（病理学与病理生理学专业论文）钙粘蛋白复合体成员在肺癌中的表达及调节机制研究.pdf

口三鼻 i = 1 习k l i i i ii ii ii il l li i ii ilu i y 1 8 9 3 4 2 1 一、 摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要7 二、英文缩略语1 5 三、论文 论文一 前言。1 6 日h 舌o 材料和方法1 7 实验结果1 8 讨论2 5 结论2 6 论文二 前言2 ”h u 舌z 材料和方法2 9 实验结果3 5 讨论4 4 结论4 6 四、本研究创新性的自我评价4 7 五、参考文献4 8 六、附录 综述5 2 在学期间科研成绩6 3 致谢6 4 个人简介6 5 中文论著摘要 钙粘蛋白复合体成员在肺癌中的表达及调节机制研究 刖昌 e c a d h e r i n 是一种介导同质细胞问相互粘附的c a 2 + 依赖性跨膜糖蛋白，主要分 布于上皮组织中，其基因c d h l 定位于染色体1 6 q 2 2 1 ，c d n a 全长4 8k b ，在胞质 内先合成1 3 5k d a 的蛋白前体，经剪切修饰成熟后转移至细胞膜发挥其生物学功 能。e c a d h e r i n 的胞外区是由5 个串联重复的结构单元构成，每个结构单元大约含 有1 1 0 个氨基酸残基，相邻的重复结构单元之问是c a 2 + 的结合位点，其中第一个重 复序列( 最外侧) 包含一个“组氨酸丙氨酸缬氨酸”( h a v ) 三肽的模体，它决定 着e c a d h e r i n 与同质细胞间的特异性识别和相互作用。跨膜区由3 2 个氨基酸组成的 疏水结构域。e c a d h e r i n 的胞内域含有s h l 和s h 2 区：s h l 区可以和p c a t e n i n ( 丫 c a t e n i n ) 直接结合；s h 2 区和p 1 2 0 c t n 结合，发挥调节粘附分子二聚体聚集和解离 的作用。目前的研究结果表明， i - c a t e n i n 和p 1 2 0 c a t e n i n 均为e c a d h e r i n 复合体的重 要调节蛋白，可以通过调节e c a d h e r i n 复合体的稳定性，进而调节细胞细胞间的 粘附。 根据剪切部位的不同，p 1 2 0 c t n 可以分为四种亚型，并且在哺乳动物的不同部 位的正常组织及肿瘤组织内，p 1 2 0 c t n 所表达的亚型不同，具有组织特异性。目前 的研究结果表明，p 1 2 0 c t n 在e c a d h e r i n 不同表达的情况下，会表现出截然不同的两 种生物学作用，目前，对于p 1 2 0 c t n 各亚型在肺癌组织中的原位表达情况及p 1 2 0 c t n 各亚型在e c a d h e r i n 存在或不完全缺失的状态下的作用的研究还未见到直接的报 道。 1 3 - c a t e n i n 既参d n e c a d h e r i n 复合体，又是w n t 信号通路中重要的信号传递子。 e c a d h e r i n 复合体与w n t 信号传导通路之间的相互作用，共同影响着肿瘤的发生发 展。在肿瘤的发生发展过程中常伴有w n t 信号通路的异常激活；并且e c a d h e r i n 异 常表达常与肿瘤细胞的低分化、高侵袭性、转移性相关。而在这一过程中b c a t e n i n 起到桥梁作用。但是在肺癌中，究竟是e c a d h e r i n 复合体还是w n t 信号通路发挥更 重要的作用，目前尚无定论。 本研究旨在讨论p 1 2 0 _ q e 型1 在8 3 例肺鳞癌、腺癌中的表达及其与预后等各临 床病理因素之问的关系，分析p 1 2 0 亚型1 的表达与，总p 1 2 0 c m 及e c a d h e r i n 表达之间 的联系和区别。 方法 l 、肺癌组织 8 3 例具有随访资料的原发性肺鳞癌、腺癌标本来自1 9 9 8 年2 月至2 0 0 0 年九 月在中国医科大学第一附属医院行外科手术切除的标本。其中男4 9 例，女3 4 例。 4 2 例新鲜肺癌组织来自中国医科大学附属第一临床学院2 0 0 8 2 0 0 9 年原发性肺癌 患者外科手术切除标本。患者的生存期的计算是从手术日期到随访同期，或由于 复发、转移而死亡的r 期为止。所有患者术前均未接受放化疗，术后常规化疗。 8 3 例具有随访资料的标本均经4 中性甲醛固定，石蜡包埋，h e 常规染色后明确 诊断。4 2 例新鲜肺癌组织一部分标本在切下后5 分钟内取材并迅速置液氮中速冻， 然后置于8 0 深冻冰箱保存备用，另一部分标本离体后用中性福尔马林固定。所 有标本的使用均征得了患者本人同意，签订知情同意书。 2 、免疫组织化学染色及结果判定 s p 染色试剂盒及d a b 显色剂购自福州迈新生物技术公司。单克隆抗体p 1 2 0 亚型1 ( 1 ：1 0 0 稀释，a b c a mc a m b r i d g em a ，美国) ，p a n - p 1 2 0 c t n ( 1 ：4 0 0 稀释， b dt r a n s d u c t i o nl a b o r a t o r i e s ，美国) ，1 3 - c a t e n i n ( 1 ：4 0 0 稀释，b dt r a n s d u c t i o n l a b o r a t o r i e s ，美国) ，e c a d h e r i n ( 1 ：15 0 稀释，s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ，美国) 4 c 孵育过夜。