（蔬菜学专业论文）ems处理诱发大白菜变异的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦壅些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 姗酶乡镢 签字日期知f 年钿衫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦垒些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑皇垦垒些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 黧灞拶签字日期易产月。日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期力，f只6i e i 电话： 邮编： 摘要 1 1 1 1 1 1 1 1l r i ii ! i lr l l ll l l l y 18 9 7 19 7 作物种质资源是品种改良的物质基础。种质资源匮乏是目前大白菜品种改良中 面临的最大问题，创造具有丰富遗传基础的育种材料是大白菜育种工作者研究的重 点之一。人工诱变可使自然突变率提高千倍以上，从而使人们定向地创造和筛选变 异成为可能。但人工诱变存在着方向不确定性和多为隐性突变，将人工诱变与小孢 子培养相结合，可达到基因迅速纯合和缩短突变鉴定时间的目的。 本研究以6 份不同基因型大白菜为试验材料，采用e m s 为诱变剂，分别进行了 种子诱变、花蕾诱变结合游离小孢子培养、游离小孢子诱变与培养以及花粉诱变处理 方法的研究，确定了不同处理方法适宜的e m s 浓度和处理时间，探讨了种子处理后 种子和幼苗防御系统相关生理生化指标的变化，并对蕾期授粉自交后代和游离小孢子 培养后代进行了田间形态学鉴定及分子辅助鉴定，初步获得了一定类型的变异材料。 主要研究结果如下： 1 以9 9 2 和津育8 0 大白菜种子为材料，研究了不同e m s 浓度浸泡种子 诱变4 h 后种子的萌发情况、电导率变化及种子与幼苗的s o d 、p o d 活性和m d a 的 含量变化。结果表明，e m s 浓度范围为肛1 o ，随着e m s 浓度的增大，种子的发 芽势、发芽率逐渐降低，幼苗根尖和叶缘出现褐化并逐渐加剧，成活率下降；种子浸 出液电导率及种子和幼苗的m d a 含量均逐渐增大；e m s 对种子及幼苗s o d 、p o d 活性影响表现为低浓度促进、高浓度抑制。初步确定大白菜种子诱变处理的适宜e m s 浓度为0 4 0 o - 4 ) 6 。 2 以大白菜8 5 1 的花蕾为处理对象，研究了不同浓度的e m s 浸泡花蕾不同 时间小孢子膨大以及产胚成苗情况的影响，结果表明随着e m s 浓度增大或处理时间 延长，小孢子膨大率和产胚率逐渐降低，畸形胚率增加；以0 1 的e m s 处理花蕾 1 5 r a i n 和3 0 m i n 可得到一定数量的活性胚并能够正常发育成植株，变异率较高，1 浓度处理1 5 m i n 也可以得到少量的活性胚胎但是再生植株能力差，未发育成苗。 3 对大白菜8 5 1 a 0 1 a 0 6 3 个自交系的小孢子进行了e m s 诱变处理并培 养，对小孢子培养过程的细胞学观察结果表明，随着培养基中e m s 含量的增加和诱变培养 时间的延长，小孢子膨大率出现了明显的下降，各浓度时间下均未形成成熟的胚状体。 4 用e m s 石蜡油处理8 5 1 a 1 2 的花粉，研究花粉离体萌发半致死的e m s 浓度和处理时间。结果表明：常温下存于液体石蜡油中的大白菜花粉在l h 内萌发率 不受影响，之后随储存时间延长而降低；随着e m s 浓度的增大或时间的延长，花粉 萌发率降低；适宜大白菜花粉诱变的e m s 诱变剂量为0 1 5 ，处理时为4 5 , - , 6 0 m i n 。 5 。对诱变后代进行了常规和分子鉴定，从中筛选了不同类型的突变体。其中种子 诱变m l 代无显著性状差异，m 2 代出现能够直接观察到的不同差异类型。花粉诱变、 花蕾浸泡诱变后获得的小孢子植株差异较明显，且变异类型较多。 关键词：大白菜；e m s ；诱变；小孢子培养；s s r i n d u c e dv a r i a t i o no fc h i n e s ec a b b a g eb ye m st r e a t m e n t a u t h o r ：l uy i n m a j o r ：o l e r i c u l t u r e t u t o r ：s h e ns h u - x i n gx u a ns h u - x i n a b s t r a c t g e r m p l a s m 他s o c 骼a r et h ef o u n d a t i o no fc r o pv a r i e t a li m p r o v