（化学工艺专业论文）重组工程在运动发酵单胞菌中的应用研究.pdf

中文摘要重组工程( r e c o m b i n e e r i n g ) 是近几年来兴起的一种新型的遗传工程技术，可有效促进线形d n a 分子之间和线形d n a 分子与染色体、质粒之间的重组，从而成为在大肠杆菌中进行基因操作及基因组学研究的最有力的新工具之一，它同时也在其它少数几种细菌中得到初步应用。运动发酵单胞菌有着非常独特的生物学特性，并能高效发酵产醇，被认为是极具开发潜力的乙醇生产菌，人们对它已经做了大量工作。但高效、简单、快速的遗传操作手段的缺乏，限制了人们对它的生物学特性的进一步认识和遗传改造。若能将重组工程技术应用于运动发酵单胞菌，必将大大加速对它的研究。本研究首次将基于r e d 基因的重组系统引入运动发酵单胞茵，并进行了初步的重组应用。首先将在大肠杆菌中得到广泛应用的、携带 重组r e d 基因的质粒p k d 4 6 ( a r a c ，p a r a - r e d ，p s c l 0 1o r i ，a m p ) ，直接引入运动发酵单胞菌，得到z m 4 ( p k d 4 6 ) ，并通过抗性检查、p c r 鉴定、酶切分析等手段，初步证明p k d 4 6能在z m 4 中复制和存在：进一步以穿梭载体p z b 2 1 ( e c o l io r i ，z m o b i l i so r i ，a m p ，c m l ，t e t ) 和p k d 4 6 为出发材料，构建得至l l p z b 2 1 r e d ( e c o l io r i ，z m o b i l i so r i ，t e t ，a r a c ，p a r a r e d ) ，并转化到z m 4 中，得到z m 4 ( p z b 2 1 r e d ) ；然后通过p c r方式制备含同源臂( 左、右各7 9 b p ) 和氯霉素抗性基因( c m l ) 的打靶片段，参照带p k d 4 6 的大肠杆菌菌株中的打靶条件，分别对z m 4 ( p k d 4 6 ) 、z m 4( p z b 2 1 - r e d ) 进行打靶实验，经p c r 鉴定，) a z m 4 ( p z b 2 1 r e d ) 顺利得到z m 4染色体上乳酸脱氢酶基因( 1 d h ) 缺失而被c m ，基因取代的重组子，且此重组子很容易通过无抗性压力条件下的连续转接培养而去掉p z b 2 1 r e d ；从z m 4 ( p k d 4 6 )则没有得到任何目的重组子。本研究初步证明重组工程可以用于运动发酵单胞菌，为下一步优化重组系统各要素、提高重组效率奠定了很好的工作基础。关键词：重组工程运动发酵单胞菌打靶a bs t r a c tr e c o m b i n e e r i n gi san e wg e n e t i ce n g i n e e r i n gb i o t e c l m o l o g yt h a th a sr e c e n t l yb e e nd e v e l o p e d i tc a l le f f i c i e n t l yb o o s tt h er e c o m b i n a t i o nb e t w e e nl i n e a rd n am o l e c u l ea n dl i n e a rd n am o l e c u l e ，l i n e a rd n am o l e c u l e sa n dc h r o m o s o m eo rp l a s m i dd n a i ti so n eo ft h em o s tf o r c e f u ln e wi m p l e m e n ti ng e n em a n i p u l a t i o na n dg e n o m i c sr e s e a r c hi ne c o l i ，i th a sa l s ob e e nu s e df o rs e v e r a lo t h e rk i n d so fb a c t e r i a z y m o m o n a sm o b i l i sh a su n i q u eb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c sa n dc a nh i 曲l ye f f e c t i v e l yf e r m e n ts u g a r st oa l c o h 0 1 i ti sc o n s i d e r e da sap o t e n t i a la l c o h o lp r o d u c e ra n dh a sb e e nr e s e a r c h e dw i d e l y b u tt h el a c ko fh i 曲l ye f f e c t i v e ，s i m p l ea n ds p e e d yg e n e t i cm a n i p u l a t i o nm e t h o dh a se m b a r r a s s e dr e s e a r c