（分析化学专业论文）基于脂质体纳米粒子的生物传感器在生化分析中的应用.pdf

摘要 霍乱是一种严重的传播广泛的流行性疾病，大多数霍乱病例发生在不发达国 家，已成为世界上亟待解决的一个严重公共卫生问题。霍乱毒素是霍乱弧菌分泌 的一种蛋白质肠毒素，是霍乱弧菌的一个典型生物标记物，所以对霍乱毒素的快 速、超灵敏检测对霍乱流行病的防疫、控制和治疗具有十分重要的意义。近年来， 前列腺癌已经成为成年男性群体中一项常见癌症，且危害严重。目前临床上对癌 症标记物的检测方法普遍操作复杂、仪器昂贵且需要专业技能。从而需要开发更 加简便、灵敏、定量准确且易于临床推广的生物传感技术。此外，地中海贫血又 称海洋性贫血，是由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致的一组遗传性溶血性贫血。 该病以地中海沿岸国家和东南亚各国多见，我国长江以南各省均有报道，以广东、 广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高，是非常严重的遗传性疾病。故开发 灵敏、准确的基因单碱基突变检测方法，对地中海贫血症的诊断有很大意义。 利用化学与生物传感技术检测疾病标志物，进行临床疾病的准确、快速诊断 以及流行病的现场筛查与群体监控，是当前医学上既新颖又极具吸引力的热门研 究课题之一。近年来，纳米材料得到广泛的研究与应用，研究表明将纳米材料应 用于生物传感器的制备可以较大的提高传感器的响应性能。脂质体是一种在水相 中由磷脂双分子定向排列而成的直径几纳米至几微米的超微粒子。脂质体纳米粒 子可以通过内部包埋或表面修饰方法成为多功能团分子的通用载体且具有良好的 生物相容性，本论文将不同功能化的脂质体用作生物传感界面的构建和信号放大 探针，并与相适宜的检测手段联用，构建了一系列基于脂质体的新型生物传感器。 纳米金制备简单，比表面积大，生物相容性好，是固定生物分子常用的有效载体。 有文献报道，电极表面通过自组装纳米金层固定抗体，可以大大增加电极表面积 和抗体固定量，同时保持抗体活性，是很好的传感界面修饰方法。另外，碳纳米 管具有隧道效应、特殊的电化学、光化学等物化性质，是目前科研领域中最热门 的一维纳米材料之一。碳纳米管的功能化修饰是将其应用于生物体系必须解决的 一个关键问题。d n a 修饰碳纳米管的研究为碳纳米管在基因检测中的应用提供了科 学基础和强有力的技术支撑。 本论文以霍乱毒素，甲胎蛋白，前列腺特异性抗原等重大疾病标志物为检测 对象，构建了一系列基于脂质体纳米颗粒的生物传感器( 第1 部分) 。具体内容包 括： ( 1 ) 首次研制了一种基于脂质体的压电免疫凝集检测( p e i a ) 技术用于对人 免疫球蛋白( h i g g ) 和甲胎蛋白( a f p ) 的直接定量检测。以脂质体替代传统胶 乳颗粒标记抗体，并采用牛血清白蛋白修饰压电探针，直接对脂质体颗粒免疫凝 甚f 僭质体纳必孝立了的生物传惑器在生化分昕中j 勺j 蠢用 集所引起的溶液粘弹性变化进行响应。其定量检测h l g g 的浓度范围为0 0 5 6g g m l ：将之用于临床样品分沂，定量能力与经典的e l i s a 法相接近。用所构建的 生物传感器对a f p 实际临宋样品检测，结果证明该方法应用于临床医学检测的可 行性。与经典的质量型压电免疫检测技术相比，这种基于脂质体的压电免疫凝集 检测( p e i a ) 无需在石英晶振表面固定抗原或抗体，具有简单、快捷、可再生的 检测优势。 ( 2 ) 开发了一种基于神经节苷脂( g m l ) 识别和脂质体界面凝集的压电生物 传感技术对霍乱毒素进行快速、定量检测。石英晶振传感界面修饰含g m l 的支撑 磷脂膜，检测介质中含有g m l 修饰的脂质体颗粒，这两者构建了压电界面凝集生 物传感器。目标物霍乱毒素会引起检测介质中g m l 修饰的脂质体在含有g m l 的 传感界面上发生特异性凝集，同时引起晶体表面巨大的质量负载和溶液粘弹性的 变化，结合了压电质量效应和非质量效应，与传统模式的压电频率响应信号相比 放大了数倍，具有响应快速、可再生的优势。其定量检测霍乱毒素的浓度范围为 0 1 5l a gm l ，检测下限达到2 5n gm l 。 ( 3 ) 提出了一种以脂质体为信号放大载体的酶催化增强化学发光传感技术对 霍乱毒素的超灵敏检测。用含g m l 的支撑磷脂膜为生物传感界面检测目标物霍乱 毒素，再用表面修饰了g m l 受体和辣根过氧化物( h r p ) 酶的脂质体为检测探针 对目标物夹心检测。最后利用h r p 酶为催化剂，对碘苯酚为增强剂的增强化学发 光法对霍乱毒素进行定量检测。本传感器实现了对霍乱毒素的超灵敏检测，检测 下限可达到o 8p gm l 一，同时具有简单、可再生的优势。将传感器用于血清样品 分析，其检测结果与e l i s a 试剂盒检测结果相一致。 ( 4 ) 发展了一种基于包酶脂质体的化学发光生物传感技术对前列腺癌特异性 抗原的超灵敏检测。以表面修饰了抗体、内部包被h r p 酶的脂质体替代传统酶标 抗体对界面识别的抗原夹心检测，并采用表面活性剂释放所固定脂质体中的酶分 子，用增强化学发光试剂盒放大酶催化化学发光强度，间接检测前列腺特异性抗 原。实现了对目标物的超灵敏检测，检测下限可达到4p gm l 一。 在第一部分中，不同形式和性能的功能化脂质体被合理运用，并结合使用多 种检测方法，提高了生物传感器的分析性能。此外，我们还构建了几种基于其他 纳米粒子的电化学生物传感技术，其中纳米粒子被用于生物分子的固定或检测探 针的制备( 第2 部分) 。纳米金比表面积大，生物相容性好，是固定生物分子常用 的有效载体。具体内容包括： ( 5 ) 构建了一种以纳米金颗粒为固定化材料和多步信号放大探针的电化学阻 抗免疫传感器对h i g g 的超灵敏检测。将纳米金颗粒自组装于己二硫醇修饰的金电 极表面，利用纳米金层吸附抗体，构建了一种纳米金界面吸附的生物分子固定化 方法。信号放大步骤为：用纳米金标记的抗体做为第一步放大探针，然后分别用 i l l 博卜学位论上 纳米金标记的二抗和纳米金标记的抗体交替反应，进行多步信号放大。基于纳米 金界面固定抗体，具有抗体固定量大、免疫活性强、操作稳定性高等优点。