（生物物理学专业论文）酶法制备大豆蛋白ace抑制肽的研究.pdf

摘要 大豆中蛋白质含量高达4 0 ，氨基酸组成比较合理，必需氨基酸平衡良好。我国大豆 资源丰富，原料成本低，所以，大豆分离蛋白的研究与利用己引起人们的关注。大豆多肽 是大豆分离蛋白经酶解后产生的分子量较小的化合物，在营养价值与生理功能上都优于大 豆分离蛋白。大豆多肽能有效的改善原料蛋白质的不足，达到无豆腥味，具有无蛋白质变 性、加热不凝固、酸性不沉淀、易溶于水、流动性好等特点，而且吸收速度快，蛋白质利 用率高。大豆多肽还具有降血压的生物活性，这对于一些目前常见的疾病如高血压、冠心 病等的预防有着重要的研究意义。 为此，本文较系统的研究了大豆分离蛋白的制备和大豆a c e 抑制肽的生产条件。由 于市售的大豆分离蛋白其添加成分不明确，而且有些有活性成分的添加剂会对a c e 抑制 活性产生影响，因此本实验采用碱溶酸沉法提取大豆分离蛋白，在单因素试验的基础上确 定正交试验的因素和水平，对正交结果进行分析得出了最佳提取条件：p h 值为9 0 ，温度 4 0 。c ，料液比为1 ：1 0 。并对产物进行了理化参数的测定和氨基酸分析、热变性分析，为 后续的实验提供了依据。 论文研究了a l c a l a s e 碱性蛋白酶、n e u t r a s e 中性蛋白酶、p r o t a m e s 复合蛋白酶、 f l a v o u r z y m e 风味蛋白酶对大豆分离蛋白的水解效果和a c e 抑制活性。水解能力用p n - s t a r t 法检测，d h 大小依次为a l c a l a s e 碱性蛋白酶) p r o t a m e s 复合蛋白酶) n e u t r a s e 中性蛋白酶 ) f l a v o u r z y m e 风味蛋白酶；a c e 抑制活性用高效液相法检测，a c e 抑制率强弱依次为 a l c a l a s e 碱性蛋白酶) f l a v o u r z y m e 风味蛋白酶) p r o t a m e s 复合蛋白酶) n e u t r a s e 中性蛋白酶。 综合考虑，选定a l c a l a s e 碱性蛋白酶为生产大豆a c e 抑制肽的最适酶，并对其酶解条件 进行了优化，确定生产大豆a c e 抑制肽的最佳条件为：温度6 0 。c ，p h 值为8 0 ，【s 】= 4 ， 【e 】【s 】_ 4 ，d 碍1 1 4 4 。在最佳生产条件获得的水解产物进行f l a v o u r z y m e 风味蛋白酶 的酶法脱苦，实验结果表明：随着苦味值的降低a c e 抑制活性也有所下降，因此不采用 此法对水解液进行脱苦处理。通过对酶解产物的氨基酸分析可知，酶解前后的氨基酸组成 变化不大，说明与其他化学方法相比，a l c a l a s e 碱性蛋白酶酶解生产a c e 抑制肽是一种较 温和，且安全、无副作用的方法。 关键词：大豆分离蛋白，a c e 抑制肽，酶解，高效液相 a b s t r a c t s o y b e a nc o n t a i n sa b o u t4 0 p r o t e i nw i t hw e l l b a l a n c e da m i n oa c i da n de n o u g he s s e n t i a l a m i n oa c i d i nc h i n at h es o y b c a nr e s o u r c e sa r ea b u n d a n ta n dt h ep r i c ei sl o w t h e r e f o r e ，t h e s t u d ya n du t i l i z a t i o no fs o y b e a np r o t e i ni s o l a t e sh a v eb e e nd r a w ns c i e n t i s t sm u c ha t t e n t i o n s o y b e a np e p t i d e s ( s p ) a r ec o m p o u n d sw i t hs m a l lm o l e c u l a rw e i g h to b t m n e df r o mh y d r o l y s i so f s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s s t u d i e ss h o w e dt h a ts pw e r es u p e r i o rt os o y b e a np r o t e i ni s o l a t e si n b o t hn u t r i t i o n a lv a l u ea n d p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s 。