h e rf o rf u r t h e rs t u d y i n gi t sb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c s ，a n dg e n e t i cm a n i p u l a t i o nu s i n gr e c o m b i n e e r i n gi nz m o b i l i sw i l lg r e a t l ya c c e l e r a t er e s e a r c hf o ri t t h i ss t u d yi st h ef i r s ta t t e m p tt oi n t r o d u c er e c o m b i n e e r i n gs y s t e mi n t ozm o b i l i sa n du s ei tf o rr e c o m b i n a t i o n f i r s t l y , p l a s m i dp k d 4 6 ( a r a c ，p a r a - r e d ，p s c l 0 1o r i ，a m p ) ，b e i n gw i d e l yu s e di ne c o l ir e c o m b i n e e r i n g ，w a sd i r e c t l yi n t r o d u c e di n t ozm o b i l i s ，r e s u l t i n gi ns t r a i nz m 4 ( p k d 4 6 ) ，a n dw a si n i t i a l l yp r o v e dt od u p l i c a t ea n de x i s ti nz m 4b ya n t i b i o t i cr e s i s t a n c ec h e c k , p c ri d e n t i f i c a t i o na n dp l a s m i de n z y m a t i cd i g e s ta n a l y s i so f z m 4 ( p k d 4 6 ) s e c o n d l y , p z b 2 1 - r e d 晖c o l io r i ，z m o b i l i so r i ，a m p ，c m l , t e t ) w a sc o n s t r u c t e df r o ms h u t t l ev e c t o rp z b 2 1 ( e c o l io r i ，z m o b i l i so r i ，a m p ，c m l ，t e t ) a n dp k _ d 4 6 ，a n df u r t h e rt r a n s f o r m e di n t oz m 4 ，l e a d i n gt os t r a i nz m 4 ( p z b 21 一r e d ) l a s t l y , t a r g e t i n ge x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u tf o rz m 4 ( p k d 4 6 ) a n dz m 4 ( p z b 2 1 r e d ) ，u n d e rt h es a m et a r g e t i n gc o n d i t i o n sa su s e df o re c o l is t r a i n sw i t hp k _ d 4 6 ，a n dt h et a r g e t i n gf r a g m e n t ，w i t hb o t h7 9 b pl o n gh o m o l o g o u sa r m sa n dc m lg e n e ，w a sp r e p a r e db yp c r i tw a sc o n v e n i e n tt og e tt h ed e s i r e dr e c o m b i n a n t sf r o mz m 4 ( p z b 21 - r e d ) i nw h i c hg e n o m i cd n al d hg e n ew a sd e l e t e da n dr e p l a c e db yt a r g e t i n gf r a g m e n t m o r e o v e r ，i tw a sa l s oe a s yt oo b t a i nt h er e c o m b i n a n t sl o s i n gp z b 21 一r e db yc o n t i n u o u si n o c u l a t i o na n di n c u b a t i o n b u tn or e c o m b i n a n tw a sf o u n dt or e s u l tf r o mz m 4 ( p k d 4 6 ) s ot h i ss t u d yh a si n i t i a l l yp r o v e dt h a tr