（分析化学专业论文）微电极阵列的制备及其在电化学传感器中的应用.pdf

摘要 摘要 本文中我们在超疏水界面上，利用光电化学方法和光催化沉积的方法相结 合制备了微电极阵列，方法简便，成本低，可大面积化。首先，我们在已经修 饰上碳十八烷基硅烷o d s 的超疏水t i 0 2 膜上，利用光催化氧化，制备超疏水 超亲水的膜样，形成凹形微阵列电极。然后，在超亲水区域光催化金属纳米粒 子的生长，从而制备出凸形微阵列电极。此种方法可以制备不同的金属纳米膜 样如金银铂，解像度可低至数微米。与其它方法相比，文中所述的方法简便， 成本低廉，无毒性蚀刻剂，具有环保性。 与此同时，用电化学沉积的方法制备不同形貌的纳米金电极，在锥状纳米 金电极上成功地实现了肌红蛋白m b 和血红蛋白h b 的直接可逆的电子传递。 修饰上m b 的锥状金电极a u n p m b 上氧化还原的表观电位是e 0 1 - - 0 2 1 v ( v s a g a g c 0 ，电子转移速率常数k = 1 6 ；修饰上h b 的锥状金电极a u n p h b 上氧 化还原的表观电位是e o = 0 2 6m v ( v s a g a g c l ) ，电子转移速率常数k s = 1 2 1 。 从电化学实验当中我们可以看出m b 和f i b 很稳定的吸附在锥状电极表面并且 对过氧化氢h 2 0 2 有着很好的电催化响应。 我们成功构建了基于m b 和h b 直接电子传递的h z 0 2 传感器。传感器在很 正的还原电位1 5 0m v 下，具有较宽的线形范围，较低的检测限，较好的稳定性 和较快的响应时间。a u n p m b 电极在还原电位1 5 0m v 下，线形范围为1 , u m - 1 2 m m ，灵敏度为2 4 # a ( c m 2m m ) ，最低检测限为o 5 , u m ，响应时间8s ；a u n p i - i b 电极在还原电位1 5 0m v 下，线形范围为2 。的灵敏度为z,um09m m 2 5 # a ( c m m m ) 。最低检测限为0 7 。响应时间 。由于金纳米粒子结果具有很好的分, u m 5s 析特性和生物兼容性，可望用于在生物体系中h 2 0 2 的连续在线检测。 关键词：微电极阵列，直接电子传递，蛋白质，生物传感器，电化学 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h ep r e s e n tw o r k ，af a c i l e ，l o w c o s ta n dn o - t e m p l a t er o u t ef o r t h ef a b r i c a t i o no f l a r g e a r e am e t a ln a n o p a r t i c l ep a t t e r n sw i t hm i c r o n s i z e df e a t u r e si sr e p o r t e dt h r o u g h c o m b i n i n gp h o t o l i t h o g r a p h ya n dp h o t o c a t a l y t i cd e p o s i t o no nas u p e r h y d r o p h o b i c i s u p e r h y d r o p h i l i cs u r f a c e f i r s t ，p h o t o l i t h o g r a p h i cm e t h o d sw e r eu t i l i z e dt of o r m s u p e r h y d r o p h o b i c l s u p e r h y d r o p h i l i cp a t t e r n s o n t ot h e s u p e r h y d r o p h o b i ct i 0 2 s u b s t r a t e ，w h i c hw a so b t a i n e db yt h em o d i f i c a t i o nw i t hn - o c t a d e c y l t r i e t h o x y s i l a n e ( o d s ) t h e n ，t h es u p e r h y d r o p h i l i c r e g i o n sc a nb eu s e d i nt h es i t e s e l e c t i v e p h o t o c a t a l y t i cn a n o p a r t i c l e sg r o w t h t h i sa p p r o a c hr e a d i l ya l l o w st h ef o r m a t i o no fa v a r i e t yo fm e t a ls u c ha ss i l v e r , g o l da n dp l a t i n u mn a n o p a r t i c l ep a t t e r n sw i t hl i n e w i d t h sd o w nt ot e nm i c r