以正常支气管粘膜上皮细胞着色强度和定位为阳性对照，p b s 缓冲液 代替一抗为阴性对照。每张切片随机选取5 个高倍视野，每高倍视野计数1 0 0 个 瘤细胞，无着色为( 一) ，总p l2 0 c t n 、1 3 - c a t e n i n 和e c a d h e r i n ：膜着色清楚、连续 且阳性细胞数9 0 定义为正常表达；膜表达减弱、消失和或细胞浆核中出现 1 0 的阳性表达均视为异常表达；p 1 2 0 亚型1 ：细胞浆中表达 1 0 贝j j 为异常表达。 3 、细胞培养和5 - a z a d c 处理 2 人肺巨细胞癌p g 亚系b e i 细胞由北京医科大学惠赠，其余肺癌细胞系购自 中科院上海细胞所。细胞系培养于含1 0 胎牛血清，2 3 9 ln a h c 0 3 、l o o u m l 青链霉素的r p m i1 6 4 0 培养液中，每2 天用0 2 5 胰酶消化传代。5 - a z a d c 直接 加入培养基，终浓度7 1 x m o l l ，每天换液加药，继续培养4 8 小时。 4 、细胞免疫荧光染色 细胞爬片后，4 多聚甲醛室温固定，0 2 t r i t o nx 一1 0 0 处理1 5 分钟，l b s a 封闭3 0 分钟，滴加鼠抗人单克隆a n t i p c a t e n i n 抗体和a n t i e c a d h e r i n 抗体，4 c 孵育过夜，滴加t r i t c 标记羊抗鼠荧光标记二抗，稀释比例为l ：1 0 0 ，3 7 孵育l 小时，d a p i 核复染。荧光显微镜观察荧光信号，c o o l p i x5 4 0 0 照相机拍摄荧光 图片。 5 、r t p c r 采用t r i z o l 试剂提取肺癌组织或培养细胞的总r n a ，利用r n ap c rk i t ( a m v ) v e r 3 0 试剂盒进行反转录。以1 3 - a c t i n 为内参，1 3 - c a t e n i n 的p c r 扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳后，成像分析。 6 、w e s t e r nb l o t 将含8 0 p g 总蛋白的裂解产物进行s d s p a g e 电泳后，转印至p v d f 膜，单克 隆抗体1 3 - c a t e n i n4 c 孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗3 7 。c 孵育2 小时后d a b 或e c l 显色。 7 、甲基化特异性p c r 提取组织和细胞基因组d n a ，采用e zd n a 甲基化试剂盒一g o l d ( 北京天漠) ， 按照试剂盒说明书操作对基因组d n a 进行甲基化转变。取甲基化产物利用甲基化 引物和非甲基化引物进行p c r 扩增，p c r 扩增产物使用1 5 琼脂糖，1 2 0 v 电泳 3 0 m i n ，e b 染色，凝胶成像系统下观察。 8 、四甲基偶氮唑盐( t e t r a z o l i u m ，m t t ) 法检测细胞增殖能力 取对数生长期的肺癌细胞悬液( 细胞密度3 x 1 0 5 个m 1 ) 分别接种于4 个9 6 孔板培养板，每板分6 组：空白组( a ) ( b ) ，干扰对照组( c ) 、干扰组( d ) 、 3 抗体抑制对照组( e ) 和抗体移植组( f ) 。培养第2 4 、4 8 、7 2 小时分别加入m 1 v r ( 5 m g m 1 ) 2 0 1 ，继续孵育4 小时后，每孔加入1 5 0 1 x l d m s o 溶解结晶，选择波长 4 9 0 n m ，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。实验重复5 次。绘制细胞生长曲 线。 9 、体外基质胶侵袭实验( t r a n s w e l l ) 检测细胞侵袭能力 按照b d 公司说明操作，取1 0 0 p 1 细胞j 悬液( 5 x 1 0 6 个m 1 ) 滴入上室内，下室加入 含有1 0 胎牛血清的r p m i1 6 4 0 培养液，上下室之间用孔径为8 p m 的聚碳酸酯微孔 滤膜分开，将小室置3 7 * ( 2 ，5 c 0 2 条件下放置后，弃去上室内液体，擦尽膜上 m a t r i g e l 胶，1 0 0 甲醇固定3 0 分钟，常规苏木素染色，光镜下计数细胞数。 1o 、统计分析 应用f 和f i s h e r 检验对蛋白表达与组织学特征以及临床指标间的关系进行 统计学处理。所有统计学处理均采用s p s s 软件系统s p s sf o rw i n d o w s1 3 0 进行 统计学分析。 结果 1 、p 1 2 0 亚型l 与总p 1 2 0 c t n 和e c a d h e r i n 的表达模式不同，p 1 2 0 亚型1 的过表达总是与总p 1 2 0 c t n 的异常表达一致，并与e 。