥将连接在拉链另一端的蛋白质分子或单抗标记 到量子点上。也可采用共价键合的方法将量子点包覆一层聚丙烯酸，然后修饰成 疏水性的聚丙烯酸酯，最后将抗体或其他蛋白共价键合到量子点上。共价键合法， 即通过化学反应将量子点表面进行羧基、氨基或环氧基等官能团化的修饰，使其 能与生物分子中的氨基或羧基结合实现偶联 2 7 , 2 8 】。 1 2 4 量子点在生物医学中的应用 随着量子点制备及表面修饰技术的提高，具有独特荧光特性的量子点为在生 物医学等研究领域的应用提供了广阔的前景，并迅速成为国内外研究的焦点。 1 2 。4 。1 量子点在生物大分子之间相互作用研究中的应用 量子点在研究生物大分子之间相互作用的应用量子点研究生物大分子之间 相互作用是基于量子点的荧光能量转移( f r e t ) 2 9 】。荧光共振能量转移是一种 非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体 激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强的敏化荧光，也可以 发生荧光淬灭，同时也伴随着它们荧光寿命的相应缩短和延长。作为共振能量转 移的供、受体，荧光物质必须满足以下条件：供、受体的激发光谱要分得足够开； 供体的发射光谱要与受体的激发光谱重叠；供、受体的发射光谱也要分得足够开。 由于量子点激发波长的选择具有很大的灵活性、发射光谱的半宽峰高窄、在红外 光谱区没有拖尾的发射谱峰等优点，因此，可以选择供体激发光谱相对于受体发 射光谱有很大蓝移的供体受体对等进行研究【3 0 1 。若两个生物分子之间可以发生 相互作用，则标记在它们上面的不同量子点就会因此靠近，那么在这一区域中的 4 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 光谱就会发生变化，成为两个光谱的叠加，在一定的条件下，可能发生能量转移， 即受体量子点的荧光增强。我们可以通过检测这两种不同量子点光谱谱图的变化 来间接观察生物分子之间的相互作用。 w a n g 等人【3 l 】较早使用量子点的共振能量转移原理，进行蛋白蛋白特异性结 合的研究。他们用发射光谱为5 5 5n n l 、6 1 1n i n 的绿、红量子点分别标记抗牛血 清白蛋白抗体( i g g ) 和牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) ，当二者形 成免疫复合物时，b s a 上的红色量子点荧光增强，i g g 上的绿色量子点荧光相应 减弱，这是由于抗原、抗体发生特异性结合时，将两种量子点拉得足够近，使其 发生电偶极相互作用，绿色量子点的激发态能量转移给了红色量子点激发态，即 发生了共振能量转移。当加入未标记量子点的b s a 时，它就会与量子点标记的 b s a 发生竞争，将量子点标记的b s a 从免疫复合物上取代下来，阻止了共振能 量转移的发生，此时红色量子点荧光强度下降，而绿色量子点荧光强度又恢复原 样。 岛 1 2 4 2 量子点在细胞成像和示踪中的应用 吸附了配体( 或抗体) 的量子点可以高特异性地与靶受体结合，进而实现对 细胞、细胞器或骨架系统的标记。目前，量子点已被成功用于活体细胞以及亚细 胞结构的标记。w u 等【3 2 】用量子点标记的羊抗鼠 g g 作为二抗，结合抗h e r 2 单 抗，观察到了乳腺癌细胞表面的h e r 2 ，用抗生物素蛋白交联具有不同光谱特征 的量子点，配合生物素标记的二抗和特异性单抗，可同时识别细胞表面的h e r 2 、 核抗原和胞浆微管蛋白。