o n s c o m p a r e dt om o s to t h e rp a t t e r n i n gm e t h o d s ，t h ep r e s e n t p h o t o p a t t e r n i n ga n dp h o t o c a t a l y t i cd e p o s i t i o np r o c e s s i s q u i t es t r a i g h t f o r w a r d ， o p e r a t e su n d e ra m b i e n t “a i r - p h a s e ”c o n d i t i o n s ，f r e ef r o mt o x i cc u r i n g e t c h i n ga g e n t s ， a n dh e n c ee n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l y d i r e c ta n dr e v e r s i b l ee l e c t r o nt r a n s f e ro fm y o g l o b i n ( m b ) a n dh e m o g l o i n ( i - i b ) ， f o rt h ef i r s tt i m e ，i sa c h i e v e da tn a n o p y r a m i d a lg o l ds u r f a c e ，w h i c hw a sf a b r i c a t e db y o n e - s t e pe l e c t r o d e p o s i t i o n a u n p m br e d o xf o r m a lp o t e n t i a li s0 2 1 ( v s a g a g c i ) a n da l la p p a r e n t h e t e r o g e n e o u se l e c t r o n t r a n s f e r r a t ec o n s t a n t ( 1 ( s ) o f1 6s 1 a u - n p h br e d o xf o r m a l p o t e n t i a l i s 0 2 6 ( v s a g a g c l ) a n da na p p a r e n t h e t e r o g e n e o u se l e c t r o n t r a n s f e r r a t ec o n s t a n t ( 1 ( s ) o f1 2 1s 1e l e c t r o c h e m i c a l i n v e s t i g a t i o ni n d i c a t e st h a tm ba n dh bi ss t a b l yc o n f i n e do nt h en a n o p y r a m i d a lg o l d s u r f a c ea n dm a i n t a i n se l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yt o w a r dh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) t h ef a c i l i t a t e de l e c t r o nt r a n s f e rc o m b i n e dw i t ht h ei n t r i n s i cc a t a l y t i c a la c t i v i t yo f m ba n dh bs u b s t a n t i a l l yc o n s t r u c tt h et h i r d g e n e r a t i o nb i o s e n s o rf o rh 2 0 2 t h e p o s i t i v er e d o xp o t e n t i a la tt h en a n o s t r n c t u r e dg o l de l e c t r o d eg i v e sas t r o n gb a s i sf o r d e t e r m i n a t i o no fh 2 0 2w i t hh i g h s e l e c t i v i t y b e s i d e st h i sa d v a n t a g e ，t h ep r e s e n t b i o s e n s o ra l s oe x h i b i t sq u i c kr e s p o n s et i m e ，b r o a dl i n e a rr a n g e ，a n dg o o ds e n s i t i v i t y u a b s t r a c t t h ea u n p m be l e c t r o d eu n d e rr e d u c t i o np o t e n t i a l1 5 0m y , t