c o m p a r et os o y b e a np r o t e i n , s o y b e a n p e p t i d e sd on o ts h o wf i s h ys m e l l ，w o u l dn o tb ed e n a t u r e d ，d e p o s i t e di na c i ds o l u t i o n ，f l o c c u l a t e d b yh e a t ，a n di sm o r es o l u b l e ，e t c m o r e o v e lt h es o y b e a np e p t i d e ss h o wm a n yb i o l o g i c a l f u n c t i o ns u c ha sl o w e r i n gb l o o dp r e s s u r e ，w h i c hs u g g e s tt h ep o t e n t i a lu s eo fs o y b e a n p e p t i d e st o p r e v e n ta n g i o c a r d i o p a t h ya n dr e l a t e dd i s e a s e t h e r e f o r e ，t h ep r e p a r a t i o no fs o y b c a np r o t e i ni s o l a t e sa n dp r o c e d u r eo fa c e ip r o d u c t i o n f r o ms o y b c a np r o t e i nw e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l yi nt h i sw o r k i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ed i dn o t u s es o y b e a n p r o t e i ni s o l a t e sf r o mm a r k e tb e c a u s et h e yc o n t a na d d i t i v e s a n dm a n yo t h e r u n k n o w nf a c t o r st h a tw o u l db r i n gu n c o n t r o l l a b l ef a c t o r si ns o y b e a np o w d e rh y d r o l y s i s s o y b e a n p r o t e i ni s o l a t e s w e r ep r e p a r e d t h r o u g hd i s s o l v i n g t h es o y b e a np r o t e i n sw i t ha l k a l ia n d d e p o s i t i n gw i t ha c i d o p t i m u m i z e de x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t m n e da f t e rs i n g l e - f a c t o r e x p e r i m e n t sb a s e do r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h a ti sl ：4 0f o r t h er a t i oo fs o l i dt ol i q u i d ，4 0 。cf o r r e a c t i n gt e m p e r a t u r e ，a n dt h er e a c t i o nw o u l db ec o n d u c t e du n d e rp h 9 0 t h e nt h e p h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r s ，a m i n oa c i d sa n dt h e r m a ld e n a t u r a t i o nt e m p r t u r eo ft h ep r o d u c t w e r ed e t e r m i n e d f o u rt y p eo f e n z y m e s ，a l c a l a s e , n e u t r a s e ，p r o t a m e s ，f l a v o u r z y m e ，w e r eu s e dt oh y d r o l y z e p r e p a r e ds o y b e a np r o t e i ni s o l a t e sa n dd e g r e eo fh y d r o l y s i s ( d 均w e r ea n a l y z e du s i n gp h s t a r t m e t h o d ，r e s p e c t i v e l y a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h ep r o d u c tw e r es t u d i e db yh p l c t h er e s u l t s s h o w e dt h a th y d r o l y s i sa b i l i t yo ft h e s ee n z y m ei sa l c a l a s e