c a d h e r i n 的表达相关 免疫组化染色表明：在正常支气管上皮细胞中。总, p 1 2 0 c t n 和e c a d h e r i n 呈连续的 膜表达，同时也可以在近膜的胞浆内呈现弱阳性表达。而p 1 2 0 亚型1 在正常支气管 上皮细胞中不表达或仅呈胞浆内的弱表达，其胞浆弱表达的阳性细胞数 1 0 ，我们将这种异常表达定义为过表达，其过表达率为4 8 2 。 在8 3 例非小细胞肺癌组织中，已o , p 1 2 0 c t n 的异常表达率为6 9 9 ( 5 8 8 3 ) ，p 1 2 0 亚型1 的过表达率为4 8 2 ( 4 0 8 3 ) ，e c a d h e r i n 的异常表达率为7 2 3 ( 6 0 8 3 ) 。 当总p 1 2 0 c t n 的细胞膜表达明显减弱或缺失时，p 1 2 0 亚型1 在细胞浆中则表达增强， p 1 2 0 i l f 型1 过表达的4 0 例全部包含在总p 1 2 0 c m 异常表达的5 8 例中，换句话说，p 1 2 0 4 亚型l 过表达的4 0 例同时也具有总p 1 2 0 c t n 的异常表达。并且我们发现，在总p 1 2 0 c t n 在细胞膜上正常表达的2 5 例中，p 1 2 0 亚型1 也均为正常表达。在e c a d h e r i n 异常表 达的6 0 例中，有4 0 例的p 1 2 0 亚型l 为过表达，而在e c a d h e r i n 正常表达的2 3 例中， p 1 2 0 亚型l 也均为正常表达，在所有4 0 例p 1 2 0 亚型l 异常表达的病例中，e e a d h e r i n 均为异常表达。因此，我们认为p 1 2 0 亚型1 在细胞浆中的过表达总是与总p 1 2 0 c t n 和e c a d h e r i n 的异常表达相关。 2 、p 1 2 0 亚型l 在肺鳞癌、腺癌组织中的过表达与肺癌患者临床 病理因素相关，是影响预后的独立因素 我们对p 1 2 0 亚型1 在肺鳞癌、腺癌组织中的过表达与肺癌患者临床病理因素之 间的关系进行了统计学分析。结果显示，p 1 2 0 亚型1 过表达与淋巴结转移、低分化、 组织学类型和高级别t n m 分期正相关( 尸 0 0 5 ) 。绘制生存曲线，并将各临床病理 因素输入c o x 模型，分别采用e n t e r 法和f o r w a r ds t e p w i s el r 法分析( 表3 ) ，结果表 明：淋巴结转移情况、t n m 分期总p 1 2 0 c t n 的异常表达和p 1 2 0 亚型1 的过表达分别 为影响肺癌患者预后的独立因素( 尸 o 0 5 ) 。 3 、非小细胞肺癌组织中f i - c a t e n i n 启动子区c p g 岛存在高甲基化现 象，高甲基化可以抑制p c a t e n i n 的表达，并与其在细胞膜上表达的减 弱或缺失及肺癌患者的临床病理因素相关 m s p 检测4 2 例新鲜的非小细胞肺癌组织中p c a t e n i n 启动子区域c p g 岛的甲基化 情况。结果发现，在4 2 例癌组织中，有6 9 o ( 2 9 4 2 ) 的病例中b c a t e n i n 启动子区 域c p g 岛存在甲基化，明显高于癌旁正常肺组织内2 8 6 ( 1 2 4 2 ) 的甲基化率。 r t - p c r 检测m r n a 水平的变化，与癌旁正常肺组织相比，1 3 - c a t e n i nm r n a 表达水 平不变或升高的有2 2 例，其中d c a t e n i n 启动子区发生甲基化的占5 4 5 ( 1 2 2 2 ) ， 而p c a t e n i nm r n a 表达水平下降的有2 0 例，其中p c a t e n i n 启动子区发生甲基化却占 到了8 5 0 ( 1 7 2 2 ) ，二者具有明显的相关性( 氏o 0 5 ) 。统计学分析结果显示， 1 3 - e a t e n i n 启动子高甲基化与其在细胞膜上的表达减弱或缺失正相关( p 0 0 5 ) ，并 与肺癌患者的淋巴结转移、低分化和高级n t n m 分期正相关( p o 0 5 ) 。 5 4 、非小细胞肺癌细胞系中去甲基化处理可以恢复p c a t e n i n 的表达， e c a d h e r i n 膜表达不同的细胞系去甲基化后p c a t e n i n 的亚细胞定位及侵 袭能力的变化趋势不同 m s p 筛选人正常支气管上皮细胞系及5 种非小细胞肺癌细胞系中1 3 - c a t e n i n 启动 子区c p g 岛的甲基化情况。选择了p c a t e n i n 启动子区c p g 岛存在高甲基化现象的 s p c 和l t e 细胞系加入5 a z a d c 进行去甲基化处理。应用r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 检 测d c a t e n i n m r n a 水平及蛋白表达，发现去甲基化后，1 3 - c a t e n i n 无论在转录水平还 是在蛋白表达水平都有不同程度的恢复。免疫荧光及t r a n s w e l l 检测发现，在 e c a d h e r i n 无细胞膜表达的s p c 细胞系中，5 - a z a d c 处理后，f l - c a t e n i n 增多但位于胞 浆内，细胞的侵袭能力增强；而在e c a d h e r i n 存在膜表达的l t e 细胞系中，一c a t e n i n 增多并表达在细胞膜上，细胞的侵袭能力下降。 