（应用化学专业论文）海绵和海星等海洋无脊椎动物中有关化学成分的研究.pdf

摘要 摘要 本课题以从海洋无脊椎动物中寻找生物活性物质为目的，对青岛沿海海域常见的3 3 种无脊椎动物进行了q 一葡萄糖苷酶抑制活性检测，对罗氏海盘车和海燕中的皂 苷总含量进行了测定，并对苔海绵( t e d a n i as i x ) 多糖及其中硫酸根含量进行了测定， 并且对其化学成分进行了提取分离与结构鉴定。 本论文研究工作以a 一葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型为基础，对青岛沿海海域常见 的3 3 种无脊椎动物进行初步筛选。发现多数无脊椎动物对a 一葡萄糖苷酶都有一 定的抑制作用，其中海筒螅、海燕、刺参和毛蚶的粗提物对a 一葡萄糖苷酶 的抑制率分别为5 6 1 、6 7 3 、6 2 2 、6 6 3 。这是国内首次对海洋常见 无脊椎动物进行的的n 一葡萄糖苷酶抑制活性的筛选。 本论文研究工作用分光光度法对海星总皂苷的含量进行了测定，用香草醛硫酸法显 色，并系统研究了测定过程中的各种条件，确定了一种快速、简单、准确的海星总 皂苷含量测定方法。用此方法测得青岛海域罗氏海盘车和海燕中的皂苷总含量分别 为0 0 2 5 1 和0 0 3 1 3 。 本论文研究工作对采集于青岛沙子i e i 海域的苔海绵( t e d a n i as l x ) 分别用水提和酸提 法制备粗多糖，用苯酚一硫酸法显色，测定多糖含量，并用硫酸钡比浊法对其中的硫 酸根含量进行了测定。结果表明测得水提和酸提粗多糖中总糖含量分别为：1 6 7 9 、 2 0 5 5 ，硫酸根含量分别为2 4 0 2 、2 7 0 2 。这是首次关于此种海绵多糖及硫酸根 含量的报道。 本论文研究工作对苔海绵( t e d a n i asp ) 的化学成分进行了研究，得到六种化合物，用 波谱分析手段鉴定了其结构，分别为胆甾醇、硬脂酸、b 谷甾醇、对羟基苯甲酸、 胡萝卜甙和胸腺嘧啶一2 脱氧核苷，均是是首次从中国海域该种属海绵得到。 硕士研究生薛峰( 应用化学) 指导教师张立新副教授 关键词：a 一葡萄糖苷酶；苔海绵( t e d a n i as p ) ：皂苷；多糖；化学 成分 a b s t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt of i n dn a t u r a lb i o a c t i v ec o m p o u n d sf r o mm a r i n ei n v e r t e b r a t e s , t h ee x t r a c t so f3 3c o n m l o n m a r i n ei n v e r t e b r a t e sc o u e c t e di no i n g d a os e a s h o r ew e r es c r e e n e df o rt h e i ra - g l u c o s i d a s ei n h i b i t i o n a c t i v i t i e sf o rt h ef i r s tt i m e a n dt h et o t a la s t e r o s a p o n i n sc o n t e n tf r o ms t a r f i s hw e r ed e t e r m i n e d m o r e o v e r , t h ec o n t e n t so ft o t a ls u g a r sa n ds u l f a t er a d i c a li nl a wp o l y s a c c h a d d e sf r o mt h em a r i n e s p o n g et e d a n i as i xw e r ed e t e r m i n e d a n ds i xo t h e rc h e m i c a lc o n s t i t u e n t si n t h i ss p o n g ew e r e s u c c e s s f u l l yi s o l a t e da n di d e n t i f i e d t h ee x t r a c t so f3 3c o i n i n o nm a r i n ei n v e r t e b r a t e sw e r es c r e e n e df o rt h e i ra - g l u c o s i d a s ei n h i b i t i o n a c t i v i t i e s a m o n gt h e m ，t h ee x t r a c t so ft u b u a r i am a r i n at o r r e y ，a s t e r i n ap e c t i n i f e r a ，a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u sa n ds c a p h a r c as u b c r e n a t ah a dh i g h e ri n h i b i t i o nr a t e s + t h i sr e s u l tw a st h ef i r s tr e p o r ti n c h i n a t h et o t a l a s t e r o s a p o n i n s c o n t e n tf r o ms t a r f i s hw a sd e t e r m i n e db yp h o t o m e t r i cm e t h o du s i n g v a n i h i n s u l f u r i ca c i d 觞c o l o r - f o r m i n gr e a g e n t s v a r i o u sd e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d a n da q u i c k ，s i m p l ea n da c c u r a t em e t h o dw a sf o u n d e d i tw a sf o u n dt h a tt h et o t a lc o n t e n t so fa s t e r o s a p o n i n s f r o m a s t e r i a sr o l l e s t o n ia n d a s t e r i a s p e c t i n i f e r aw e r e0 0 2 5 1 a n d0 0 3 1 3 ，r e s p e c t i v e l y t h ec o n t e n t so ft o t a ls u g a r sa n ds u l f a t er a d i c a li nr a wp o l y s a c c h a r i d e sw e m a n a l y z e da f t e rt h er a w p o l y s a c c h a r i d e sw e r ee x t r a c t e df r o mt h em a r i n es p o n g et e d a n i as p w i t hh o tw a t e ra n dd i l u t e dh c i r e s p e c t i v e l y p h e n o l - s u l p h u r i ca c i dm e t h o da n db a c l 2t u r b i d i m e t r ym e t h o dw e r eu s e dr e s p e c t i v e l y t h et o t a ls u g a r st h et w oe x t r a c t sw e r e1 6 7 9 ，2 0 5 5 r e s p e c t i v e l y , a n ds u l f a t er a d i c a l ，2 4 0 2 a n d 2 7 0 2 t h i sw a sa l s ot h ef i r s tr e p o r ta b o u tt h ec o n t e n t so ft o t a ls u g a r sa n ds u l f a t er a d i c a li nt h er a w p o l y s a c c h a r i d e sf r o mt h i ss p o n g ei nc h i n a w i t ht h eu s eo fm u l t i c h r o m a t o g r a p h ym e t h o d s ，s i xc o m p o u n d sw e r ei s o l a t e df r o mt h em a r i n es p o n g e t e d a n i as p a n dt h e i rs t r u c t u r e sw e r ei d e n t i f i e da sc h o l e s t e r o l ，s t e a r i ca c i d ，b - s t i o s t e r o l ，d a u c o s t e r o l ， 4 - h y d r o x y b e n z o i ca c i da n dt h y m i d i n eb yt h eu s eo fn m rs p e c t r a t h e yw e r ei s o l a t e df r o ms p o n g e 死d a n i as p f o rt h ef i r s tt i m e p o s t g r a d u a t es t u d e n t ：f e n gx u e ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yl i - x i nz h a n g ，a s s o c i a t e dp r o f e s s o r k e yw o r d s ：a - g l u c o s i d a s e ；t e d a n i as p ；p o l y s a c c h a r i d e s ；a s t e r o s a p o n i n s ；c h e m i c a l c o n s t i t u e n t s 学位论文独创性声明及学位论文知识产权权属声明 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中 依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 论文作者签名： 荔靖 日期：训7 年莎月，日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。 