h el i n e a rs c o p ef o r1 m - 1 2m m ，t h es e n s i t i v i t yi s2 4 t a ( c m zr a m ) ，t h el o w e s te x a m i n a t i o nl i m i t sf o r0 5 m ，r e s p o n s et i m e8s ；a u - n p h be l e c t r o d eu n d e r r e d u c t i o np o t e n t i a l1 5 0m y , l i n e a r s c o p ef o r2 t m - 0 9m m t h es e n s i t i v i t yi s2 5 # a ( c m zm i ) t h el o w e s te x a m i n a t i o n l i m i t sf o r0 7 m r e s p o n s et i m e5 s t h es t r i k i n g a n a l y t i c a lp e r f o r m a n c eo ft h e p r e s e n tb i o s e n s o r , a sw e l la st h eb i o c o m p a t i b i l i t yo fg o l dn a n o s t r u c t u r e sp r o v i d e da p o t e n t i a lf o rc o n t i n u o u s ，o n l i n ed e t e c t i o no fh 2 0 2 i nt h eb i o l o g i c a ls y s t e m k e yw o r d s ：m i c r o a r r a ye l e c t r o d e s ，d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e r , p r o t e i n s ，b i o s e n s o r , e l e c t r o c h e m i s t r y i i i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：夏诺售 1 年弓月i 乡日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：复罄碚 加7 年弓月i g 日 第l 章前言 1 1 研究背景 1 1 1 微电极阵列 第1 章前言 当今许多科学领域的研究对象正在不断地由宏观转向微观，而生物体的研 究中则常以细胞作为研究的对象。为此，分析工作者必须寻求高灵敏度、高选 择性的微型、快速的测试工具其中最有成效的技术之一是微电极或微电极阵列 ( m e a ) 。它们既不损坏组织，又不会因电解而破坏测定体系的平衡，成为电分 析化学发展的一个方面。微传感器被广泛地研究和开发，并应用到了生物医学、 生物化学和电分析化学等领域n 嘲，这些微传感器都含有微电极或微电极阵列 ( m e a ) 。 微电极是指电极的一维尺寸为微米级( 1 酽m ) 至纳米( 1 0 母m ) 级的一类电极。 当电极的一维尺寸从毫米级降低至微米级时，表现出许多优良的电化学特性， 例如微电极不仅因为电极微小而有利于在体分析，更重要的是，它具有常规电 极无可比拟的优点，即极高的稳态电流密度、极短的响应时间、极化电流小、 欧姆压降小、传质速度高、信噪比大，可用于瞬态电极过程研究、高阻抗电解 质和流动体系m 1 。从几何尺寸、动态特性、电性能、化学过程及应用效果等角 度来看，微电极具有如下显著特征： ( 1 ) 极小的电极半径 在对生物活体测试研究过程中，可以将其插入单个细胞而不使其受损坏， 并且不破坏体内原有的平衡。它可成为研究神经系统中传导机理、生物体循环 和器官功能跟踪检测的得力工具。 ( 2 ) 易于达到稳定的电流 微电极表面呈球形扩散，具有很强的边缘效应，电极表面建立稳态的扩散 平衡所需时间很短。因此用微电极可以研究快速的电荷转移或化学反应，也可 以进行对短寿命物质的监测。 ( 3 ) 很小的双电层充电电流 由于微电极面积极小，而电极的双电层电容又正比于电极面积，因而微电 第1 章前言 极上的电容非常低，这大大提高了响应速度和信噪比。 ( 4 ) 很小的瓜电流降 由于微电极的表面积很小，相应电流的绝对值也很小，因此，电解池的内 部电流降常小至可以忽略不计。这样，在电阻较高的溶液中，如某些有机溶剂 和未加支持电解质的水溶液中测量时，就可用采简单的双电极体系代替为消除 池内电流降而设计的三电极体系。 微电极在理论上比常规电极更适用于电化学反应过程中的热力学和动力学 研究【9 1 1 1 。 微电极阵列( m e a ) 是指由多个电极集束在一起所组成的外观单一的电极， 其电流是各个单一电极电流的加和这类电极保持了原来单一电极的特性，又 可以获得较大的电流强度，提高了测量的灵敏度。微电极阵列的独特优点使其 具有较好的应用前景，已用于流动分析、色谱、电泳的检测器 一微电极阵列的基本特征 微电极阵列具有微电极的特征，而又能提供较大的总电流【1 2 。1 4 l 。