p r o t a m e s n e u t r a s e f l a v o u r z y m e ； t h ea c e i n h i b i t o r ya c t i v i t yo fp r o d u c tf o r ma l c a l a s ei st h eb e s t o p t i m u mp r o c e s sf o r p r o d u c t i n ga c ei n h i b i t o r yp e p t i d e su s i n ga l c a l a s ew a st e m p e r a t u r e6 04 c ，p h 8 0 ， s 】_ 4 ， e s 】- 4 ，d h = 1 4 4 t h eh y d r o l y s a t ew e r ed e b i t t e r e du s i n gf l a v o u r z y m t l l i sp r e c e d u r e ， h o w e v e r , a l s oi n d u c ed e c r e a s eo fa c ei n h i b i t o r yo ft h eh y d r o l y s a t ea n di sn o ts u i t a b l e t h e a m i n oa c i d ss h o w j u s tal i t t l ec h a n g ea f t e rh y d r o l y s i s , s u g g e e s tt h a ta l c a l a s eh y d r o l y s i si sm i l d e r , s a f i i e ra n dh a sn os i d e e f f e c tt h a no t h e rc h e m i c a lm e t h o d k e yw o r d s ：s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s ( s p i ) ，a n g i o t e n s i nic o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t i o n , e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，h p l c 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同： 作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 、 学位论文作者签名： 叮 鸪痈 ll 签字p l 期：j 砷箩年多月彳 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 导师签名： 仔知 刁名匆 签字同期：2 卵2 年多月多 1 签字同期：二彻矿年月，矿同 吉林农业大学硕士学位论文酶法制备大豆蛋白a c e 抑制肽的研究 1 1 大豆及大豆蛋白的概述 第一章前言 大豆( 学名为g l y c i n em a xm e r r i l l ) 属蝶形花科，大豆属，别名黄豆。早在数千年前， 大豆在中国最先栽培，有着5 0 0 0 多年的栽培和消费历史，是世界上产量最大的食用和饲 用蛋白资源。而且我国也是大豆食品加- r n 用最早的国家，据报道1 9 9 9 2 0 0 0 年，全世界 大豆总产量为1 5 6 7 2 亿吨，其中中国大豆总产量为1 4 2 9 万吨，排在美国、巴西、阿根廷 之后位列世界第四，大豆在我国国民经济发展中起着举足轻重的作用【1 1 。在过去大豆的一 个重要用途是提取豆油，但对蛋白质却未能充分利用，大豆压榨过的副产物只是用作饲料 和肥料。随着食品工业的发展，人们采用先进的工艺技术生产大豆蛋白，并加工成多种蛋 白制品，如浓缩大豆蛋白、分离大豆蛋白、组织化大豆蛋白等，这些大豆蛋白制品蛋白质 普遍含量在5 0 以上，其中大豆分离蛋白的的蛋白质含量更高达9 0 左右，而且大豆分离 蛋白具有许多食品加工特性，如乳化性、持水性、持油性、起泡性等，在肉类制品、饮料、 冰淇淋、焙烤食品及各种保健食品中具有广泛的应用，高品质系列化大豆蛋白产品的工业 化大规模生产，极大地拓宽了大豆蛋白的应用范围【2 3 】。 大豆作为来源最丰富且价廉的优质植物蛋白质原料正受到世界各国越来越广泛的关 注。大豆蛋白是目前开发利用的植物蛋白中最优质的植物蛋白之一。大豆蛋白质被世界卫 生组织定为一类蛋白，其具有良好的营养和保健功能。大豆含有3 0 一5 0 的蛋白质，高 于其他粮食作物，从大豆蛋白氨基酸组成来看，它含有八种人体必需的氨基酸，而且氨基 酸组成比较合理，只有蛋氨酸略有不足，与f a o w h o 组织所制定的必需氨基酸需要量 接近，尤其是赖氨酸较高，可弥补谷物食物中的赖氨酸不足【4 。】。从表1 1 可以看出大豆 中的八种必需氨基酸含量明显优于其它四种谷类食物。现代食品营养研究表明，大豆中的 蛋白质不但含量高，而且在质量上可与优质动物蛋白( 如鸡蛋、牛奶) 相媲美。大豆被称 为田地里长出的肉，其蛋白质含量如此之高：1 k s 大豆= 1 7 k g 瘦肉= 2 6 k g 鸡蛋= 1 1 7 k g 牛奶【6 1 。 