学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校 后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为 青岛大学。 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密呼 ( 请在以上方框内打“4 ”) 论文作者签名 蕊- 专日期：劢布年月日 导师签名：易夕夕铂日期：渺7 年6 月日 ( 本声明的版权归青岛大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用) 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 1 1 海绵研究概况 海洋生物种类繁多，约占地球上生物种数的8 0 由于海洋生物的生态环境与 陆地生物有显著差异，海洋生物中蕴藏着大量结构新颖、生物活性极其强烈的物质。 因此，海洋天然产物是天然产物研究中最活跃的领域之一，而海绵因为种类极多， 分布广泛，易于采集，而且往往含有很多结构罕见的、具有抗癌或抗病毒活性的次 生代谢产物，历来是海洋天然产物研究的热点，是海洋药物开发最重要的生物资源 之一 1 1 海绵动物门” 海绵动物为多细胞动物：身体由皮层，胃层( 领鞭毛细胞) 组成，一般认为海 绵动物是多细胞动物进化中的一个侧枝，具有独特的水沟系统；没有神经系统海 绵动物固着生活在水中物体上，而且看不出它们的运动，所以1 8 5 7 年以前。被视为 植物海绵动物门的主要特征：l 、体制、体壁结构：2 、水沟系统( 分为三类：单 沟型、双沟型和复沟型) ；3 、生殖与胚胎发育( 无性生殖、有性生殖) 海绵动物 的成体没有运动能力，呼吸、摄食、排泄、生殖等生理机能都依靠水沟系统中的水 流来实现 1 1 1 1 海绵动物门的分类 1 、钙质海绵纲( c a l c a r c a ) ：骨针钙质，水沟系简单，个体较小，多生活于浅 海 2 、六放海绵纲：骨针六放，硅质，或由硅质丝联成网状，体较大，单体，常对 称，主要生活于4 5 0 - - 9 0 0 m 水深或更深海底 3 、寻常海绵纲( d c m o s p o n g i a c ) ：硅质骨针或海绵丝，或两者联合，骨针单轴 或四射型，或两种骨针均存在，埋在海绵丝中，非六放型，9 5 海绵属此纲。 1 1 2 海绵中活性物质研究现状 海绵是一种简单的多细胞动物，种类极多，生存环境差异很大，自身的结构虽 简单但很有特点，并且往往共生着许多细菌、真菌和其他生物，决定了其次生代谢 产物的丰富多样，是海洋药物开发最重要的生物资源之一目前，已从海绵中分离 青岛大学硕士学位论文 出的化学成分主要有萜类、生物碱、甾醇、肽类、大环内酯等这些物质在抗肿瘤、 抗病毒、抗菌等方面具有明显的活性。下面按化学结构类型对从海绵中分离得到的 生理活性物质的研究进展作简要介绍 1 萜类 海绵中含有大量的具有强烈生理活性的萜类物质m u s m a n 等从海绵s t y l o t e l l a a u r a n t i u m 中分离得到5 个新的萜类化合物，其中4 个( 1 - 4 ) 具有细胞毒性，它们抗小 鼠淋巴性白血病细胞p 3 8 8 、人肺癌细胞a 5 4 9 ，人结肠癌细胞h t - 2 9 和人黑素肿瘤细 胞m e l - 2 8 细胞系的i c 5 0 值在0 1 1u g m l 之间啪。j i m e n e z 等从海绵s t r e p s i c h o r d a i a a l i e n a 中获得十二个二倍半萜h o n u l a c t o n c sa - 蜞中h o n u l a c t o n e sa - d ( 5 8 ) 对p - 3 8 8 、 a - 5 4 9 ，h t - 2 9 和m e b 2 8 都具有细胞毒性，l c 5 0 为1 爿g m l ”。y o u s s e f 等 a h y r t i o s e r e c t a 的甲醇提取物中分离得到一个二倍半萜酯( 9 ) 和三个二倍半萜( 1 0 - 1 2 ) 。也都有 显著的抗t - 3 8 8 、a - 5 4 9 和t - 2 9 的细胞毒性。从海绵d y s i d e as p 中得到两个倍半萜环 戊烯酮d y s i d e n o n e sa ( 1 3 ) 和b ( 1 4 ) ，及一个倍半萜氨基醌d y s i d i n e ( 1 5 ) ( 1 3 ) 和( 1 4 ) 的l ：l 混合物及d y s i d i n e 在1 0p m 时能显著的抑制人滑膜磷脂酶p i a t 。