e m e n t t h es c a r c i t yo fg e r m p l a s m r e s o u r c e si st h em o s ts e r i o u sp r o b l e mi nc h i n e s ec a b b a g eb r e e d i n g ，t h ec r e a t i o no fb r e e d i n gm a t e r i a l s 、j l ，i mr i c hg e n e t i cb a s i si st h ee m p h a s i so fr e s e a r c hf o rb r e e d i n gs c i e n t i s t s n a t u r a lm u t a t i o nr a t i oc a nb e i m p r o v e dm o r et h a nat h o u s a n dt i m e sb ya r t i f i c i a l l yi n d u c i n gv a r i a t i o n ，w h i c hm a k e si tp o s s i b l et o c r e a t ea n ds c r e e no r i e n t a t i o nv a r i a t i o n t h ed i r e c t i o no fa r t i f i c i a lm u t a g e n e s i si su n c e r t a i n t y , a n dm o s t o fm u t a n t sa r er e c e s s i v e c o m b i n e da r t i f i c i a lm u t a g e n e s i sa n dm i c r o s p o r ec u l t u r et o g e t h e r , w ec a ng e t h o m o z y g o u sg e n e sr a p i d l ya n dr e d u c et h et i m eu s e df o rm u t a t i o n si d e n t i f i c a t i o n i nt h i se x p e r i m e n t ，d i f f e r e n tg e n o t y p e so fc h i n e s ec a b b a g ew e r eu s e da sm a t e r i a l s ，t h em e t h o d s o fs e e dm u t a g e n e s i s ，b u dm u t a t i o nc o m b i n e d1 ) i r i mm i c r o s p o r ec u l t u r e ，i s o l a t e dm i c r o s p o r em u t a t i o na n d c u l t u r ea n dp o l l e nm u t a g e n e s i sw e r ei n v e s t i g a t e db ye m si n d u c i n g t h es u i t a b l ee m sc o n c e n t r a t i o n a n dp r o c e s s i n gt i m e o fd i f f e r e n tt r e a t m e n tm e t h o d aw e 他d e t e r m i n e d t h ev a r i a t i o ni nr e l a t e d p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so nt h ed e f e n s es y s t e mi ns e e d sa n ds e e d l i n g sa f t e rd e a l i n g 丽ms g c d sw e r ed i s c u s s e d f u r t h e r m o r e ，t h em o r p h o l o g i c a li d e n t i f i c a t i o na n dm o l e c u l a r p r o f i l i n gw e r e c o n d u c t e di no f f s p r i n g so fb u d sp o l l i n a t i o ns e l f m ga n df r e em i e r o s p o r ec u l t u r i n g ，r e s u l t i n gi ns o m e t y p e so f m u t a t i o nm a t e r i a l s t