（生理学专业论文）哺乳动物超数排卵和卵母细胞的生发泡互换研究.pdf

摘要 一、家猫的超数排卵及卵母细胞的体外成熟 对家猫超数排卵( s u p e r o v u l a t i o n ) 、卵母细胞的体外成熟( i nv i t r o m a t u r a t i o n 。i v m ) 、孤雌激活( p a r t h e n o g e n e t l s ) 进行了研究，结果表明：f s h h c g 法平均超排卵数( 9 1 5 枚只) ，显著多于p m s g h c g ( 5 2 8 枚只) 法( p o 0 1 ) ，阴 道刺激对猫超排有显著促进作用；t c m 1 9 9 + 1 0 f c s + p m s g 对家猫卵巢卵 母细胞进行体外成熟培养，其成熟率为7 8 9 ( 1 1 6 1 4 7 ) ，显著高于在 t c m 1 9 9 + 1 0 f c s中的成熟率4 8 8 ( 6 6 1 3 5 ) ( p 0 0 1 ) ；采用 0 5 k v c m ，1 0 k v c m 和1 5 k v c m 三种直流电压以相同的脉冲时间4 0 p s ，脉冲 次数3 次对猫卵进行孤雌激活，1 5 k v c m 的电压对猫卵激活率( 8 8 7 ) 显著高 于1 0 k v c m ( 6 2 2 ) 和0 5 k v e m ( 4 5 4 ) 的激活率( p o 0 1 ) 二、兔初级卵母细胞生发泡移植方法的研究 本文共收集g v 期卵母细胞9 8 7 枚，g v 互换成功率2 7 6 ( 2 7 2 9 8 7 ) ，融合 率为8 4 6 ( 2 3 0 2 7 2 ) ，重构卵的成熟率( 排出第一极体) 7 7 4 ( 1 7 8 2 3 0 ) 。 经i c s i 后，受精率为7 0 8 ( 1 2 6 1 7 8 ) 。这些结果说明，显微操作和电融合过 程并没有影响移植后的g v 卵的成熟发育，也不影响作为受体的卵胞质的形态 结构，从而证明对兔初级卵母细胞进行生发泡互换是可行的。 三、 兔生发泡移植的重构卵经显微受精后产仔 本文以兔为实验动物模型进行g v 互换。当进行同卵或异卵g v 移植时， 有约8 0 的重构卵成熟至m i i 期。将这些成熟的重构卵进行显微受精( i c s i ) 时，有7 1 - 9 4 的胚胎发育到囊胚。将9 3 枚受精卵移植到6 只受体母兔后，获 得2 只仔兔，这是世界上首批通过g v 互换、体外成熟和i c s i 后，经胚胎移植 获得的动物。 关键词：家猫，超数排卵，体外成熟，孤雌激活，家兔，生发泡， 生发泡移植，胞质内精子注射 a b s t r a c t 1 s u p e r o v u l a t i o na n d 砌v i t r o m a t u r a t i o no fd o m a s t i cc a t s u p e r o v u l a t i o n ，i nv i t r om a t u r a t i o na n dp a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n o fd o m e s t i cc a to o c y t e sw e r es t u d i e d 。t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta na v e r a g e 9 15 e g g sw e r eo v u l a t e db yt h em e t h o do ff s h h c ga d m i n i s t r a t i o n ， e v i d e n t l yh i g h e r t h a nt h a to b t a i n e d b yi n j e c t i n gp m s g h c gf 5 2 8 ) s t i m u l a t i o no fv a g i n ap r o m o t e dt h es u p e r o v u l t i o ns i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) t h em a t u r a t i o nr a t ei nv i t r oo fd o m e s t i cc a t o v a r yo o c y t e s i n t c m - 1 9 9 + 1 0 f c s + p m s gw a s7 8 9 s i g n i f i c e n t l yh i g h e r t h a nt h a t i nt c m - 1 9 9 ( 4 8 8 ) + 1 0 f c s ( p 2 m m 的卵泡卵。