微电极阵 列能极大地提高响应电流并保持单一微电极的全部优点，即尺寸越小，响应时 间越短，电流密度越大，能使用的电位扫描速率越高，因而成为当今电化学研 究热点之一。有更优越的电化学特性，更高的稳态电流密度和更短的响应时间， 而且微电极的尺寸越小，上述特点越明显。因此采用小尺寸的微电极阵列作为 生物传感器的基础电极是十分有利的【”】。 二微电极阵列的发展 由于微电极阵列具有优异的电化学特性，以微阵列电极为基础电极的各类 化学传感器发展相当迅速，现正朝着微型化、集成化和智能化的方向发展。生 物传感器是利用了生物活性材料的高选择性和灵敏性的特殊种类化学传感器 【1 6 l ，1 9 6 6 年，u p d i k e 和h i c k s 研制成功了葡萄糖传感器，标志着化学传感器向 生物领域拓展。进入9 0 年代，利用集成电路加工技术制造基于微阵列电极的 生物传感器已经成为令人关注的研究方向。微电极阵列常用的制备方法主要是 微蚀刻法和模板法i l 引。 三微电极阵列的应用 微电极阵列制作简单，易于检测细胞网络的多种参数，生物相容性佳，具 有广泛应用前景。既可以探测心肌细胞层的信号传播和心脏药物筛选，也可以 用来记录脊椎动物神经元和哺乳动物神经元的胞外电位，测量神经元对不同物 2 第1 章前言 质的响应。大量的神经细胞胞外记录信号在药物筛选中有着及其重要的作用， k c c f e r 等【1 9 l 在6 4i t o 微电极阵列上培养了小鼠脊髓神经网络，测量了引起痉挛 的药物t m p p 对神经元的响应。另外，与f e t 相似，m e a 另一个重要应用是 记录多点神经组织切片的活动l 冽。切片的多点测量也可用于药物或者毒性物质 的筛选，研究神经元的整体兴奋性。 2 0 世纪9 0 年代以来，f r o m h e r z 2 1 j 习采用平面传感器阵列来检测细胞膜电 位等各项参数。这类传感器主要有两种，一种采用m o s 场效应管阵列f e t 形 式，另一种采用m e a 形式。f e t 细胞阵列可以同时反映多个单细胞的电生理 活动，y e u n g 等【2 2 j 用带有自动节律性的细胞( 如心肌细胞) 来反映细胞的动作电位 变化，在f e t 的s i 0 2 层上固定一层赖氨酸或者层粘连蛋白使细胞贴附，并使用 兴奋性药物或抑制性药物检测各种药物对细胞动作电位的频率和幅度变化，从 而判断药物对心肌细胞的影响。f e t 细胞阵列不仅可以用于研究药物对细胞的 影响，也可以研究电刺激对细胞的影响。但需和膜片钳技术结合。 s e l i n g e r 等【2 3 j 也使用m e a 记录了神经组织的电信号并分析神经兴奋的同步 性。近年来，f e t 与m e a 相结合上，更进一步向集成阵列化发展，e c k e n 等1 2 4 1 在无绝缘栅场效应管的基础上又提出了一种8 x 8 路扩展栅电极阵列的细胞传感 器，在金属微电极阵列上培养心肌或神经细胞后，将感应到的细胞动作电位作 为栅极电压引到外电路的j f e t 上，避免f e t 与电解液接触，既有效将微电极 阵列和外电路集成f e t 相结合，又实现了细胞外记录系统所需的高输人阻抗。 微电极陈y l j ( m e a ) 系统适用于培养多种组织系统，包括分离的神经细胞、 视网膜、心肌细胞、干细胞、有机培养物和急性分离脑片等。在m e a 上，可 以同时记录和刺激多个位点，这大大地扩展了研究的视野，同时又保持了对单 细胞的准确记录。在基础生物学和医疗诊断等研究中广泛得到越来越重要的应 用。 ( 1 ) 应用于神经网络方面的研究 在m e a 培养皿上，可以同时记录和刺激超过1 0 0 个神经元。m e a 技术可 以用非侵入和非破坏式的方法将胞外电极放置在培养基底来研究培养神经元网 络的分布式模式。 ( 2 ) 应用于胚胎干细胞方面的研究 m e a 可广泛用于心肌细胞的培养，从基本心脏生理瞄j 到新的治疗策略，例 如针对心率失常的病理生理学【冽方面。m e a 在人类和鼠的胚胎干细胞的电生理 3 第1 章前言 特性研究和发育特性方面的应用有增长趋势。人类胚胎干细胞可以分化成心肌 细胞，该研究中的电生理特性是利用m e a 获得的【2 7 1 。干细胞分化成心肌细胞， 通过电生理特性例如心跳频率和传导速度来监视。当前，多个小组正应用m e a 研究神经元起源的电生理特性。观察到依赖标准方法例如形态学分化和免疫化 学神经标记来评估干细胞的成熟是不够的。通过形态学分化和免疫化学神经标 记评估，培养物表现出一个典型的神经细胞特性；然而其神经细胞的电生理特 性，却在两周后才能被观察到，这表明完全神经成熟比免疫化学神经标记的标 准要推迟很长时间。 ( 3 y 心肌细胞的研究 心血管疾病是现代社会人类健康的主要威胁。因此关于个体的基因或药物 的副作用足如何影响心脏的正常兴奋特性方面的知识，变得极为重要。m e a 为 在急性分离的，胚胎干细胞分化成的心肌上进行速率条件等研究提供了解决方 案i 矧。 ( 4 ) 在医疗诊断方面的应用 视网膜( 人造视网膜) 可以在m e a 上培养，研究其生物相容性、综合视听等 外界刺激因素的超感官知觉试验、刺激的视网膜响应、施加药物后的视网膜图 的活动性等【2 9 1 。 m e a 在3 0 年前就出现了，随着微制造技术的发展，m e a 已经成为系统生 物学实验中主要的工具。