l i d k c 等【3 3 】选用能够表达c r b b 的人类鳞状细胞癌a 4 3 1 细胞，分别用3 种不同颜色的荧光蛋白标记e r b b l 、c r b b 2 、c r b b 3 ，同时将结合 了亲和素的量子点和生物素化的表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ) 形成的复合物作用于a 4 3 1 细胞。利用量子点的长时间荧光，通过体内显微术示 踪e g f 与c r b b l 的结合和信号传导过程，实现了直接实时动态观察到一个信号 分子从与细胞膜结合到与c r b b 2 、c r b b 3 相互作用的全过程。 1 2 4 3 量子点在活体和组织成像中的应用 生物体的复杂性和特殊性，要求荧光探针具有较好的光稳定性、生物相容性 好、不易被光分解和漂白、荧光寿命长等特点。因此，量子点的独特物理化学特 性为其在活体和组织成像提供了广阔的前景。a k e r m a n 等【3 4 1 研究指出c d s c z n s 5 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 量子点表面用不同的多肽修饰后，经尾静脉注射到小鼠体内一定时间后，做组织 切片分析。结果发现，不同多肽修饰的量子点可特异性的结合到正常或发生肿瘤 小鼠的肺部脉管系统。g a o 等【1 8 1 研究了量子点在小鼠体内的特异性成像，将前列 腺特异性膜抗原的抗体与量子点连接，通过尾静脉注入小鼠体内，清楚地观察到 肿瘤的大小和位置。这两项研究指出量子点应用于疾病诊断等方面的研究前景。 1 2 4 4 量子点在药物靶点和药物筛选中的应用 药物靶点和药物筛选的研究在药学领域中是非常重要的，但是难度高，工作 量大。将量子点技术与芯片技术相结合研究生物分子与药物的作用，为药物作用 机制的研究提供重要的方法和信息。 量子点荧光稳定性强、寿命长，可以用它进行长期的实时监测和跟踪生物分 子间的相互作用。同时，可用不同颜色量子点，用同一种激发光，同时观测活细 胞中或其表面的多个靶分子以及它们之间的相互关系。因此，量子点可被用于体 内跟踪药物分子作用的靶点和过程。通常，一种有效的药物要发挥效用，往往需 要和数个不同的靶分子结合，还要避开其他的一些靶点以避免其副作用。若将不 同颜色的量子点分别与药物的不同靶分子结合，就可以一次性检测出药物作用的 靶分子，进而判断其实用性。例如：g o l d m a n 等用4 种不同颜色的量子点分别 与志贺毒素、葡萄球菌毒素b 、蓖麻毒素和抗霍乱毒素的抗体偶联，实现了在同 一微孔板上对4 种毒素的同时检测。同时，n i e 等【3 6 】将不同数量的不同荧光特征 的量子点组合成内部镂空的高分子小球，从而形成可标记到生物分子上具有不同 光谱特征的的微球。发现将5 6 种颜色，6 种发光强度的量子点进行不同组合即 可形成1 0 0 0 0 - - 4 0 0 0 0 种可识别编码的量子点微球，若将发光强度的变化增加到 1 0 种，则可以加工出1 0 0 万种可识别的编码微球，理论上可以对1 0 0 万种不同 的d n a 或蛋白质进行识别。因此，量子点在生物芯片领域具有很大的应用前景， 为药物筛选提供了新的途径。 1 2 4 5 量子点用作光敏治疗剂用于光动力疗法 光动力学疗法( p h o t o d y n a m i ct h e r a p y ，p d t ) 相对传统的治疗，侵害性更少， 目标性更强，没有声波治疗的剂量限制，因而治疗几乎没有伤疤。但是，目前光 动力学的研究热点之一是光敏治疗剂性能的提高。 理想的光敏剂应具备以下七个基本特御，7 】：组分明确，材料来源广泛， 6 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 且易于化学合成；在没有光照射的条件下，无毒性；癌细胞对其具有选择 性吸收；单态氧的量子产率高；能经人体新陈代谢快速排除体外，药物副 作用小；在人体内没有药物聚集现象；光漂白效应不明显，具有很好的光 稳定性。