其操作方 法为，将实验猫麻醉，将4 c m 长的针自腹部正中插入腹腔，在腹腔镜的引导 下，找到一侧卵巢，吸取表面的卵泡，将内容物全部吸出，当卵泡被吸出后， 将针自腹腔抽出，把抽得的内容物释放到培养皿中。同样，将另一侧卵巢的卵 泡抽出。将舜拣出后，根据卵的形态及其周围的卵丘缨胞情况评价卵的质量及 其成熟状态。如卵的放射冠及卵丘细胞已经松散并且扩展开，则认为卵已经成 熟。如果卵外有紧密的放射冠、卵丘细胞仍然很致密，则是不成熟的，需经过 体外成熟培养才能进行受精【7 l o 卵母细胞的另一类来源是当地宠物诊所。将因作绝育手术或因病作卵巢切 除手术所得的卵巢放入含1 0 0 i u m l 青霉素钠和o 1 m g m l 链霉素的1 5 m lp b s 液中直接送回实验室( 4 。c 可保存2 4 h ) ，从卵巢表面抽出卵泡，进行体外成熟 培养【1 3 1 【3 2 l 【3 3 1 。只有卵艟质均匀、卵丘细胞完整的卵母细胞才麓用于i v m 2 2 卵巢卵母细胞的分类 w o o d & w i l d t 3 4 1 将抽取的猫卵巢卵母细胞分为4 级。i 和i i 级具有均匀的 黑色胞质和可辨别的生发泡；i 级有5 层及5 层以上的卵丘细胞，i i 级卵丘细 6 胞不足5 层。i i i 级和级部分胞质退化或呈嵌合式碎裂，部分或全部卵丘细胞 缺如。在所收集的1 7 3 9 枚卵中，只有1 2 3 是i 级卵泡卵。i 级卵泡卵的i v m 和i v f 率分别为5 9 3 和2 9 7 ，i i 级为3 2 4 和1 1 6 ，i i i 级为2 1 9 和5 1 。 有2 4 4 的i 级卵在f 后发育到囊胚，而i i 级卵的囊胚率只有5 3 。 2 3 i v m 成熟培养液为d m e m ，即含e a r l e盐的m e m 和碳酸氢盐缓冲的缓冲液， 2 0 m m 0 1 l 谷氨酰胺，0 1 m m o i l 丙酮酸，0 4 b s a ，1 0 0 i u m l 青霉素，0 1 m g m l 链霉素和o 2 m g m l 新霉素，1 p 咖lf s h ，2 斗g m ll h ，1 g m l1 7 一b 雌二醇i ”j 。 5 0 - - 1 0 0 p l 液滴中含1 5 2 0 枚卵，在3 8 。c 、5 c 0 2 中培养2 7 2 9 h i 州。培养 液中b s a 的存在似乎比f c s 的存在更有利于卵的成熟；然而当f s h + l h + 1 7 - b 雌二醇存在时，f c s 的加入可提高i v f 率和卵裂率。f c s 可以通过抑制透明带 硬化而提高i v f 。s c h r a m m & b a v i s t e r 【2 5 】认为促性腺激素和催乳激素对猫卵母细 胞的核质成熟具有显著促进作用。 ( 二) 生发泡互换研究进展 1 哺乳动物年龄与卵母细胞质量的关系 哺乳动物出生前后，卵原细胞停止增殖，卵母细胞进入第一次减数分裂前 期，成为初级卵母细胞。之后，经细胞期、偶线期、粗线期发育到双线期。在 双线期的后期时，染色质高度疏松，外包完整的核膜，称为核网期( d i c t v a t e s t a g e ) ，此时的细胞核又称为生发泡( g e r m i n a l 诂i c l e ，o v ) 。在不同动物，卵母 细胞将在这一时期休止数日至数年不等。性成熟后，在促性腺激素或其他因子 的作用下，这些初级卵母细胞，才有可能恢复减数分裂，发生发生泡破裂 ( g e r m i n a lv e s m eb r e a k d o w n ，g v b d ) ，排出第一极体，并发育到第二次减数分 裂中期( m i i ) ，卵母细胞从卵巢释放。卵母细胞的成熟，包括细胞质成熟和细 胞核成熟，两者对卵母细胞完成受精和发育，起关键作用【9 】。然而，有些卵 母细胞虽然完成核成熟，但其受精后却不能发育到囊胚，或即使可以进行早期 胚肥发育，却不能发育到期【9 1 。其主要原因是细胞质未能完全达到成熟状态或 处于过成熟状态。研究表明，卵胞质中的一些因子，在卵母细胞减数分裂、受 精和早期胚胎发育过程中，起极为重要的作用1 6 1 。不同种类的雌性动物，均有 最佳的繁殖年龄，在这一年龄段内，所生后代的绝大多数是健康的，但在这一 区段之外进行繁殖，动物的发育率下降，流产率升高、所生后代的遗传疾病发 病率，有增长的趋势。卵母细胞在早期胚胎发育时期就已经进入并停滞在第一 次减数分裂前期的双线期。进入繁殖年龄后，也只有很少数的卵母细胞被排出， 有机会受精和繁殖后代。而当进入生殖年龄后期( 如超过4 0 岁的妇女) ，此时排 出的卵母细胞是已经等待4 0 年或更长时间才得以完成第一次减数分裂发育而来 的。而此时机体内分泌或卵巢内分泌环境并不是卵母细胞生长和成熟所需的最 佳状态，这就有可能造成卵胞质的缺陷，引起受精后胚胎发育失败。 2 高龄妇女不孕与卵母细胞质量的关系 随着人们生育观念的改变，生育年龄逐渐升高，4 0 岁左右才开始生育的妇 女人数越来越多。