其中d y s i d i n e 比标准抑制剂m a n o a l i d e 具有更强的活性和更高的选择性，i c 5 0 为2 0 p m ”从该属 海绵中还得到另一种倍半萜化合物d y s i d o t r o n i ca c i d ( 1 6 ) ，它具有强烈的抑制p l a ：活 性，l c 5 0 为2 6 m 神。从海绵m y r r n e k i o d e r m as t y x 中分离w , 2 2 个新的二萜化合物 c y a n t h i w i g i ne - a a ，其 a c y a n t h i w i g i nf ( 1 7 ) 显示较强的抗人体原发性肿瘤的活性， i c 5 0 为3 1 掣m “1 。从o k i n a w a n 海绵h a l i c h o n d r i a 印中得到四种新的倍半萜类化合物 h a l i c h o n a d i n sa - d ( 1 8 2 1 ) 蚓。从海绵f a s c i o s p o n g i ac a v e r n o s a 中得到两种新化合物二 倍半萜类化合物( 2 2 2 3 ) 嘲。从日本海绵a x i n y s s as p 中发现一种新的二萜 ( ) 一a x i n y s s e n e ( 2 4 ) ，其对急性早幼粒细胞白血病细胞h l - 6 0 有中度的细胞毒性“”。 2 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 1 4 1 3 2 6 p c h 3 2 8 a - c h 3 f l 2 = o c o c h 3 r 2 = h 童璺查兰堡主堂堡望兰 1 8 1 7 1 9 ：r 一n h c 0 2 m e 2 0 ：r = n c 2 1 ：r - n h 2 4 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 2 4 2 生物碱类 生物碱是海绵中含量较丰富的一类含氮的碱性有机物。每年都有许多文献报道 从海绵中发现新的生物碱，其中许多具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒的生理活性。日本 学者吐沏t s u k a m o t o 等 a x e s t o s p o n g i a 视4 m p k i m e d o n 两种海绵中获得一组3 一烷基 毗啶生物碱h a c h i j o d i n e sa ( 2 5 ) - 6 它们都具有细胞毒性，抗p 一3 8 8 的i c 5 0 值在1 o _ 2 3 p g m l 之间“c 堋bt s u k a m o t o 等还a u , x i n e l l ab r e v i s l y l a d p 得到四种具有抗真 菌活性的生物碱( 2 6 - 2 9 ) 。它们表现出较明显的抗f l , s c z c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 酵母活 性。2 7 2 9 还具有抗l 1 2 1 0 细胞的细胞毒性，其i 值分别为2 5 ，1 1 ，0 6 6 g m 1 “”。 儿h a l i c o r t e xs p 中得到一种新的溴吲哚生物碱d r a g r a a c i d i nf ( 3 0 ) ，具有体外抗病毒 活性，其抗h s v - i 和h i v - 1 的i c 。值分别为9 5 8 掣m ，0 9 1pm 【l ” , a s p o n g l a 属的一种 海绵中得到4 个毗啶生物碱s p o n g i d i n e s a d ，他们在1 0 m 时均能显著抑制人滑膜磷 脂酶p t a 2 ，其中s p o n g i d i n ed ( 3 1 ) 的活性最强“”。从地中海海f f 乱4 x i n e l l ad a m i c o r n i s 中 分离得到一种新的生物碱d a m i n i n ( 3 2 ) ，对鼠皮层细胞有抑制作用，有望开发成为治 疗神经干细胞疾病的新药物。目 a p s e u d o c e r a t i n as p 海绵中得到两种抗有丝分裂的 杂环类生物碱c e r a t a m i n c sa b 0 3 3 4 ) “” 9 ，i - i h l h 3 c i ：i 孝h ，k 入。 主 0 s 青岛大学硕士学位论文 r b r 3 甾醇 h h 矿飞 廷：。旷矽 从海绵中得到的甾醇类化合物往往具有酶抑制活性。从红海海绵幽f 砌s p 的 甲醇一乙酸提取液中分馏得到一种新颖的甾醇硫酸盐c l a t h s t e r o l ( 3 5 ) ，它在1 0 _ m 时 就表现出抑制h i v 1 反转录酶的活性“”。m e l i s s a 等从菲律宾海绵x e s t o s p o n g i as l x 得到中三种新的化合物：i b i s t e r o ls u l f a t e b ( 3 6 ) 和c ( 3 7 ) 及4e ，5 b 一环氧基一2 d ，3 a ， 1 28 ，2 2 s - 四羟基- 1 4a 一甲基胆甾一7 9 ( 1 1 ) 二烯一6 ，2 4 一二酮( 3 8 ) ，它们都具有抑制 h i v - l 整合酶的活性“”。