m e a 提供了一个单一平台，样本跨度从细胞水平到组 织水平到生物系统水平。在目前国际性的学术会议上，m e a 应用都呈上升趋势， 除了一年两次m e a 设备和应用会议，美国生物物理学会和美国神经科学学会 年会都有基于m e a 进展的专门报告会。而在制药工业，高通量的i v i e a 平台 在药物安全评估方面成为重要工具。m e a 设备配合多孔平台，可以加速基于 m e a 平台在药物筛选和开发方面的应用。m e a 在医学诊断、环境监测、反生 物恐怖主义等领域1 3 0 】有着潜在应用价值。在干细胞研究，m e a 正成为研究细 胞分化和成熟的强有力平台。研究显示，免疫化学标准对于细胞类型功能鉴定 是不充分的，在细胞被认为完全分化之前，基于功能特性的更严格的检验是必 须的。m e a 为细胞电生理功能长时程发展特性研究提供了一个理想的平台。该 技术还可用于研究发展替代细胞，作为治疗各种组织退化疾病，例如糖尿病、 神经退行疾病和心血管疾病等m e a 均有良好的应用前景。 4 第1 章前言 1 1 2 电化学生物传感器 传感器与通信系统和计算机共同构成现代信息处理系统。传感器相当于人 的感官，是计算机与自然界及社会的接口，是为计算机提供信息的工具。 1 9 6 2 年，a a r k i ”i 提出将生物和传感器联用的这一设想。制得一种新型分 析装置“酶电极”( c m y m c c l c c c m d c ) ，这为生命科学打开一扇新的大门，酶电 极也成为了发展最早一类的生物传感器。，生物传感器这一新技术引起生物医 学、环境科学、农业科学等领域科学家的重视，使之在国际上开始广泛研究。 生物传感器己发展成为现代生物技术的重要领域之一。 传感器通常由敏感( 识别) 元件、转换元件、电子线路及相应结构附件组成。 生物传感器是指用固定化的生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素等) 或生物 体本身( 细胞、细胞器、组织等) 作为敏感元件的传感器罔。 电化学生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极( 固体电极、离子 选择性电极、气敏电极等) 作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感 器。图1 1 是电化学生物传感器基本构成示意图。由于使用生物材料作为传感 器的敏感元件，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取复杂 体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床 检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。 图1 , 1 电化学生物传感器基本构成示意图 具有生物效能的分子识别( 如酶，抗原和抗体，结合蛋白质，植物凝血素， 激素受体) 同时产生可供换能器灵敏地检测到的物理化学变化的信号，从而分 析出相应物质，电化学生物估感器原理图如下图1 2 ： 第1 章前言 具 有 识 别 效 能 的 分 子 生 物 功 能 物 质 的 固 化 豳1 2 电化学生物传感器原理图 电流型 电位型 根据作为敏感元件所用生物材料的不同，电化学生物传感器分为酶电极传 感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、 电化学d n a 传感器等田】。 以酶传感器为例，间接电催化电极表面电信号产生方式有如下两种类型 ( 1 ) 以氧为中继体的电催化( 第一代生物传感器) 溶液： g o d o x + 一u c o _ + g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e x g o d r e x + o z g o d o x + h 2 0 2 电极：h 2 0 2 _ + 0 2 + 2 h + + 2 e ( 2 ) 基于人造中继体的电催化( 第二代生物传感嚣) 溶液：c 沁d o x + g t u c o s e 十g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e x g o d r c x + m o x _ + g o d o x + m r e x 电极：m r c x m o x + n e 这种方式可使酶反应所伴随的电子转移、微生物细胞的氧化直接或通过电 子传递作用在电极表面发生，从而直接进行测定。这类传感器被称为第三代生 物传感器。直接电催化电极本身就是电子的受体( 或供体) ，酶与电极之间直接进 行电子交换从而完成催化循环，电信号产生方式是直接的。反应式如下： 溶液：g o d o x + g l u c o s e _ g l u c o n o l a c t o n c + g o d r e x 电极： 0 0 d i e x _ + 0 0 d o x + 2 e 根据上述反应，通过氧电极( 测氧的消耗) 、过氧化氢电极( 测h 2 0 2 的产生) 和p h 电极( 测酸度变化) 来间接测定葡萄糖的含量。