。 结论 1 、p 1 2 0 亚型1 在非小细胞肺癌的细胞浆内过表达，而且p 1 2 0 亚型1 在细胞 浆内的过表达与非小细胞肺癌患者的临床病理因素相关，并且p 1 2 0 亚型1 的过表 达常常与总p 1 2 0 c t n 和e - c a d h e r i n 的异常表达相关。同时，p 1 2 0 亚型1 在细胞浆 中的过表达还是非小细胞肺癌患者不良预后的标志，有可能作为非小细胞肺癌患 者预后判定的重要指标。 2 、在非小细胞肺癌中， ；- c a t e n i n 的细胞膜表达与e c a d h e r i n 的细胞膜表达具 有很好的一致性。在p - c a t e n i n 启动子区c p g 岛中，肺癌细胞存在高甲基化现象， 并且高甲基化抑制了1 3 - c a t e n i n 的表达，造成1 3 - c a t e n i n 表达下降，同时通过与钙粘 蛋白复合体间的相互作用，促进了非小细胞肺癌的侵袭转移能力。 关键词 非小细胞肺癌；p 1 2 0 c t n 亚型l ； i - c a t e n i n ；e c a d h e r i m 不良预后，侵袭和转 移 6 英文论著摘要 t h e s t u d y o fe x p r e s s i o na n d r e g u l a t i o nm e c h a n i s m f o rc a d h e r i n c a t e n i nc o m p l e xm e m b e r si nl u n g c a n c e r i n t r o d u c t i o n e c a d h e r i n c a t e n i nc o m p l e xi sc o m p o s eo fe c a d h e r i na n dc a t e n i n s e c a d h e r i n b e l o n g st oaf a m i l yo ft r a n s m e m b r a n ep r o t e i n sw h o s ep r i m a r yf u n c t i o ni st oe s t a b l i s h a n dm a i n t a i nc e l l c e l la d h e r s i o n t h eh u m a ne c a d h e r i n ( c d h 一1g e n e ，c h r o m o s o m e 1 6 q 2 2 1 ) i sa1 2 0 k dg l y c o p r o t e i na f t e rs p l i c e df r o map r e c u r s o ro f1 3 5 k d i tc o n s i s t s o f5c a d h e r i nr e p e a t s ( e c1 一e c 5 ) i nt h ee x t r a c e l l u l a rd o m a i n ，o n et r a n s m e m b r a n e d o m a i n ，a n da ni n t r a c e l l u l a rd o m a i nt h a tb i n d sp 12 0 c t na n d1 3 - c a t e n i n t h ei n t r a c e l l u l a l d o m a i nc o n t a i n sah i g h l y - p h o s p h o r y l a t e dr e g i o nv i t a lt o l b - c a t e n i nb i n d i n ga n d ， t h e r e f o r e ，t oe c a d h e r i nf u n c t i o n 1 3 - c a t e n i nc a na l s ob i n dt o0 【一c a t e n i n a - c a t e n i n p a r t i c i p a t e si nr e g u l a t i o no fa c t i n c o n t a i n i n gc y t o s k e l e t a lf i l a m e n t s i ne p i t h e l i a lc e l l s ， e - - c a d h e r i n - c o n t a i n i n g c e l l - t o c e l lj u n c t i o n sa l eo f t e na d j a c e n tt o a c t i n - - c o n t a i n i n g f i l a m e n t so ft h ec y t o s k e l e t o n b o t hp12 0 c t na n d1 3 - c a t e n i np l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h e r e g u l a t i o no fc a d h e r i n c a t e n i