基于 纳米金的信号放大技术极大的提高了传感器的灵敏度，对目标物h l g g 的线性检测 范围为1 5 3 3 2 8 3n gl 。 ( 6 )通过自组装纳米金层固定具有碱基突变识别能力的m u t s 蛋白，m u t s 蛋白能捕获含碱基突变的d n a 双链并以亚甲基兰在d n a 双链中的嵌入作为电化学 响应信号来检测单碱基突变核酸链。该方法成功地实现了对1 3 一地中海贫血症基因 的一2 8 位点的单个碱基突变的识别，检测限达到5 6 6 x 1 0 0 3m ，对点突变的检测具 有快速、灵敏度高、成本低的特点。对实际样品的两步检测方法可实现样品的基 因分型，即将样品分类为变异杂合子，野生纯合子和变异纯合子。 ( 7 ) 单壁碳纳米管具有隧道效应、特殊的电化学、光化学等物化性质，将其 作为纳米材料探针与电化学方法联用可以超灵敏的检测核酸单链，构建了新型的 核酸检测方法。检测原理：将单壁碳纳米管与核酸检测探针混合机械超声，制备 核酸检测探针修饰的水溶液分散的单壁碳纳米管。与目标d n a 链的杂交反应会使 检测探针解离离开碳管表面，裸露的单壁碳纳米管继而吸附在疏水的电极表面， 由于其特有的隧道效应使原本绝缘的电极导通，从而检测到氧化还原电子对在电 极表面实现电子传递的电化学信号。背景非特性吸附不能产生隧道效应，故检测 背景极低，实现了对目标核酸单链的超灵敏测定，线性范围为6 9p m 5 0n m 。 关键词：临床疾病诊断；压电免疫传感技术：压电界面凝集传感技术：增强化学 发光；纳米颗粒：脂质体；单壁碳纳米管；霍乱毒素；单碱基突变 i v a b s t r a c t c h 0 1 e r at o x i n ( c t ) i sap r o t e i ne n t e r o t o x i ns e c r e t e db yt h e b a c t e r i a mv i b r i o c h o l e r a et h a tc a nc a u s ea ne p i d e m i cd i s e a s el e a d i n gt or a p i dd e h y d r a t i o n ，a c l d o s l s ，a n d e v e nd e a t hi ns e v e r a lh o u r sw i t h o u ta p p r o p r i a t et r e a t m e n t - m o s tc h o l e r ac a s e sa r e r e p o r t e di nm a n yu n d e r d e v e l o p e dc o u n t r i e s ，a n di t i s e s t i m a t e dt h a tc h o l e r ac a u s e s a p p r o x i m a t e l y12 0 ，0 0 0d e a t h sa n n u a l l y a sat y p i c a lb i o m a r k e ro f v i b r i oc h o l e r a e ，c t h a sb e c o m eav e r yi m p o r t a n tt a r g e t i n b i o l o g i c a l d e t e c t i o n ，a n dt h e r eh a s b e e n i n c r e a s i n g i n t e r e s ti nt h ed e v e l o p m e n to fr a p i d a n ds e n s i t i v em e t h o d sf o r t h e d e t e r m i n a t i o no fc t i na d d i t i o n ，p r o s t a t ec a n c e r ( p c a ) h a sb e c o m e am o s tw i d e s p e a d a n ds t u b b o r nd i s e a s e sa n dam a j o rc a u s eo fd e a t hi nt h e o l da g em a l ep o p u l a t l o n n o w a d a v s i ta d m i t so fn od e l a yf o rt h es e n s i t i v ed i a g n o s i sa n de f f i c i e n tt r e a t m e n to f p c a p o r s t a t e s p e c i f i ca n t i g e n ( p s a ) ，a 3 3 - k d s i n g l e 。c h a i ng l y c o p r o t e l n w l t n c h y m o t r y p s i n 1 i k ep r o t e a s ea c t i v i t y ，h a sb e e nu s e da st h em o s t v a l i d a t e dm a r k e rf o r t h e d e t e c t i o no fp c ai ns c r e e n i n g ，d i a g n o s i s a n dm o n i t o ro fd i s e a s er e c u r r e n c e a f t e r s u r g ic a lp r o s t a t e c t o m y u s eo fc h e m o b i o s e n s i n gt e c h n i q u e st od e t e c tt h em e a n i n g f u lb i o 。