因此只要将g o d 固定在上 述电极表面即可构成铡葡萄糖的g o d 传感器。这便是所谓的第一代酶电极传 信号转换 第1 章前言 感器。这种传感器由于是间接测定法，故干扰因素较多。 第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心 与电极之问传递电子。第二代酶电极传感器可不受测定体系的限制，测量浓度线 性范围较宽，干扰少。 第三代酶电极传感器，即酶的氧化还原活性中心直接和电极表面交换电子 的酶电极传感器。目前已有的商品酶电极传感器包括：g o d 电极传感器、l 乳 酸单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器等。在研究中的酶电极传感器则非 常多。 电化学生物传感器的应用范围广，它已经渗透到医药领域、食品卫生、环 境检测等生活实践中去，主要应用有：细茵及病毒感染类疾病诊断1 3 4 1 ，基因诊 断【3 5 删，药物分析 3 7 - 3 8 ，d n a 损伤研究【3 9 删等。由此可见，电化学生物传感 器的研究对临床医学和遗传工程的研究具有深远的意义和应用价值。 我们课题组也进行了很多关于第三代电化学传感器的研究，刘海清博士致 力于研究在不同形貌金电极上制各生物传感器，先后在jp h y sc h e mb ，c h e m m a t e r ，l a n g m u i r l 5 1 巧4 j 等国外期刊上发表论文。罗永平博士主要研究在球状和针 状二氧化钛上，不同蛋白质进行直接电子传递，并构建第三代生物传感器。 1 2 研究目的与内容 1 2 1 研究目的 用简便的光电化学的方法制作微电极阵列。研究微电极阵列的电化学特性。 制备不同形貌的纳米金电极，表面满足以下两个要求：修饰到表面上的生物大 分子仍然具有较高的生物活性并且有较快的电子转移速率。我们选择金银铂纳 米粒子作为创建这一表面的物质，是因为金银铂具有好的生物兼容性，并且纳 米又具有块状物质所不具有的些优良性质。纳米粒子具有极佳的比表面积， 可用于生物分子的固定，能增加固定的分子数量，从而实现信号的放大。金银 铂纳米粒子作为催化剂的载体，可以大大提高催化剂的性能。因此，我们设计 的这一表面就可以为构建第三代电化学生物传感器提供一个较好的途径和研究 方法。 7 第1 章前言 1 2 2 研究内容 本课题提出采用光电化学方法制作微电极阵列，并在表面修饰上纳米银粒 子和纳米铂粒子作为功能设计表面，表征其物理化学性质：以生物大分子为研 究对象，采用电化学方法研究生物大分子电子传递机理和生物大分子内部的一 些构造信息，实现生物大分子的直接电化学研究。并设计良好的功能表面，为 第三代电化学生物传感器的研究提供信息和途径。 ( 1 ) 微电极阵列的制备 我们采用导电玻璃作为基底，通过光电化学方法制备微电极阵列，并对其进 行物理化学性质的表征。 ( 2 ) 生物大分子的修饰 我们用血红蛋白和肌红蛋白作为研究对象，分别把它们修饰到不同形貌纳 米金电极上，研究其电化学行为。 ( 3 ) 基于蛋白质直接电子传递，我们构建第三代过氧化氢生物传感器。 1 3 研究的创新点 本课题首次提出使用光电化学方法制备微电极阵列，方法简便，成本低廉， 可大面积化。 在不同形貌的纳米金电极上面实现肌红蛋白m b 和血红蛋白h b 的直接电子 传递，并且构建的第三代生物传感器具有响应时间短，检测限低，线性范围大， 灵敏度高等优点。 8 第2 章实验部分 2 1 仪器和试剂 2 1 1 仪器 第2 章实验部分 k q 2 2 0 0 d e 型数控超声波清洗机 匀胶机 数显p h 计 马弗炉 紫外可见分光光度计( a g i l e n t8 4 5 3 ) 紫外光源 j c 2 0 0 0 a 静滴接触角界面张力测量仪 x t i 3 4 0 0 x e 显微镜 q u a n t u m 2 0 0 0x 射线光电子能谱( x p s ) h i t a c h is 4 5 0 0 扫描电子显微镜( s e m ) 甜原子力显微镜( a f m ) d 8x 射线衍射仪 c h i6 6 0 型电化学系统 2 1 2 试剂 ( 昆山市超声仪器有限公司) ( 中国上海) ( 上海精密科学仪器有限公司) ( 上海实研电路有限公司) ( 安捷伦公司，美国) ( 日本电子株式会社) ( 中国上海) ( c h t c v , 中国上海) ( u l v a c p h i 公司，美国) ( 日本电子株式会社) ( 上海爱建纳米发展有限公司) ( b r u k e ra x s ，美国) ( c hi n s t r u m e n t s 公司，美国) 材料：i t o 玻璃( 深圳，2 2c m 1 5c m ) ；二氧化钛( i s h i h a r as a n g y ok a i s h a ) 试剂：无水乙醇( a r ，国药) ；氢氧化钠( a r ，国药) ；氯化钾( a r ，国药) ： 硫酸( a r ，国药) ；1 0m m o l l 磷酸盐缓冲溶液p h = 7 2 5 ( p b s ) ；铁氰 化钾溶液；n o c t a d e c y l t r i e t h o x y s i l a n e ( o d s ) ( a l f aa e s a r ) ；a g n 0 3 ( 国药) ； h 2 p t c l 69 8 5 ( o s a k a ，日本) ；h a u c h9 9 0 ( o s a k a ，日本) ；铝粉( s t r u e r s ，日 本) ；铁血红蛋白h e m o g l o i n ( h bm w6 6 0 0 0 美国s i g m a 公司) ；肌红蛋白 m y o g l o b i n ( m bm w1 7 8 0 0 美国s i g m a 公司) ；实验用水均为二次蒸馏水。 