（生理学专业论文）caveolin1在乳腺癌经验之谈生长因子信号通路中的作用.pdf

华东师范大学硕士学位论文 | | i l l i lli llp ll i i ii i ly 1 9 0 2 5 9 9 2 011m a s t e rd i s s e r t a t i o nu n i v e r s i t yc o d e ：1 0 2 6 9 s t u d e n ti d ：51 0 8 1 3 0 0 0 4 8 lv vl ea s tch i n an o r ma lu n i v e r s i t y t h ee f f e c to fc a v e o l i n 一1i nn e r v e g r o w t hf a c t o rs i g n a l i n gp a t h w a y o f b r e a s tc a n c e r d e p a r t m e n t ： m a j o r ： s p e c i a l i t y ： s u p e r v i s o r ： l i f es c i e n c e m a s t e rc a n d i d a t e ：基盟i 墨h 曼n gl 丛 m a y , 2 0 1 1 牟东师范史学硕士学位论文 声明 郑重声明： 路中的作用， 华东师范大学学位论文原创性声明 l 在乳腺癌神经生长因子信号通 ( 请勾选) 学位期间，在导师的 指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的 个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 日期：2 。7 嶂月5 日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 ( c a v e o l i n - 大学攻读学位期 中的作用系本人在华东师范 ( 请勾选) 学位论文，本论文 的研究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使 用此学位论文，并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学 位论文的印刷版和电子版；允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查 阅、借阅；同意学校将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进 行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理 复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密”学位论文毒， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 、72 不保密，适用上述授权。 导本人签名 函 年占月弓日 “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过 的学位论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有 效) ，未经上述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公 开学位论文，均适用上述授权) 。 华东师范大学硕士学位论文答辩委员会 陆瑞盛硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 吴自荣教授华东师范大学答辩主席 钱晏教授华东师范大学 俞国华副研究员华东师范大学 马骥讲师华东师范大学答辩秘书 华东师范大学硕士学位论文中文摘要 摘要 目的研究c a v e o l i n 1 对于乳腺癌m c f 7 细胞中神经生长因子( n e eg r o w t h f a c t o r ，n g f ) 信号通路的作用，以及最终对m c f 7 细胞增殖与存活的影响，从 而探索治疗乳腺癌的潜在靶点。 方法运用蛋白质印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) 检测c a v e o l i n 1 在不同种系的乳腺癌 细胞中的表达；运用电转染技术在m c f 7 细胞中高表达c a v e o l i n 1 蛋白；运用 单核细胞直接细胞毒性测定法( m t t ) 检测m c f 7 细胞转染前后的增殖速率； 运用w e s t e r nb l o t t i n g 方法和免疫荧光方法检测转染后c a v 1 表达情况、细胞凋 亡相关信号通路的变化以及n g f 信号通路的变化。 结果实验结果显示c a v e o l i n 一1 在5 株不同的乳腺癌细胞系均只有低表达。 