从s t e l l e t t ah i w a s a e n s i s 海绵中得到一种新的甾醇衍生物 o r o s t a n a l ( 3 9 ) ，能够诱导人急性前髓细胞自血胞的程序性死亡“”从海绵 e u r y s p o n g i a ns p 中发现一种新的类固醇3 口一h y d r o x y - 2 6 - n o r c a m p e s t 一5 - e n - 2 5 - o i c a c i d ( 4 0 ) 从s t y t i s s as p 中得到一种新的化合物h a t o m a s t e r o l ( 4 2 1 1 6 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 h o h o 4 肽类 4 1 从海绵中提取到的肽类往往具有新颖的结构和较强的生理活性，一度成为人们 研究的热点但近几年从海绵中提取到的直链多肽和环多肽明显减少l i k 等从海绵 c e r a t o d i c t y o n s p o n g i o s u m 和s i g n u z d o c l as y m b i o t i c a 的共生体中获得两个环七肽异构 体：l t a n s ，t r a n s c e r a t o s p o n g a m i d e ( 4 2 ) 和c i s , c i s - c c r a t o s p o n g a m i d e ，化合物( 4 2 ) 在以细 胞为基础的抗炎模型中表现出潜在的抑制s 眦：表达的活性，还能抑制9 0 的以人 o s p l a 2 激发器为基础的指针的表达嘲从量k l c o n as i x 海绵中得到h a l i c l a m i d e ( 4 3 ) ， 一种新的环缩肽，含有两个从未从自然界中得到的残基：5 一羟基辛酸( h o a ) 和6 - 氨基 - 7 - 羟基一2 - 甲基庚酸( 姗a ) i t a l i c l a m i d e 具有细胞毒性，对n s c l s - n 6 a 支气管的 青岛大学硕士学位论文 非小细胞肺癌细胞系的i c 5 0 值为4 0 掣g m l 嘲。 叭s i d o n o p sm i c r o s p i n o s a 中得到得 m i c r o s p i n o s a m i d e ( 4 4 ) ，它包含一个首次从自然界得到的d - 羟基一p - 溴苯基丙氨酸残 基。该化合物在以x t t 为基础体外实验中对h i v 1 感染的细胞病理作用具有抑制活性， 其即。值为0 2 l ：g m 1 但盯 5 其它 近年来，从海绵中还分离出过氧化物、神经酰氨衍生物等其他类化合物，其中 不乏具有强烈的生理活性者。i l p l a k o r t i ss p 海绵中得到4 个聚酮衍生的环过氧化物， d l a k o r t i d ei l 其中p l a k o r t i d ei ( 4 5 ) 为首次报道的具有q ，一不饱和酮部分的 聚酮衍生的环过氧化物，并且具有显著的抗疟活性，其抗尸缸跏。出口肌f a l c i p a r u m 菌群的i c 鲥值为5 7 0 n g m l 从海绵p 1 4 鼬纠g s d 删旃口中得到一种新的过氧化物 p l a k o r t i d eq ( 4 6 ) 嗍 a l r c i n i as b 中分离得到的c y e i o t h e o n a m i d ce 4 ( 4 7 ) 能够强烈抑制 人胰蛋白酶( i 值为5 1 栅，胰蛋白酶被认为参与了哮喘等过敏性疾病的炎症过 程。因此c y c l o t h e o n a m i d ee a 有望成为治疗各种过敏性疾病的有效试剂日本学者 8 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 k c n t a r ot a k a d a 等 a d i s c o d e r m a 翻蜥中分离出三个神经酰氨硫酸盐c a l y c c r a r n i d e 钺4 8 ) - c 。它们均能显著抑制神经氨酸苷酶，i c 砘0 2 - o 8 g m l 之闻卿。他们还从 e r y l u s n o b i l i s 中得到另一种神经氨酸苷酶抑制n o b i l o s i d e ( 4 9 ) ，它可以抑制来自于细 菌c l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s 的神经氨酸苷酶，i c o 值为0 4 6 f g m l y o i c h i n a k a o 等 还9 , e e n a r e ss p 中获得两个大环内酯硫酸盐( 5 0 - 5 1 ) ，它们抑制a - 葡萄糖苷酶的i c 5 值分别为1 2 和1 5 口g m 1 洲。