h em a i nr e s e a r c hr e s u l t sa r e 弱f o l l o w s ： 1 u s i n gc h i n 黜c a b b a g eg e n o t y p e s 9 9 - 2 a n d j i n y u8 0 ，t h ee f f e c t so f4 hs e e d - t r e a t m e n t 、) l ，i n l d i f f e r e n te m sc o n c e n t r a t i o ns o l u t i o n so ns e v e r a lm a j o rc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha ss e e d sg e r m i n a t i o n ，s e e d s c o n d u c t i v i t ya n dt h ea c t i v i t yo fs o d ，p o da n dm d ai ns e e d sa n ds e e d l i n g so fc h i n e s ec a b b a g ew e r e s t u d i e di nt h ep r e s e n tp a p e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a te m sc o n c e n t r a t i o n sr a n g e df r o m0 - 0 1 ，、j l r i t h e m sc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ，s e e dg e r m i n a t i o np o t e n t i a l ，s e e dg e r m i n a t i o nr a t ea n ds e e d l i n gs u r v i v i n g r a t eg r a d u a l l yd e c r e a s e d , t h er o o tt i pa n dc o t y l e d o ne d g eo fs e e d l i n g sb e c a m eb r o w ng r a d u a l l y t h e c o n d u c t i v i t yo fs e ：e d sa n dt h em d ac o n t e n to fs e e d sa n ds e e d l i n g sw e r eb o t hi n c r e a s e dw i t he m s c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g t h es o d ，p o da c t i v i t yo fs e e d sa n ds e e d l i n g sw a gp r o m o t e db yl o we m s c o n c e n t r a t i o ns o l u t i o nt r e a t m e n ta n di n h i b i t e d b yh i g he m sc o n c e n t r a t i o ns o l u t i o nt r e a t m e n t t h e o p t i m a le m sc o n c e n t r a t i o n si n d u c i n gc h i n e s ec a b b a g es 吲2 l sm u t a t i o n sr a n g e df r o m0 4 t o0 6 2 u s i n gb u d so fc h i n e s ec a b b a g e 8 5 一l 嬲m a t e r i a l s ，t h ee f f e c t so fd i f f e r e n te m sc o n c e n t r a t i o n s o nt h er a t eo fm i c r o s p o r es w o l l e na n dt h ec o n d i t i o no fe m b r ：o sa l i v ea n dr e g e n e r a t i o nw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw i t he m sc o n c e n t r a t i o na n dt r e a t m e n tt i m ei n c r e a s i n g ，b e t ht h er a t eo f m i e r o s p o r es w o l l e na n de m b r