m c f 7 细胞增殖迅速，有大量的n g f 受体t r k a 的表达，而微量表达的c a v e o l i n - 1 蛋白不能作为激酶底物被磷酸化；运用电转染技术在m c f 7 细胞中转染 c a v e o l i n - 1 基因后，c a v 1 在m c f 7 细胞系中大量表达，且能作为激酶底物在 y 1 4 位点被磷酸化。转染后m c f 7 增殖率明显降低，转染后短期内，细胞中磷 酸化p 3 8 的含量明显上升，b a x 的表达随时间上升，而b c l 2 的表达则有所下 降。转染c a v 1 后t r k a 的表达水平没有明显变化，但磷酸化的r s k 2 明显下降， 细胞核内磷酸化的c r e b 含量都有明显下降。转染c a v 1 后，e r k 蛋白的磷酸化 程度上升，但n g f 处理对其产生的影响明显减弱。 结论多种乳腺癌细胞中缺乏c a v e o l i n 1 的表达。通过电转染强迫表达c a v 1 蛋白后，m c f 7 细胞的增殖和存活受到明显抑制，细胞形态发生一定的变化。 在转染c a v e o l i n - 1 基因的乳腺癌细胞系m c f 7 中，n g f 受体t r k a 的表达量没 有明显变化，而其核分布有所减少。下游通路中磷酸化r s k 2 和磷酸化c r e b 的 含量明显降低，而c r e b 的磷酸化显著降低，且n g f 处理不能完全逆转这种降 低，提示c a v e o l i n 1 能抑制乳腺癌细胞的n g f 自循环，进而抑制乳腺癌细胞增 殖，而且这种抑制效应很可能是c a v 1 调节t r k a 功能的结果。在转染c a v e o l i n - 1 基因的乳腺癌细胞系m c f 7 中，b a x 表达在转染后2 4 小时内出现上调，同时伴 随b c l 2 表达的下调，提示c a v e o l i n - 1 可能会通过b a x 途径引发细胞凋亡。因此 i 华东师范大学硕士学位论文 中文摘要 推测c a v e o l i n 1 可能通过同时抑制增殖信号和触发凋亡信号两条途径，最终产生 抑制细胞增殖的生物效应。 关键词：乳腺癌细胞信号通路神经生长因子c a v e o l i n 一1 华东师范大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to f c a v e o l i n 一1o nn e r v eg r o w t hf a c t o rs i g n a l i n g p a t h w a yi n h u m a nb r e a s tc a n c e rm c f 一7c e l l s ，t h ee f f e c to fc a v e o l i n 一1o nc e l l p r o l i f e r a t i o na n ds u r v i v a li nm c f 一7c e l l s ，a n dt of i n dt h ep o t e n t i a lt h e r a p e u t i ct a r g e t f o rb r e a s tc a n c e r m e t h o d s ：c a v e o l i n - ie x p r e s s i o ni ns e v e r a ld i f f e r e n tb r e a s tc a n c e rc e l ll i n e sw a s m a p p e db yw e s t e r nb l o t t i n g c a v e o l i n - 1w a sf o r c e d l ye x p r e s s e di nm c f 一7c e l l sb y t r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n t h ep r o l i f e r a t i o nr a t eo fm c f - 7c e l l sb e f o r e a f t e rt r a n s f e c t i o n w a sd e t e c t e db ym t t a s s a y c a v - 1e x p r e s s i o na f t e rt r a n s f e c t i o n , a p o p t o s i sr e l a t i v e s i g n a lp a t h w a ya n dn g fs i g n a lp a t h w a yw e r ed e t e c t e dv i aw e s t e r nb l o t t i n ga n d i m m u n o f l u o r e s c e n c e r e s u l t s ：c a v e o l i n - 1o n l yh a saw