量子点作为一种可能应用的新型光敏剂已具备了上述的前四个特征。 在光动力疗法中，光敏剂受到光的激活，但并不是光敏剂直接与组织细胞反 应来杀死癌变细胞，而是通过临近氧分子从三线态转变为能与细胞产生毒性反应 的单线态氧来杀死癌变细胞。s a m i a 等通过f r e t 机理证明了c d s e 量子点作 为光动力光敏剂的可能性，为光敏剂的发展开辟了新的思路。l o u 等【3 9 1 研究了量 子点生物连接癌细胞作为p d t 传统光敏剂具有的潜在优势。水溶性的c d s eq d s 连接于与白血病有特别作用的抗c d 抗体上，标记的细胞与正常的淋巴细胞混合 同时受到有经典光敏剂存在的紫外光的照射。结果表明，量子点与抗c d 连接的 白血病细胞对紫外光刺激敏感，同时增强了经典光敏剂的效果。t s a y 等【删也指 出量子点表面包被蛋白质后与传统光敏剂连接，单线态氧的产率提高，在光动力 中有广泛的应用前景。因此，量子点作为光动力光敏剂具有很好的应用前景【4 1 1 。 l2 5 量子点毒理学效应研究现状 迄今为止，对量子点的研究表明，量子点的毒性取决于自身的物理化学特性， 如：表面电荷、粒径大小、合成过程、表面修饰基团、形状和浓度等，所处的微 环境，如：紫外线、p h 值、氧化环境、培养暴露时间等。因此，在评价量子点 毒性时，不能简单地定义其是否具有毒性，而应综合分析量子点的物理化学性质， 及其与所处环境的相互作用等诸多因素。 1 2 5 1 量子点的体外毒性研究 大量的量子点体外研究发现，量子点可通过受体介导、细胞胞吞、诱导细胞 膜损伤等方式进入细胞，从而影响细胞活性、产生细胞毒性。l o v r i c 等【4 2 】研究发 现，单一c d t e 量子点在lpg m l 时，作用2 4h 后，即可对人乳腺癌细胞产生 毒性；在1 0 1 tg m l 时，可引起细胞膜的损伤、线粒体肿胀、细胞核固缩和染色 质凝集等。c h a n 等【4 3 1 研究发现，c d s e 量子点能抑制人神经母细胞瘤细胞的生长， t u n e l 的阳性率是对照组的2 9 倍，引起了细胞凋亡，发生了核小体间双链d n a 的随机断裂。王丽萍等1 研究了表面包覆巯基丙酸( m e r c a p t o p r o p i n i ca c i d ，m p a ) 的c d t e 量子点对人脐静脉内皮细胞的细胞毒性和遗传毒性。结果发现，c d t e 量 7 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 子点对硼_ e c s 具有剂量依赖的细胞生长抑制效应；用磷酸化组蛋白h 2 a x 焦 点形成检测d n a 损伤，发现1 、1 0 和5 0 ug m lq d s 作用于h u v e c s ，1 2h 后 可以显著诱导yh 2 a x 的焦点形成并呈剂量效应关系；流式细胞仪分析结果也显 示了同样的结果。因此，c d t e 量子点对h u v e c s 具有细胞毒性和遗传毒性。 量子点的粒径大小影响其细胞毒性和亚细胞器中的分布。l o v r i c 等1 4 5 】研究发 现：2 2n n l 和5 2n l t i 的两种粒径的q d s ，相同浓度下作用于嗜铬细胞瘤细胞2 4 h 后，细胞的存活率分别为3 1 2 和5 3 2 ，在激光共聚焦显微镜下观察，2 2n m 量子点主要分布在细胞核中，5 2n l t l 量子点位于细胞质中。以上表明，较小尺度 的量子点具有更大的潜在毒性。s h i o h a r a 等【4 6 】通过对三种不同尺度的c d s e - z n s 量子点与羊血清蛋白键合后，分别对h e l a 、v e r o 和h c 的细胞活性的影响进行 了观察。