m a r k e r sf o rt h e a c c u r a t ea n dr a p i dd i a g n o s i so fc l i n i c a ld i s e a s e sa sw e l l a sf o rt h ef i e l ds c r e e n l n ga n d m a s sm o n l t o r i n go ft h ee p i d e m i cd i s e a s e sh a sb e e nan o v e l ，a t t r a c t i v ea n dh o tt o p 1 cl n t h ec u r r e n tm e d i c a ls t u d i e s i nt h ep a s tf e wy e a r s ，n a n o m a t e r i a l sh a v eb e e n w l d e i y r e s e a r c h e da n du s e d a p p l y i n gn a n o m a t e r i a l sf o rt h e f a b r i c a t i o no fb i o s e n s o r sw l l i g r e a t l yi m p r o v et h ep e r f o r m a n c e o ft h er e s u l t i n gb i o s e n s o r l i p o s o m e sa r ef o r m e ds p o n t a n e o u s l yw h e np h o s p h o l i p i d sa r e d i s p e r s e di n t ow a t e r l i p o s o m e sc a ns i m p l yb ep o r t r a y e da ss p h e r i c a lv e s i c l e sc o n s i s t i n g o fo n eo rm o r e p h o s p h o l i p i db i l a y e r ss u r r o u n d i n ga na q u e o u sc a v i t y m o l e c u l e ss u c h a sf l u o r o p h o r e s ， e n z v m e so rd r u g s ，p r e s e n ti n t h ea q u e o u sp h a s ed u r i n gt h ep r e p a r a t i o n ， c a nb e e n c a p s u l a t e di nt h el i p o s o m e l i p o s o m e sh a v eb e e nw i d e l yu s e d a sa n a l y t i c a lt o o l sl n i m m u n o c h e m i s t r ya n dc a nb e i m p l e m e n t e dw i t hh a r d l ya n y m o d i f i c a t i o n s s i n c e c o l l o i d a la uh a sav e r yl a r g es u r f a c ea r e a a n dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y ，t h eu s eo t c o l l o i d a lp a r t i c l e sa s v e r s a t i l ea n de f f i c i e n tt e m p l a t e s f o rt h ei m m o b i l i z a t l o no f b i o m o l e c u l e sh a sb e e nr e c o g n i z e ds i n c et h ee a r l y 19 8 0 s a san e wk i n do tc a r b o n m a t e r i a l s c a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) h a v ea t t r a c t e dc o n s i d e r a b l e i n t e r e s tb e c a u s eo r t h e i ru n i q u es t r u c t u r a l ，m e c h a n i c ，e l e c t r o n i c ，m a g n e t i c a n do p t i c a lc h a r a c t e r l s t l c s b i o m o l e c u l e f u n c t i o n a l i z e d c a r b o nn a n o t u b e s h a v er a p i d l ya t t r a c t e d s u b s t a n t l a i v 博卜擎垃论上 r e s e a r c hi n t e r e s t sf o t sa p p l i c a t i o ni nt h eb i o s e n s o ra n d e l e c t r o c h e m i s t r yd e t e c t i o n t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so n d e v e l o p i n g as e r i e so f n a n o p a r t i c u l e s b a s e d b i o s e n s o r sf o rt h ed i a g n o s i so fs o m ec l i n i c a ls e r i o u sd i s e a s e si n c l u d i n gp r o s t a t ec a n c e r ， v i b r i oc h o l e r aa n d3 - 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