e c o m b i n e e r i n gc o u l db eu s e di nz m o b i l i sa n dl a y e dt h eg o o df o u n d a t i o n sf o rn e x ts t e pt oo p t i m i z et h er e c o m b i n a t i o ns y s t e ma n di m p r o v er e c o m b i n a t i o ne f f i e n c y k e yw o r d s ：r e c o m b i n e e r i n g ，z y m o m o n a sm o b i l i s ，t a r g e t i n g 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：旅耷建签字日期：矽。7 年月矿同学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解丞洼盔堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权丞洼太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：欲雪建签弓j ：ii 期：汐d 7 年月玎h新妊了季必岔签字f i 期：u 叼年月灰第一章文献综述第一章文献综述1 1 重组工程及其应用研究1 1 1 重组基因重组是所有生物都可能发生的基本的遗传现象。无论在高等生物体内，还是在细菌、病毒中都存在基因重组。不仅在减数分裂过程中会发生基因重组，在高等生物的体细胞中也会发生基因重组。基因重组不仅可以发生在细胞核内的基因之间，也可以发生在线粒体和叶绿体的基因之间。可以说，只要有d n a ，就可能发生重组。从广义上讲，任何造成基因型变化的基因交流过程，都叫做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及d n a 分子内断裂一复合的基因交流。真核生物在减数分裂时，通过非同源染色体的自由组合形成各种不同的配子，雌雄配子结合产生基因型各不相同的后代，这种重组过程虽然也导致基因型的变化，但是由于它不涉及d n a 分子内的断裂一复合，因此，不包括在狭义的基因重组的范围之内。根据重组的机制和对蛋白质分子的要求不同，可以将狭义的基因重组分为三种类型，即同源重组、位点特异性重组和异常重组。同源重组的发生依赖于大范围的d n a 同源序列的联会，在重组过程中，两条染色体或d n a 分子相互交换对等的部分。真核生物的非姊妹染色单体的交换、细菌以及某些低等真核生物的转化、细菌的转导接合、噬菌体的重组等都属于这种类型。大肠杆菌的同源重组需要r e c a 蛋白，类似的蛋白质也存在于其他细菌中。位点特异性重组发生在两个d n a分子的特异位点上。它的发生依赖于小范围的d n a 同源序列的联会，重组也只限于这个小范围。两个d n a 分子并不交换对等的部分，有时是一个d n a 分子整合到另一个d n a 分子中。这种重组不需要r e c a 蛋白的参与。异常重组发生在顺序不相同的d n a 分子间，在形成重组分子时往往依赖于d n a 的复制而完成重组过程q j 。例如，在转座过程中，转座因子从染色体的一个区段转移到另一个区段，或从一条染色体转移到另一条染色体。这种类型的重组也不需要r e c a 蛋白的参与。1 1 2 同源重组在生物细胞中，d n a 或r n a 分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以第一章文献综述一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组( h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ) 。同源重组的频率与d n a 或r n a 序列的同源程度( 即序列的相似程度) 、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍 3 - 8 1 。1 1 2 1 同源重组机制同源重组是个非常复杂的过程，其生物化学模型见图1 1 ，涉及到的多个基因见表1 1 。图l - 1 、遗传重组的生物化学模型f i g1 - 1t h eb i o c h e m i c a lm o d e lo fg e n e f i cr e c o m b i n a t i o n2第一章文献综述表1 1 大肠杆菌遗传重组所需要的蛋白质t a b l e1 - 1p r o t e i n sa n ds i t e si n v o l v e di ng e n e t i cr e c o m b i n a t i o ni ne c o l ipd【c岫and峨dmnr e c a 。