（生物化学与分子生物学专业论文）脂联素介导的脂肪积累调控研究.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 摘要 脂肪组织是生物体内最大的储能组织，而且也是十分活跃的脂肪代谢的主要器 官。近年来的研究发现，脂肪组织作为一个十分重要的内分泌器官，能够分泌许多 细胞因子和细胞因子样分子，如：瘦素( 1 e p t i n ) 、脂联素( a d i p o n e c t i n ) 、抵抗素( r e s i s t i n ) 等脂肪细胞因子( a d i p o c y t o k i n e s ) 。这些脂肪细胞因子通过内分泌或旁分泌方式对全 身各器官系统功能具有重要调节作用，特别是参与调节与肥胖相关的胰岛素抵抗和 葡萄糖代谢紊乱。 成肌作用是一个复杂并受到高度调控的过程，包括细胞周期阻滞和肌肉特异性 转录因子的表达。骨骼肌已经被确定作为一个主要的糖代谢组织。肌细胞内脂质， 作为一种重要的能量来源，在运动中提供线粒体氧化所需要的能量。越来越多的研 究证明，肌细胞内脂质过度积累与胰岛素抵抗明显呈正相关。研究脂肪骨骼肌之间 的对话( c r o s s t a l k ) 对阐明骨骼肌胰岛素抵抗的发生的机理有重要的意义。 脂联素是近年来新发现的一个脂肪细胞因子，脂联素由脂肪细胞分泌后进入血 液，以多种形式在血液中循环。脂联素球状区在体内独立存在，与完整的脂联素功 能相似。脂联素能够促进肌肉脂肪酸氧化、降低血浆甘油三酯、通过增强胰岛素的 敏感性而促进葡萄糖代谢。 本研究采用r e a l t i m ep c r 和细胞转染等技术，研究了肌细胞成肌过程中细胞 脂肪含量情况，脂联素对该过程的影响，促卵泡生成素对a d i p o r l 的表达调控，猪 僦j 和删2 基因的克隆和生物学特性等进行了研究，结果如下： 1 以c 2 c 1 2 成肌细胞为研究模型，添加2 马血清作为诱导分化培养基，用油红o 染色的方法对c 2 c 1 2 在成肌过程细胞内脂肪含量进行研究，发现在这个过程中， 细胞内脂肪含量急剧减少 2 用r e a l t i m ep c r 的方法，研究了在c 2 c 1 2 成肌过程中，糖脂代谢相关基因以 及脂联素受体相关基因的m r n a 表达模式，证明了c 2 c 1 2 成肌过程中，肌细胞 脂肪含量的减少是由于脂肪酸氧化增加，合成减少导致；并发现脂联素受体的 表达模式与成肌过程有相关性。 3 用基因转染的方法，证实脂联素参与了成肌过程脂肪含量减少的过程，并证明 了脂联素通过增加脂肪酸氧化途径，而不是水解和合成途径参与上述过程。 4 通过同源分析比较，以人的a p p l l 和a p p l 2 基因序列为参照，运用r t - p c r 的 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 方法，获得了猪a p p l l 和a p p l 2 基因；以猪的心、肝、脾和肺等1 0 个组织样 品作为研究材料，通过定量p c r 分析获得了猪4 p 尸! ，j 和a p p l 2 的组织表达谱； 通过电子定位的方法进行a p p l l 和a p p l 2 的染色体定位。 5 用重组人促卵泡生成素刺激体外培养的3 t 3 l 1 细胞和c 2 c 1 2 细胞，并用 r e a l t i m ep c r 的方法，证明了f s h 在5 n g m l 时能够增加a d i p o r lm r n a 表达 水平；在n i h 3 t 3 细胞中，f s h 对a d i p o r l 的表达具有相反的作用。 关键词：c 2 c 1 2 成肌细胞；脂联素；脂联素受体1 ；脂联素受体2 ；促卵泡生成素； 含p h ，p t b 结构域及亮氨酸拉链模体的接头蛋白1 ，2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t a d i p o s et i s s u e i sn o to n l ya ne n e r g ys t o r a g er e s e r v o i rb u ta l s oa l li m p o r t a n t e n d o c r i n eo r g a ni nw h i c ht h em e t a b o l i s mi s v e r ya c t i v e i tc a l l s e c r e t ean u m b e ro f a d i p o c y t o k i n e s ，s u c h 踞l e p t i n ，a d i p o n e c t i n , r e s i s t i ne t c t h e s ea d i p o c y t o k i n e s c a n m e d i a t et h ef u n c t i o n so f m a n yo r g a n st h r o u g ha u t o c r i n e p a r a c r i n e ，e s p e c i a l l yr e g u l a t i n g i n s u l i nr e s i s t a n c ea n dg l u c o s em e t a b o l i cd i s o r d e rl i n k i n gt oo b e s i t y m y o g e n e s i si sah i g h l yc o m p l e xa n dr e g u l a t e dp r o c e s si n c l u d i n gc e l lc y c l ea r r e s ta n d m u s c l es p e c i f i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o re x p r e s s i o n s k e l e t a lm u s c l eh a sb e e ni d e n t i f i e da st h e m a j o rt i s s u ei ng l u c o s em e t a b o l i s m a sa l li m p o r t a n te n e r g ys o u l c