（生物化学与分子生物学专业论文）黄酒中抗氧化活性物质的研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要对黄酒的主要抗氧化活性成分，包括对酚类和肽类物质进行分离 和抗氧化活性的测定，并将其与从银杏中分离得到的多种抗氧化活性的物质进行 抗氧化协同作用的研究。 测定了黄酒中的多酚含量以及抗氧化性。大孔树脂分离黄酒中的总酚和多肽 物质，测定抗氧化性，分析表明黄酒的抗氧化性主要来源于其中含有的多酚物质， 也有一部分来源于多肽。对黄酒中丰要的三种丰要酚类( 儿茶酚，没食子酸，丁 香酸) 的抗氧化活性测定，表明这三种酚类都有很强的抗氧化性，是黄酒抗氧化 性的主要来源。通过大孔树脂，离子交换层析，凝胶过滤层析，反相层析，得到 两个具有一定抗氧化活性的多肽样品，分子量为6 0 0 d a 。氨基酸组成分析表明， 黄酒多肽的抗氧化性来源于肽链中的精氨酸，亮氨酸，赖氨酸等氨基酸。 以银杏种仁为原料，通过提取液浸取，硫酸铵沉淀，d e a e 一5 2 离子交换层析， m o n o q 离子交换层析，u l t r o g e l a c a 5 4 分子筛层析，获得一种有抗氧化活性的 蛋白e 1 。该蛋白经u l t r o g e l a c a 5 4 分子筛层析测定分子量为6 0 k d ，p a g e 鉴定为 单一条带。s d s p a g e 鉴定也为单一条带，亚基分子量约为1 0 k d ，初步推测该 蛋白为单一亚基组成，亚基数为6 个。此外，通过热水浸取，s e v a g 法去蛋白，乙 醇沉淀，d e a e 5 2 离子交换层析，u l t r o g e l a c a 3 4 分子筛层析，得到银杏种仁多 糖。该多糖具有一定的清除d p p h 自由基的能力。通过乙醇温育浸取，9 0 乙醇 沉淀，大孔树脂吸附，初步得到银杏种仁酚类乙醇提取物。该乙醇提取物具有很 强的清除d p p h 自由基的能力。 将黄酒的主要抗氧化成分与从银杏种仁中分离得到的抗氧化物质进行抗氧 化协同作用研究，结果表明。银杏种仁蛋白e 1 与儿茶酚，没食子酸，丁香酸有一 定的协同作用，p h 3 ，温度为6 0 时，反应体系的抗氧化性最好。反应时间对协 同作用影响实验表明e 1 使反应较为温和，抗氧化能力释放时间延长。 关键词：黄酒，银杏，抗氧化活性，分离，协同作用 摘要 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h ec o m p o n e n t sw i t ha n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yi ny e l l o wr i c ew i n e ， i n c l u d e d p o l y p h e n o l i c a n dp e p t i d e ，w e r ei s o l a t e da n d p u r i f i e d ，s y m e r g i s i t i e a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so fc o m p o n e n t sw i t ha n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yi s o l a t e df r o m g i n k g ob i l o b as e e dw i t ht h e mw e r ea l s or e s e a r c h e d t h ec o n t e n to ft o t a l p h e n o l i ny e l l o wr i c ew i n ew a sd e t e r m i n d e d t h e a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fy e l l o wr i c ew i n ew a sd e t e r m i n d e d r e s u l t ss h o w e dt h e m o s t l ys o u r c eo fa n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fy e l l o wr i c ew i n ew a sp o l y p h e n o l i ci n c l u d e c a t e c h i n ，g a l l i ca c i da n ds y r i n g i ca c i d t h ep e p t i d ei nt h ew i n ea l s oc o n s i d e r e d c e r t a i na n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y w i t ht h em e t h o d so f m a c r o p o r o u sr e s i nc h r o m a t o g r a p h y , i n o