d n as t r a n de x c i a n g e d n at e u t u m t i m , d n a - d e p e n d e ma t p a 辩d n a a n da t p d e p e n d e n tc o p r o l e a s ed n ab c l k a s c a t p 曲p e n d e n td s d n a 孤一u d n a 口硼k 妇a t f - n i m , a , m ds s d n ae n d o n u c k a s e xb 硝s p i nr e c o g n i t i o nr c c b c 一d n ah c b 暇r 瞄el c i 帅u c l 啦ev l l l ) ( e t a ) 。d s d n ac , x o n u c l e a s e 5 - + 3 s p e c 讯cr r c f 。一一黛d n aa n dd s d n au i n d 咄a t pb i n d i n gr c c g 一。b r a n 曲m i g r a b o do fh o l l l d a yj u n c t i o n s , d n ah e l i c u er e c , i 一x s d n am m n 删u e e ，5 - + 3 。s p e d f i cr e c n m 一u n k | l o 峨a t p - b i n d i u ga 瑚就借u ss e q u e m ，er e c o 。一1 m e r a c ：l i o nw i l hr e c ra 1 d ( p 诚1 ) r ) r e c fp r o t e i n sp , e c q 。一d n ah e s c a s cr c c r 一。i m c r a c l i o aw i t hl t 0a n d ( p 蜥) g c c fp r o z e i mr c c t 一一d n ar c n a t 廿n l i o l ir u v a h o l l i d a y - c m c i f o r m a n df o u r 呻i 嘲啪b i n d i n g ：i n t e r a c t i o nw i t hr u v bp r o t e i nr u v b 一一一b r a n c hm i g r a t i o no fh o t l i d a yi u n c t i o m , d n ah c j i c a s c m t c r w , i o ow i l l ) r i y ap r o l e i nr u v c 一一一一h o u i d 硝讪n c n 锄c k m v a g e o u r - w a yl u n c t i o nb r a d i i l s b c b ( e , x 0 9 u d c 越ci lc 柳一) 一。s s d n ae x o n u c l e a s c 3 - + 5 r p e c i cd c f 岬b p l 唧蛐c 髓c 馆掰s b c c d 一一a r p d e p c n d m td s d n ac a m u d c a s cs s b 。s s i ) n ab m d j n gd n at o 丽m e r 撵if l d i 叫) t ep r m c m ，i y p eii o 口o i 瓣嘴ed n ag y f a 转b 叫a n d 自柏k 一一一d n ag y r a , 2 ，t y r oi it 口p 0 i s o m c r a 鸵d n a1 i 2 a 耻( f 垃) d n al i g a 辩d n ap o l y m e r a s ei ( m m d n ap o b m r t m ：。5 3 。锄n 眦l c c 3 - * 5 e j m m 卫l u m ：h c t z a s ：i i ( 们“竹肥c l 删。d n ah d i c a m ：h e l 把u el vl 栅l , , d n ah c l i c a 馨锄( x )r e c o m b i n a t i o nh ms p m ( 5 g c t g o r g g 3 ) 。m l l a t o ro fp , 上c b c dc 立2 y m cn u d e a s ea c t i v i i ) 。曲一瞻虹曲瞄i e 州叫硪”咖帕岫岫蚓咄r j c eh 卫嘲讽现将其中的主要基因介绍如下。1 ) r e c a 基因在一项以高频转导细菌为供体、f 细胞为受体的大肠杆菌接合实验中，人们筛选出无法产生选择性突变子的f 克隆，从而分离得蛩j r e c a 突变子。它与野生型亲本株的不同点在于其转导缺陷特征，对紫外线和x 射线呈现高度耐受性，既不为紫外线所突变，也不能使紫外线失活的噬菌体回复突变，更无法通过紫外线诱导溶源噬菌体进入裂解循环【9 1 。进一步的研究结果表明，大肠杆菌r e c a 基因编码的r c c a 蛋白是一个3 9k d a的单一多链肽，它作为一种重要的重组酶参与同源重组，其主要作用包括促进d n a 同源片段的联会以及d n a 分子间的单链交换。