吉林农业大学硕士学位论文酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 表卜1 大豆与几种粮食及其制品的8 种必需氨基酸含量比较( m g l o o g ) t a b e i 一1 c o m p a r i t i o no ft h ee i g h tk i n d so fa m i n oa c i do ns o y b e a na n dc o m m i s s a r i a ta n d b y p r o d u c t ( r a g 10 0 9 ) 1 1 1 大豆蛋白的成分与结构 大豆蛋白质并不是指某一种蛋白质，而是指存在于大豆种子中诸多蛋白质的总称。根 据不同的分类方法可将大豆蛋白划分为不同的类别：根据溶解性分类，大豆蛋白可分为大 豆清蛋白( a l b u m i n ，5 左右) 和大豆球蛋e t ( g l o b u l i n ，9 0 左右) ，大豆球蛋白又称酸沉 蛋白，在p h 4 5 4 8 之间沉出；根据生理功能分类，大豆蛋白可分为储存蛋白和生理活性 蛋白。储存蛋白是主体，占蛋白质的7 0 左右，它与大豆制品的加工性质关系比较密切； 而生理活性蛋白包括较多种类，主要有胰蛋白酶抑制剂、b 淀粉酶、血球凝集素、脂肪氧 化酶等，它们在总蛋白质中所占比例虽然不多，但对大豆制品的质量却有重要的影响；根 据沉降系数分类，大豆蛋白可分为四个组分，即2 s 、7 s 、1 1 s 和1 5 s 。每一组分都是一些 分子量大小接近的分子混合物，如果将每个组分的蛋白质进一步分离，可以获得蛋白质单 体或相类似的蛋白质。7 s 蛋白和l l s 蛋白是主要组分，两者占全部蛋白质的7 0 左右； 根据免疫反应的不同，大豆中主要的球蛋白分为大豆豆球蛋白( g l y e i n i n ，4 0 左右) 、a 一 伴大豆球蛋白( q - - c o n l y c i n i n ，1 3 8 左右) 、b 一伴大豆球蛋白( 1 3 - - c o n l y c i n i n ，2 7 9 左右) 和y 一伴大豆球蛋白( y - - c o n l y c i n i n ， 3 o 左右) 。进一步研究结果表明( 见表 1 2 ) ，a 伴大豆球蛋白属于2 s 蛋白组分，b 一和y 一伴大豆球蛋白属于7 s 蛋白组分， 而大豆豆球蛋白属于1 l s 蛋白组分。随后又从大豆中分离出一种只溶于盐水的7 s 球蛋白， 由于其等电点在碱性范围，因此称其为碱性7 s 球蛋白。 由上可见，大豆蛋白的组成和结构非常复杂。对大豆蛋白组分进行研究是加工利用大 豆蛋白的基础，因为只有对有某些类似理化性质的一类蛋白进行酶解研究，才能得到较好 2 吉林农业大学硕士学位论文酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 的预期效果。 表1 - 2 大豆的主要蛋白组分 t a b l e1 - 2t h em a i np r o t a i nc o m p o n e n to fs o y b e a n 1 1 2 大豆蛋白的改性 大豆蛋白的营养价值较高，资源丰富，原料成本低，而且还具有热凝胶性等与食品加 工密切相关的功能特性，不仅可以作为动物蛋白的替代物，广泛应用于儿童食品、强化食 品、保健食品等食品的生产，还可以用来研制透明的可生物降解材料。但是，大豆蛋白在 酸性条件下溶解性差，在热、酸、碱等条件下易变性，对某些消费者具有过敏性等缺陷， 使它在现代食品工业中的应用受到了一定程度的限制。随着食品工业的发展，需要大量具 有良好功能特性和较高营养价值的蛋白质作为食品的原料成分或添加基料来提高食品的 营养价值【l 】。为此，加强或改善大豆蛋白的功能特性，提高大豆制品营养成分的生物有效 利用性成为食品加工工业急待解决的问题。天然的蛋白质往往不能完全满足要求，人们通 过采用物理方法、化学方法、酶方法以及基因改造等方法来处理蛋白质，使蛋白质的氨基 酸残基和多肽链发生某种变化，引起蛋白大分子空间结构和理化性质的改变，从而获得具 有理想的功能特性和营养价值的蛋白质。由于各种单一改性方法均有其局限性，当采用一 种蛋白改性技术仍不能达到理想效果时，可以考虑综合采用多种改性手段，最终获得较理 想的蛋白产品。从某种意义上说，蛋白质的改性技术就像传说中的点金术，能够将普通的 低价值蛋白原料通过改性变成高附加值的产品，以满足食品工业及其相关行业的特殊需要 【6 】 o 蛋白的物理改性方法是指通过加热、冷冻、加压、磁场、电场、声场、机械作用、超 声、低剂量辐射及添加小分子双亲物质等物理手段来改善蛋白质的功能特性、提高营养价 值的方法。物理改性方法具有加工费用低，耗时少，无毒副作用，对蛋白营养价值破坏小 的特点，但也同时存在设备投入大，改性范围窄的缺点1 7 。 化学改性方法主要是指采用化学方法针对蛋白中的氨基、羟基、琉基和羧基进行改性， 具有反应简单、效果显著的特点，但同时也存在试剂专一性不强，反应条件苛刻，易有化 学物质残留和副产物混杂等不足之处，蛋白质的化学改性方法主要有酸碱处理、酰化、脱 3 吉林农业大学硕士学位论文酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 酰胺、磷酸化、糖基化、共价交联以及氧化等方、法【7 j 。 