e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y , r e s e r s e dp h a s e c h r o m a t o g r a p h y , t w os a m p l e sw e r eo b t a i n e d m o l e c a l a rw e i g h to ft h e s et w os a m p l e s b ys e p h a d e xg - 10g e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yw a sa b o u t6 0 0 d a m i o na c i d a n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h es o u r c eo fa n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo ft h es a m p l e sw e r ea r g ， l e ua n dl y s a na n t i o x i d a n ta c t i v ep r o t e i nw a si s o l a t e df r o mt h eg i n k g ob i l o b as e e d sw a su s i n g a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a e 一5 2 ，m o n o q ， a n dt h e ng e lf i l t r a t i o no nu l t r o g e l a c a - 5 4 t h i sp r o t e i ng a v eas i n g l eb a n do np a g e a n ds d s - p a g e t h et o t a lm o l e c u l a rw e i g h to ft h i sp r o t e i ni s6 0 k d a n dt h e m o l e c u l a rw e i g h ti s10 k d a n dt h ep o l y s c c c h a r i d eo fg i n k g ob i l o b as e e dw a s i s o l a t e da n dp u n f i e db ye t h a n df r a c t i o n a t i o n ，d e p r o t e i np r o c e s s i n gw i t hs e v a g e m e t h o da n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , t h i sp o l y s c c c h a r i d eh a dt h ec a p a b i l i t y d p p hf r e er a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t y b ye x t r a c t i n gt h et o t a lp o l y p h e n o l sf r o m g i n k g ob i l o b as e e d ，w i t ht h em e t h o d so ft a k e i n ge t h a n o la sm e n s t r u u ma n di s o l a t i n g b ym a e r o p o r o u sr e s i n t h ea c t i v i t yo fa n t i o x y g e no fp o l y p h e n o l se x t r a c tw a sa l s o s t u d i e d t h es y m e r g i s t i ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so ft h ec o m p o n e n t si nt h ew i n ew i t ht h e e c t r a c tf r o mg i n k g ob i l o b as e e di m d i f e r e n td p p hs y s t e mw e r er e s e a r c h e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o t e i ne1a n dt h ep o l y p h e n o l i ci nt h ew i n ee x h i b i t i e d r e m a r k a b l ea n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n ds y n e r g i s i ee f f e c t t h eo p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o