由于r c c a 蛋白具有依赖于单链d n a 的a t f 酶活性，因此涉及到所有耗能的d n a 反应，如互补单链d n a 区域的退火、线状单链d n a 并n 环状双链d n a 间d 环状结构的形成、线状双链d n a 和环状单链d n a 转变成线状单链d n a 和环状双链d n a 、两条线状双链d n a 分子间的单链交联( 即同源重组h o l l i d a y 机制的中间体，) 等。r e c a 介导的同源重组反应对单链d n a 的结构要求与同源d n a 分子间的联会机制有关。在中性p h 的条件下，r e c a 能大量结合于单链d n a ，每个单体与单链d n a 上的3 5 个碱基结合，而且这种结合作用呈现高度的协同效应。此外，r c c a第一章文献综述还具有依赖p h 和a t p 等三磷酸核苷酸的双链d n a 结合活性。这种持续的结合作用使得双链d n a 有效地解离为单链，直到与含有大于5 0 碱基的同源区域发生联会，并形成h o l l i d a y 中间体h d n a 。在r e c a 蛋白催化的d 噜噗分叉迁移反应中，单链d n a 同化是单方向的，速度极慢，每秒仅几个碱基，并且存在着1 以上的错配碱基。r e c a 介导的链同化反应对于d n a 底物具有较强的选择性，两种不同类型的反应证明了这一点。只有当双链d n a 的3 端同源并互补于单链环状d n a 分子时，它们的重组才能形成稳定的h d n a ：类似地，在s s b 蛋白存在的情况下，只有当线状单链d n a 的3 端与环状双链d n a 同源时，h d n a 结构才能产生。这说明单链同化反应只能沿着的固定方向进行，这个方向对双链d n a 上的互补链来说是3 - - 5 ；而对于入侵的单链d n a 来说则是5 - - 3 。r e c a 蛋白要求单链或双链d n a分子上具有3 同源末端以启动稳定的链同化反应。r e c a 促进d n a 同源重组反应并形成稳定的重组产物，要求底物具备三个条件：即d n a 分子间或分子内存在较高的同源序列、至少一种d n a 底物呈单链结构、至少一条d n a 链具有自由末端。但值得注意的是，当拓扑异构酶参与反应时，最后一个条件并不是必需的。对纯化的r e c a 蛋白和完整细胞的研究表明，有效重组事件的发生至少需要4 0 - 5 0 个碱基对的同源性，3 0 个同源碱基对通常不能发生联会作用。2 1r e c b c d 基因r e c a 蛋白质无疑是同源重组中最重要的蛋白组份之一，但是它只能催化同源联会和链交换反应，不能控制重组过程中的其他步骤，如单链d n a 区域的形成、连锁分子的拆分等。根据对大肠杆菌各种重组突变体的研究发现，除了r e c a蛋白之外，还需要r e c b 、r e c c 、r e c d 、r e c e 、r e c f 、r e c g 、r e c j 、r e c k 、r e c l 和r e c n等基因的编码产物。在筛选大肠杆菌重组缺陷型突变株的过程中，相继鉴定了r e c b 和r e c c 突变子。其它细菌中也发现了与大肠杆菌r e c b c d 酶性质相同的a t 依赖型脱氧核糖核酸酶，第一个关于这方面的报道来自于藤黄微球菌( m i c r o c c u sl u t e u s ) 。大肠杆菌的r e c b 、r e c c 和r e c d 基因分别编码1 3 0k d a 、1 2 0k d a 和6 0k d a 的多肽链，三者构成一个在同源重组中的功能单位r e c b c d 蛋白复合物。它是一个多功能的酶系，具有依赖于a t p 的单链和双链d n a ) i , 切酶的性质，因此又称为外切核酸酶v 。它能利用水解a t p 释放的能量使线型d n a 解旋，此外还呈现序列特异性的d n a 单链内切酶活性。体外实验结果表明，如果系统中缺少s s b ，r e c b c d 能进攻线型双链d n a 的末端，一次解旋1 0 0 0b p 左右的区域，其中一条链被切成4 - - 5 碱基的寡核苷酸，另4第一章文献综述一条链则成为1 0 0 0 个碱基左右的单链尾巴。r e c b c d 对线型双链d n a 的外切活性最高，而对于平头末端的双链d n a 来说，螺旋酶活性占主导地位。r e c b c d 只对具有平头末端或者几乎平头结构的线型d n a 分子呈现解旋功能，而对超螺旋、缺刻、含1 0 到7 7 4 个碱基缺口的环状双链d n a 或含大于3 0 碱基的单链结构的线型d n a 分子均无活性。f i q r e e b c d 产生的单链d n a 可能是r e c a 促进联会反应的主要底物。从理论上讲，r e c a 蛋白介导的同源重组反应可以发生在d n a 链上的任何同源序列之间，但是实际上某些序列( 即重组热点) 发生重组的频率要远远高于其它序列。迄今已知的重组热点主要是c h i 位点，最初是在突变的噬菌体中发现的。纯化的r e c b c d 酶切割含c h i 位点的d n a 比不含c h i 的d n a 有效得多，在c h i 处重组频率显著增加，而位于c h i 上游约2 眦5k b 处的重组呈指数减弱。r e c b c d 解旋d n a 后，从c h i 位点伸出的单链结构是r e e a 和s s b 蛋白形成d 噜噗的有效底物。