e a ke x p r e s s i o ni n5d i f f e r e n tb r e a s tc a n c e rc e l l s m c f - 7c e l ll i n eh a sah i g hp r o l i f e r a t i o nr a t ea n dah i g hl e v e lo ft r k ae x p r e s s i o n i n t h i sc e l ll i n e ，n a t i v e l ye x p r e s s e dc a v 一1c a n n o tb ep h o s p h o r y l a t e da sak i n a s es u b s t r a t e t r a n s i e n t l yt r a n s f e c t e d 谢t l lt h ew h o l el e n g t hh u m a nc a v e o l i n - 1g e n e ，m c f - 7 e x p r e s s e dc a v e o l i n - 1p r o t e i na t ah i 曲l e v e l a n dt h ep r o t e i np r o d u c t i o nc a nb e p h o s p h o r y l a t e d a ty 1 4s i t e t h ep r o l i f e r a t i o nr a t ed e c r e a s e dd r a m a t i c a l l ya f t e r t r a n s f e c t i o n w ed i d n to b t a i na n yo b v i o u sd i f f e r e n c eo ft r k ae x p r e s s i o nb e f o r e a f t e r t r a n s f e c t i o n , b u t i t sl o c a l i z a t i o nw a s c h a n g e d f r o mn u c l e u st o c y t o p l a s m p h o s p h o r y l a t e de r k l 2i n c r e a s e da f t e rt r a n s f e c t i o n ，b u tt h ee f f e c to fn g f t r e a t m e n t o ni tw a sa b o l i s h e dr e m a r k a b l y m e a n w h i l ew er e c o r d e dad e c r e a s eo fp h o s p h o r y l a t e d f o r mo fr s k 2i nc y t o p l a s ma n dc r e bi nn u c l e u s ，r e s p e c t i v e l y a n dt h ed e c r e a s eo f p - c r e bc a n n o tb et o t a l l yr e c o v e r e db yn g f t r e a t m e n t i ns h o r t t e r mo b s e r v a t i o n ，t h e q u a n t i t yo fp h o s p h o r y l a t e df o r mo fp 3 8i n c r e a s e dr e m a r k a b l y ，t h ee x p r e s s i o no fb a x i n c r e a s e da n db c l - 2d e c r e a s e d ，r e s p e c t i v e l y c o n c l u s i o n ： c a v e o l i n - 1 e x p r e s s i o nl o s ti n s e v e r a lb r e a s tc a n c e rc e l l l i n e s t h e p r o l i f e r a t i o na n ds u r v i v a lo fm c f 一7c e l l sw e r ei n h i b i t e da f t e rt r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n a m 华东师范大学硕士学位论文 英文搐要 d i f f e r e n tc e l lm o r p h o l o g yo c c u r r e da f t e rt r a n s f e c t i o n t h en g ft y r o s i n er e c e p t o r t r k ae