n so fs c a v e n g i n gd p p hf r e er a d i c a lw e r e ：p h 3 4 ，6 0 c k e y w o r d s ：y e l l o wr i c ew i n e ，g i n k g ob i l o b a ，a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y , i s o l a t i o n ， s y m e r g i s i t i ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y h 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：垂怒荛 e l 期： 丝! 工 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，- q - 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：重盘盘 导师签名：塑墨至 e l 期： 盘： ：1 l 第一錾绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 黄酒及其活性物质的研究现状 黄酒是中国历史上最悠久的传统酿造酒，是中国所特有的酒种，在世界酿造 史上也独树一帜。黄酒的酒体丰满，酒昧醇厚，酒性柔顺；并且以其美妙的色泽 而得名，以其丰富的营养独特的滋味而著称于世吖2 1 。由于黄酒酒精度较低， 耗粮较少等优点，是我国饮料酒发展的方向，黄酒越来越受到广大消费者的青睐。 相较于黄酒来说，国内外对葡萄酒和啤酒的研究起步早，研究也比较深入。 目前研究人员已对葡萄酒的抗氧化活性进行了较深入的研究，并证实葡萄酒中的 多酚类物质具有很强的抗氧化活性怕1 。葡萄酒中酚类物质对机体的抗氧化防御作 用主要是由于它特有的化学结构，酚羟基结构。酚羟基具有供电子作用，通过提 供活泼的氢捕捉机体内活性氧等自由基，阻断了自由基对机体的损伤。另外，葡 萄酒中酚类物质也具有络合过渡金属离子能力、激活抗氧化酶的活性、减少q 一 生育酚自由基及降低氧化酶活性的能力。在机理上，葡萄酒中酚类物质抗氧化作 用可归结两大方面，一是直接机理，即清除自由基作用：二是间接机理，即络合 过渡金属离子作用。研究发现红葡萄酒中的花青素能保护人体红血球不受氧化， 并具有高自由基清除能力。红葡萄酒中分离出的酚类组分能够抑制体内低密度脂 蛋白的氧化，能有效地抑制活性氧自由基的产牛h h6 1 。对于啤酒中抗氧化性物质 也有许多研究。啤酒中酚类化合物丰要有阿魏酸、香草酸、3 一羟基苯甲酸等，大 部分以结合态存在。g h i s e l l i 等研究表明啤酒中的多酚组分能够增强人体血浆抗 氧化性暗卜旧1 。曹炜等通过啤酒及其提取物对超氧阴离子自由基、羟基自由基和脂 质过氧化的抑制作用进行实验，研究表明啤酒及其酚类提取物具有较明显的抗氧 化作用，且啤酒的抗氧化作用大于其酚类提取物，这说明在啤酒中还可能含有其 他的抗氧化成分n0 | 。对于葡萄酒和啤酒抗氧化性的研究主要集中在多酚类物质的 抗氧化和清除自由基作用。 近来的研究表明了黄酒不但营养丰富，而且还含有许多功能性物质。目前对 葡萄酒等酒类研究开展的较为广泛，相对来说，作为我国传统酒类的黄酒研究的 较少，对其含有的功能性物质还有待进一步深入研究。 1 1 2 常规营养物质的研究现状 黄酒的营养价值及其突出的营养地位，主要体现在以下几个方面： ( 1 ) 氨基酸：黄酒中含有多种氨基酸，而且富含人体所需的八种必须氨基酸可 直接被肠、胃消化道吸收而进人血液。黄酒蛋白质含量为1 7 r a g 1 0 0 m l ，比啤 第章绪论 酒多4 2 5 倍，比白酒多7 0 ，黄酒中氨基酸含量为1 3 4 6 6 7 m g l o o m l ，比啤酒多 7 5 5 倍，比白酒多2 0 9 倍。氨基酸作为黄酒检测中的一个重要指标，一方面反 映出黄酒中总体氨基酸含量的水平另一方面酒中氨基酸含量高低揭示了不同原 料，不同的工艺对氨基酸含量的最终影响，同时氨基酸含量的高低也是鉴别黄酒 真伪的重要指标。 ( 2 ) 碳水化合物：黄酒中的碳水化合物基本上都是发酵所产牛的葡萄糖、果糖 等单糖以及麦芽糖、异麦芽糖、乳糖等低聚糖。它们可以直接被吸收到血液中并 运送到全身，直接产牛能量。其余部分以糖原的形式储存到肝脏和肌肉中，不易 使人发胖。黄酒的发热量约为8 5 k c a l l o o m l ，比啤酒多5 5 3 4 k c a l ，比白酒少 2 5 0 3 3 k c n ，是介于两者之间n 1 1 3 1 。黄酒中的糖分和其它营养要素均为牛命的燃 料，在体内消化吸收后，一能满足和供给人体组织细胞的能量需要；二能转化成 糖原储存在肝脏和肌肉中，以补充和平衡能量的需要；三能变成脂肪作为能量储 备起来1 4 3 。 ( 3 ) 维生素：黄酒中富含维生素。据相关的资料报道达六种。多数黄酒中含有 v b l 、v b 2 、v p p 等维生素。维牛索是维持身体健康所必须的有机化合物，它是蛋 白质、脂肪、碳水化合物代谢的催化剂，人体不能自行合成，必须从饮食中摄取， 而黄酒是酒类饮料中维牛素含量比较丰富的酒种，这和黄酒的原料和酿造工艺有 很大关系。