这部分人的不育率很高，如何改良其卵母细胞的质量，满足 她们的生育需要，得到健康的后代，已经成为人类生殖和优生优育领域探讨的 热门课题之。有资料表明，妇女发育年龄的增大对生育功能有显著影响。 超过4 0 岁的妇女的生育能力大为降低。研究表明，许多大龄生育妇女的不孕， 主要归因于卵母细胞的质量，而不是子宫环境问题。她们的卵母细胞或卵巢细 胞的线粒体d n a ，可能有不同程度的“缺失” 1 5 1 , 线粒体氧化磷酸化的能力发 生改变”o 】。而母性来源的线粒体缺陷，如果在后代卵巢或睾丸上表达，则会导 致后代不育1 9 1 。染色体不成对的几率，或者染色体断裂的几率 2 1 都随年龄的增长 而增加，而染色体的不成对，引起了约6 0 的自发流产1 2 l 。这些染色体异常，可 能都是因为卵母细胞在减数分裂过程中，染色体分离异常所致。 3 改良卵母细胞质量的途径 人们主要通过两种途径来改良卵母细胞。第一种是将年轻妇女卵母细胞的 细胞质，交换给较大年龄妇女的卵母细胞，再通过正常的体外受精( i v f ) 进行 受精【2 j 。最近，胞质移植被用于提高卵母细胞和胚胎的质量【2 】，但是在胞质移植 过程中只能有极少量的胞质被移植到受体卵母细胞中，胞质移植所带来的线粒 体数也十分有限，所以胞质移植究竟可在多大程度上改善卵母细胞的质量，并 不清楚。而将高龄生育妇女卵母细胞的生发泡移植到年轻妇女的去生发泡的卵 胞质内，即将患者的初级卵母细胞的核置换到去核的优良卵胞质中，有可能最 大限度的解决细胞质成熟不良问题，以达到改良卵母细胞的目的。在迸行临床 大限度的解决细胞质成熟不良问题。以达到改良卵母细胞的目的。在进行临床 试验之前，必须建立合适的动物试验模型，探讨与此相关的问题。 4 生发泡互换研究现状 l i u h 等人【1 7 】将小鼠的o v 进行自卵和异卵的互换，有4 0 7 0 自卵g v 互 换和9 5 1 4 4 异卵g v 互换的重构卵发育到m i i 期的小鼠卵中，只有极少数的卵 发生了g v b d ( 5 3 0 ) ；而且，没有卵发育到m i i 期z h a n gj 等人1 3 5 1 将老年妇女( 大 于3 8 岁) 的生发泡移入到年轻妇女( 小于3 1 岁) 的g v 期胞质中。重构成功1 2 枚， 有7 枚发育到m i i 期，和对照组无显著差异，嗽e 岫it 等人【2 8 1 对小鼠的生发泡 进行卵互换，有9 2 9 的卵互换成功，成功互换的卵有9 2 3 排出第一极体，并 且比较移入的不同体积的g v 核体( g v - k a r y o p l a s t s ) 与g v b d 发生率的关系，结 果发现，培养2 4 小时以后，大于直径4 0 u r n 的g v 核体重构后，生发泡有1 0 0 破裂， 有3 0 - 4 0 1 a m 和小于3 0 p r o 的只有5 2 6 和9 1 j a c q u e sc 等人【1 4 】将供卵者的部分卵胞质吸出，保证被吸出的胞质为完整 的，放入己吸出部分胞质的病人的卵周隙中，将供卵者的胞质用电融合的方法 融入病人的卵中，完成部分胞质替换或者直接用胞质内精子注射针互换部分胞 质，不需要电融合步骤。结果发现，通过注莉进行胞质互换的卵的受精率为6 3 受精卵移植后，有2 例怀孕，1 例产下健康婴儿，1 例流产通过融合的方法的受精 率为2 3 ，受精卵移植后没有着床 二、实验目的和意义 本论文研究了家猫超数排卵，卵母细胞的体外成熟、电脉冲孤雌激活家 猫卵母细胞的较适合条件。在兔生发泡互抉研究时，从实际操作中总结了较 为实用的显微注射方法。并获得世界首例生发泡互换后经显微受精的两只仔 兔，建立了兔生发泡互换模型，可能为解决高龄生育妇女因卵母细胞质量问 题而导致的不育症提供理论和实践依据。 9 材料与方法 一、材料 l 仪器 1 e g 4 0 0 型磨针仪日本n a r i s i g e 公司 2 m f 9 0 0 型煅烧仪日本n a r i s i g e 公司 3 p u l - 1 型拉针仪日本n a r i s i g e 公司 4 e c m 2 0 0 型电融合仪美国b t x 公司 5 g b b l 6 型培养箱德国h e r e a u s 公司 6 o p t o n 显微操作仪德国e p p e n d o r f 公司 7 洁净工作台北京半导体设备一厂 8 m - 4 0 0 型体积镜日本n i k o n 公司 2 试剂 电融合液 配方：d - 甘露醇0 3 m ，c a c l 2 2 h 2 0 ，o 0 5 m m ，m y s 0 4 6 h 2 00 1 m m ，h e p e s 0 5 m m b s ao 0 5 胎牛血清( f c s )购自s i g m a 公司 t c m 1 9 9 培养液购自s i g m a 公司 f s h购自中国科学院动物所 h c g 购自中国科学院动物所 p m s g 购自中国科学院动物所 i b m x 购自s i g m a 公司 b s a 购自s i g m a 公司 h e p e s 购自s i g m a 公司 培养液 购自s i g m a 公司 细胞松弛素b 购自s i g m a 公司 3 实验动物 选取外观健康，性成熟的家猫( f e l l sl i b y c ad o m e s t i c a ) ，体 重为2 5 4 5 公斤，单笼饲养，饲喂猫粮，鱼等。 