ef o rs k e l e t a lm u s c l e ， i n t r a m y o c e l l u l a rl i p i dp r o v i d e st h ef u e lr e q u i r e df o rm i t o c h o n d r i a lf a to x i d a t i o nd u r i n g e x e r c i s e i n c r e a s i n g e v i d e n c e s u g g e s t e d t h a te x c e s s i v e i n t r a m y o c e l l u l a rl i p i d i s s i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e dw i t hi n s u l i nr e s i s t a n c e i ti sv e r yi m p o r t a n tt os t u d yt h ec r o s s t a l k b e t w e e nf a ta n ds k e l e t a lm u s c l ef o rt h eo c c u r r e n c eo fs k e l e t a lm u s c l ei n s u l i nr e s i s t a n c e a d i p o n e c t i ni sn e w l yd i s c o v e r e dh o r m o n e ss p e c i a l l ys e c r e t e df r o ma d i p o c y t e s a d i p o n e c t i nc i r c u l a t e s i nb l o o di nm u l t i p l e ss u c ha st r i m e r s ，h e x a m e r sa n dah i g h m o l e c u l a rm a s ss p e c i e s t h eg l o b u l a ra d i p o n e c t i ne x i s t si n d e p e n d e n t l yi nv i v oa n dh a s t h es i m i l a rf u n c t i o n st ot h ef u l l - l e n 垂ha d i p o n e c t i n a d i p o n e c t i nc a ns t i m u l a t et h ef a t t y a c i do x i d a t i o ni ns k e l e t a lm u s c l e ，d e c r e a s ep l a s m at r i g l y c e r i d e ，a n di m p r o v eg l u c o s e m e t a b o l i s mb yi n c r e a s i n gi n s u l i ns e n s i t i v i t y i nt h i ss t u d y , b yu s i n gr e a l t i m ep c r ，t r a n s f e c t i o n , w es t u d i e di n t r a m y o c e l l u l a rl i p i d a c c u m u l a t i o nd u r i n gt h em y o g e n e s i s ，t h ee f f e c t so fa d i p o n e c t i no nt h i s p r o c e s s ， f o l l i c l e - s t i m u l a t i n gh o r m o n er e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fa d i p o r1 ，a n dt h ec l o n i n ga n d b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fp i ga p p l la n da p p l 2 ，a n dg o tt h ef o l l o w i n gr e s u l t s ： 1 u s i n gc 2 c 12m y o b l a s t sa st h em o d e l ，a d d2 h o r s es e r u ma sad i f f e r e n t i a t i o n m e d i u m ，w es t u d i e dt h ei n t r a m y o c e l l u l a rl i p i da c c u m u l a t i o nd u r i n gt h em y o g e n e s i s b yo i lr e dos t a i n i n g ，w ef o u n dt h a tt h ei n t r a m y o c e l l u l a rl i p i dm a r k e d l yd e c r e a s e d d u r i n gc 2 c 1 2d i f f e r e n t i a t i o n 2 s t u d i e dt h ee x p r e s s i o np a t t e r no fl i p i da n dg l u c o s em e t a b o l i s mr e l a t e dg e n e sa n d a d i p o n e e t i nr e c e p t o rr e l a t e dg e n e sd u r i n gt h ec 2 c12m y o g e n e s i sb yr e a l t i m e i 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 p c r ，a n dw ed e m o n s t r a t e dt h a tl i p i da c c u m u l a t i o ni nc 