大量的实验结果证实，所有r e c b c d 酶介导的重组过程都要求c h i 或类似c h i的位点，而c h i 位点只激活r e c b c d 重组途径，对r e e e 、r e e f 或r e d 途径不起作用。通常，r e c b c 无效突变株比r e c a 突变株的重组水平高，这表明在大肠杆菌细胞内至少还存在着另一种依赖r e c a 但却独立于r e c b c d 的低水平重组途径。一种能强化这些低水平重组途径并同时使r e c b c 突变株恢复重组能力的突变体被分离出来，经鉴定证实其中的关键基因为s b c ，其编码产物实质上是r e c b c 基因表达的抑制因子。3 ) s b c a b c 基因某些s b c a 缺陷的大肠杆菌k 1 2 株，可以通 p c j s b c a 基因的回复突变，或者与不含r a e 原噬菌体的f 菌株接合，重新产生具有重组活性的r a c 原噬菌体。相关实验发现，噬菌体的r e d - g a m 突变体在含r a c 原噬菌体的大肠杆菌宿主中，会产生极少量的拟回复突变体，但这种现象在其它大肠杆菌中并不出现。进一步研究表明，这些噬菌体的拟回复突变体中含有部分r a c 原噬菌体，并在其裂解循环中产生不依赖a t p 的核酸酶。对含有r e c b c - s b c a 双重突变的大肠杆菌重组缺陷株的遗传分析发现，r a e 原噬菌体基因组上的r e c e 位于控制它表达的s b c a 附近，编码核酸外切酶e x o v h i ，e h 3 或4 个约1 4 0k d a 的多肽组成。d n a 序列分析表明，s b c a 突变子呈现一系列的结构改变，如点突变、缺失和倒位等。此外，s b c a 基因的突变能使r e c e 基因与另一个基因融合，或者通过改变转录和翻译调控位点激活r e c e 的表达。从r a c 原噬菌体缺陷的大肠杆菌菌株中，还可以分离出r e c b c 的第二种抑制基因s b c b 。与具有核酸酶活性的s b c a 突变株不同的是，s b c b 突变株缺乏e x oi 的核酸酶活性。e x oi 从3 端消化单链d n a ，同时释放出5 单核苷酸。一种可能的假设5第一章文献综述是，e x oi 破坏了趋向形成重组子的d n a 结构。x o r 和s b c b 是等位基因，因为它们的突变都会使e x oi 失活。此外研究结果还表明，单独的s b c b 突变不足以恢复r e c b c 突变株的重组功能，必须在另一位点s b c c 的突变才能使r e c b c 突变株有效进行d n a 重组反应。r e c b c s b c b 突变株中常伴随着s b c c 的突变，这一现象暗示r e c b c 突变株d n a 重组过程的抑制同时需要s b c b 和s b c c 两个基因的协同作用【6 】。4 ) r e c e 基因r e c e 突变株是通过筛选无法与高频转导菌株同源重组产生原养型噬菌体的r e c b c s b c a 突变株时获得的。r e c e 靠j 匠s b c a ，通常表达少量的e x o v i i i 。e x o v i i i从3 端将双链d n a 中的一条链降解成5 单核苷酸，它对双链末端结构具有明显的偏爱性，缺刻或缺e l d n a 不是良好的底物。外切反应形成的单链d n a 分子或含3 突出末端的双链d n a 分子，能与其他的双链d n a 片段相连，这是同源重组过程中的一个重要步骤。e x o v i i i 、核酸外切酶与r e c b c d - - 样，都能作用于线型双链d n a 分子并产生3 末端结构，但后者是通过解旋d n a 起作用的。5 1r e c f 基因与r e c e 突变株相同，r e c f 突变株也是在筛选r e c b c - s b c b s b c c 突变菌是获得的，它位于砌州和g y r b 之间。突变区域的d n a 序列分析结果表明，此处含有一个编码3 5 7 个氨基酸的开放型阅读框架，与咖口n 基因重叠一个碱基，并于g y r b 编码区的前2 8 个碱基处结束。体外实验结果表明，在入噬菌体强启动子p l 和p r 的控制下，r e c f 基因低水平表达一个4 0k d a 的多肽，其功能可能是调节r e c a 蛋白的d n a 链传递活性或者调控相关调节基因的表达【1 0 16 1 。1 1 2 2 同源重组的主要途径大肠杆菌体内的同源重组有4 条途径，虽p r e c b c d 途径、r e e f 途径、r e c e 途径和r e d 途径( 见图1 1 和表1 1 ) 。图1 1 中，r e c q 也有解旋功能，有r e c j 合作的情况下，运用它的5 一3 外切活性把5 s s d n a 降解，留下3 s s d n a ，被r e e f和r e c o 结合，而r e c r 结合d s d n a ，能促进联合分子的形成，r e c f o & 三者合作，可以代替r e c a 的部分功能，这条途径且p r e c f 途径，其效率低于r e c b c d 途径。r e c e 途径不用r e c b c d ，也不用r e c a ，由r e c e 和r e c t 联袂主演，但此途径很少被大肠杆菌使用【m 2 3 1 。