维牛素在人体中需要量虽然很少，却在物质代谢中起着及其重要的作 用一。 1 1 3 生理活性物质的研究现状 1 1 3 1 降血压活性物质 近年来的研究表明，以数个氨基酸结合而成的低肽具有比氨基酸更好的吸收 性能，而且许多肽具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的牛理功能，如促钙吸收、 降血压、降血脂、镇静神经、免疫调节等功能。黄酒与啤酒、葡萄酒相比，有着 很高的含氮量，这些含氮物质在黄酒中丰要是以肽类和氨基酸等形式存在，而这 些肽类中不乏具有生理活性的肽，如降压肽等。血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b t i o n 。a c e ) 在。肾素一血管紧张素系统中对调节血压具有重 要的牛理功能。肾素作用于血管紧张素原放出非活性的血管紧张素，通过a c e 的作用生成具有血管平滑肌活性的血管紧张素，从而引起血压升高。降血压肽的 作用机理是通过抑f 1 l j a c e 的活性来实现降血压功能的7 卜u 引。 张蓉真引等最早对黄酒中的a c e 抑制活性肽进行研究，从福建老酒中分离 纯化出具有较强的a c e ( 血管紧张素转换酶) 抑制活性的肽。戴军等从绍兴黄酒 中的肽类组分中分离出一种a c e 活性抑制肽g l n s e r - g l y - p r o 制。 2 第章绪论 1 1 3 2 抗氧化活性物质 目前围内外对于葡萄酒、啤酒的抗氧化性的研究已相当深入。而对黄酒的抗 氧化活性研究甚少，除f e iq u e 瞄叫等曾对绍兴黄酒的总抗氧化 舌性和自由基清除 率等进行过分析之外，尚兀其它对黄酒抗氧化活性的研究。 黄酒中具有抗氧化活性的物质包括多肽，美拉德反应产物、酚类物质和矿物 质等。对抗氧化能力贡献最大的是多肽和酚类物质。 ( 1 ) 酚类物质 植物多酚的酚羟基结构( 邻苯二酚或邻苯三酚) 中的邻位酚羟基很容易被氧 化成醌类结构，消耗环境中的氧，同时对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力， 这使多酚具有较强的抗氧化性以及清除自由基的能力。 研究发现葡萄酒中抗氧化活性物质主要是多酚类物质陋吖22 】，啤酒中主要抗 氧化性物质有多酚乜3 1 、蛋白质等心4 。 就黄酒而言，是由大米、小麦原料等经过酶、曲等发酵陈酿而成，原料和 辅料中的酚类物质便容易溶于酒中瞳引。大米中的酚类主要为阿魏酸，香豆酸，咖 啡酸，榭皮素，丁香酸等，并且发现丁香酸是含量最高的一种酚类。在黄酒中的 酚类物质又与原料中的含量与种类有所不同，这与发酵的曲与工艺有关。黄酒中 丰要酚类物质有十种： 咖啡酸，丁香酸，芦丁，儿茶酚，儿茶素，没食酸，香草酸，香豆酸，阿魏酸， 榭皮素。酚类物质与黄酒的抗氧化能力高度有关乜6 1 。 ( 2 ) 肽类物质 作为抗氧化剂，蛋白质类物质中最有前途的当属肽类。肽类不仪在油溶体系 中有良好的增效作用，如双肽对q ，6 一生育酚有增效作用：而且在水溶体系、乳 化体系及- t - 燥体系中也有较高的抗氧化活性，构成肽的氨基酸种类、数量及氨基 酸的排列顺序决定着肽的抗氧化能力。一般说来，肽类的抗氧化能力大于氨基 酸。分子量在2 5 0 0 3 0 0 0 的肽类较理想，以a l a 为n 末端的双肽中，a l a - t y r ，a l a h i s 及a l a t r y 的抗氧化能力很强，其他双肽也都比构成它们的氨基酸的抗氧 化能力强口6 | 。 黄酒中含有大量的肽类物质，对黄酒的抗氧化性有很大的贡献。但是却没有 得到足够的重视，研究也很少。 1 1 4 黄酒中添加功能性物质的研究现状 向黄酒中添加合适有益的功能性物质，增加黄酒的营养和保健功能是现在研 究的热点。如在黄酒酿造结束时直接加入低聚麦芽糖或低聚果糖等制成双歧因子 保健黄酒。或者通过合理的改变黄酒原有的工艺，加入天然产物的有效成分，如 中药植物，来降低黄酒中乙醇对人体的危害，既不影响原来的风味，又增加了黄 酒的功能性成分。总之，向黄酒中添加合适有益的功能性物质可以有效的提升黄 第章绪论 酒的竞争力。 功能性黄酒在市场上总体还处于起步阶段，还需要解决一系列问题，如添加 物质的稳定性，对黄酒品质的影响等，这还需要更进一步的研究。 1 1 3 3 其它生理活性物质 ( 1 ) 功能性低聚糖 低聚糖或称寡糖，是由2 1 0 个单糖通过糖苷键的连接，形成直链或支链的 低聚合糖，主要分为功能性低聚糖( f u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e ) 和普通低聚糖两 大类。功能性低聚糖具有整肠、增强免疫力、减少血氨浓度、改善营养素的吸收、 改善便秘、抗龋齿等功能儿引。 黄酒中糖份含量随制造工艺改变和酒品种的不同有所改变。从绍兴酒中的糖 分组成看，葡萄糖是丰体，含量1 7 2 8 6 m g 1 0 0 m l - - 2 0 7 7 2 m g 1 0 0 m l ，占了糖分 组成的5 4 7 4 一6 6 6 2 ，其次是低聚糖、异麦芽糖和麦芽糖等八、九种糖，使 加饭酒略带甜鲜味。