x p r e s s i o nd i d n ts h o wo b v i o u sd i f f e r e n c ea f t e rt r a n s f e c t i o n ，b u ti t sl o c a l i z a t i o n w a sc h a n g e df r o mn u c l e u st oc y t o p l a s m t h eq u a n t i t yo fp h o s p h o r y l a t e dr s k 2a n d p h o s p h o r y l a t e dc r e b d e c r e a s e dd r a m a t i c a l l ya n dp - c r e bq u a n t i t yr e d u c t i o nc a n n o t b et o t a l l yr e c o v e r e db yn g ft r e a t m e n t t h i sr e s u l ts t r o n g l yi n d i c a t e dt h a tc a v e o l i n 一1 i n h i b i t st h en g fs e l f - c y c l i n gi nm c f - 7c e l l sv i at h er e g u l a t i o no ft r k af u n c t i o n i n m c f 一7 c a v 1c e l l s ，b a xe x p r e s s i o ni n c r e a s e da t2 4h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o nw h e r e a s b c l 一2e x p r e s s i o nd e c r e a s e da tt h es a m et i m e ，w h i c hs u g g e s t st h a tc a v e o l i n ic a l l t r i g g e rc e l la p o p t o s i sv i ab a xp a t h w a y a l lt h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tc a v e o l i n 一1m a y b o t hi n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o ns i g n a la n dt r i g g e rt h ea p o p t o s i ss i g n a l ，a n df m a l l y i n h i b i t st h ec e l lp r o l i f e r a t i o n k e y w o r d ：b r e a s tc a n c e rc e l l ，s i g n a lp a t h w a y ，n e r v eg r o w t hf a c t o r ，c a v e o l i n 一1 华东师范大学硕士学位论文 日录 目录 前言1 第一章低表达c a v e o l i n 1 的乳腺癌细胞系的筛选及培养4 1结果5 1 1c a v e o l i n 1 在6 种不同乳腺癌细胞系中的表达5 1 2 乳腺癌细胞系m c f 7 的生长曲线6 2 讨论7 第二章c a v e o l i n 1 基因在m c f 7 细胞系中的转染及其效率的检测以及转染后 细胞增殖速率的变化 l实验结果。1 0 1 1c a v - 1 在m c f 7 细胞系中的转染及其效率的检测1 0 1 2c a v e o l i n - 1 在转染后的m c f - 7 细胞中的表达情况l l 1 3转入的c a v e o l i n 1 的蛋白功能检测1 3 1 4m t t 检测转染c a v - 1 后细胞的增殖速率变化1 4 1 5 光镜检测转染c a v 1 后细胞的增殖速率变化1 5 ：! 讨论15 第三章转染c a v e o li n - 1 后n g f 信号通路蛋白表达及功能变化的检测。1 7 l实验结果l7 1 1转染后2 4 小时细胞形态的变化。1 7 1 2 转染c a v - 1 后t r k a 表达的变化1 8 1 3 转染c a v - 1 后e r k l 2 磷酸化含量的变化2 0 1 4 转染c a v - 1 后r s k 2 磷酸化含量的变化21 1 5 转染c a v - 1 后c r e b 磷酸化含量的变化2 2 ：! 讨论：! z i 第四章转染c a v e o i n - - 1 对m c f - 7 细胞凋亡通路的影响2 6 l 实验结果2 6 1 1 转染后2 4 小时内细胞p 3 8 磷酸化含量的变化2 6 1 2 转染后b a x b e l 2 表达的动力学曲线2 7 1 3 转染后2 4 小时内细胞b a x b c l - 2 表达情况的免疫荧光检测2 8 ：! 