基因工程改性是指应用植物育种和分子技术，改变蛋白质分子的结构，进而影响其功 能性质的方法。广义的基因工程改性包括基因重组、基因突变和染色体变异；狭义的基因 工程改性是指基因的定点修饰。目前大豆蛋白的基因工程改性主要包括两方而，一是研究 如何改变大豆球蛋白的组成，尤其是减少胰蛋白酶抑制剂的含量，提高大豆蛋白的营养价 值；二是研究改变脂肪氧合酶同功酶的组成，减少大豆产品的豆腥味【7 j 。 蛋白质的酶法改性通常是指利用酶对组成蛋白质分子的氨基酸主链水解及侧链基团 的修饰。化学改性尽管具有反应简单、效果显著的特点，但由于有容易发生副反应、试剂 易残留、蛋白质营养价值下降等缺点，在食品工业中的应用受到限制。蛋白质的酶法改性 具有专一性强、条件温和，无毒副作用的特点，而且对营养几乎无不良影响等优越之处， 受到人们的广泛关注。随着酶工业、固定化酶技术和膜反应器的不断发展，酶解过程更趋 于自动化、简单化，酶法水解己成为一种趋势。随着一些新用途的酶的发现和应用，极大 的拓宽了酶法改性的应用范围，例如各类蛋白水解酶、转谷氨酰胺酶、磷酸酶以及过氧化 氢酶的应用，使得过去只能采用化学方法进行的去酰胺、水解、磷酸化、交联聚合、氧化 等改性方式都可以采用酶法改性来进行。特别是一些价格低廉的微生物酶的出现，进一步 降低了酶法改性的成本，使其更具有实用性。有目的酶促改性不仅能改变大豆蛋白的功能 特性，而且可使其氨基酸组成更趋合理，消化吸收率更高。进一步的研究还发现，酶解大 豆蛋白可产生一系列具有生理活性的多肽，从而提高大豆蛋白的营养价值悼j 。 i 1 3 大豆蛋白的酶水解 食品工业的飞速发展，需要大量具有卓越功能特性和营养特性的蛋白质作为食品的原 料成分或添加基料来提高食品的营养价值。为此，改善大豆蛋白的功能特性，提高大豆制 品营养成分的生物有效利用性成为食品工业急待解决的问题。大豆蛋白经过酶的不完全水 解生成大豆肽后，大豆蛋白原有的许多功能性质，如乳化功能、起泡功能、吸水功能、增 稠功能、粘着功能、营养价值、生理功能等均有了不同程度的改善，能够更好的满足食品 工业及相关行业的需要。 1 1 3 1 蛋白酶概述 在大豆蛋白酶解过程中，正确选择蛋白酶是生产上的关键。现有的蛋白酶种类很多， 蛋白酶按水解蛋白质的方式不同可分为以下几种l s j ： 1 内切酶，切开蛋白质分子内部肽键c o - n h ，将蛋白质水解成分子量较小的多肽类。 包括动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如丹麦n o v o n o r d i s k 公司生产的 碱性蛋白酶a l c a l a s e 、复合蛋白酶p r o t a m e x 、中性蛋白酶n e u t r a s e 以及国产的碱性蛋白酶 地衣型芽孢杆菌2 7 0 9 ，中性蛋白酶枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖上曲霉3 9 4 2 、酸性蛋白 4 吉林农业大学硕士学位论文酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 酶黑曲酶3 3 5 0 等。 2 外切酶，切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸。其中又 把作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。如丹麦n o v o n o r d i s k 公 司生产的f l a v o u r z y m e 酶就含有外切酶。外切酶的一个重要特性就是能够把处于肽链末端 的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味。 3 此外有些蛋白酶还能够水解蛋白质或多肽的酯键和酰胺键。 蛋白酶水解蛋白质时，作用部位因肽键种类而异。如胰蛋白酶的切点是羧基侧为碱性 氨基酸( 精氨酸、赖氨酸) 的肽键；胃蛋白酶要求切点两端有芳香族氨基酸；枯草杆菌碱性 蛋白酶要求切点的羧基侧为疏水性芳香族氨基酸( 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 。这种蛋 白酶对切点的特异性要求叫做蛋白酶的底物专一性。利用蛋白酶的底物专一性可以定向获 得特殊结构的多肽。 1 1 3 2 关于大豆蛋白水解的研究 黄惠华等研究了木瓜蛋白酶对大豆蛋白的水解作用，并通过电泳实验和氨基酸分析分 析了水解前后水解物组成的变化1 9 。j i n y e o l 研究了酸处理、热处理对大豆分离蛋白酶解 的影响，研究了不同预处理方法对水解度、氨基氮、氮溶指数、肽链长度的影响i l0 j 崔继科 等不仅研究了酸、碱及加热处理对大豆蛋白酶解的影响，还探讨了大豆蛋白采用木瓜蛋白 酶水解后对其溶解性、乳化性、粘度、起泡性的影响，针对大豆肽的苦味，研究了活性炭 吸附、柠檬酸掩盖等方法对大豆肽苦味的影响，分析了大豆蛋白的酶水解机理【1 1 1 。w e n d e e c h i a n g 等采用酶膜反应器连续生产大豆肽，由于及时分离了酶解生成的多肽，消除了产物 反馈干扰，提高了酶解效率。并且采用氧化稳定指数( o s i ) 检测了大豆分离蛋白及其水解 物的抗氧化活性，结果显示大豆分离蛋白酶水解后抗氧化性提耐1 2 1 。