y o m cg e n e r a t i o nr e d u c e dg r a d u a l l y , a n dt h en u m b e ro fd e f o r m i t ye m b r y o s i n c r e a s e d t r e a t i n gb u d sb yo 1 e m sf o r15 r a i no r3 0 m i n ，w ec a ng e tq u i t es o m ee n e r g e t i ce m b r y o s w h i c hc a l lb er e g e n e r a t e di n t os e e d l i n g sa sn o r m a l ，丽mah i g hv a r i a t i o nr a t i o b u ti ft h ee m s c o n c e n t r a t i o nw a sr e a c h e dl ，w i t ht r e a t m e n tt i m eo f15 m i n ，o n l yaf e wa c t i v i t ye m b r y o sw e l e p r o d u c e d 、) i r i l hal o wr e g e n e r a t i o nr a t i oa n dw i t h o u ts e e d l i n g sa ta 1 1 3 m u t a g e n e s i sm i e r o s p o r eo ft h r e ei n b r e dl i n e si nv i t r oi n d u c e db ye m st h e nc u l t i b a t e d ，i n t h ep r o c e s so ft h em i c r o s p o r ec u l t u r e ，t h o u g hc y t o l o g yo b s e r v a t i o n , w ec a l lg e tt h er e s u l tt h a tt h er a t e o fm i e r o s p o r ee x p a n d si s s i g n i f i c a n t l yr e d u c e da l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o na n dt h e e x t e n s i o no f m u t a g e n e s i st i m e ，n o t h i n ge m b r y o sw a sg o ta tl a s t 。 4 p o l l e n so ft w od i f f e r e n tv a r i e t i e so fc h i n e s ec a b b a g ew e r et r e a t e d 、) i ，i t l le m s - p a r a f f mo i l s o l u t i o n ，h a l fl e t h a le m sc o n c e n t r a t i o na n dt r e a t m e n tt i m eo fp o l l e ng e r m i n a t i o ni nv i t r ow e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eg e r m i n a t i o nr a t eo fp o l l e ns t o r e di nl i q u i dp a r a f f i no i lw a sn o ta f f e c t e d w i t h i nl h ，a n dt h e nw a sd e c r e a s e d 、) l r i t l lp r o l o n g e ds t o r a g e w i t ht h ei n c r e a s i n ge m sc o n c e n t r a t i o no r t h e m u t a g e n e s i st i m eg r a d u a l l y ，t h er a t eo f p o l l e ng e r m i n a t i o nr e d u c e d t h es u i t a b l ee m sc o n c e n t r a t i o n i n d u c e df o rp o l l e nm u t a g e n e s i sw a s0 0 1 5 ，、) l r i t l lt r e a t m e n tt i m eo f 4 5 6 0 m i n 5 b yr o u t i n ei d e n t i