绍兴加饭酒中的低聚糖含量可以达至u 7 9 3 8 m g 1 0 0 m l ，可占糖 分的2 5 左右。谢广发等利用h p l c 分析出古越龙山酒中功能性低聚糖异麦芽糖、 潘糖、异麦芽三糖的含量各可达2 8 8 9 l 、2 9 7 9 l 、1 4 0 l ，其来源分两部分， 一是支链淀粉的酶解，古越龙山酒以糯米为原料，糯米中的淀粉几乎全部是支链 淀粉，淀粉酶对它的分支点不易切断，因而在酒中残留的分支低聚糖较多；二是 麦曲中微牛物分泌的葡萄糖苷转移酶通过转糖苷合成心7 h 2 剐。 ( 2 ) 丫一氨基丁酸 y 一氨基丁酸( g a b a ) 是一种天然存在的功能性氨基酸，其广泛分布于动植 物体内。它是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢 活动，具有很高的牛理活性。g a b a 对人体具有很好的降血压作用、可对抗多种 实验性心律失常、在神经系统的发育过程中有营养作用、治疗顽固性癫痫的特效 生化药物，其还能参与激素的分泌调节瞳叩叫3 2 1 。黄酒是以大米、小麦等为原料， 通过糖化发酵等工艺酿造而成，期间酵母菌、曲霉菌和乳酸菌等微牛物都能合成 g a b a ，谢广发等利用o p a f m o c 柱前衍生h p l c 法对古越龙山绍兴黄酒中 g a b a 含量进行测定。结果显示该酒中g a b a 含量为1 6 7 m g l 一3 6 0 m g l ，说明 古越龙山绍兴黄酒是一较理想的富含天然g a b a 的保健饮品。螂1 。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 机体氧化原理 氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质称活性氧( r o s ) ，它 们包括超氧负离子自由基( o 。2 ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 和羟基自由基( o h ) 等。存 在于生物体内活跃的r o s 可用电子自旋共振仪( e s r ) 测定。尽管活性氧的半衰期 4 第。章绪论 很短，但是它们可以与d n a 、蛋白质和多元不饱和脂肪酸( p u f a ) 作用，从而造 成d n a 链断裂和氧化性损伤、蛋白一蛋白交联、蛋白- d n a 交联和脂质过氧化。 其中脂质过氧化是造成牛物体氧化损伤的主要原因h 0 1 。p u f a 是生物膜组成的基 本元素，极易被r o s 引发的脂质过氧化所损伤，造成牛物膜结构和功能的破坏， 从而引起癌症、衰老、心血管疾病等慢性疾病h 吖4 3 3 。因此，抑制脂质过氧化已成 为生命科学领域的一项重要课题，并形成了自由基治疗学h 制。 1 2 2 生物抗氧化剂的种类以及作用方式 一切能够干扰自由基链反应中链引发和链增长过程，清除r o s 的化合物统称 为自由基捕获剂( s c a v e n g e r ) 或抗氧化剂( a n t i o x i d a n t ) 。从不同角度的对生物抗氧 化剂进行分类，可分为水溶性，如维牛素c ( v c ) 、谷胱苷肽( g s h ) 、吲哚类化合 物( i n d o l e s ) 、和儿茶酚类( c a t e c h o l s ) 等，和脂溶性抗氧化剂，如维牛素e ( v e ) 、 1 3 一胡萝卜素( 1 3 c ) 和牛物黄酮类化合物( b i o f l a v o n o i d s ) 等。又可分为捕获型( p r e v e n t i v ea n t i o x i d a n t s ) ，如超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 等和断链 型牛物抗氧化剂( c h a i n b r e a k i n ga n t i o x i d a n t s ) ，如v c ，v e 和多元酚类化合物等： 还可分为酶类，如s o d ，c a t 、过氧化物酶( p o d ) 等和非酶类抗氧化剂如( g s h ) 、 抗坏血酸盐( a s a 或v c ) 、v e 、类古月萝卜素( c a r ) 等。这些抗氧化剂丰要从深色 水果、蔬菜和果汁中获得，也有一小部分可以从牛奶和日常食用的脂肪、蛋黄和 海鱼中获得。 自1 9 6 0 年发现了清除超氧化物自由基的s o d 以来，已经证实，氧的某些代 谢产物如o 。2 ，h 2 0 2 和o h 等引起的细胞损伤过程是微粒体脂质过氧化和p u f a 氧化变性的主要原因h 5 卜6 1 。当p u f a 遭受到氧化损伤时细胞失去了完整性，破坏 了镶嵌于膜系统上的许多酶的空间构型，以至酶的孔隙扩大、通透性增加、出现 退行性变化，从而使内质网膜、线粒体膜、溶酶体膜等牛物膜系统的液体镶嵌状 态发生变化，导致广泛性损伤和病变7 1 。占当前医学研究领域前三位的肿瘤、冠 心病和衰老均与自由基引起的膜脂质氧化性损伤有关。牛物体内抗氧化剂通过捕 获或猝灭过氧自由基，抑制微粒体脂质过氧化和p u f a 的氧化变性，从而维持生 物膜的结构和功能的完整性，预防和治疗一些疾病h 踟1 4 9 1 。 