r e d 途径( 重组缺陷( r e c o m b i n a t i o nd e f i c i e n t ，r e d ) ) 则是入噬菌体专用的途径，其基因和原理将在下文进一步介绍。各条途径所用的蛋白质有相同而又不尽相同，所以各条途径不是孤立的，而是互相交叉、相互渗透的。在多数途径中都用或可用r e c a ，所以一般说来不提r e c a 途径。6第一章文献综述1 1 3 重组工程ii2 中提到的基于r e c e 和r e c t 基因或基于r e d 重组基因的重组途径，被人们利用而发展出一项新的遗传工程技术即重组工程。重组工程可定义为：基于噬菌体短同源序列重组功能的遗传工程。相关的噬苗体b p p , a c 噬菌体和 噬菌体，r a c 噬菌体重组相关的基因分别为r e c e 、r e c t ，前面已有介绍，x 噬菌体重组相关的基因统称为r e d 【2 0 ”】包括三个基因，b p e x o 、b e t 和g a r a ，分别编码e x o 、b e t a 和g a m e 种蛋白质分子。e x o 蛋白的分子质量为2 4 k d ，具有d n a 外切核酸酶活性，以每秒钟1 0 0 0 个碱基的速度从双链d n a 末端按5 一3 的方向消化单链d n a 。b e t a 是一种单链d n a 结合蛋白，结合在由e x o 消化产生的3 单链d n a末端，促进该单链d n a 末端与互补链退火和体内重组，e x o 蛋白与单链d n a 分子结合需要至少3 5 个碱基的区域。g a m 抑制宿主菌的r e c b c d 线性双链d n a外切酶活性，协助e x o 和b e t a 完成同源重组( 见图i 一2 ) 。磊= = = = = = = = = ( ) _ 二二巾 i i i ： ： j 一i i 一i u h m圈i - 2e x o 和b e t a 蛋白的作用f i g l - 2t h e i n t e r a c t i o no f e x oa n d b e t a重组工程原理见图1 3 。r e c e 、r e c t 重组效果不及r e d 系统，胃宿主适应性不及r e d 系统宽泛。因此人们对陀d 系统的应用更多更深入。下文重组工程一般指r e d 系统的重组工程。【2 “) o 1 1 3 1 重组工程与传统重组技术的比较i ) 大肠杆菌传统重组技术由于大肠杆菌内的限制修饰系统，线形双链d n a 在大肠杆菌内是不稳定的绣第一章文献综述后来出现了增c b c 和s b c b c 突变株，使线形d n a 能稳定地进入大肠杆菌并发生同卜 i 垂= = = ；万+ s 。 i l l _ i 宣- i - l l _ i 7。卜3 叫j 兰可pg图1 - 3 重组工程原理f i g 1 - 3t h ep r i n c i p l ef o rr e c o m b i n e e r i n g源重组。这种菌株可用于进行胞内克隆，如带同源臂的线形d n a 与环状的染色体d n a 发生重组；引入抗药基因到细菌染色体上作为选择标志；或对质粒上的基因进行修饰。另外：在线形双链d n a 两端若存在c h i 位点( 5 g c t g g t g g 3 ) ，则核酸外切酶的外切酶活性会削弱，但其螺旋酶活性会使线形双链的两个3 端各产生一条长的单链尾巴，这条尾巴被认为是r e c a 和单链结合蛋白的底物。这样的线形双链d n a 就可以与染色体发生重组。由于r e c b c d 不能降解环状的d n a ，因此，通常利用这一点进行重组。方法是将目的片段插入到有如下几个重要特点的质粒载体上：1 、含一个抗性基因作为筛选标志：2 、有一个温度敏感复制子：3 、含有待重组基因两侧的同源区；4 、有时还有r e c a 基因；然后以环状形式进入菌体，即可避免r e c b c d 的降解而主要通过r e c b c d 途径进行重组。但此方法有以下几点不足：第一，要构建一个带有长同源臂( 每个数百至一千余碱基长度) 的打靶载体；第二，重组效率比较低；第三，载体上若有r e c a ，贝i j r e c a 的胞内过长表达易引起一些错误的重组，而且这些错误的重组体更具生长优势。2 1 重组工程技术r e d 重组系统完全不同于传统的依赖r e c a 的重组系统，使用较短同源臂长度( 几十个碱基) 的线形片段即可高效率地催化体内同源重组反应。重组过程不第一章文献综述再需要预先构建含有同源序列的质粒中间产物，只需要简单在体外合成寡核苷酸同源序列，或者用p c r 方法合成线性打靶片段( 因此其所受的限制是p c r 反应的忠实性或扩增d n a 的长度) 。重组反应不依赖大肠杆菌r e c a 系统，不需要限制性内切核酸酶和连接酶，不需要复杂的体外重组操作，可在大肠杆菌体内对染色体d n a 、b a c 和p a c 质粒或普通质粒载体进行精确的修饰，完成包括真核或原核细胞基因组d n a 的基因敲除、基因敲入、基因克隆和各种突变体引入的操作。由于该技术具有高效率、简单性和应用的广泛性等独特优点，被认为将来有可能取代传统的遗传工程技术。 3 1 - 3 6 11 1 3 2 发展历史1 9 9 8 年，美 m u r p h y 等最早构建成带有r e d 重组酶基因的质粒p t p 2 2 3 ，首次直接利用线性双链d n a 片断转化大肠杆菌，与染色体发生重组，但其同源臂长达几百个碱基，且效率较低。