nc o m p l e xm e d i a t e dc e l l - c e l la d h e r s i o n p 12 0 c t ni sc u r r e n t l yc o n t r o v e r s i a ls i n c ee v i d e n c es u g g e s t st h a tp12 0 c t nc a nb o t h p o s i t i v e l ya n dn e g a t i v e l yr e g u l a t ea d h e s i v ea c t i v i t yo fc a n c e rc e l l s ar e a s o nf o rt h i s c o n t r a d i c t i o nm a yl i ei nt h ea l t e r n a t i v e l ys p l i c e di s o f o r m s t h e r ea r e4p12 0 c t n i s o f o r m si nm a m m a l s ，a n dd i f f e r e n to r g a n so rt i s s u e se x p r e s sd i f f e r e n tpl2 0 c t ni s f o r m s r e c e n tr e s e a r c hr e v e a l e dt h a tp12 0 c t ni n d u c e so p p o s i n ge f f e c t so nt u m o rc e l lg r o w t h ， d e p e n d i n go ne c a d h e r i ne x p r e s s i o n w h e ne c a d h e r i nw a sp r e s e n t ，e n d o g e n o u s p 12 0 c t ns t a b i l i z e se - c a d h e r i nc o m p l e x e sa n da c t i v e l yp r o m o t e st u m o r - s u p p r e s s i o nb y e - c a d h e r i n ；w h e ne - c a d h e r i nw a sl o s td u r i n gt u m o rp r o g r e s s i o n ，e n d o g e n o u sp12 0 c t n 7 p r o m o t e st r a n s f o r m e dc e l lg r o w t hb o t hi nv i t r oa n di nv i v o h o w e v e r , c u r r e n t l yt h e r e a r el i t t l ee v i d e n c eo ft h en a t u r eo ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np12 0i s o f o r me x p r e s s i o n a n de - c a d h e r i n ，a n dt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e ne x p r e s s i o no ft h e s ep r o t e i n sa n dt h e c l i n i c o p a t h o l o g i c a lp a r a m e t e r so fl u n gc a n c e rp a t i e n t s 1 3 - c a t e n i n i sam o l e c u l ew h i c hb o t hi n t e r a c tw i t he - c a d h e r i nt o r e g u l a t et h e c e l l a d h e r s i o na n dt r a n l o c a t et ot h en u c l e u sw h e r ei tb i n d st h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r st o a c t i v a t ew n t s i g n a l i n gp a t h w a y b u tt h ee v i d e n c eo f1 3 - c a t e n i no r i e n t e da b n o r m a lw n t s i g n a l i n gi nl u n gc a n c e ri sl e s sc o n c r e t et h a nt h a ts e e ni ng a s t r o i n t e s t i n a lm a l i g n a n c y i s t h ee c a d h e r i nc o m p l e xo rt h ew n ts i g n a l i n gp a t h w a yw h op l a y sm o r ei m p o r t a n tr o l e s i nt h