从海绵g e o d i a e x i g u a 中发现的e x i g i l o 瑚“5 2 ) 具有一定 的生理活性，可以阻止海胆卵的受精，但不能阻止其受精卵的胚胎化m 1 从红海海 绵d , a m e l l o d y s i d e ah e r b a c e a 中的到两种新的多氯代的衍生物，命名为d y s i d a m i d ed 3 - i ) 6 ( 5 3 - 5 6 ) 3 2 1 从海绵d i c t y o d e n d r i l l aa f t r e t i a r a 中得到一种新化合物o m r i o l i d e b ( 5 7 ) 1 3 3 l 。a i j t y a t e l l as p 海绵中得到两种新的法昵基对苯二酚l i k o n i d c sa ( s s ) 和 b ( 5 9 ) l u l 。i a s t y l i s s a 幼：海绵中得到m 勰s a d i n c ( 6 0 ) 是一种新的异戊烯化酶的抑制剂阁 从海绵m y c a l ei z u e n s i s 中得到m y c a p o l y o l sa - f ( 6 1 6 6 ) ，都有中等程度的细胞毒性 a 6 1 。 蚺, , 4 9 e l a s s p e c i e s 海绵中得至l j n a g e l a m i d e j ( 6 7 ) ，有抗菌活性咖。从海绵d y s i d e a h e r b a c e a t 争得到三种新的甜菜碱d y s i b e t a i n ep p ( 6 8 ) ，d y s i b e t a l n ec p a ( 6 9 ) 和d y s i b e t a i n e c p b ( 7 0 ) 。从海绵r h i z o c h a l i n ai n c r u s t a t a 得至l j r h i z o c h a l i na ( 7 1 ) 一种新的神经鞘脂类 洲。从海绵e r y l u s t r i s p h a e r u s 得到t r i s p h a e r o l i d e a ( 7 2 ) ，是一种有中度细胞毒性的次生 代谢产物”。 - 一 、，0 0 2 c h a 9 o h 童鱼查竺堡主堂垡堡塞 5 3 ：r 1 = c c l 3 。r 2 = c h c l 2 5 4 ：r 1 = c h c l 2 ，r 2 = c c l 3 5 5 ：r - h ，r 2 = o h 5 6 ：r 1 = r 2 = o h 5 7 1 0 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 6 1n = 6 ；6 2n = 5 6 3n = 4 ：6 4 n - - 3 6 5 n = 2 ：6 6n = l l i 6 9 青岛大学硕士学位论文 7 0 7 1r = b d g a l a c t o p y r a n o s y l 1 2 海绵药物研究简介与展望 由于海绵的种类繁多，容易采集。并且其中往往含有大量结构奇特、具有很强 生理活性的次生代谢产物，各国研究人员对此进行了大量卓有成效的研究。近几年 来，对海绵的研究已渐渐集中到其中抗肿瘤，抗菌活性成分的发现与开发以及相关 的病理学研究，并在此基础上进行活性物质的全合成，为进一步开发成为新药作准 备，这个趋势在最近的相关文献及研究报告体现得非常的明显。目前已有多个化合 物( 主要是大环内酯类化合物，如h a l i c h o n d r i nb 、s p o n g i s t a t i n1 ，d e s c o d e r m o l i d e 等) 正在进行临床前的研究，部分化合物有望进入到临床阶段。在抗病毒活性成分 的研究，尤其是抗h i v 活性成分的研究也非常活跃，目前已发现了a v a r o l ，a v a r o n e 等很具开发潜力的化合物。对抗炎症成分的研究也取得丰硕成果m a n o a l i d e 及其类 似物的研究便是典型，其它如抗过敏活性成分的研究也很具吸引力m 1 。虽然研究工作 开展得非常广泛，但是由于药品开发要求的苛刻性，已经开发为能够应用于人体的 新药非常地少。我国的研究人员在海绵生理活性物质的研究方面也作了一定的工作， 1 2 第一章引言海绵生理活性物质研究进展 但从总体看，仍处于起步阶段，远落后于国际研究水平，目前尚处于以提取分离活 性物质为主的基础层面上，对于活性物质药理学的分析，以及人工合成的实现方面 工作比较少，进一步进行新药开发的工作就更少了我国拥有漫长的海岸线，海绵 分布广泛，种类超过5 0 0 0 种，有着极其丰富得的海绵资源，有大量的海绵资源尚未 被认识，具有极大开发利用的广阔前景。 1 3 研究目的与意义 对于糖尿病的研究是世界范围的难点和热点，o d - 葡萄糖苷酶能催化a - 1 ，4 - 糖苷键水解，是小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解的酶，控制a 一葡萄糖苷酶的活性， 对调节糖的吸收和血糖水平有重要的控制作用。故而抑制q d - 葡萄糖苷酶的活性 就能条节人体内的血糖水平，为防治糖尿病提供思路海洋无脊椎动物中含有很多 特异的生物活性物质。本课题计划首先测定筛选中国山东常见海洋无脊椎动物粗提 物对a 一葡萄糖苷酶的抑制活性。在此基础上选取有活性的无脊椎动物进行化学成 分的研究，为进一步进行生理活性以及结构鉴定的研究打下良好的基础。