1 9 9 8 年，f r a n c i ss t e w a r t 和他的同事们发现，在携带r a c 噬菌体( 编码基因为r e c e 和r e c t ) 的大肠杆菌k 1 2 中，r a c 噬菌体中的s b c a 突变、r e c e 和r e c t基因表达使得大肠杆菌也能像酵母一样，可利用携带短同源臂的线性d n a 分子进行体内同源重组1 4 0 ”。虽然重组效率不是很高，但由于首次在大肠杆菌中应用了线性打靶序列，且同源重组反应不依赖于r e c a ，因此被认为是该研究领域的重大突破。然而上述系统建立在缺乏r e c b c d 酶活性的基础之上，不适合b a c 、p a c 质粒的研究。之后，s t e w a r t 的研究室又构建 7 p b a d e ty 重组质粒 2 6 - 2 81 ，采用了入噬菌体的g a m ( r e dv ) 基因抑制大肠杆菌r e c b c d 外切酶活性。在这个系统中，只有主管重组的r e c e 基因置于可调控启动子之下，而r e c t 和g a i n 基因置于组成型启动子控制之下。重组效率比染色体上携带r e c e 基因、s b c a突变的系统提高三倍。2 0 0 0 年y u 等将首次部分入噬菌体d n a 片段( 包括重组酶基因) 整合至大肠杆菌染色体上，得到菌株d y 3 3 0 、d y 3 3 1 等。y u 所在的研究室除d y 3 3 0 、d y 3 3 1等菌株外，还建立了多种携带入噬菌体r e d 重组酶基因的大肠杆菌菌株( 见表卜2 ) 。它们的共同点是入噬菌体r e d 基因整合在大肠杆菌宿主菌的染色体上，单拷贝的e x o 、b e t 、g a m 在染色体上的位置彼此相连，表达受温度敏感型强启动子p l 控制。温度为3 2 时，c i 8 5 7 阻遏物结合在启动子区，关闭p l 启动子。c i 8 5 7 在4 2 时失活，抗转录终止蛋白n 修饰r n a 聚合酶使其转录通读过终止子使g a m 、b e t 、e x o 基因表达【3 。诱导5m i n 即可见显著的重组活性，7 5 1 5m i n时达到最高水平，1 5m i n 后逐渐降低。该系统的重组效率大于0 1 1 ，较大肠杆菌r e c a 系统提高l o 1 0 0 倍。同源臂长度仅为3 5 5 0b p ，简单的p c r 反应9第一章文献综述便可获得打靶序列【3 7 3 2 1 。如果需要，还可通过p 1 噬菌体转导方法将e x o 、b e t 、g a m 基因转移至其它大肠杆菌。表1 2 重组工程中使用的菌株t a b l e l 一2b a c t e r i a ls t r a i n su s e dj nr e c o m b i n e e r i n 2w o r k s菌株基因型墨塑堕i 墅鱼呈里q 业皇嘲f 鼬珏h i si l vr p s l l a c u l 6 9n a d a ：t n l og a l 4 9 0 入c 1 8 5 7 fc r 0 2 b i o a )阻、1 4 1w 3 l l oal a c u l 6 9g a l 4 9 0a n ：l 口c z ( n 2 i n oc 1 8 5 7a ( c r 0 2 b i o a )b r 3 6 7 7l a c l ql a c z ( m l5 ) s r l ：t n l oar e c ad y 3 2 9w 3 l l o l a c u l 6 9n a d at n l 0g a l 4 9 0 入c 1 8 5 7 ( c r 0 2 b i o a )d y 3 3 0w 3 llo l a c u l6 9g q l 4 9 0ac i 8 5 7 ( c r 0 2 b i o a )d y 3 3 1w 3 l l o l a c u l 6 9s 订：t n l oa r e c ag a l 4 9 0 九c 1 8 5 7 ( c r 0 2 b i o a )d y 3 7 8w 3l l o 九c i 8 5 7a ( c r 0 2 b i o a )i - i m e 5w 3 1 1 0 l a c u l6 9ac 1 8 5 7 fc r 0 2 b i o a )2 0 0 0 年d a t s e n k o 等将入噬菌体重组酶基因蹦d 、6 p f 和g 口研置于受阿拉伯糖诱导的p b a d 启动子之下，构建t p k d 4 6 ( 其图谱见附件1 ) ，同时构建了一系列方便制各两端各含有一个f i 玎位点的抗性基因的配套质粒，如p k d 3 【2 j 】。1 1 3 3 重组工程的应用重组工程己广泛用于大肠杆菌及其它一些微生物的基因操作和基因组学的研究之中，具体说来有以下几个方面的应用。1 ) 染色体d n a 的靶向修饰基因敲除与基因敲入随着越来越多的菌株基因组测序结果的完成，基因功能的确定成为功能基因组学研究的重点。重组工程能直接对染色体d n a 进行靶向修饰，完成染色体上的基因敲除与基因敲入操作。其操作原理和流程见图1 - 4 。1 0第一章文献综述s t