ec a c i n o g e n e s i s ，p r o g r e s s i o n ，i n v a s i o na n dm e t a s t a s i si nl u n gc a n c e r ，t h e r ei sl e s s e v i d e n c e w eu s e da n t i b o d i e sd i r e c t e da g a i n s tp a n p12 0 c t n ，p12 0i s o f o r m1 ，a n de - c a d h e r i n t oe x a m i n et h e i r e x p r e s s i o n i n8 3 s q u a m o u s c e l l l u n g c a n c e r sa n d l u n g a d e n o c a r c i n o m a s a n di n v e s t i g a t e dt h ep r o m o t e rm e t h y l a t i o ns t a s u so fp - c a t e n i nt o d i s c u s st h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e np r o m o t e rm e t h y l a t i o na n dp - c a t e n i n ，e c a d h e r i n e x p r e s s i o n sa n dt h e i re f f e c tso nc l i n i c o p a t h o l o g i c a lp a r e m e t e r s a n du s e d5 - a z a d ct o e x a m i n et h ei m p a c t so fp - c a t e n i np r o m o t e rd e m e t h y l a t i o no nt h es u b c e l l u a rd i s t r i b u t i o n m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 、p a t i e n t sa n ds p e c i m e n s t h ep r i m a r yt u m o r ss p e c i m e n sw e r e f r o mp a t i e n t sw i t hl u n gs q u a m o u sc e l l c a r c i n o m a sa n da d e n o c a r c i n o m aw h ou n d e r w e n tc o m p l e t er e s e c t i o ni n t h ef i r s t a f f i l i a t e dh o s p i t a lo fc h i n am e d i c a lu n i v e r s i t yn o n eo ft h ep a t i e n t sh a dr e c e i v e d r a d i o t h e r a p yo rc h e m o t h e r a p yb e f o r es u r g i c a lr e s e c t i o n ，a n d a l lw e r et r e a t e dw i t h r o u t i n ec h e m o t h e r a p ya f t e rt h eo p e r a t i o n a m o n gt h e s es a m p l e s ，s o m ef r e s hs p e c i m e n s a n dc o r r e s p o n d i n gn o r m a lt i s s u es a m p l e sw e r es t o r e da t - 8 0 0 ci m m e d i a t e l ya f t e r r e s e c t i o nu n t i lt h ee x t r a c t i o no fp r o t e i na n dr n a 8 2 、i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t u d ya n dr e s u l ta s s e s s m e n t s t a i n i n gs c o r e sw e r ed e t e r m i n e db yt h ep e r c e n t a g eo fp o s i t i v ec e l l sp e rs l i d ef o r m e m b r a n o u sa n dc y t o p l a s m i cs t a i n i n gs e p a r a t e l y a sp r o p o s e dp r e v i o u s l y , n o r m a l e x p r e s s i o nw a sd e f i n e dw h e no v e r9 0 o ft h et u m o rc e l l