这是这是 国内首次对海洋常见无脊椎动物进行的较大规模的。一葡萄糖苷酶抑制活 性的筛选 海星是一种含有大量营养成分的海产品。它含有丰富的维生素，多种氨基酸和 蛋白质，还有大量的微量元素锌，铜、硒、锰等，但是海星中含有的皂苷类物质对 人体和动物体却都有一定的毒性，人或动物过量服用后会产生头晕、呕吐等中毒症 状。所以对海星皂苷含量进行准确测定就显得尤为重要。目前，海星皂苷的定量是 皂苷研究中的最大难题，因皂萤的本身没有紫外吸收，无专一性显色剂，直接测定 的难度较大对海星的研究开发迫切需要建立一个快速、简便、重复性较好、灵敏 度高的分析方法。本课题应用其能与香草醛一硫酸试剂起显色反应，来检测海星中 皂苷的总含量，确定了理想的测定条件，建立了一种快速、简便的海星皂苷的测定 方法 多糖类化合物，广泛参与生命过程的许多方面，目前已发现不少多糖物质及其 衍生物具有药用价值，尤其在抗凝、抗血栓、调血脂、调节免疫功能和抗肿瘤、抗 放射方面都有显著的药理作用与疗效，多糖的研究日益受到重视并且越来越多的 研究表明多糖的许多生理特性与其结构中的硫酸根的含量有密切关系。并且目前对 于海绵多糖的研究极少本课题分别用水提和酸提法从采于青岛海域苔海绵t e d a n i a 艰中制得多糖，测定其中总糖含量和硫酸根含量这是首次关于此种海绵多糖及硫 酸根含量的报道 青岛大学硕士学位论文 海绵是一种简单的多细胞动物，种类极多，分布广泛，生存环境差异很大，自 身的结构虽简单但很有特点，并且往往共生着许多细菌、真菌和其他生物，决定了 其次生代谢产物的丰富多样，是海洋药物开发最重要的生物资源之一。目前，已从 海绵中分离出大量结构奇特的化学成分，这些物质在抗肿瘤、抗病毒、抗菌等方面 具有明显的活性但有关青岛附近海域海绵中次级代谢产物的研究很少。本课题对 采集青岛沙子e l 海域的苔海绵t e d a n l as i x 的化学成分进行了提取、分离与结构鉴定， 以期可以发现新结构的或是有潜力开发为海洋新药的活性物质，进而为人工合成提 供一些思路通过实验得到六种化合物，均为首次从该种海绵中发现 1 4 第二章海洋无脊椎动物中t 葡萄糖苷酶抑制剂的初步筛选 第二章海洋无脊椎动物中a 一葡萄糖苷酶抑制剂的初步筛选 2 1 前言 。一葡萄糖苷酶又叫q - d - 葡萄糖苷水解酶，以前还曾被称作麦芽糖酶 ( m a l t a s c ) ，是能水解存在于非还原末端的n 一糖苷键的一类酶的总称它包括麦芽 糖酶( d g l u c o s i d a s c g l u c o h y d m l a s c ) 、异麦芽糖酶( d e x t r i n 6 - o d g l u c a n c h y d o o l a s c ) 、蔗糖酶( s u c r o s ea d - g l u c o h y d r o l a t e ) 和海藻糖酶( t r e h a l a s ec t ， a t r e h a l a s e g l u c o h y d r o l a s e ) 等，这些酶首先是从猪肠囊肿的刷状缘粘膜上分离 得到的a 一葡萄糖苷酶在生物体内分布广泛，并参与食物的消化、糖蛋白的生 物合成，多糖及糖复合物的合成与分解代谢等许多生物过程嘲，另外，人们发现它 与某些因代谢紊乱失调而引起的疾病有关，如：糖尿病、癌症、病毒感染嗍等食 物中多糖类的吸收过程可见图2 1 吸 泛醐删 葡萄糖生气及吸收减缓 图2 i 食物中多糖类的吸收过程 食物中的淀粉等在唾液和胰d 一淀粉酶作用下水解生成寡糖和蔗糖等， 然后在。一葡萄糖苷酶作用下生成葡萄糖和果糖等单糖后才能被吸收正常 人进食后，淀粉等都被糖苷酶水解而被机体吸收，糖尿病患者因代谢障碍 而导致血糖、血清、胰岛素和脂蛋白的浓度发生异常改变，控制这类病的 合理方法是限制多糖在消化道内分解和吸收，为此这就必须降低糖苷酶的 活性d 一葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制a 一葡萄糖苷酶的活性，可阻 青岛大学硕士学位论文 滞双糖水解成单糖，延缓糖的吸收，使血糖平稳且缓慢地维持在一定水平。 由图2 1 中可以看出a 一葡萄糖苷酶在食物中的碳水化合物的消化过程中是一种非常 重要的酶。对多糖类体内代谢过程的关键步骤加以调节，可以达到降低血糖的目的。 a 一葡萄糖苷酶抑制剂可抑制a 一葡萄糖营酶的活性，使葡萄糖的生成及吸收减缓， 降低餐后血糖峰值，调整血糖水平，从而减少高血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素敏 感性，保护胰腺的功能，有效预防并改善并发症的发生和发展大量的医学研究表 明糖苷酶抑制荆不仅能调节糖代谢，治疗和预防糖尿病，还具有抗h i v ，抗病 毒感染的作用“”正因为a 一葡萄糖苷酶与人体的健康存在密切的联系，启发了 人们寻找合适的抑制剂，主动地对a 一葡萄糖苷酶的活性进行调控，降低乃至阻断 部分酶的生理作用，对有关疾病进行预防和治疗口一葡萄糖苷酶抑制剂依其来 源可划分为3 大类：微生物代谢物( 例如，1 9 6 6 年发现由链霉菌，芽孢杆菌， 和枯草杆菌产生的卜脱氧野尻霉素对a 一葡萄糖苷酶有强烈的抑制作用 钉) 、天然动植物( 如茶叶”、虎杖n ”、五味子h ”、大黄、五倍子、赤 芍、鸡血藤，甘草、葛根、丹参等“”) 提取物和人工合成物( 其中目前已 应用于临床的主要有3 种，分别是阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，其 化学结构都有低聚糖结构类似物“”，见图2 2 ) i c h 2 c ) i i9 h ai o h 2 0 h千h d 。