讨论：；( ) 总结。 材料与方法。3 3 l 基础试剂配方3 3 2 主要抗体3 4 3 主要仪器3 5 4 实验材料3 5 5 实验方法3 6 5 1 乳腺癌细胞系的培养3 6 华东师范大学硕士学位论文 日录 5 2w e s t e r nb l o t t i n g 蛋白检测一3 7 5 3m c f 7 细胞的转染3 9 5 4 细胞增殖分析4 0 5 5 免疫荧光检测4 1 5 6 统计学处理4 l 参考文献4 2 综述：细胞凋亡的信号转导通路研究进展5 0 l 、膜死亡信号通路。5 0 2 、线粒体信号通路5 2 3 、内质网信号通路5 3 4 、结论5 5 参考文献：一5 6 致谢5 8 华东师范大学硕士学位论文 前言 l - j 一 刖置 乳腺癌是目前临床上最多发的癌症之一，与其他癌症不同的是，乳腺癌主要 的发病群体是女性，发病率和死亡率居妇女各类恶性肿瘤之首1 。全世界每年约 有1 2 0 万妇女发生乳腺癌，5 0 万妇女死于乳腺癌，目前乳腺癌的发病率正以每年 3 左右的速度逐年递增。乳腺癌已经是全球对女性健康、增加经济负担威胁最 严重的疾病。近年来，由于生活压力逐年增大，工作节奏不断加快，我国开始由 乳腺癌低发区逐渐转为高发区，发病率呈逐年上升趋势，。近年来乳腺癌在我国 沪、京、津等大城市的发病率直线上升，已超过宫颈癌，跃居女性恶性肿瘤的第一 位。统计数据表明，1 9 9 1 年n 2 0 0 0 年十年间，我国城市妇女乳腺癌死亡率上升了 近3 9 。乳腺癌已经成为中国女性第一杀手。因此，对乳腺癌发病机理和治疗手 段的各种研究具有非常重要的现实意义。 乳腺癌是一全身性疾病，其生物学特性之一是早期可以发生隐匿性转移病 灶，且往往经过数年或更长时间的病灶发展。基于这一特点，为了提高乳腺癌患 者的生存率和生活质量，乳腺癌治疗概念和模式正在逐渐改变。放射治疗、化学 治疗、内分泌治疗、免疫生物学治疗和各种支持疗法正在介入乳腺癌的治疗，单 一手术模式逐渐被综合疗法所取代2 。目前，成功的早期发现和治疗方法的改进 已经使乳腺癌死亡率得到了实质性的降低。但针对乳腺癌的经典化疗和内分泌治 疗地位仍不容质疑。在国外，治疗的热点始终聚焦于靶向治疗和个体化治疗，而 基因和生物标志物的研究则是个体化治疗的依据3 。 近年来，由于对肿瘤分子病理学的深入认识和重组d n a 技术的快速发展， 针对肿瘤的基因治疗应用已经有临床上的可行性。目前对乳腺癌的基因治疗主要 集中在免疫基因治疗、肿瘤抑癌基因治疗、凋亡基因治疗、化学基因治疗、基因 敲除基因治疗和抗血管生成基因治疗4 。 目前，已经有部分乳腺癌表面抗原被当作基因治疗的靶点。例如人表皮生长 因子受体2 ( h e r 2 ，也称为n e u 、e r b b 2 、p 1 8 5 n e u 和c e r b b 2 ) 是乳腺癌标记物。抗 h e r 2 治疗是乳腺癌的常规治疗。然而只有2 0 的乳腺癌患者过表达e r b b 2 ，这 1 - 华东师范大学硕士学位论文 前言 一现象限制了它在治疗中的广泛使用5 。因此我们需要找出更多的乳腺癌分子标 记物，以及治疗靶点。 近几年，已经有众多研究发现乳腺癌细胞的生长还受到其他生长因子调节， 这些生长因子同样能刺激或抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移与分化，从而增快或者 减缓肿瘤的生长和转移6 。例如，类胰岛素生长因子( i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r s ， i g f ) 7 - 1 0 转化生长因子q ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - q ，t g f q ) 1 1 - 1 3 以及成 纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r , f g f ) 1 4 。6 等都能刺激乳腺癌细胞的 增殖，然而乳腺源的生长因子抑制剂与转化生长因子b ( t g f p ) 1 7 ，1 8 能抑制乳腺 癌细胞的增殖。 神经生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o r ，n g f ) 是神经系统最重要的生物活性分 子之一，促进发育中的感觉神经元及交感神经元的存活及分化，营养成熟的神经 元，维持其正常的生物学功能，参与损伤神经再生和功能修复，并且参与维系神 经、免疫和内分泌系统之间的平衡1 9 2 2 。 神经生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o r , n g f ) 是发现最早、研究最为透彻的神经 营养因子，是由q 、b 、y 三种亚基构成的多聚体，其中仅亚基b 具有神经营养作 用。