顾振宇等采用木瓜蛋 白酶水解大豆分离蛋白，研究了大豆分离蛋白水解液的乳化特性，结果显示：水解度约为 1 7 时，乳化性最佳【1 3 1 。a d l e r - n i s s e n 认为，将大豆蛋白部分水解，使其分子量与鸡蛋清 蛋白相当，则可提高大豆蛋白的发泡性1 4 1 。舒展【1 0 2 】经研究发现，以微生物中性蛋白酶水 解大豆蛋白，当水解度达到4 3 时，热凝结度从9 3 增加到3 5 似，酸性溶液中的氮溶 解率从5 7 增加到4 8 1 。赵毅等l b 】贝u 注意到大豆蛋白水解产物对保加利亚乳杆菌的增 值有促进作用，且其促进作用优于大豆蛋白。另外，通过酶解，还可产生一些具有生理功 效的小肽；可以减弱和打破产生大豆腥味的有味物质与大豆蛋白之间的紧密结合，使有味 物质挥发掉，从而减弱豆腥味。c a l d e r o na m 研究了大豆蛋白的水解和再聚合过程，通过 在水解液中添加甲硫氨酸，有效增加了类蛋白中的甲硫氨酸含量，提高了蛋白质的营养价 值【16 1 。 y o s h i k a w am 等的研究表明大豆球蛋白a 1 亚基( 氨基酸序列g l y - a r g p r o a r g ) 、大豆 蛋白的胰蛋白酶解物( 氨基酸序列h i s c y s g i n a r g p r o a r g ) 分别具有免疫活性。而且大 豆球蛋白a 1 亚基还具有抑制肿瘤生长的作用【1 7 1 。 吉林农业大学硕士学位论文 酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 吴建平等采用不同的蛋白酶水解大豆蛋白，研究了单一酶水解物和复合酶水解物对大 白鼠血管紧张素( a c e ) 的抑制活性，证实大豆蛋白的酶水解液中含有降血压功能因子，得 出了生产大豆降压肽的最佳条件，并分析了大豆降压肽的分子量分布、氨基酸组成和肽谱 1 1 8 】 o 刘粼研究了大豆蛋白酶水解的机理，在此基础上推导出了大豆蛋白酶水解的动力学方 程，指出水解过程中，大豆蛋白底物浓度的上限约为1 ，超过此浓度反应速率显著下降， 并通过试验进行了验证【1 9 l 。赵新淮从酶水解过程中水解度随水解时间的变化曲线，推断大 豆蛋白的酶水解方程是指数方程形式【2 0 1 。 1 1 3 3 针对大豆蛋白水解物的苦味的研究 大豆蛋白水解产物的分子量小、水溶性较高、无蛋白质变性、在人体内易消化吸收， 特别适合于功能、保健、疗效食品和临床营养制品、各类速溶饮品及方便食品的生产，其 用途十分广泛。但是，其水解产物中常含有少量能产生苦味的亮氨酸、蛋氨酸等游离氨基 酸及其衍生物和小分子疏水性肽物质，使产品带有不同程度的苦味，直接影响了食品的风 味，给人们的食用带来一些麻烦，也在一定程度上限制了它在食品工业中的推广应用。 g u i g o z 和s o l m s 发现这些肽长度大都是1 2 个氨基酸以下的小肽或中等长度肽1 2 。 a d l e r - n i s s c n 也证实蛋白酶解物的苦味是由含量很少的一些高疏水性的肽造成的，而且疏 水性氨基酸位于短肽末端时苦味较到2 2 1 。h e v i ap 认为肽链分子量在8 0 0 左右时苦味较强 【2 3 l 。g a r d n e r 等学者则尝试建立了一些定量和定性的关系来描述蛋白质酶解物及肽的苦味 2 4 1 o 蛋白质酶解产物苦味给其推广应用带来问题，目前减少蛋白质水解物苦昧的方法可概 括如下：( 1 ) 严格控制酶解条件，酶解后立刻采取有效措施灭酶，使蛋白质的水解度保持 在适当的范围。实践证明蛋白质的轻度水解产物的苦味较淡。( 2 ) 选择性分离的方法，通 常疏水性多肽是水解物苦味产生的主要原因，通过对酶解过程中产生的苦味肽进行疏水吸 附、有机溶剂萃取、酶聚合类蛋白反应等可以针对性去除或减少疏水性多肽，降低水解物 苦味。常见的吸附一剂是活性碳，有机溶剂是正丁醇，木瓜蛋白酶可作为酶聚合反应的用 酶。选择性分离的最大缺点是蛋白质、多肽的损失很大，而且这些疏水性多肽往往具有显 著的功能特性。( 3 ) 研究证实当疏水性氨基酸残基处于多肽链的外侧时多肽呈现苦味，而 单个的疏水性氨基酸苦昧却低的多，因此采用外切酶将疏水性氨基酸从多肽链的端基切下 可以有效的减少苦味。丹麦n o v o n o r d i s k 公司生产的f l a v o u r z y m e 酶是一种由内切酶和外 切酶组成的混合酶，和其它的内切酶一同使用时可以有效的防止苦味的产生【1 0 3 1 0 4 1 。 1 1 4 大豆蛋白开发利用现状 目前，国内新开发了许多大豆蛋白的深加工产品，如大豆肽豆奶等。随着大豆蛋白产品 质量的逐步提高，应用领域也不断扩大，国际贸易与经济效益俱增，美国和日本都处在大 6 吉林农业大学硕士学位论文 酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 豆蛋白生产与应用的前列。美国于7 0 年代中期生产大豆蛋白制品3 5 万吨，8 0 年代在1 1 0 万吨以上。今天的日本，每年有2 l 万吨大豆蛋白食品供应市场【2 习。然而，由于大豆蛋白 自身功能存在一些缺陷，使得它们在食品工业中的应用受到了很大的限制。如大豆蛋白溶 解性低，无法作为功能性成分在乳制品、饮料和糖果等食品体系中加以利用：大豆蛋白具 有一定的抗原性，而且其消化率和生物效价远不及牛奶，鸡蛋等动物性蛋白，一直不为人 们所满意。