1 0 选取外观健康，性成熟的日本大耳白( j a p a n b i g e a r e dw h i t er a b b i t s ，w ) 和 青紫兰( b l u ec h i n c h n l ar a b b i l s , b ) 母兔为实验动物，体重2 5 4 。5 公斤，提供 g v 期和m i i 期卵母细胞。 二、方法 实验一：家猫的超数排卵及卵母细胞的体外成熟 1 超排方法： 1 1 p m s g r n c g 法： 每只母猫肌肉注射p m s g ( 中科院动物所) 1 0 0 i u ，8 4 h 后注射1 0 0 i u h c g ( 中科院动物所)。注射h c g 后立即用玻璃棒刺激其阴道。 1 2 f s h h c g 法： 即连续5 天分8 次肌注总量为1 o 1 5 m g 的f s h ( 中科院动物所) ，第一 天晚注射0 2 3 m g ，第二天早晚注射o 2 0 m g ，第三个早晚各注射o 1 5 m g ，第四天 早晚各注射o 1 5 m g ，第五天早注射o 1 5 m g ，在末次注射f s h1 2 h 后注射1 0 0 i u h c g ，注射h c g 后立即用玻璃棒刺激其阴道。 2 卵母细胞的收集 2 1 成熟卵母细胞的收集 注射h c g 后3 6 3 8 小时后，注射新速眠注射液( 长春农牧大学兽医研究所) ， 每公斤体重0 2 0 3 m l 肌注给药，使猫处于全麻状态，将输卵管及卵巢剪下，用 m 2 + 1 0 f c s 冲洗输卵管，在体视镜下及倒置显微镜下计卵母细胞数量及观察 卵母细胞发育情况，计数卵巢表面排卵点。 2 2 卵泡卵母细胞的收集： 用m 2 + 1 0 f c s ，2 5m l 注射器抽取卵巢表面2 6 m m 卵泡，观察胚胎发育 情况，将未成熟卵( 未排第一极体) ，培养于t c m 1 9 9 + 1 0 f c s 或 t c m 一1 9 9 + 1 0 f c s + 1 0 i u r o _ lp m s g 中。 3 8 c 、5 c 0 2 中培养2 7 2 9 小时【l 】后。在倒置显微镜下观察卵发育情况，卵 丘扩展情况，记录成熟卵数( 是否排第一极体) 及退化卵数。 3 成熟卵母细胞的孤雌激活 选取形态良好的成熟卵母细胞，在电融合液( o 3t o o l l 甘露醇，0 0 5 m m o l lc a c l 2 ，o 1m m o l lm g s 0 4 ) 中平衡2 分钟，转入间距为i m m 的融合槽 内。所用的融合仪为k e f ac e - 4 5 0e l e c t r i c c e l lf u s e r ( 中科院发育所曹明丹研 制) 。激活电压分别为o 5 k v c m 、1 0 k v c m 和1 5 k v c m ，分三组激活，脉冲 持续时间为4 0 1 a s ，间隔o 5 s ，电击3 次。将电击后的卵放入含1 0 f c s 的 t c m - 1 9 9 中，于5 c 0 2 、3 8 。c 培养箱中培养，每2 4 小时观察激活情况。 4 活化鉴定 以电激活后2 0 2 4 小时发育到2 细胞作为激活的标准，以期进一步发育 到囊胚作为发育潜能的标准 5 统计方法 实验数据经t 一检验( s t u d e n tt - t e s t ) 进行统计学处理分析，差异极显著以p 0 0 1 表示。 实验二：兔初级卵母细胞生发泡移植方法的研究 1 g v 期卵母细胞的收集及处理 以6 1 2 月龄的日本大耳自母兔为实验动物，分3 天6 次共注射0 8 1 0 m g 促 卵泡激素( f s h ，中科院动物所) 。在注射第1 针f s h8 4 h 后自其卵巢中抽取卵 泡，收集( i v 期卵母细胞。用含5 0 0 1 u m l 透明质酸酶( s i g m a ) 的m 2 液处理 2 m i n 后，经适当口径的吸管去掉卵丘细胞。然后将g v 期卵培养于含l o 胎 牛血清( f c s ，s i g m a ) 和2 0 j a g m l3 - 异丁基一l - 甲基黄嘌呤 ( 3 一i s o b u t y l - l - m e t h y l x a n t h i n e ，i b m x ，s i g m a ) 的t c m - 1 9 9 中培养2 h ，以阻止其 生发泡破裂( g v b d ) 并使之产生卵周隙。 2 g v 核体的分离 将卵母细胞放在5 0 9 l 含有1 0 f c s ，1 0 i t g m t 细胞松驰素b ( c b ) 和 2 0 p g m li b m x 的m 2 液中培养3 0 r a i n ，然后进行显微操作。