ss h o w e dc e l lm e m b r a n e s t a i n i n go fp 12 0 c t n ，1 3 - c a t e n i na n de c a d h e r i n w h e nl e s st h a n9 0 o ft h et u m o rc e l l s w e r es t a i n e df o rp12 0 c t n ，p - c a t e n i na n de c a d h e r i na tt h ec e l lm e m b r a n e ，t h es a m p l e w a sl a b e l e dw i t h “r e d u c e dm e m b r a n o u se x p r e s s i o n ”w h e nm o r et h a n10 o ft h e t u m o rc e l l ss t a i n e df o rc y t o p l a s m i cp12 0 c t n ，p - c a t e n i na n de - c a d h e r i ne x p r e s s i o n ，t h e s a m p l ew a sl a b e l e dw i t h “e c t o p i cc y t o p l a s m i ce x p r e s s i o n ad e s i g n a t i o no fe i t h e r r e d u c e dm e m b r a n o u se x p r e s s i o n o r e c t o p i cc y t o p l a s m i ce x p r e s s i o n w a sd e f i n e da s a b n o r m a le x p r e s s i o no fp12 0 c t n ，1 3 - c a t e n i na n de c a d h e r i n 3 、c e l lc u l t u r e a l lt h ec e l l l i n e sw e r ec u l t u r e di nr p m i16 4 0m e d i u m ，c o n t a i n i n g10 f e t a lc a l f s e r u m ，10 0 i u m lp e n i c i l l i n ，a n d10 0 p g m ls t r e p t o m y c i n c e l l sw e r eg r o w no ns t e r i l i z e d c u l t u r ed i s h e sg l a s sa n dw e r ep a s s a g e de v e r y2d a y sw i t h0 2 5 t r y p s i n 4 、i m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n g a f t e rg r o w no ng l a s sc o v e r s l i p s ，c e l l sw e r ef i x e dw i t hi c e - 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c a t e n i n a f t e ri n c u b a t i o nw i t h p e r o x i d a s e c o u p l e da n t i - m o u s ei g ga t3 7 0 cf o r2h o u r s ，t h ep r o t e i n sw e r ev i s u a l i z e d u s i n gd a b e c l 7 、m e t h y l a t i o ns p e c i f i cp c r m s pw a sp e r f o r m e dw i t ht h ee zd n a m e t h y l a t i o nk i t g o l d ，a c c o r d i n gt ot h e m a n u f a c t u r e r si n s t r u c t i o n s 8 、3 一( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l 一2 - y 1 ) 一2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ( m t t ) a s s a y c e l lp r o l i f e r a t i o nw a se v a l u a t e de a c hd a yf o rf o u rd a y sa f t e rt h em t rt r e a t m e n t t h ea b s o r b a n c e ，w h i c hi sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h en u m b e ro fl i v i n gc e l l si nt h e c u l t u r e ，w a sm e a s