随着近代研究的深入，人们逐渐发现，许多小分子量肽( 包括大豆肽) 在经人 体消化道时不被水解，而是直接被人体吸收利用，而且大豆肽具有与大豆蛋白相同的氨基 酸组成。此外，这些小肽还具有大豆蛋白所不具备的良好的理化性质和生理活性，如大豆 多肽能有效改善原料蛋白质的不足，达到无豆腥味，无蛋白质变性、低抗原性、酸性不沉 淀、加热不凝固、易溶于水、流动性好等特点，这些特性有利于用于食品、保健品、医药 等领域的开发和应用。此外，经研究，大豆肽还具有许多生理活性，如促进脂肪代谢和增 强体能、降低血清胆固醇、降血压、抗氧化性、降血脂血糖、增加骨密度、促进矿物质吸 收等等。由于大豆肽在食品加工和营养保健方面显示出其他植物蛋白无法比拟的优势，世 界各国都高度重视高附加值大豆肽制备和功能方面的研究。虽然大豆蛋白制品的产量和供 应量较大，尤其是具有生理活性功能的大豆肽产品的市场逐渐扩大，但由于忽略酶解蛋白 时对水解度的控制，许多大豆肽产品具体的功能性质不明确。我国人口众多、市场巨大， 开发大豆蛋白系列产品，尤其是肽类制品前景将十分广阔，效益将十分可观。 1 2 大豆肽的概述 1 2 1 大豆肽的营养价值及组成 大豆肽( s o yp e p t i d e ) ，即“肽基大豆蛋白水解物一( p e p t i d e b a s e ds o yp r o t e i nh y d r o l y s a t e ) 之简称，是大豆蛋白质的水解物【2 6 1 。目前一般以大豆、豆粕或大豆分离蛋白为底物，用酶 解的方法来制备。大豆肽是平均链长为2 1 0 的短肽( 以2 3 的低分子肽为主) ，分子量为 1 0 0 0 - 2 0 0 0 0 d a l t o n ，以低于1 0 0 0 的为主体，主要溶出峰位置在分子量3 0 0 7 0 0 范围内1 2 7 j 。 大豆肽的蛋白质含量为8 5 左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质基本相同，必需氨基酸 平衡良好且含量丰富，同时大豆肽与大豆蛋白相比具有无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉 淀、加热不凝固、易溶于水、流动性好的理化特性，可用于大多数普通的营养食品中l 列j 。 1 2 2 大豆肽的理化性质 1 2 2 1 良好的溶解性及在高浓度状态下的低粘度 大豆蛋白的粘度随着浓度的增高而急剧升高，在浓度为1 3 以上时经高温处理易于产 生疏水键结合和二硫键结合形成网状聚合物，使得溶液粘度高达9 0 0 0 厘泊，失去流动性， 7 吉林农业大学硕士学位论文 酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 这限制了大豆蛋白在流体食品中的添加使用，大豆蛋白经过水解后，网状结构被破坏，因 而膨胀性减少、粘度下降，大豆肽在溶液中浓度达3 0 时的粘度仅相当于1 0 大豆蛋白溶 液的粘度，即使浓度达到6 5 ，粘度只有2 2 0 0 厘泊，且溶解度高达9 9 以上，流动性良 好。大豆肽在高浓度时具有低粘度的特性，特别适合应用在需要高蛋白含量而又无法大量 添加的高蛋白流体食品中【1 、3 、2 6 】。 1 2 2 2 良好的耐酸及耐热稳定性 大豆蛋白在酸性或加热条件会产生沉淀，而很多酸性饮料的p h 值正好处于p h 4 5 左 右蛋白质的等电点附近，因此无法添加大豆蛋白来强化营养。精制的大豆肽能够在大豆蛋 白的等电点p h 4 5 附近保持良好的溶解状态，溶液澄清透明，不受p h 变化及加热的影响。 另外，大豆肽的n s i 值高达9 0 以上，速溶性好，很适合于速溶饮品的生产，这为开发酸 性大豆饮料和富含蛋白质的酸性食品提供了有利条件1 、3 、2 6 1 。 1 2 2 3 良好的吸湿性和保湿性 大豆肽的吸湿性非常强。这一特殊性质己被应用于日化工业，作为毛发和皮肤的保湿 剂使用。大豆肽的吸湿性和保湿性比胶原蛋白多肽和丝蛋白肽更强，符合人们追求纯天然 植物性化妆品的心理，并能降低产品成本【1 、3 、2 6 1 。 1 2 2 4 改善蛋白质的起泡性 酶解可以增加大豆蛋白的起泡性，研究表明大豆蛋白的水解度不同，其起泡性也不同， 在水解度达到4 时起泡能力可以达到大豆蛋白的十倍【1 3 2 6 1 。 1 2 2 5 使凝胶软化功能 大豆肽具有明显的抑制蛋白质形成凝胶的性质，这是由于大豆肽具有较强的吸湿和保 湿作用，使水分保存在制品中。利用这种性质可以用于火腿、香肠、鱼糕等高蛋白食品中， 起到软化食品、调整硬度、改善口感的功能作用1 、3 、2 6 1 。 1 2 2 6 促进发酵作用 大豆肽具有促进微生物生长发育和活跃代谢的作用，可以促进乳酸菌、双歧杆菌、酵 母、霉菌和其它菌类的增殖以及有益代谢物的分泌。实验证明，在发酵液中添加0 2 的 大豆肽，就能显著促进发酵速度。因此，可以将其用于乳酸饮料、干酪、醋、酱油和发酵 火腿等发酵食品的生产，可以明显提高生产效率，稳定产品品质，改善风味，也可以用于 生产酶制剂【1 、3 2 6 1 。 1 2 3 大豆肽的功能性质 大豆肽的分子质量大小、肽链长短以及肽链上连接的特殊集团如磷酸基、糖链等，影 响着肽的营养特性和生理活性，且这些理化性质还与选用的酶类、水解条件和分离方法有 关。