f i c a t i o na n dm o l e c u l a ra p p r a i s a l ，s d i f f e r e n tt y p e so fm u t a n t sf r o mm u t a g e n e s i s o f f s p r i n g sw e r es c r e e n e d a f t e rt h es e e d sm u t a g e n e s i s ，t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nt r a i t s v a r i a t i o ni nm lg e n e r a t i o n ，b u ts o m em u t a n t sc a nb eo b s e r v e di nm 2g e n e r a t i o n t h e r ew e r el a r g e d i f f e r e n c e si np h e n o t y p i cv a r i a t i o na m o n gt h ep l a n t so b t a i n e df r o mm i c r o s p o r ec u l t u r eo fp o l l e n s m u t a g e n e s i sa n db u d sm u t a g e n e s i s ，谢mm u l t i p l em u t a n tt y p e s k e yw o r d s ：c h i n e s ec a b b a g e ；e m s ；m u t a g e n e s i s ；m i c r o s p o r ec u l t u r e ；s s r 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s 目录 1 弓i 言1 1 1 大白菜种质资源的利用现状及创新1 1 2 诱变育种。l 1 2 1 诱变育种技术的原理与方法2 1 2 2 诱变育种技术的发展及最新进展2 1 3e m s 诱变技术3 1 3 1e m s 诱变原理及特点一3 1 3 2e m s 诱变技术的关键及处理材料和部位的选择3 1 3 3e m s 后代突变体的筛选鉴定方法5 1 4 本研究的目的和意义7 2 材料与方法8 2 1 材料8 2 2 研究内容与方法一8 2 2 1e m s 诱变种子方案的研究与方法8 2 2 2e m s 诱变花蕾结合小孢子培养方案的研究与方法9 2 2 3e m s 诱变小孢子方案的研究与方法1 0 2 2 4e m s 诱变花粉方案的研究与方法1 0 2 2 5 诱变后代突变体的筛选鉴定1 1 3 结果与分析1 3 3 1 大白菜诱变种子处理适宜e m s 浓度的确定及相关研究1 3 3 1 1 不同浓度e m s 处理对大白菜种子萌发及存活率的影响1 3 3 1 2e m s 处理对大白菜种子浸泡液相对电导率的影响1 3 3 1 3e m s 处理对种子和幼苗s o d 、p o d 活性的影响1 4 3 1 4e m s 处理对种子及幼苗m d a 含量的影响。1 4 3 1 5e m s 诱变种子m 1 代植株性状及结实性1 5 3 2e m s 诱变花蕾结合游离小孢子培养的研究1 5 3 2 1 适宜游离小孢子培养的花蕾外部形态指标的确定1 5 3 2 2e m s 处理花蕾对小孢子膨大率的影响1 5 3 2 3 小孢子胚胎发生的细胞学观察及产胚率统计1 5 3 2 4 小孢子胚的转接及植株再生研究1 6 3 3 诱变e m s 小孢子与培养研究1 7 3 4e m s 石蜡油诱变花粉相关研究1 8 3 4 1 液体石蜡油对花粉萌发率的影响18 3 4 2e m s 不同处理时间和浓度对大白菜花粉萌发率的影响1 8 3 5 诱变后代的突变体的筛选鉴定1 9 3 5 1e m s 诱变种子后代形态学性状调查和分子鉴定1 9 3 5 2e m s 花蕾诱变结合小孢子培养m 1 代的变异情况2 2 4 讨论：1 6 4 1 最适宜e m s 诱变浓度时间的选择标准和探讨2 6 4 3 对e m s 诱变方案的具体探讨2 6 4 3 1e m s 种子诱变处理2 6 4 3 2e m s 石蜡油的花粉诱变处理2 6 4 3 3e m s 小孢子诱变技术2 7 4 3 4e m s 花蕾诱变结合小孢子培养2 7 4 3 5 适于大白菜的e m s 诱变技术的讨论2 8 5 结论2 9 参考文献3 0 在读期间发表的学术论文3 6 作者简历3 6 至| 【谢3 8 e m s 处理诱发大白菜变异的研究 1 引言 大白菜( b r a s s i e ar a p als s pp e k i n e n s i s ) ，是十字花科芸薹属芸薹种中能够形成叶 球的亚种，由芸薹演化而来，染色体数2 n = 2 x = 2 0 ，为一二年生的草本植物，是我国 乃至世界的重要蔬菜作物l l 吲。 