首先用固定针( 或 称持卵针) 固定住卵，使生发泡处于时钟1 2 点的位置，用一尖针自卵的切线方 向刺穿透明带并经过卵周隙穿透对侧的透明带。释放卵母细胞，借助穿刺针将 卵放到固定针下方，利用尖针与固定针之间的摩擦力将透明带划开一个小口。 然后，调整卵的位置用固定针吸住，使切口位于2 点的位置，加大固定针内负 压，同时用尖针从卵的垂直上方向下压卵，这样持卵针和尖针协同作用，将g v 1 2 将一批卵的g v 核体挤出。 3 g v 移植 用持卵针吸住已挤出g v 一核体的卵，并且将挤出的g v 一核体置于2 点的位 置，然后用内径约3 0 p m 的注射针将第l 枚卵的( i v - 核体轻轻吸入针内，同时 固定针释放该卵并吸住第二枚己挤出g v 的卵，同样将g v 核体置于2 点位置。 再将注射针内的第l 枚卵的g v 核体注射入第二枚卵的卵周隙内( 图b ) 。之后， 再将第二枚卵的g v 一核体轻轻吸入注射针内( 图c ) 。释放刚做成的重构卵。继 续吸住第3 枚卵，用注射针将第2 枚卵的g v ，核体放入第3 枚卵的卵周隙内， 此时第2 枚卵的g v 核体和第3 枚卵的胞质构成的重构胚已经完成。以此类推， 将最后一枚卵的g v 一枚体移入第1 枚卵的卵周隙内，完成最后一枚重构卵的构 建。也可以用两个持卵针同时分别吸住两个g v 期卵，再进行g v 一核体分离与 互换【 1 。 4 电融合 将g v 互换后的g v 核体- 卵胞质对( p a i r so fg vk a r y o p l a s t c y t o p l a s t l 放于 含1 0 f c s 的t c m 1 9 9 中，于3 8 。c 、5 c 0 2 培养箱中恢复3 0 m i n 。然后将 其放于电融合液( 0 3 m o l l 甘露醇，o 0 5 m m o l lc a c l 2 ，o 1 m m o l lm g s 0 4 ) 洗 3 遍，放于电极间距为l m r n 的融合槽内，细胞接触面与两极平行。融合电压为 1 5 k v c n l ，脉冲持续时间为4 0 i - t s ，间隔o 5 s ，电击3 次。将融合后的卵放入 含1 0 f c s 的t c m - 1 9 9 中，于5 c 0 2 、3 8 。c 培养箱中培养1 h 后观察融合 情况。 5 重构卵的成熟培养 将己融合的重构卵放于含1 0 f c s 和1 0 i u 孕马血清促性腺激素( p m s g ) 的t c m - 1 9 9 中，在5 c 0 2 、3 8 0 c 培养箱中培养1 4 1 6 h 。 6 胞质内精子注射( i n t r a c y t o p l a s m i cs p e r mi n j e c t i o n ，i c s i ) 选择形态良好成熟重构卵进行i c s i 受精。由于移入的g v 多数位于透明带 切口处，因而排出的第一极体多数也位于切i ：1 处，这样i c s i 时应注意注射针的 刺入位置。其方法如下：如果第一极体不在透明带切v 处，i c s i 方法同g o m e z m c 等”叫，即用持卵针将卵母细胞固定住，使其极体位于1 2 点或者6 点位置， 从3 点处将已经吸住精子的注射针( 内径5 p m ) 扎入透明带并且扎进卵胞质中。 在进针过程中观察卵质膜是否被扎破，只要卵质膜破开，即停止进针。若质膜 透明带并且扎进卵胞质中。在进针过程中观察卵质膜是否被扎破，只要卵质膜 破开，即停止进针。若质膜韧性强，针快扎到对侧时卵质膜仍不破，可采用回 吸胞质法即用注射针将胞质轻轻回吸入针内，使卵质膜破裂，然后将精子推 入胞质中，轻轻抽回注射针即可。若第一极体正好位于透明带切口处，则采 用下述方法：用持卵针将卵固定，使第一极体位于3 点处，将吸好精子的注射 针从透明带切口处即3 点的位置扎入透明带内，但不碰到质膜，轻轻将注射针 尖上移，伸入卵周隙中( 图d ) 。然后减小固定针内的压力并将卵释放，此时注 射针己插入卵周隙中，卵不能自由移动( 图e ) 。再用固定针在卵的原7 点位置重 新吸卵，并用注射针在透明带内将卵顺时针拨动，使卵作4 0 0 6 0 。的顺时针转 动，使第一极体从3 点转达4 5 点的位置，然后再进行精子注射( 图f ) 。将i c s i 后的受精卵培养于含1 0 f c s 的t c m - 1 9 9 ，于3 8 c 、5 c 0 2 培养箱中培养即 可。 实验三：兔生发泡移植的重构卵经显微受精后产仔 1 g v 期卵母细胞的收集及处理 以6 1 2 月龄的日本大耳白兔( j a p a nb i ge a r e dr a b b i t ，j b e r ) 和青紫兰兔 ( c h i n c h i l l ar a b b i t s ，c r ) 提供g v 期和m i i 期卵母细胞，以青紫兰公兔提供精 子。 