9 第2 章实验部分 2 2 微电极阵列的制备 ( 1 ) 导电玻璃( i t o ) 的清洗 在超声波清洗机中，首先用无水乙醇超声清洗约3 0m i n ，再用1mn a o h 超 声清洗约3 0m i n ，最后用蒸馏水冲洗干净。如亲水性良好，吹干待用。如亲水性 不好，继续重复以上步骤。 ( 2 ) 纳米二氧化钛0 a 0 2 ) 的涂膜 开启电源，按下“控制键 ，把匀胶机的转速调节在1 5 0 0 转分，匀胶的时间是 1 0 s ，把洗净的玻璃片用镊子放在片托的中心，滴t i 0 2 胶，高速匀胶，涂膜4 5 层。在马弗炉中3 0m i n 升温到4 5 0 ，在4 5 0 保温1h ，再慢慢降到室温。 ( 3 ) 微电极阵列的制备 烧结好的t i 0 2 i t o 电极，浸泡在1 7 v 0 1 的碳十八烷基硅烷( o d s ) d p ，2 4 小时。 得到超疏水性的电极表面。然后用具有不同形状的光掩膜，用紫外从背面照射 约1 h ，可以得到疏水亲水的电极表面。再在亲水的区域滴上贵金属溶液如本文 中所用的硝酸银和氯铂酸两种贵金属溶液，再用紫外照射约3 0 r a i n 。可以得到 和光掩膜形状一样的膜样，由于光掩膜具有不同形状，我们可以得到不同形状 不同尺寸大小的膜样。实验步骤示意图如下图2 1 ：图中凹形电极是指省略了制 作步骤中沉积贵金属这一步骤制作出来的微电极阵列，即由步骤二完成制备的 微电极阵列；凸形电极是指由制作步骤中，一步一步制作，直到沉积了贵金属 这一步骤结束，制作出来的微电极阵列，即由步骤二完成制备的微电极阵列。 1 0 f fff w ffff 秘l 锚= 一 瓣_ 瓣兰 一m 曼 摊= i i 一摊=_雨 辩一i 第2 章实验部分 2 3 测量方法 2 3 1 电化学方法 化学是内容非常广泛的科学领域，它涵盖了界面电化学、分析电化学、生 物电化学、腐蚀，电沉积和表面处理等方向【4 。电化学的实验测定方法很多， 本文中主要用循环伏安法、交流阻抗法和计时安培法。 ( 1 ) 循环伏安法( c v ) 循环伏安法可用于研究化合物电极过程的机理、双电层、吸附现象和电极 反应动力学成为最有用的电化学方法之一。 循环伏安法将如图2 2 所示的等腰三角形脉冲电压施加在电解池的电极 上。如果前半部扫描( 电压上升部分) 为去极化剂在电极上被还原的阴极过程， 则后半部扫描( 电压下降部分) 为还原产物重新被氧化的阳极过程。一次三角波 扫描，完成一个还原过程和氧化过程的循环，故称为循环伏安法【4 2 】。 o 矗 譬。一 螗 亡o o 0 - n 2 i l | 伺嘲 图2 2 三角波图 1 2 第2 章宴验部分 圈2 3 循环伏安图 图2 3 为一典型的可逆电极反应过程的循环伏安曲线。极化曲线的上半部 是还原波，下半部是氧化波。阳极峰电位e p a 、阴极峰电位e p c 和两者的差值 e p ，阳极峰电流j p a 、阴极峰电流i p c 及它们的比值是非常重要的电极参数。 对于可逆电极过程： e p = e h = 5 7 n - 6 3 ( m v ) i p - 2 6 9 1 0 5 n m 俨v ”a c ，i p | i “一1 其中，n 为电子转移数，d 为扩散系数，v 为电压扫描速率，a 为电极面 积，c 为浓度。可见，i p 与v l 2 成正比，为扩散控制过程，且扫描速率大，峰 值电流也越大。 三电极体系：红( 对极) 白( 参比) 绿( 工作) 国2 , 4 二电极体系图 第2 章实验部分 两个峰电流值及其比值，两个峰电位值及其差值是循环伏安法中最为重要 的参数。 对于符合n e m s t 方程的可逆电极反应，在2 5 c 时： 厶e p = 一= 半m v 7 峰电势与标准电极电势的关系为 加j = 当挚+ 半t g 器 表2 1 电极过程判据 c v 电极过程 a e p ，i 昨，l l m ，与v 的关系 i p c ，i p a “v 1 尼 ( 0 可逆过程i p a i p c = 1 e p = 5 8 nm v i p c o c ，1 2 ，- 弘= 0 ( i d 不可逆过程 q 小罢- g 啪y i p c ，i o = v 1 2 ) a = 0 5 时， ( i i i ) 准可逆过程 i p c = 1 e p 5 8 nm v ( 2 ) 电化学阻抗谱( e i s ) 电化学阻抗谱( e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ，e i s ) 早期称为交 流阻抗( a ci m p e d a n c e ) 【4 3 1 ，是一种以小振幅的正弦波电位( 或电流) 为扰动 信号，从得到的响应信号电流( 或电位) ，求算等效电路，推测电极反应机理 的方法。