有效抑制氧化是使用抗氧化剂目的所在，由于受自身结构及性质的影响，抗 氧化剂发挥作用的途径是有多样性的，其作用机理可以概括为以下四种： ( 1 ) 清除自由基 脂类化合物的氧化反应丰要牵涉到自由基的链反应，为了抑制氧化的进行， 除了隔绝空气和光线外，最有效的方法就是添加抗氧化剂。抗氧化剂在此起清除 自由基的作用，所以被称为自由基终止剂。多数抗氧化剂，包括日前常用的b h t 、 b h a 、t b h q 、v e 、t p 等都是有效的自由基终止剂，它们主要作为氢的给予体 第一章绪论 与脂类自由基反应，使自由基转变为非活性的或比较稳定的化合物，从而干扰或 延滞了链反应中的链增长，从而达到抑制氧化的目的埘1 ，其反应如下： r o + a h r o h + a r o o + a h r o o h + a a h ：抗氧化剂 a ：抗氧化剂供氢后自身形成的自由基 多酚类化合物与脂类自由基反应后形成的自由基稳定性比较高，原因是没有 成对的电子可以在苯环上离域分布嵋2 1 ，因此，有效的自由基终止剂必须具备的条 件为： a 能够迅速向脂类自由基提供氢原子。 b 新产生的自由基a 的稳定性要高于r 0 0 及r o 。 ( 2 ) 鳌合金属离子 许多氧化过程是在金属离子的参与下进行的。金属离子在价态发生变化过程 中起传递电子的作用，可缩短链引发期的时间，从而加快了脂类化合物氧化的速 度。因此，除去金属离子对抑制氧化反应显得十分重要。 柠檬酸、磷酸衍生物等能与金属形成惰性的0 一络合物，抑制了氢过氧化物 的分解，从而起到了抗氧化的目的瞄硼吖5 4 1 。据k a t h e r i n e l 等人报道，植酸与聚磷酸 钠可通过鳌合金属离子起抑制氧化的作用。金属离子鳌合剂通过鳌合引发链反应 的物质抑制自由基生成，不能直接与自由基结合，从而起到的间接抗氧化的作用， 因此单独使用时的抗氧化效果往往不佳，所以经常与其它抗氧化剂一起使用嫡5 1 。 ( 3 ) 清除氧 此类抗氧化剂丰要通过试剂本身的氧化还原反应来抑制氧化。如v c 由于分 子2 、3 位上存在两个相邻的烯醇式羟基，具有较强的还原性，可以有效地还原油 脂中的过氧化物，消耗油脂中的氧，从而抑制氧化反应的发生嘲h 5 7 1 。同样，亚 硫酸及其盐类在食品中易被氧化成磺酸及硫酸盐，因而能够起到抗氧化作用瞄引。 ( 4 ) 作用于与自由基有关的酶 抗氧化剂在体内可以抑制导致自由基产生的酶的活性，从而表现出抗氧化作 用。研究发现，棚皮素可抑制黄嘌呤氧化酶及细胞色素p 4 5 0 的活性，甘草次酸 由于能够抑制苯丙羟化酶而起到抗脂质过氧化作用陆引，黄皮酞胺抑制谷胱甘肽过 氧化酶活性训，t p 能够有效抑制细胞中n a d p h 细胞色素还原酶及细胞色素p 4 5 0 6 第。章绪论 的活性阳门吖6 2 1 。 1 2 3 天然抗氧化剂的研究现状 目前所分离得到的天然抗氧化剂的化学组成多集中在黄酮类，苯酚类，生物碱 类等物质，多糖，蛋白类的抗氧化活性也有报道。如人参多糖的免疫增强作用， 茶叶，银杏叶和竹叶提取的活性多糖的抗肿瘤作用，银耳多糖的保护肝脏细胞的 作用，芦荟多糖的抗肿瘤和抗艾滋病毒作用等，都与它们的抗氧化活性有密切的 关系呻踟叫6 4 1 。金樱子多糖具有明显的清除超氧阴离子自由基，抑制超氧自由基对 细胞膜的破坏而引起的溶血和脂质过氧化产物的产生，具有显著的抗氧化作用 哺。天然的蛋白类抗氧化剂比较少见，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，谷胱甘肽 过氧化物酶，谷胱甘肽还原酶等酶类作为内源性的抗氧化剂而存在于动物体内。 动物体内的肌球蛋白，血红蛋白一蛋白质复合物，胆红素( 血红蛋白衍牛物) 等 具有类似于过氧化物酶的作用m 引。保护蛋白是1 9 9 8 年首先从啤酒酵母中分离得到 抗氧化蛋白质哺7 1 。l i m 等于1 9 9 4 年从人红细胞基质中纯化出人红细胞保护蛋白 ( h r p r p ) 旧刖。2 0 0 1 年傅明辉研究了苦瓜籽蛋白的抗氧化作用阳9 j 。天然抗氧化 物质与人工合成的抗氧化剂相比，具有更高的安全性和营养价值。 1 2 4 抗氧化剂的协同作用 尽管使用一种抗氧化剂就可以阻止自由基氧化损伤，但不同抗氧化剂间的 平衡仍是重要的。最有前途的研究方向是多种抗氧化剂间的协同作用。协同作用 可补偿由于某种抗氧化剂缺乏造成的损害。实验证实，多种抗氧化剂协同抗氧化 效力远大于单独使用所产生效力的叠加。n i k i 等研究了豆卵磷脂水分散体系中 v e 和v c 的协同抗氧化作用，发现反应初期v e 的浓度基本不变而v c 浓度不 断降低，当v c 消耗完后，v e 的浓度开始下降h 引。李兆陇发现v e 和1 3 c 间存在 协同抗氧化作用是v e 和1 3 c 互相修复作用1 。v e ，v c ，1 3 c 着i g s h 等抗氧 化剂协同作用明显抑制口腔癌的牛成。p a l o z z a 和k r i n s k y 观察到1 3 c 和v e 混合比单一成分对于防止癌症的牛长和抑制早期恶性肿瘤更有效。n 1 。 由于协同抗氧化的过程比较复杂，目前人们对其机理的了解还不十分 透彻，总结已有的研究工作，协同抗氧化方式主要有以下三种。 ( 1 ) 再生抗氧化剂 有些抗氧化剂如v c ，辅酶o 等除了自身可直接作用于氧化过程外还可以与高 效抗氧化剂( 主要为v e ) 交换电子从而使v e 维持正常水平并不断发挥抗氧化作 用。如v e 与v c ，人们在抑制大豆磷脂的脂质体、鱼油、均相体系中亚油酸或亚 油酸甲脂的脂质过氧化等试验中，发现在反应初期v e 的浓度基木不变，而v c 的 浓度有所下降，待v c 完全消耗后，v e 的浓度开始下降。由此人们推n v c 可将 第一葶绪论 v e 自由基还原为v e ，从而提高溶液 v e 的有效浓度，增强了总体抗氧化能力； 同时v c 还可将脂类化合物的氢过氧化物分解成非自由基产物，所以表现出协同 作用。 r 。h r 。h 。 高0 0 4 0 0 2 0 051 01 52 02 5 3 03 5 洗脱体积m l 图2 1 4 组分c 的s e p h a d e x g 1 0 层析图 f i g 2 - 1 4s e p h a d e xg 一1 0d 哟m a t o g r a mo f e l u a t ec 峰液c 经s e p h a d e xg 1 0 分离后得到完全分开的两个峰，峰c 1 和峰c 2 。将 2 l 第二章黄洒中抗氧化活性成分的研究 收集的峰液调整浓度一致，以d p p h 法分别测定抗氧化活性，结果表明，峰c l 有比较明显的清除效果。 0 1 4 o 1 2 o 1 0 0 8 n 言0 0 6 o 0 4 o 0 2 0 o 5 洗脱体积m l 图2 - 1 5 组分a 的s e p h a d e xg 1 0 层析图 f i g 2 - 15s e p h a d e xg - 10c h r o m a t o g r a mo fe l u a t ea 峰液a 经s e p h a d e xg 1 0 分离后，有两个分离不完全的峰，记为a l 和a 2 。收 集峰尖部分备用。 将收集的峰液调整浓度一致，以d p p h 法分别测定抗氧化活性，结果表明， 峰a 2 有比较明显的清除效果。 将收集的组分进行下一步分离。 2 3 4 4 反相层析分离肽类物质 反相层析是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相间相互作用力大小 与溶质分子极性基团与流动相中极性分子在相反方向上相互作用力大小的差异 进行分离。由于通过上述的方法进行分离后，肽类的浓度已经很低，无法测出明 显的抗氧化活性，所以收集各个样品中的丰要成分以备实验。 ( 1 ) h e l p 反相层析s o u r c e 5 r p cs t 4 6 5 0 层析： 第二章黄洒叫t 抗氧化活件成分的研究 o 0 7 0 0 6 0 0 5 o0 0 4 n n o0 0 3 0 0 2 0 0 l 0 o1 02 03 04 05 06 0 时问( m i n ) 图2 1 6 组分c 1 的反相层析 f i g 2 - 16s o u r c e5 r p cc h r o m a t o g r a mo ft h es a m p l ec l 1 0 0 6 0 4 0 2 0 o 如图2 1 6 ，组分c 1 经反相层析，在流动相b 浓度约为6 0 时得到一个丰要 的组分，此外，还有三个比较小的洗脱峰，由于浓度较低，收集主要的洗脱峰， 记为c 1 2 。 0 0 6 0 0 5 0 0 4 o 銎0 0 3 3 o 0 2 o 0 1 o a 2 - 厂一 。 ? 。弋jk i 0 1 0 2 03 04 05 06 0 时问( m i n ) 图2 - 1 7 组分a 2 的反相层析 f i g 2 - 17s o u r c e5 r p cc t u o m a t o g m mo ft h es a m p l ea 2 1 0 0 8 0 6 0 b 4 0 2 0 0 如图2 1 7 ，组分a 2 经反相层析，在流动相b 浓度约为4 0 时得到一个主要 的组分，收集丰要的洗脱峰，记为a 2 2 ，备用。 2 3 第二章黄酒中抗氧化活性成分的研究 能够被反相层析柱吸附的物质都是具有一定的疏水性的，对于肽来说，说明 其中氨基酸组成中有疏水性的氨基酸，比如p r o ，p h e ，x y r 。一般来说，含巯基 的氨基酸具有较强的抗氧化性，如半胱氨酸。而组氨酸及其衍牛物的抗氧化活性 主要是由于分子中咪唑基部分。色氨酸及其衍牛物的抗氧化活性是由于其吲哚基 结构。而肽类的抗氧化活性与其氨基酸组成和排列顺序有关，一般来说，肽类的 抗氧化能力大于氨基酸。 ( 2 ) h p - h i c 将反相制备层析得到的两个样品进行h p h i c 分析，如下图： 图2 1 8c 1 2 的h p h i c 图谱 f i g 2 - 1 8s b c 1 8c h r o m a t o g r a mo f c l - 2 图2 1 9a 2 2 的h p - h i c 图谱 f i g 2 19s b c18c h r o m a t o g r a mo fa 2 2 2 4 第二章黄洒l f j 抗氧化活忭成分的研究 图中负峰为2 2 0 n m 下的溶剂峰。从图2 1 8 中可以看出，样品c 1 2 经s o u r c e 5 r p cs t 4 6 5 0 层析后，主要有三个组分，其中丰要组分在4 8 分钟时被洗脱下 来。