母兔超排：分3 天6 次皮下共注射f s h ( 中科院动物所) 0 8 1 , 0 m g 只，在 第一次注射f s h 后8 4 h ，从其卵巢中收集g v 期卵母细胞。 将采集到的g v 期卵母细胞，用含5 0 0 i u m l 透明质酸酶( s i g m a ) 的m 2 液处理2 m i n 后，经适当口径的吸管去掉卵丘细胞。然后将g v 期卵培养于含 1 0 胎牛血清( f c s 。s i g m a ) 和2 0 p g m l3 异丁基1 甲基黄嘌呤 ( 3 - i s o b u t y l - 1 。m e t h y l x a n t h i n e ，i b m x ，s i g m a ) 的t c m - 1 9 9 中培养2 h ，以阻止其 生发泡破裂( g v b d ) 并使之产生卵周隙。 2 g v - 核体的分离 将g v 期卵母细胞自i b m x 液中移到5 0 m1 0 f c s ，7 5 g g m l 细胞松 弛素b ( c b ) 和2 0 飕，m l 的m 2 液中，培养3 0 m i n 。然后在显微操作仪下摘i r g v 核 体( g v k a r y o p l a s t ) ，其方法为：先用一玻璃针在卵透明带上挑开一个小1 2 1 ，然 后用内径为1 5 - 2 0 岬的注射管从切口处进入，连同g v 周围的细胞质将g v 一核体 1 4 吸出。或者直接加大固定针内负压使g v 一核体从切口处挤出。f l ：g v - 核体仍与胞 体部分相连( 图g ) 3 g v - 核体移植 将日本大耳白兔的g v ( j b e r - g v ) 或青紫兰兔的g v ( c r - g v ) 核体进行 同卵( a u t o j b e r - g v 或a u t o c r - g v ) ，或异卵即将大耳白兔卵的g v 移植到去 g v 的青紫兰兔卵胞质中或反之( h e t e r o g v g v ) 。g v 核体被挤出透明带后， 并没有完全和卵脱离，仍与卵胞质有藕断丝连式的质膜作连接，而这个连接可 以作为一个标记，指示透明带切口。用内径约3 0 p r o 的注射针将g v 核体轻轻 吸入针内，沿透明带上的切口送入另一个卵的卵周隙( 图g ) 。 4 电融合 将g v 互换后的g v 核体- 卵胞质对( p a i r so f g vk a t y o p l a s t c y t o p l a s o 放于 含1 0 f c s 的t c m - 1 9 9 中，于3 8 。c 、5 c 0 2 培养箱中恢复3 0 r a i n 。之后在 电融合液( o 3 m o l l 甘露醇，0 0 5 r n m o l lc a c l 2 ，o 1 m m o l f lm g s 0 4 ) 中平衡2 分钟，转入问距为l m m 的融合槽内。所用的融合仪为k e f a c e - 4 5 0e l e c t r i cc e l l f u s e r ( 中科院发育所) 。融合电压为1 5 k v c m ，脉冲持续时间为4 0 l l s ，间隔 0 5 s ，电击3 次。将电击后的卵放入含1 0 f c s 的t c m 1 9 9 中，于5 c o ，、 3 8 0 c 培养箱中培养0 5 1 h 后观察融合情况。 5 重构卵的成熟培养 将已融合的重构卵放于含1 0 f c s 和1 0 i u 孕马血清促性腺激素( p m s g ) 的t c m - 1 9 9 中，在5 c 0 2 、3 8 。c 培养箱中培养 4 - 1 6 h 。 6 染色体分析 在预备实验中，对部分成熟重构卵作染色体分析，在处理的2 7 枚卵q 有2 0 个卵母细胞的染色体数为2 0 条。 7 胞质内精子注射( i n t r a e y t o p l a s m i cs p e r mi n j e c t i o n ，i c s i ) 选择形态良好的具有第一极体的成熟重构卵进行i c s i 受精。精子注射方法 同实验二所述( 图h ) 8 受精卵的体外培养 将i c s i 后的受精卵培养于含1 0 f c s 的t c m ，1 9 9 于3 8 c 、5 c 0 2n 养 箱中培养即可。 9 胚胎移植 5 将i c s i 后的受精卵移到同期发情的受体受体日本大耳白母兔( j b e r ) 输 卵管中，待其产仔。受体母兔处理：f s h 注射同供卵兔，在第一次f s h 注射后 7 2 h ，肌注h c g1 0 0 1 u ，同时用无菌玻璃棒刺激其阴道。 1 0 数据分析 利用百分数问的t ，检验对数据进行统计分析。 6 结果与讨论 实验一：家猫的超数排卵及卵母细胞的体外成熟 为了获得较好的家猫超排效果，我们从激素用量、激素种类两方面进行了 比较研究。