据农业部种植业管理司统计，2 0 0 6 年我国大白菜种植面积达2 6 3 3 7 万h m z ， 总产量达1 05 0 6 万t 【4 】。2 0 1 0 年全国仅秋播大白菜面积为1 6 4 9 6 万h m 2 ，同比增 长2 1 ；预计总产量7 5 5 5 3 万t ，同比增长0 9 。其中，云南、贵州、江苏、黑龙 江、吉林等5 省大白菜面积、产量增幅较大【5 】。最近我国蔬菜产业发展迅速，提高效 益、改善品质将是今后蔬菜产业发展的一个重要研究课题。随着大白菜基因组测序计 划的完成，如何利用全基因组信息有效改良大白菜现有种质资源备受育种学家关注， 大白菜在我国蔬菜产业发展中的地位日益受到重视1 6 j 。 1 1 大白菜种质资源的利用现状及创新 大白菜种质资源具有品种丰富多样化、归类复杂化以及利用率较低的特点。一方 面大白菜作为最早的栽培植物之一，在我国己有两千多年的栽培历史，从原始的野生 种通过引种栽培，杂交选择，精心培育，演化出各种各样的类型【7 墙】。大白菜属于异 花授粉植物，杂种优势明显，在自然环境条件下极易“串粉”，异交率高，从而形成 了极其丰富多样的品种类型，成为世界上品种最为丰富的栽培植物之一p 。1 。 然而，由于大白菜品种间分类复杂化，不同品种长期在不同生态环境下栽培杂交 选择，使现有品种无论在形态、生长发育习性、生态适应性上都有很复杂的变异。不 同变种间亲缘关系复杂，命名多样，理清各类型之间的关系比较困难【l ，给常规育种 技术中的初期选种工作带来了一定局限性，易造成初期选种量过大、重复选择或优良 品种的遗漏等问题。因而实际育种中，多集中采用少数有利用价值的优势品种，使大 白菜遗传多样性受损，遗传基础不断变窄，导致育种工作很难有突破性的进展。而少 数优势基因的集中利用必然存在着难以预料的潜在危险。因此，大白菜的种质的保存 和创新不仅具有重大的理论意义和实用价值，而且是形势所需，势在必行。 种质创新泛指人们利用各种变异( 自然的或人工的) ，通过人工选择的方法，根据 不同目的而创造成的新作物、新品种、新类型、新材料。因此，种质创新是种质资源 有效利用的前提和关键，是作物遗传育种发展的基础和保证。 种质创新的途径是多样的【1 2 1 ，目前已经可利用的技术手段包括对自然的基因突变 进行培育、改造，也可以通过远缘杂型1 3 1 、组织培养【1 4 - 1 5 】、基因工程【1 6 l 、人工诱变 等手段获得，其中人工诱变是种质创新中较常用的手段和方法。根据不同的研究目的 和意义采用不同的方法以提高种质创新效率。 1 2 诱变育种 基因突变是种质创新的根本途径之一。突变在自然界中广泛存在，利用系统育种 l 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 方法可筛选出一些优良自然突变体并加以利用，进而育成一些可在生产上应用的新品 种。但基因自发突变的频率很低，难以满足品种改良的需求。诱变育种就是利用物理 和化学因素诱发植物遗传变异，并对其后代进行研究、筛选和鉴定的一门现代生物学 技术，是选育新品种的有效技术之- - 1 8 - l9 】。 常规杂交育种基本上是染色体的重新组合，这种技术一般并不引起染色体发生变 异，更难以涉及到基因突变。利用具有辐射能的各种射线或化学诱变剂诱发植物的基 因突变或染色体结构变异、倍性变异，可使突变频率提高千倍以上，从而使人们定向 地创造和筛选变异成为可能【2 0 】。诱变还能增加突变类型，扩大变异谱，能出现自发突 变所没有出现的新类型【2 1 1 。此外，诱变技术还可与杂交育种、基因转移及离体筛选等 手段相结合以实现高效育种，是现代不可或缺的重要育种技术之一【2 2 】。 1 2 1 诱变育种技术的原理与方法 近几十年来，随着人们的不断探索和相关科技的发展，人们对诱变原理和技术的 研究逐渐深化，新型诱变技术和方法及相关成果报道不断涌现【2 3 2 5 】。但是无论采用何 种方法，究其根本都是诱发研究对象内部d n a 分子结构的改变，从而引起遗传信息 改变，从本质上实现单性状或多性状的改良，但是具体诱变机理因方法而异【2 6 】。诱变 育种根据诱变手段的不同可分为物理诱变育种和化学诱变育种。 物理诱变主要是通过物理方法，如射线、激光微束、离子束、微波、超声波、热 力等方法引起植物体内产生可遗传的变异。它主要是通过这些离子束对植物体内的 d n a 进行作用，使得d n a 发生片段丢失、异位、倒位等【2 7 _ 2 9 1 。常用的物理诱变剂， 包括x 射线、y 射线、州j 寸线、夕射线、中子、质子以及紫外线等，根据诱变作用特 点可分为电离辐射和非电离辐射，前者导致d n a 分子上的原子( 基团) 发生电离，后 者不足以产生电离作用1 3 。 化学诱变则是利用化学诱变剂处理植物材料。化学诱变剂的种类很多，如烷化剂、 亚硝基化合物、叠氮化合物、碱基类似物、抗生素、轻胺等。