研究发现：q d 5 2 0 和q d 5 7 0 对细胞活性的影响比q d 6 4 0 的影响要大。 这也表明，不同粒径的量子点对细胞可能产生不同的毒性。 量子点的表面修饰基团对其细胞毒性的影响。研究表明，量子点的细胞毒性 可能是由于其表面修饰分子引起，而不是量子点的核本身。例如：h o s h i n o 等【4 7 】 在c d s e z n s 量子点壳核结构的基础上包被m u a 、半胱氨盐、硫代甘油及等比 例的上述混合物质，分别得到q d - c o o h 、q d - n h 2 、q d - o h 、q d o h c o o h 和q d n h 2 o h 五种亲水性量子点。通过单细胞凝胶实验发现，在2um o l l 的 暴露浓度下对w t k l 细胞作用2h ，只有q d c o o h 呈现高毒性，而其他基团修 饰的量子点在同等条件下均呈现低毒或无毒，这解释了q d c o o h 呈现高毒性， 可能是由于其表面修饰分子引起的。g u o 等【4 8 】发现：f l u r o n i c6 8 修饰的c d s e 量 子点对h e p g 2 细胞的毒性远小于c t a b ) 和十二烷基磺酸钠( s o d i u md o d e c y l s u l f a t e ，s d s 修饰后的毒性。然而，也有研究表明，量子点的细胞毒性是由于表 面修饰分子脱落，其核暴露或c d 2 + 的释放引起。s e l v a n 等【4 9 】研究了q d s 外层包 覆s i 0 2 后对细胞毒性的影响。结果发现，s i 0 2 包覆的q d s 对猴肾细胞、小鼠成 纤维细胞和h e p g 2 三种细胞的毒性远小于同等条件下m a a 包覆的量子点和p a 包覆的量子点的细胞毒性。h o s h i n o 等【5 0 】研究发现浓度为o 1 、o 2 和0 4m g m l 的c d s e z n s 量子点作用于t 淋巴细胞2 4h 后，细胞存活率存在明显的剂量效 应关系。q d s 浓度大于0 1m g m l 时，细胞存活率呈现下降趋势；在浓度达到 0 4m g m l 时，作用细胞时间仅6h ，细胞存活率接近于0 ，即大部分细胞死亡。 8 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 s h i o h a r a 等【4 5 】研究了c d s e z n s 量子点暴露于不同浓度和不同时间对v e t o 细胞存 活率影响。结果表明，细胞存活率存在明显的剂量效应、时间效应关系，即随 着暴露浓度和暴露时间的增加，细胞存活率也显著性降低。 1 2 5 2 量子点的体内毒性研究 人们可能会在环境中、工作场所、医源性处理等过程中接触到量子点，量子 点可通过皮肤、呼吸道、消化道、皮下、静脉注射等途径进入机体内。 在生物吸收方面，肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结和骨髓中都有不同程度 地检出。其中，肝脏是其主要靶器官。但是这两种量子点在肝脏中吸收比率有显 著性的差异。g 等【5 l 】将5 0 0 0 一p e g 包被c d t e z n sq d s ，经小鼠尾静脉注射， 研究其在体内的毒物动力学行为。研究发现：q d s 在体内的半衰期较长，在血浆 中的清除速度为2 3m l h k g ，消除半减期为1 8 5h ，脾脏、肾脏和肝脏是其主要 的靶器官。其中，量子点主要分布于肝窦、脾的红髓、肾小管和肾小球。静脉注 + j 射量子点2 4 h 后，主要分布脏器中量子点的含量为：肝脏( 2 9 ) 、肾脏( 1 5 ) 、 脾脏( 4 。8 ) ；而在注射2 8 天后，肝脏( 4 0 ) 、肾脏( 9 2 ) 、脾脏( 5 2 ) 。 