同时也对家猫卵母细胞的体外成熟及孤雌激活作了相应的研究 一、材料与方法：见前文“材料与方法”部分 二、结果与讨论 结果 1 不同的超排方法对超排结果的影响 f s h h c g 法平均超排卵数( 9 1 5 枚a ) ，显著多于p m s g h c g ( 5 2 8 枚只) 法 ( p 0 0 1 ) ( 见表1 ) ；阴道刺激对猫超排有促进作用。 表1 用p m s g h c g 和f s h h c g 超排的不同结果 t a b l e1t h ed i f f e r e n c eo f e a t s u p e r o v u l a t l o nb yp m s g h c ga n df s h h c g 实验用猫数是否阴猫平均体重h c g 后取平均卵平均排卵平均收集 超排方法 ( 只)道刺激( 公斤)时间( h )点数( 个)卵数( 枚) p m s g ，h c g2 1是3 0 13 7 o l6 15 2 8 3 3是3 0 63 6 8 01 0 ，39 1 5 f s h ，i l c g 1 6否2 9 83 7 0 34 03 0 1 2 不同培养液对猫卵的体外成熟的影响 t c m 一1 9 9 + 1 0 f c s + p m s g 对猫卵巢卵母细胞进行体外成熟培养，其成熟率 为7 8 9 ( 11 6 1 4 7 ) 显著高于( p o 0 1 ) 在t c m 一1 9 9 + 1 0 f c s 中的成熟率 4 8 8 ( 6 6 1 3 5 ) ( 表2 ) ； 表2 不同培养液对猫卵的体外成熟的影响 t a b l e2i nv i t r om a t u r a t i o no fc a to o c y t e sb yu s i n gd i f f e r e n tm a t u r a t i o n m e d i u m 体外成熟 2 - 6 r a m 卵泡数收集卵鼓( 幻 培养液 排第一极数退化卵数 其它( ) ( )( ) 1 6 21 4 7 ( 9 0 7 )m 1 9 9 + f c s + p m s g1 1 6 ( 7 89 ) 1 5 ( 1 0 2 )1 6 ( 1 0 9 ) 1 4 81 3 5 ( 9 1 2 )m 1 9 9 + f c s6 6 ( 4 8 s ) o2 l ( 1 5 6 )4 8 ( 3 5 。6 ) 3 电压对猫卵的孤雌激活的影响 用0 5 k v c m ，1 o k v c m 和1 5 k v c m 三种电压以相同的脉冲时间4 0 p s ，脉冲 次数3 次对猫卵进行孤雌激活，1 5 k v e m 的电压对猫卵激活率( 8 8 7 ) 显著高于 1 0 k v e m ( 6 2 2 呦和o 5 k v c m ( 4 5 4 ) 的激活率 表3 电压对猫卵的孤雌激活的影响 电压( k v c m ) 操作卵数 激话卵数( 嘲 8 1 6 细胞期胚胎( ) 055 5 2 5 ( 4 54 ) 6 ( 1 0 - 9 ) l0 6 74 2 ( 6 2 2 ) b 1 0 ( 2 3 8 ) 1 5 7 l6 3 ( 8 8 7 ) 。 1 8 ( 2 8 5 ) 讨论 卵泡发育可被外源促性腺激素如卵泡刺激素( f s h ) 、孕马绒毛膜促性腺激 素( e c g ) 、孕马血清促性腺激素( p m s g ) 等诱导，而且可用g n r h 或h c g 诱 1 8 导排卵【1 。对家猫的超摊目前多采用p m s g h c g 、f s h h c g 或e c g h c g3 种处理方式。在不同的实验中，3 种处理方式的效果有所不同有实验结果查明， p m s g h c g 处理效果不及f s h h c g 和e c g h c g l 3 0 【1 9 1 。目前普遍使用的是 e c g h c g 和f s h h c g 超排方式，在注射h c g 后2 5 2 7 h 利用腹腔镜自卵巢卵 泡中抽取卵母细胞；或注射h c g 后3 4 3 8 h 自输卵管冲得卵母细胞。 获得质量优良，数量充足的家猫卵母细胞，是进行家猫的孤雌激活，体外 受精，显微受精与克隆等科研的前提。为了获得较好的超排效果，我们在实验 中用p m s c 抛c g 和f s h h c g 对家猫进行超排。注射h c g 后3 4 3 8 h 自输卵管 冲得卵母细胞，p m s g h c g 平均超排卵数每只5 。2 8 枚，f s h h c g 平均超排卵数 每只9 15 枚，f s h h c g 的超排效果好于p m s g h c g 。与w i l d t 掣”】和吕连升 等【4 4 】的结果相似。 家猫是诱导性排卵动物，a d a m s 【lj 报道猫排卵不是随机的，而往往发生在交 配或类似交配行为的刺激之后2 4 3 0 h 。在我们的实验中发现，用f s h ，l l c g 对 猫进行超排卵时，注射h c g 后阴道刺激与否对超排效果有显著影响。