目前，在这些化学诱变 剂中，研究和应用最为广泛的主要是烷化剂，主要有、e m s 、n a n 3 、d e s 和甲基亚 m n u 等。这些烷化剂的诱变作用主要是通过自身带有的一个或多个不稳定的烷基置 换d n a 分子上的氢原子，改变基因的分子结构，从而造成基因突变。这种置换主要 发生在碱基的n i 、n 3 、n 7 位置上。目前，在植物突变体创建中，应用最多的烷化剂 是e m s 【3 2 - 3 3 1 。 1 2 2 诱变育种技术的发展及最新进展 早期关于诱发突变的研究主要停留在理论上。1 9 0 4 年，d ev r i e s 提出了辐射可以 诱发突变，随后h j m a l l e t 和l j s t a d l e r 相继发表了射线和紫外线能诱发果蝇、玉米 及大麦等出现突变，标志着作物诱变育种探索的开始。但由于他们得到的突变体大多 为一些畸形的不利变异，因此未能在作物改良中得到应用。t o l l e n e r 于1 9 3 4 年首次利 用x 射线诱发获得烟草叶色突变品种c l o r i n afl 并应用于生产，迈出了作物诱变 2 e m s 处理诱发大自菜变异的研究 育种的第一步。之后诱发突变逐渐成为作物品种改良的一种快捷高效的手段【3 4 1 。据 m a l u s z y n s k i 等统计，2 0 0 0 年世界上育成推广的诱变品种已经有2 2 5 2 个，其中以中国、 印度、苏联、荷兰、德国、美国和日本为最多，占世界诱变育种总数的7 2 【3 引。目 前，载入f a o i a e a 诱变品种数据库的品种己经达到2 3 8 5 个( f a o i a e a ) ，并且就 f a o i a e a 的不完全统计，世界上共有6 8 5 个品种间接利用了诱变种质，占诱变育种 总数的2 8 7 6 【3 6 1 。由于利用诱变技术获得的种质在作物育种中应用极为广泛，大部 分诱变材料都是作为亲本间接应用于育种中，育成品种很多未载入该数据库，因此与 诱变相关的品种数量会大于这一数字。 目前，诱变育种技术已趋于成熟，除了被应用于各种作物的品种改良和创新外， 还被广泛的应用于功能基因组学、比较基因组学等各个领域的研究上。如各种作物大 型突变体库的构建并以此为基础进行作物功能基因组研究和新品种选育提供基础材 料，成为当今研究的热点问题【3 7 】。f e i z 3 8 3 9 】等诱变技术创建了25 0 0 株普通软质小麦 突变体库，并推算发现，每隔1 2k b 就会有一突变体产生，其创制的突变体库是目前 报道突变频率最高。韩锁义等【3 9 】对南农8 6 4 大豆种子进行诱变，构建了大豆品种 的突变体库，并在m 3 代获得了蛋白质和油含量变化明显的材料。赵天祥等【4 i 】利用突变 技术创建了小麦品种偃展4 1 1 0 的突变体库，并进行了形态学分析和鉴定。陈锋等【4 z j 还对诱变所建立的不同植物突变体库进行研究，分析对比了不同植物的突变频率。 1 3e m s 诱变技术 1 3 1e m s 诱变原理及特点 e m s 属于烷化剂的一种。烷化剂通常带有一个或多个活性烷基，此基团能够转 移到其它电子密度高的分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基，从而在多方面改变 氢键的能力。e m s 诱变过程主要通过两个步骤来完成：首先鸟嘌呤的氧原子位置被 烷基化；然后在d n a 复制过程中，烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换， 即g ：c 变为a ：t 4 3 1 。 e m s 的诱变效应可用“两高一广 来评价，即：效率高、频率高、范围广。e m s 化学诱变产生点突变的频率较高，而染色体畸变相对较少，可以对作物的某一种特殊 性状进行改良。此外它可以产生范围较广的突变类型，如：转换、颠换等。 1 3 2e m s 诱变技术的关键及处理材料和部位的选择 确定合适的诱变剂量是诱变成败的关键环节。不同作物都有一定范围的适宜剂 量，在适宜剂量范围内，能更多的产生新的变异，保持原有的优良性状。在育种实践 中，一方面参考前人的育种经验，一方面通过试验摸索。常用临界致死剂量( 被诱变 生物体存活率为4 0 的剂量) 或半致死剂量( 被照射生物体存活率为5 0 的剂量) 4 4 - 4 6 o 诱变亲本材料的选择在诱变育种中有着重要作用。由于e m s 诱变育种的主要特点 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 是对少数不利性状进行改良，因此需要根据育种目标选用具有较好的综合性状、只需 进行少数性状改进的亲本作为材料，一般可选用当地推广的良种或育种高世代品系进 行诱变。此外，对诱变组织和器官的选择应以便于操作，并且使诱变因素发挥最大效 应为原则，一般可选用最容易处理、对诱变最敏感的部位进行诱变处理。针对诱变部 位的不同可采用以下几种具体的诱变方法。 