生物酶降解大豆蛋白得到的产物中，有许多大豆肽片段起到了活性肽的功能。大豆肽 在原大豆蛋白序列中并无活性，一般通过胃肠道时释放出来的很少，但在体外可通过水解 8 吉林农业大学硕士学位论文 酶法制各大豆a c e 抑制肽的研究 将这些活性肽释放出来，使其除了营养丰富、容易吸收外，还具有抗高血压、降胆固醇、 抗血栓形成、促进脂肪代谢、防止动脉硬化、增强肌肉运动能力、促进肌红细胞复原、帮 助恢复体力、促进矿物质吸收和微生物发酵、抗氧化等生理功能1 2 9 瑚】。大豆肽还能促进大 脑发育提高记忆力，还具有增强吞噬细胞和b 细胞活力，增强免疫力功能，在抗癌、延缓 衰老等方面也具有广阔的应用前景。 1 2 3 1 大豆肽的易消化和易吸收性 用酶水解大豆蛋白制得的大豆肽，其吸收性与蛋白质和氨基酸混合物相比，大豆肽从 胃向肠的移行速度明显加快，吸收率也高，显示其消化和易吸收性。 大豆肽具有易消化吸收、能迅速给机体供能量、促进脂质代谢和恢复体力等功能，故 它可用于制备医疗食品、老年保健食品、运动员特殊食品，其中包括体育运动员用的粉、 片和颗粒状食品，蛋白质强化食品和能量补品等。 1 2 3 2 大豆肽降血脂和胆固醇作用 早在2 0 世纪初，人们就发现与动物蛋白不同的是，大豆蛋白具有降低血脂与胆固醇 的作用p 6 1 ，而大豆蛋白水解物一大豆肽同样具有这样的功能。总的来说表现出以下几点： ( 1 ) 对于胆固醇值正常的人，没有降低胆固醇的作用； ( 2 ) 对于胆固醇值高的人具有降低总胆固醇值的功效； ( 3 ) 有防止血清胆固醇值升高的作用； ( 4 ) 使总胆固醇中有害的l d l 、v l d l 值降低，但不会使有益的h d l 值降低的作用。 1 2 3 3 大豆肽的恢复疲劳效果 有报道指出，在小鼠运动负荷试验中，给予大豆肽组比对照组恢复疲劳快，报道中还 提出疲劳恢复效果具有大豆肽的浓度依赖性，并确认在相同组成的氨基酸混合物中未见此 现象。新浦等人以摇动器和旋转取数器测定小鼠服用大豆肽和混合氨基酸后恢复疲劳的效 果，发现服用大豆肽的各组恢复疲劳的效果均高于服用混合氨基酸各组1 3 。 1 2 3 4 大豆肽的增强肌肉作用 村松等曾对大学柔道运动员进行大豆肽饮服试验，在训练后适时摄取大豆肽有增加最 大无氧能量的倾向，与肌肉增强有联系。三浦等人在举重运动员中进行的实验也证实了服 用8 的大豆肽的运动员其最大肌力( 举重、深蹲、卧推) 比对照组明显增大【3 引。 另外，大豆肽对加速肌肉恢复疲劳有明显的效果。当肌肉细胞破坏时，血液中的肌红 蛋白就会增加，反之，当肌细胞复原时则肌红蛋白减少。曾经有学者给2 0 k m 竞走运动员 饮服2 0 8 大豆肽的饮料，在运动前后分别测定血液中肌红蛋白变化情况，经测定后发现， 饮服大豆肽群其肌红蛋白值减少速度比未饮服大豆肽的快。 1 2 3 5 大豆肽的促进能量代谢和抗肥胖作用 对大豆肽的营养效果所进行的一系列研究中，发现大豆肽具有很强的促进脂肪代谢的 效果，可以使人体的能量消耗更高。若以肥胖的动物，比如老鼠做试验，发现大豆肽既能 有效减少脂肪，又能保持骨骼肌重量不变，目前认为原因是老鼠通过摄取大豆肽，促使交 9 吉林农业大学硕士学位论文 酶法制备大豆a c e 抑制肽的研究 感神经活跃，引起褐色脂肪组织功能激化，促进了能量的代谢。年幼肥胖症患者食用添加 大豆肽的食品时，皮下脂肪减少的速度加快【3 2 l 。利用这一特性，可将大豆肽用作运动员增 强体质、减轻体重的食品以及肥胖病人减肥的良好食品。 1 2 3 6 大豆肽的抗氧化作用 研究表明，大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化活性的活性肽，这类活性肽能抑制机 体内自由基的大量积累，对提高自由基清除机制起到一定功效。从而能在一定程度上消除 机体内多种生理功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生【3 2 1 。 所以将大豆多肽分离、纯化并加以富集，然后作为新的治疗药物、功能食品添加剂或 饲料添加剂来使用【3 ，以提高其自身的使用价值，将是大豆肽类产品今后的发展方向。 1 3 食源性血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制肽的研究进展 近年来，生物活性肽己成为食品和医药领域的研究热点。生物活性肽是指那些具有特 殊生理功能的肽类，一般这些肽类相对分子质量较小，在人体内的消化吸收较蛋白质更容 易，这些小肽不仅能提供人体生长发育所需要的营养物质与能量，还能调节人体生理机能， 起到预防疾病的作用。已报道的生物活性肽较多，包括促钙吸收肽f 3 3 1 、免疫调节肽【3 4 】、抗 血栓肽【2 5 1 、抗菌肽【3 6 1 、抗氧化肽 3 7 1 、阿片样活性肽1 3 引、a c e 抑制肽等【3 9 1 。 1 3 1 血管紧张素转化酶与高血压 高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，它发病率高，常伴有 心脏、血管、脑和肾脏等器官病变，极易引起中风、冠心病、老年痴呆症等多种疾病，直 接威胁患者的生命安全，被视为中老年人的头号健康杀手。据统计，2 0 0 2 年我国成人高血 压患病率为1 8 6 ，患者数量达1 6 亿，每年将近1 0 0 万患者因此而死亡。而且随着人们 生活水平的提高，高血压患