注射h c g 后进行阴道刺激的猫，平均每只排卵9 1 5 枚，而注射h c g 后没有进行阴道刺激 的猫，平均每只仅排卵3 0 1 枚，总共1 6 只中，有2 只猫没有排卵 为了充分利用卵巢卵母细胞，获得质量较好的体外成熟的家猫的卵母细胞， 我们用t c m 1 9 9 + 1 0 f c s 和t c m 1 9 9 + 1 0 f c s + p m s g 两种培养液对猫卵巢卵 母细胞进行培养，发现其成熟( 排放第一极体) 率分别为4 8 8 ( 6 6 1 3 5 ) 和 7 8 9 ( 1 1 6 1 4 7 ) ，说明p m s g 对猫卵的体外成熟有促进作用。i v m 2 4 h 卵母细胞 的卵丘扩展良好，s c h r a m m 和b a v i s t e r l 笛】认为促性腺激素和催乳激素对猫卵母 细胞的核质成熟具有显著促进作用( p o 0 1 ) 。 卵母细胞活化( a e t l v a f i o n ) 是影响胚胎细胞核移植成功率的关键技术环节 卵母细胞人工孤雌活化，主要依靠外界刺激，使细胞内c a 2 + m 9 2 + 浓度发生瞬间 变化，使原核的形成以及正常分裂，其中电刺激方法具有许多优点，如操作方便， 对卵无毒无副作用，激活率高且稳定等。 本实验采用o 5 k v c m ，1 0 k v c m 和1 5 k v c m 三种电压以相同的脉冲持续时间 4 0 u s ，脉冲次数3 次对猫卵进行孤雌激活，结果表明，1 5 k v c m 的电压对猫卵 激活率( 8 8 7 呦显著高于1 0 k v c m ( 6 2 2 呦和o 5 k v c m ( 4 5 4 ) 的激活率( p o 0 1 ) ， 说明电激活对于猫卵来讲，较高的电压更易使细胞内c a 2 + m 9 2 + 浓度发生瞬间变 原核形成以及正常分裂 实验二：兔初级卵母细腮生发泡移植方法的研究 本文以兔为模型，具体介绍生发泡期卵母细胞的获得、g v - 核体 ( g v - k a r y o p l a s t ) 的分离、g v 移植、重构卵的融合与体外成熟、成熟卵的显微 受精等旨在为人类生殖健康建立良好的动物实验模型。 一、材料与方法：见前文“材料与方法”部分。 二、 结果与讨论 结果 本文共收集g v 期卵母细胞9 8 7 枚，g v 互换成功率2 7 6 ( 2 7 2 1 9 8 7 ) 。由 于g v 期的卵尚未成熟，卵质膜很脆弱，故g v 互换后重构卵的得率较低。融 合率为8 4 6 ( 2 3 0 2 7 2 ) ，重构卵的成熟率( 排出第一极体) 7 7 4 ( 1 7 8 2 3 0 ) 。 经i c s i 后，受精率为7 0 8 ( 1 2 6 1 7 8 ) 。这些结果说明，显微操作和电融合过 程并没有影响移植后的g v 卵的成熟发育，也不影响作为受体的卵胞质的形态 结构，面且重构卵的纺锤体也是正常的。 讨论 由此可见，采用改进的显微操作方法对兔的初级卵母细胞进行g v 互换和胞质 内精子注射( i c s i ) 是可行的。用g v 互换的方法，可能有助于解决高龄生育 妇女因卵母细胞的质量问题而导致的不育症。 由于兔卵母细胞的大小、形态及其透明带的硬度和韧性同人卵相似，因而 是一种很好的进行人卵母细胞操作的动物模型。根据我们的经验。在进行g v 分离、移植及成熟卵的i c s l 时，以下几点应引起注意。 1 i b m x 处理时间对卵母细胞的操作有影响，若处理时间小于1 5 h ，卵周 隙很小不易操作；如果处理时间超过2 5 h ，操作时卵死亡率上升。 2 g v - 核体分离。本实验采用较为柔和的二步法使g v 核体从透明带中被 挤出，即先给透明带划一切口，再将g v 核体从胞质中挤出。尖针应为实心玻 璃毛细管拉制而成，较空心针更适于切割卵的透明带。透明带的切口不宜过大 或过小，一般在透明带五分之一圆周长左右。因g v 卵质膜脆弱，用尖针下压 卵挤出胞质时用力要柔和。以免用力过猛而将其挤破( 图a 1 。 3 g v 移植时，因g v 核体被挤出透明带后，又没有完全和卵脱离，和原 2 0 来的卵胞质有藕断丝连式的狭窄胞质作连接，而这个连接正处于透明带的切1 2 处。这样，g v 核体可以作为一个标记，指示透明带切口，可以很容易地将另 一个g v 核体放入该卵的卵周隙，有利于提高显微操作的效率，节省操作时间 ( 图b ) 。 4 i c s i 时，因重构卵在进行g v 互换时已经使透明带产生切口，所以若进 行i v f 或带下受精( s u b z o n a ls p e r mi n j e c t i o n ) ，会造成多精受精。而采用i c s i 法就能确保单精受精。重构卵培养成熟后，部分卵的第一极体正好位于透明带 切口处。而卵母细胞的遗传物质基本位于第一极体的下方。因而在注射时为了 避开极体，以免触及和损伤卵的遗传物质，可以通过持卵针和注射针协同作用 将卵顺时针旋转4 0 。6 0 。，使极体离开透明带切口处，再从切口进行精子注射 ( 图d ) ( 图e ) ( 图f )