以往的研究表明n g f 对中枢和外周神经系统多种类型神经元的生长、发育分 化、再生和轴突形成具有重要作用2 3 。目前人们逐渐认识到神经生长因子及其受 体( n g fm o f r ) 2 4 2 7 在多种神经系统及非神经系统肿瘤中均有表达，并参与肿瘤 的凋亡、转移、分化和血管新生，且由神经生长因子介导的信号通路已成为抗肿 瘤治疗研究的新靶点2 8 。 已经有实验证明，n g f 的酪氨酸激酶受体t r k a 能在c a v e o l a e 中被富集，进 而在接受n g f 信号激活后通过自磷酸化的形式活化并发生受体内吞。t r k a 的激 活会引发胞内的一系列级联反应，并最终导致基因表达的改变。这些基因包括编 码多种蛋白酶，离子通道和其他细胞成分。t r k a 的激活需要受体形成二聚体并 发生酪氨酸残基位点的自身互磷酸化，这些酪氨酸残基则能作为多种下游信号效 应蛋白和适配体蛋白的对接位点。t r k a 的激活会导致其本身与p l c y ，p 1 3 k 和适配体蛋白的迅速联系。t r k a 的酪氨酸残基能磷酸化适配体蛋白g a b l 和 2 一 华东师范大学硕士学位论文前言 s h c ，并引发这些蛋白与g r b 2 一s o s 的结合，增强r a s 上的g d p g t p 的交换， 并激活r a s 。激活的r a s 结合至r a f 上，随后由后者磷酸化并激活m e k ( m a p k e r k 激酶) 。m e k 能磷酸化m a p k 和e r k l 2 。被磷酸化的e r k l 2 至少参与了2 条级 联反应。e r k l 2 可能转移至核内，并在细胞核内磷酸化转录因子e l k l ，或者直 接在胞浆磷酸化r s k 。e l k l 的磷酸化使其能与副转录因子s r f ( j 0 6 t 清应答因子) 相互作用，s r f 则能结合至s r e 上。s r e 包含了c f o s 启动子并能促使转录起 始。r s k 的磷酸化能使其转移至细胞核内并进而磷酸化c r e b ( c a m p 反应元件 结合蛋白) ，最终起到修饰基因表达的作用2 3 , 2 9 - 3 4 。 n g f 具有一系列神经营养因子的功能，但越来越多的文献补充了它的非神经 营养因子的功能2 8 。n g f 能够影响一些非神经细胞包括癌细胞的生长，分裂，分 化与存活。有研究指出，正常乳腺细胞不表达神经生长因子但表达n g f 的两种受 体，但乳腺癌细胞不仅表达n g f 的两种受体，甚至出现n g f 自分泌现象3 5 。有研 究报告指出，n g f 是乳腺癌细胞的有丝分裂素，它通过缩短g 1 期，对乳腺癌有 直接的促有丝分裂的效果3 6 ，n g f 对乳腺癌还有抗凋亡的作用3 7 ，粥。另外，据文 献报道，对移植了人源乳腺癌细胞的免疫缺陷小鼠用n g f 抗体处理或用针对n g f 的小分子r n a 干扰处理都可以抑制肿瘤的生长与迁移5 。这些都预示了n g f 是乳 腺癌的潜在治疗靶点。二 然而对于n g f 究竟是如何控制乳腺癌细胞的生长，n g f 信号通路受到哪些因 子调控，哪些因子能够影响n g f 在乳腺癌细胞中的作用，从而起到抑制增殖和促 进凋亡的作用，n g f 与t r k a 结合之后的下游通路到底有哪些特异性等，目前的 研究还不能给出明确详实的答案。因此，针对这些方面进行研究，对探讨乳腺癌 细胞的发生发展机理，寻找新的药物靶点以及研发新型抗乳腺癌药物都具有重要 的现实意义。 - 3 _ 竿东师范大学硕士学位论文 第一章 第一章低表达c a v e o l i n 1 的乳腺癌细胞系的筛选及培养 c a v e o l a e 于上世纪5 0 年代被发现，是一种囊泡样的细胞膜亚结构，由位于胞 质侧的c a v e o l i n 蛋白与膜上的脂筏组成。c a v e o l a e 的蛋白质成分主要包括 c a v e o l i n 、脂质锚定蛋白( 如g p l 2 锚定蛋白) 等，其中c a v e o l i n 是c a v e o l a e 的主要 结构和调节成分3 9 。 c a v e o l i n 是一类细胞膜整合蛋白，位于c a v e o l a e 的胞内侧，分子量约2 1 2 4 k d 。在哺乳动物细胞中，根据c a v e o l i n 家族蛋白的免疫学特性，可分为c a v 1 ， c a v - 2 ，c a v 3 三种类型，c a v e o l i n - 1 ( c a v 1 ) 又分为q 和b 两个亚型4 0 ，4 1 。人类 c a v e o l i n - 1 ， c a v e o l i n - 2 基因均定位于7 q 3 1 1 4 2 ，而c a v e o l i n 3 基因则定位于 3 p 2 5 4 3 。