可以确定等效电路与其他电极过程结合，推测其电极系统中包含的动 力学过程的机制，同时可确定等效电路中有关元件的参数值，计算出动力学参 数m 。 电化学研究表明，一个电极系统在小幅度的扰动信号作用下，各种动力学 1 4 第2 章实验部分 过程的响应与扰动信号之间呈线性关系，所以可以把每一个动力学过程用电学 上的一个线性元件或几个线性元件的组合来表示，例如电荷转移过程可以用一 个电阻来表示，双电层充放电过程可以用一个电容的充放电过程来表示等等。 这样就把电化学动力学过程用一个等效电路来描述，通过对电极系统的扰动和 响应，求得等效电路各个元件的数值，从而推断电极体系的反应机理。 等效电路法是电化学阻抗谱的主要分析方法。因为由等效电路来联系电化 学阻抗谱与电极过程动力学模型的方法比较具体，一些简单的电化学阻抗谱的 分析中可以用电阻参数r s 表示参比电极与研究电极之间的溶液电阻。基 本上是服从欧姆定律的纯电阻。其阻值可由溶液电阻率以及电极间的距离等参 数计算或估计，也可以由试验测定。c d 表示电极溶液界面的双电层电容。 r d 表示电极过程中电荷转移所遇到的阻力( 电荷转移在很多情况下是电极过 程的速度决定步骤_ ) 。z f 表示法拉第阻抗。由于它通常不是纯电阻或电容，在 比较简单的情况下，z f 通常包括电化学极化( 活化极化) 引起的阻抗r 戗和 浓度极化引起的阻抗乙。等效电路图如图2 5 所示。 图2 5 电化学电池等效电路图和法拉第阻抗组成 如果修饰膜的表面几乎不存在缺陷，则在交流阻抗所得到的n y q u i s t 圆 的低频区域，将出现一条直线，而在高频区域，则呈现出半圆形状，其高频区 域半圆直径的大小可以直接反映表面膜电阻的大小和异相电子转移速率的差 异。 1 5 第2 章实验部分 ( 3 ) 计时电流法( a m p e r o m e t r i cc u r r e n t - t u n e ，i - 0 在计时电流方法中，外加一个恒电压，电流作为时间的函数被记录下来。 _ j f 矗 ： c o o 山 t i m e ( s ) 图2 6 电压波形作为时间的函数 以上三种电化学方法均在电化学工作站c h i6 6 0 进行，采用三电极体系，修饰 电极为工作电极，a g a g c l 电极为参比电极，p t 电极为辅助电极。 2 3 2 表面表征方法 本文的表征主要手段有扫描电子显微镜( s e m ) 、x 射线光电子能谱 ( x p s ) 、紫外可见分光光度法( u v - v i s ) 、原子力显微镜( a f m ) 等。 ( 1 ) 扫描电子显微镜( s e m ) 扫描电子显微镜，英文名称s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e 简称s e m 。扫描电 子显微镜是1 9 6 5 年发明的较现代的细胞生物学研究工具，主要是利用二次电 子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电 子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次 电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起 来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。 扫描电子显微镜的制造是依据电子与物质的相互作用。当一束高能的人射 电子轰击物质表面时，被激发的区域将产生二次电子、俄歇电子、特征x 射线 和连续谱x 射线、背散射电子、透射电子，以及在可见、紫外、红外光区域产 生的电磁辐射。同时，也可产生电子空穴对、晶格振动( 声子) 、电子振荡 ( 等离子体) 。原则上讲，利用电子和物质的相互作用，可以获取被测样品本身 1 6 第2 章实验部分 的各种物理、化学性质的信息，如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电 场或磁场等等。扫描电子显微镜正是根据上述不同信息产生的机理，采用不同 的信息检测器，使选择检测得以实现。如对二次电子、背散射电子的采集，可 得到有关物质微观形貌的信息；对x 射线的采集，可得到物质化学成分的信息。 正因如此，根据不同需求，可制造出功能配置不同的扫描电子显微镜。扫描电 子显微镜由三大部分组成：真空系统，电子束系统以及成像系统。 扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面 激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表 面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经 光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电 子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本 表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金 属在电子束的轰击下发出次级电子信号