从图2 1 9 中可以看出，样品a 2 2 经反相s o u r c e5 r p cs t 4 6 5 0 层析后， 丰要有两个组分，且穿透峰较大，分离效果不是很理想。由于肽类组份没有完全 分离开，无法进行更进一步的鉴定。初步确定为分子量都为约6 0 0 d 的小肽。 2 3 4 5 肽类物质的氨基酸组成分析 将经h e l p 反相层析后的样品进行氨基酸组成分析。 姗： 笛； 踌 帕 盘 吉 需蕊 ： ；， 暑塔惫 爨妻 1 0佰 巧一 图2 2 0e 1 2 的氨基酸组成 f i g 2 - 2 0a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fc 2 1 嚣兰拿詈l ： 季睁 蓥嘲争i淄 图2 2 1a 2 2 的氨基酸组成 f i g 2 - 21a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no f a 2 2 ， 一 一 一 ，i _一曲套oor_ 一 ，卫1-竹h8一 j： ”j“，o 狮 仔 5 o 嘲 。邑峤ol-n(1r f 为 ! i 一 |i坎并一“!| ，卫non 一， 。韶篓一 _1_ 4j_一_?0 帆咖 瑚 湖 啪 枷 湖 狮 伽 。 第二章黄酒巾抗氧化活性成分的研究 表2 - 2 样品c 1 2 中氨基酸组成 t a b 2 2a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fs a m p l eel 一2 表2 - 3 样品a 2 2 中氨基酸组成 t a b 2 - 3a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fs a m p l ea 2 - 2 样品a 2 2 的 氨基酸种类 含昔 ( ) a r g a l a l e l l p r o 4 2 4 7 0 1 4 8 6 4 1 0 0 5 具有抗氧化性的氨基酸已用粗体表示 氨基酸组成分析结果表明，样品c 1 2 中主要氨基酸a l a ，而具有抗氧化活性 的氨基酸为a r g ，l e u ，l y s ，占含量的1 1 左右。而样品a 2 2 中a l a 的含量为7 0 ， 具有抗氧化活性的氨基酸为a r g ，l e u ，只占1 2 。有可能这些小肽都是以a l a 为主， 上述具有抗氧化活性的氨基酸有疏水性氨基酸和碱性氨基酸。此外，对a c e 活 性肽的研究表明，肽c 末端的p r o ，t y r 或序列中含有的疏水性氨基酸是其活性所 必需的。从氨基酸组成来看，两个样品中都含有疏水性氨基酸，样品a 2 2 中还 含有较高含量的p r o 。至于其具体组成还有待进一步研究。 2 4 本章小结 ( 1 ) 分析了黄酒中的抗氧化活性与成分，黄酒具有较高的抗氧化活性。经大孔 树脂分离分析了酚类对黄酒总抗氧化活性的贡献度。结果表明酚类是黄酒的抗氧 化活性的丰要来源。此外肽类物质也有一定的抗氧化活性。 ( 2 ) 经过大孔树脂，离子交换层析，反相层析，分离到黄酒中具有抗氧化活性 的肽类组分。氨基酸组成测定表明，其中含量最高的氨基酸为a l a ，抗氧化活性 主要来源于其中的氨基酸a r g ，l e u ，l y s 。 第二章银杏种仁- i ，抗氧化活性物质的初步提取 第三章银杏种仁中抗氧化活性物质的初步提取 3 1 前言 目前，广泛使用的是人工合成的抗氧化剂，其中比较常见的包括b h t ，b h a ， p g 等。但是，一些人工合成抗氧化剂的安全性受到怀疑。如在食品工业使用广 泛的b h t ，b h a 和p g ，虽然有较好的抗氧化活性，但是有研究表明，这些抗 氧化剂有不同程度的致癌和毒副作用。从天然产物中提取抗氧化物质，具有较高 的安全性，正成为研究的热点。本章内容主要是通过对银杏种仁中的蛋白质，酚 类物质，多糖进行初步提取和抗氧化性分析。为研究黄酒中抗氧化有效成分和银 杏种仁中抗氧化成分的协同作用，也须提取银杏种仁中抗氧化效果较好的成分以 供实验。根据已有的报道，银杏种仁中含有多种抗氧化活性成分，包括蛋白质， 酚类物质，多糖等。本章通过对银杏种仁中抗氧化活性较高的成分的提取，为下 一步实验做准备，同时也对银杏种仁的抗氧化活性成分进行初步研究。 3 2 材料与方法 3 2 1 主要实验材料 银杏种仁市售 二苯代苦味酰自由基( d p p h )s i g m a 公司 福林试剂 自制 其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。 d e a e 5 2 离子交换纤维素a m e r s h a m 生物有限公司 m o n o q 离子交换p h a r m a c i a 公司 u l t r o g e l a c a 5 4r e a c h f si b f 公司 标准分子量蛋白上海博亚牛物有限公司 考马斯亮蓝r 2 5 0上海牛工 大孔树脂d 1 0 1西安蓝晓科技有5 6 5 公司 其他试剂均为国产分析纯。 3 2 2 主要实验仪器 d s 1 型组织捣碎机 h i t a c h i 高速离心机 z h d a