c a v e o l a e 主要存在于高度分化的细胞，c a v e o l i n 1 ，c a v e o l i n - 2 在脂肪细 胞、内皮细胞、成纤维细胞中大量表达，而c a v e o l i n - 2 ，3 的表达具有肌细胞特异 性( 包括心肌、骨胳肌、平滑肌严。 c a v e o l i n 的结构和功能从线虫到人都有高度的相似性，这暗示了c a v e o l i n 对 于维持细胞功能的正常发挥是至关重要的4 5 。c a v 1 是这个基因家族中最早发现 也是研究最深入的成员。它通过n 段序列( 6 1 1 0 1 ) 的相互作用形成1 4 1 6 个单体 组成的同聚物，并通过n 端的脚手架域( c a v e o l i ns c a f f o l d i n gd o m a i n ，c s d ) 与 众多信号转导蛋白内保守的c a v e o l i n 结合域( c a v e o l i nb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 产生相互作用，使结合后的信号分子处于失活状态，从而实现其对信号通路的负 性调控4 4 一。 h u l i t 等人的研究发现c a v e o l i n - 1 的正常表达可以抑$ 1 j c y c l i n d 1 基因启动子 的活性，从而抑$ 1 j c y c l i n d 1 的表达，产生细胞周期阻断4 7 。而g l a i r 等人则发现 c a v e o l i n - 1 能控制b r c a _ 1 基因的表达以及产物的细胞定位，而后者是恶性乳腺癌 发生过程中的重要角色4 8 。另外也有研究发现c a v e o l i n - 1 的表达能够抑制乳腺癌 细胞的非贴壁依赖性生长4 9 。有报道显示乳腺癌的发生与染色体7 q 3 1 1 区内的缺 失有关5 0 。5 5 ，由于c a v - 1 基因就编码在这一区域，因此可以推i 贝u j c a v 1 可能对细胞 的恶性转化和恶性增殖有抑制作用。这些研究都暗示tc a v e o l i n 1 在乳腺癌细胞 华东师范大学硕士学位论文第一章 增殖存活中可能有非常重要的作用。 在第一章的实验中，我们首先运用t w e s t e r n b l o t t i n g l 约方法检测了多种不同 来源的乳腺癌细胞系中c a v - 1 的表达情况；随后我们根据检测结果选择进行下一 步实验的细胞系；最后在挑选出来的细胞系中检测内源c a v l 的生理功能是否完 好。这些结果可以作为后续研究中的重要依据。 1结果 1 1c a v e o l i n 1 在6 种不同乳腺癌细胞系中的表达 我们选取了实验室保有的6 种不同来源的乳腺癌细胞系，用w e s t e r nb l o t t i n g 的方法测定在各种不同乳腺癌细胞系中c a v e o l i n - 1 的表达情况，以便选取低表达 c a v e o l i n - 1 的细胞系供后续研究使用。c a v e o l i n 1 的分子量约为2 2 k d ，定位于细 胞膜上。从w e s t e r nb l o t t i n g 的结果( 图1 1 ) 可以看出，在参与筛选的6 种乳腺 癌细胞系中，除了在m d a m b 2 3 1 中之外，c a v - 1 在其他的5 个细胞系中均只 有极低的表达，运用o d y s s e y 的w e s t e r nb l o t t i n g 分析软件进行半定量分析，可 以发现其中表达量最低的是m c f 7 细胞系。 7 5 3 02 3 14 3 54 5 3m c f 7b c a p 0 一囊- 章_ _ - - - - - - 一1 3 - t u b u l i n 妊。z 翩蝴哆。，拶，一：，矗。瓤：，锄。c a v 。1甓g _ w 一，盘0 ”协，舷k ，一，；j i 、d 一 图1 1c a v e o l i n - 1 在6 种不同乳腺癌细胞系中的表达从左至右：z r - 7 5 3 0 ，m d a m b 2 3 1 ， m d a m b - 4 3 5 ，n 匝l a m b _ 4 5 3 ，m c f 一7 ，b - c a p 一3 7 f i g 1 1t h ee x p r e s s i o no fc a v e o l i n li n6b r e a s tc a n c e rc e l ll i n e s f r o ml e f tt or i g h t ：z r - 7 5 3 0 ， m d a m b 一2 31 ，m d a - m b - 4 3 5 ，m d a m b 4 5 3 ，m c f - 7 ，b a p 一3 7 - 5 华东师范文学硕士学位论文第一章 图1 2c a v e o l i n 1 在乳腺癌细胞系中的表达差异的半定量结果从左至右：z r - 7 5 3 0 ， m d a - m b 一2 3l ，m d a m b - 