h h 唇。铒。狮h 6 h6 h 6 h h o 阿卡波糖 h o h o 伏格列波搪米格列醇 圈2 2 三种人工合成的a 一葡萄糖苷酶抑制剂 而对于来源于动物的d 一葡萄糖苷酶抑制剂的报道并不多，曾有韩国学者对 全蚕粉的降糖效果进行过报道“”我们以d 一葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型为 呈- 峪)啊p卑洲 第二章海洋无脊椎动物中a 葡萄塘苷酶抑制剂的初步筛选 基础，进行了海洋无脊椎动物粗提物的初步筛选工作这是国内首次对海 洋常见无脊椎动物进行的较大规模的q 一葡萄糖苷酶抑制活性的筛选。 2 2 实验部分 2 2 1 材料、仪器与试剂 材料：实验用海洋无脊椎动物均采集于青岛沿海海域，新鲜动物洗净、 去除杂物，用匀浆机打碎备用。实验用海洋无脊椎动物的名称 见表2 1 仪器：7 2 1 型分光光度计( 上海第三分析仪器厂) r e 5 2 旋转蒸发器( 上海亚荣) s h b - m 循环水式多用真空泵( 郑州科工贸) p h 计( 雷磁) 恒温水浴锅( 常州国华) 试剂：a 一葡萄糖苷酶( s i g m a ，t y p ei i i 来源于酵母) ，a 一葡萄糖苷酶 ( s i g m a ，t y p ei 来源于霉菌) ，对硝基苯酚一a d 一吡喃葡萄糖苷 ( m e r c k ) ，阿卡波糖( 德国拜耳公司) ，k h 2 p 0 4 ，k o h ，m g c l 2 6 h 2 0 ， 二甲亚砜( d m s o ) 所有溶剂、化学试剂均为分析纯 2 2 2 海洋无脊椎动物粗提物的提取 已打碎的样品分别用浓度约为9 5 的工业乙醇浸泡提取7 天，其间须 频繁搅拌，抽滤出提取液，将残渣再用同体积的乙醇同样操作3 次，合并 提取液，4 0 c 以下真空旋转蒸干，制得浸膏，以备做a 一葡萄糖苷酶抑制剂 筛选实验。 2 2 3 a 一葡萄糖苷酶抑制剂活性筛选 2 2 3 1 溶液的配制 o 5 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) ：k h 2 p 0 41 3 6 1 0 9 ，k o h3 2 1 0g ，m g c l 2 6 h 2 0 0 6 5 0 9 ，用蒸馏水定容至2 0 0 m l ，p h = 6 8 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) ：取0 5 m 磷酸盐缓冲液1 0 0 m l ，用蒸馏水稀 释定容至5 0 0 m l 酶溶液：以0 1 mp b s 配制0 1 t t m la d 一葡萄糖苷酶溶液 底物溶液：6 r a m 对硝基苯酚一a - d 一吡喃葡萄糖苷溶液 0 4 m 终止液：甘氨酸3 0 0 3 9 ，n a o h1 2 4 0 9 ，蒸馏水定容至1 0 0 m l ， p h - 1 0 4 1 7 青岛大学硕士学位论文 样品液：称取样品6 0m g ，用1 0 r a ld m s o 溶解于带塞的试管中，滤除不溶性 杂质，放入冰箱，备用 2 2 3 2a 一葡萄糖苷酶抑制剂活性测定方法 a 一葡萄糖苷酶抑制荆活性筛选模型的原理是利用a - 葡萄糖苷酶催化 水解对硝基苯基一a d - 吡喃葡萄糖苷，通过测定释放出来的对硝基苯酚的 量达到测定a 一葡萄糖苷酶活性的目的m 州删 2 2 3 2 1a 一葡萄糖苷酶抑制剂活性测定 向试管中准确加入1 0 2 t l0 5 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) ，1 2 0 i l i 样品 ( o 6 n l i g m l 的d m s o 溶液) ，2 8 2 i t l 蒸馏水，2 0 0 l t l 底物溶液。将混合溶液在 3 7 ( 2 恒温水浴中预热5 r a i n 。然后加入2 0 0 p 1 酶溶液( t y p ei i i ) ，摇匀，再在 3 7 c 恒温水浴中反应3 0 m i n 。加入反应终止剂1 2 m l 。用7 2 1 分光光度计在 4 1 0 h m 处测量其吸光度。以阿卡波糖为阳性对照。每批样品都要做空白对 照。对照和样品均在同一条件下反应。 2 2 3 2 2 酶对反应的影响 操作方法同2 2 3 2 1 ，将其中的酶采用d 一葡萄糖苷酶( s i g m a 。t y p ei 来 源于霉菌1 ，依次测定样品的吸光度。 2 2 3 2 3 样品液浓度对反应的影晌 操作方法同2 2 3 2 1 ，将其中样品液的浓度改为o 4 m g m l 、o 8 m g ，m l 、 l o m g m l ，依次测定样品的吸光度。 2 2 3 2 4 抑制率计算方法 在反应体系中，样品提取物的浓度为7 9 6 1 x g m l 。在该浓度下各种海洋 无脊椎动物粗提物对a 一葡萄糖苷酶活性的抑制率可以表示为： 酶活性抑制率( ) = ( a 对照一a 样品) a