c h e n 等吲将羟基修饰的c d s e s s i 0 2 量子点，以浓度5n m o l l 、1 0 0ul 的剂量 经尾静脉注入小鼠体内。量子点在体内的消除半减期为f 9 8 3 。2h ，血浆清除率 为5 7 3 9 2m l h k g ，表观分布容积( v d ) 为1 6 1 1 1 1 2m l k g ，其中v d 体液 容量，说明组织对量子点的摄取量大。 在生物吸收方面，量子点主要分布在肝脏、肾脏、脾脏和肺中，少量分布在 心脏、脑、骨骼和肌肉中。脾脏、肺脏和肾脏可在4 8h 内将脏器中的q d s 清除 出，而肝脏清除速度慢，在注射后1 2 0 h ，仍有相当于注射剂量的8 6 停留在肝 脏组织中。g o p e e 等【5 3 】发现，p e g 包被的c d s c c d sq d s 经皮内注射，通过淋巴 管系统从注射部位到了局部淋巴结、肝脏和其他组织中。随着注射后时间的延长， q d s 在注射部位的浓度降低，并主要分布于肝脏、淋巴结、肾脏和脾脏。同时， 量子点在体内的排泄研究还存在不同的实验结果。c h c n 等【划发现量子点可通过 粪便和尿液形式排出体外。r o b e 等【5 5 1 在小鼠前爪皮内注射c d s e z n s 量子点2 4h 后，尿液和粪便中未检测出。y 抽g 等【5 l 】在单次给药后眦8 天的过程中，尿液和 粪便中也未检测出量子点。 综上所述，量子点的体外和体内毒性，都取决于其固有的物理化学性质和外 9 光动力疗法中核一壳结构量子点对人正常外周血单核细胞的毒性研究 部环境条件。量子点合成方法的多样性也导致了其毒性研究十分复杂。因此，在 量子点的毒性研究中，要综合考虑这两方面的影响因素。 1 2 6 光动力疗法中量子点 在光动力疗法中，量子点作为能量的施主，在光动力作用中可以与细胞分子 中的氧分子之间发生能量转移，从而产生具有毒性反应的或单态氧。为了提高单 态氧的产率，就必须要提高量子点的量子效率。单独的量子点颗粒很容易受到杂 质和晶格缺陷的影响，量子产率很低，当以其为核心，用另一种半导体材料包覆， 形成了核壳结构后，可以提高量子产率【5 6 1 。同时用于光动力疗法中的量子点必 须具有亲水性和生物相容性。常采用化学修饰的方法对量子点进行修饰【5 7 1 ，一方 面提高荧光效率和量子产率，同时也解决了水溶性和生物相容性。 1 2 6 1 光动力疗法中量子点的毒性作用机制 研究表明，在生物体或是外界环境的氧化作用下，量子点壳层结构或表面修 饰基团易受到破坏，引起氧化脱落，进而引起中心核的氧化【5 8 ，5 9 1 ；另一方面， 氧化过程中产生的活性氧物质( r o s ) 在生物体内又会引起一系列自由基链反应 【6 0 ，6 1 】，诱发脂质过氧化，可导致生物膜结构和功能的损伤、d n a 损伤，最终引 起细胞凋亡或坏死。 ( 1 ) 量子点诱发氧化损伤 活性氧的生成和氧化反应是量子点引起多种生物毒性效应的主要方式【6 0 , 6 1 】。 量子点表面的电子受体和供体活动位点能与分子氧发生作用，形成超氧离子，并 通过歧化反应产生过量活性氧。活性氧是多种细胞发生氧化应激所产生氧的部分 还原代谢产物。细胞只要产生一种活性氧，就可通过自由基链反应产生其他活性 氧。适量的r o s 具有调节生理的功能，但过量的r o s 可以使细胞或机体内的氧 化压力增加，产生氧化损伤，导致脂质过氧化物含量增加，与膜脂交联形成高聚 物，可导致生物膜结构和功能的损伤。 ( 2 ) 对d n a 的损伤 研究表明，量子点可通过活性氧( r o s ) 的生成，对核苷酸进行攻击引起 d n a 断裂，使超螺旋结构解旋，d n a 降解。g r e e n 等【6 2 1 深入地研究了生物素修 饰的c d s e z n