4 3 5 ，m d a m 旧4 5 3 ，m c f 一7 ，b - c a p 3 7 f i g 1 2t h es e m i - q u a n t i f i c a t i o no ft h ee x p r e s s i o no fc a v e o l i n 一1i nb r e a s tc a n c e rc e l ll i n e s f r o m l e f tt of i g h t ：z r - 7 5 3 0 ，m d a - m b - 2 31 ，m d a m b - 4 3 5 ，m d a - m b 一4 5 3 ，m c f - 7 ，b c a p 一3 7 1 2 乳腺癌细胞系m c f 7 的生长曲线 利用m t t 法测定在完全培养基中培养的m c f 7 细胞的生长曲线，以便准确 描述细胞生长周期中具体数量的动态变化。结果显示当m c f 7 细胞使用完全培 养基培养时，生长曲线均呈较典型的“s ”形，第0 2 d 为生长缓慢的潜伏期，第 2 5 d 为斜率较大的指数生长期，第5 d 以后开始退化衰亡( 图1 3 ) 。通过公式计 算倍增时间( d o u b l i n gt i m e ) ：d t = ( 1 0 92 ( 1 0 9n t l o gn o ) ) t ，其中n o 、n t 分别代表接种时和培养t 小时后的细胞数。由公式得出m c f 一7 细胞的倍增时间 d t 为= 2 7 7 8 h 。得出倍增时间后，就可以较准确把握细胞传代时间和传代比例。 当细胞长满培养瓶9 0 时就需要及时传代，否则细胞相互紧密排列，容易产生接 触抑制，从而影响细胞正常的增殖生长，对实验结果产生不利影响。 我们通过绘制生长曲线，了解细胞生长的基本规律及其增殖能力。m c f 7 细 胞增殖速度很快，倍增时间约为2 8 小时，而且细胞状态稳定，是很好的实验模 式细胞。 - 6 华东师范太学硕士学位论文第一章 图1 3m c f 7 细胞系的生长曲线横坐标为培养时间( 天) ，纵坐标为细胞增长倍数( 与第一 天相比) f i g 1 3t h eg r o w t hc h iv eo fm c f 一7c e l l s t h ex a x i ss h o w st h ec u l t u r et i m e ( d a y s 、a n dt h ey - a x i s s h o w st h ec e l lg r o w t hm u l t i p l e s ( c o m p a r et ot h ef i r s td a y ) 2 讨论 c a v e o l a e 是细胞膜上异化的亚结构，其中富集了多种信号分子，各种信号分 子在这里聚集，产生相互作用，并相互产生影响，使得多条信号通路在此发生交 叉作用，因而c a v e o l a e 被认为是细胞信号通路的枢纽之一。而c a v 一1 作为c a v e o l a e 的主要蛋白成分，毫无疑问对c a v e o l a e 的生理作用的实现和正常运行发挥着重 要的作用。其中位于c a v e o l i n ln 端的c a v e o l i n 脚手架域，又被认为是其与信号 分子产生相互作用的部分，是调节信号分子功能的平台。 在大多数情况中，c a v e o l i n 1 能引起信号分子的变构或共价修饰，对大多数信 号分子主要发挥负性调节作用。因而c a v - 1 的缺失很可能造成某些信号通路的非 正常的激活。信号通路的非正常激活在癌细胞中非常常见，r a s 通路就是一个最 著名的例子。因而可以猜测在乳腺癌中，c a v 1 表达的缺失也很有可能造成细胞 信号通路的变化，从而影响细胞的增殖和存活。 本章实验通过w e s t e mb l o t t i n g 的方法，j 在蛋白水平上证明t c a v - 1 在5 种参与 筛选的乳腺癌细胞中均只有极低表达；c a v 1 在参与筛选的6 种乳腺癌细胞系中， 7 - 华东师范大学硕士学位论文 第一章 只有在m d a - m b 一2 3 1 细胞中有高表达。引起这种差异的原因我们还不清楚，但可 以肯定的是有多种乳腺癌细胞存在c a v - 1 表达的缺失，提示我们在这些细胞中很 有可能存在信号通路转导的变化。 - 8 华东师范大学硕士学位论文第二章 第二章c a v e o l i n 1 基因在m c f 7 细胞系中的转染及其效 率的检测以及转染后细胞增殖速率的变化 第一章的实验中，我们在蛋白表达的水平上证明了在多种乳腺癌细胞系中存 在c a v 1 表达的缺失。有研究指出，c a v 1 在多种癌症发生中都能抑制细胞的信 号传导，起到了抑癌因子的作用。在乳腺癌中，c a v 1 表达的缺失究竟对细胞产 生了怎样的影响，是否会引起细胞的生命活动，如增殖，凋亡，存活等等过程 的变化，我们尚不清楚。 在生物研究中，运用质粒转染引入外源基因，使有机体表达原本不表达或表