1 3 2 1e m s 诱变种子技术 种子是最早也是最常用来作为e m s 诱变处理的材料。早在2 0 世纪6 0 年代，c o m u 等用e m s 水溶液处理感染小斑病的法国自交系种子，而后把m 3 代正在发芽的种子放 在小斑病菌液上生长，或用小斑病菌液喷洒幼苗，两个处理均筛选出了抗性个体【4 n 。 一般来说，e m s 水溶液处理种子受限制因素较多。包括：( 1 ) e m s 与水起作用产 生不起诱变作用但有毒的化合物：甲磺酸和乙醇，甲磺酸显著的引起植物损伤和不育； ( 2 ) 胚细胞在成熟的种子中被许多有生命的细胞包围，再加上细胞膜的双透性就阻 碍了e m s 进入胚细胞。为解决这一问题，现在多用一定p h 的磷酸缓冲液或者石蜡油 作为e m s 的溶解剂、此外种子处理易产生嵌合体，要筛选的诱变后代群体大显性突变 在m 2 代表现，隐性突变在m 3 代才能表现出来，得到稳定突变体所需的时间长【4 孓4 9 1 。 尽管e m s 种子诱变存在众多受限因素，也存在着对其他材料诱变所不具有的巨大 优势，种子作为最基本生殖器官，可以在诱变前后长时间保存自身活性以及诱变所获 得的变异基因，无需在无菌环境下操作，大大简化了诱变程序，虽然因存在滞后性， 一些性状差异需要在m 2 、m 3 代得以表达，但是经过几代的积累所能表现出来的变异 性状往往可以遗传，从而可以免去其后期相关不必要的鉴定程序【删。 1 3 2 2e m s 诱变小孢子技术 若想在较短的时间内快速获得纯系的理想突变体，单倍体的单细胞是最佳的诱变 对象。过去由于受技术条件的限制，特别是单细胞再生方面的困难，无法实施诱变和 选择，诱变育种多以种子作为处理对象。1 9 8 2 年l i c h t e r 等【5 l 】报道y d , 孢子培养的成功， 为实施单倍体的单细胞诱变创造了条件。国外首先开展了这方面的研究，1 9 8 9 年 s w a n s o n 等【5 2 用诱变小孢子的方法得到了耐受咪唑酮的甘蓝型油菜。在国内这一技术 也得到了发展，顾宏辉等【5 3 】对油菜离体小抱子诱变育种研究情况作了综述，指出用 e m s 诱变油菜小抱子的方法已获得抗除草剂突变体、脂肪酸突变体、硫贰突变体、抗 病突变体和优良农艺性状突变体等。 1 3 2 3e m s 诱变花粉技术 1 9 6 6 年人们发现玉米花粉可以在石蜡油中悬浮几个小时仍保持生命力，把它们涂 到花丝上，仍能正常授精结实。后来又进一步把化学诱变剂悬浮于石蜡油中，而后与 玉米花粉混合进行诱变，获得成功。经过不断改进和完善，现在这项技术已经成为玉 米诱变育种的主要手段 5 4 - 5 9 】。 4 e m s 处理诱发大白菜变异的研究 1 9 8 6 年，美国i c l 种子公司用e m s 的石蜡油溶液处理玉米自交系的成熟花粉 4 0 m i n ，在m 2 代用除草剂进行筛选，获得9 株抗除草剂普杀特( p u r s u i t ) 突变体，其 中反应最佳的植株可以忍受1 0 倍除草剂致死剂量，该基因为抗除草剂显性基因，命 名为i t ( i m a z e t h a p y rt o l e r a n t ) ，并申请专利保护，1 9 8 7 年该公司用此方法获得玉米 糯质突变3 个、甜质突变3 个，突变率均为o 1 2 。1 9 9 1 年i c i 公司首次推出含1 1 r 抗除草剂基因的玉米杂交种唧- 6 2 1 。因它不属于转基因玉米，不存在转基因产品的安全 性问题，所以市场反应良好。李海军【6 3 】利用e m s 石蜡油诱导玉米成熟花粉，后代按 照系谱法种植，经m l 、m 2 代选择和m 3 代田间鉴定，得到了早熟、晚熟和株型等有利 用价值的突变体。薛守旺畔】采用同样方法处理6 个稳定玉米自交系的成熟花粉，结果 得到浅黄粒突变体，母株穗发芽突变体，显性核不育突变体和甜玉米。 e m s 花粉诱变快速创造新种质这一技术较种子诱变获得的后代群体较大，世代 间容易区分，嵌合变异出现较少【9 1 。但是目前的有关这一技术的报道多为在玉米育 种中的应用，在其他作物中报道很少。 1 3 3e m s 后代突变体的筛选鉴定方法 e m s 诱变技术作为一种高效成熟的诱变方法使诱发突变的频率得到极大提高，如 何对突变进行快速有效地筛选鉴定成为诱变成功的关键因素。近年来e m s 诱变产生突 变体的鉴定筛选技术，在采用常规方法的基础上，一些与生物技术相结合的鉴定技术 得到新的发展，特别是随着分子生物学的发展，人们逐渐将从分子水平对变异体进行 早期鉴定，其中分子标记辅助选择技术具有准确、有效等优点，从而减少了选择群体 和缩短育种时间。目前常用的鉴定方法有：常规鉴定、分子标记鉴定、n i b s 鉴定鉴 定及以及其他鉴定方法。 1 3 3 1 常规鉴定 常规鉴定包括形态学鉴定、细胞鉴定等常规鉴定方法。对于表型变异较明显的突 变体，利用直观的形态学方法进行筛选鉴定是最简便有效的方法。经过诱变处理的种 子或营养器官所长成