2 c 1 2c e l l si sr a p i d l y r e d u c e dd u r i n gm y o g e n e s i s ，a p p a r e n t l yd u et oi n c r e a s e df a t t ya c i do x i d a t i o na n d d e c r e a s e df a t t ya c i ds y n t h e s i s a n dw ea l s of o u n dt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e n m y o g e n e s i sa n dd y n a m i ce x p r e s s i o no fa d i p o n e c t i nr e c e p t o r s 3 w ed e m o n s t r a t e dt h a ta d i p o n e c t i nr e d u c e si n t r a m y o c e u u l a rl i p i da c c u m u l a t i o n t h r o u g hp r o m o t i n gf a t t ya c i do x i d a t i o n , r a t h e rt h a nh y d r o l y s i sa n ds y n t h e s i s ，d u r i n g c 2 c 1 2d i f f e r e n t i a t i o n 4 b yt h ec o m p a r a t i v ea n a l y s i s ，a c c o r d i n gh u m a n a p p l la n da p p l 2s e q u e n c e s ，p i g a p p l la n da p p l 2g e n e sw e r ec l o n e d b yr e a l - t i m ep c r 、t h et i s s u ee x p r e s s i o n p r o f i l e so fa p p l la n da p p l 2i nt e n t i s s u es a m p l e sw e r ed e t e r m i n e d b y c h r o m o s o m ee l e c t r o n i cp o s i t i o n i n ga n a l y s i s ，p i ga p p l la n da p p l 2w e r el o c a t e d 5 s t i m u l a t e dw i t hr e c o m b i n a n th u m a nf o l l i c l e - s t i m u l a t i n gh o r m o n eo n3 t 3 - l 1c e l l s a n dc 2 c12c e l l si nv i t r o ，w ef o u n dt h a tf s hc a ni n c r e a s et h ee x p r e s s i o nl e v e lo f a d i p o r lm r n a a tc o n c e n t r a t i o no f5 n g m lb yr e a l t i m ep c r h o w e v e r , f s hh a s t h eo p p o s i t ee f f e c to nt h ee x p r e s s i o no f a d i p o r lo nn i h 3 t 3c e l l s k e y w o r d s ：c 2 c 1 2m y o b l a s t ；a d i p o n e c t i n ；a d i p o r l ；a d i p o r 2 ；f s h ；a p p l l 2 i v 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加i j , 标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生张予收旱 帆姗夕年日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数 据股份有限公司将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信 息服务( 包括但不限于汇编、复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在 其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保 密的论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：尹长旱 导师签名：乏雩耄妻一 签名日期：2 d 钾年6 月ff 日签名日期：垆口7 年6 月f 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 第一部分：脂联素及受体介导的肌细胞脂肪积累 1 前言 脂肪组织是生物体内最大的储能组织，而且也是十分活跃的脂肪代谢的主要器 官。近年来的研究发现，脂肪组织作为一个十分重要的内分泌器官( m e i e ra n d g r e s s n e r , 2 0 0 4 ) ，能够分泌许多细胞因子和细胞因子样分子，如：瘦素( 1 e p a n ) 、脂联 素( a d i p o n e c t i n ) 、抵抗素( r e s i s t i n ) 、肿瘤坏死因子a ( t u m o rn e c r o s i s f a c t o r - a ，t n f a ) 、 白介素6 ( i n t e r l e u k i n 一6 ，i l 一回等脂肪细胞因子( a d i p o c y t o k i n e s ) 。这些脂肪细胞因子， 通过自分泌和旁分泌的形式调控脂肪组织本身的代谢，并且，还能通过血液运输， 以内分泌信号方式与脑、肝、骨骼肌、心肌、血管内皮及胰岛等组织细胞进行脂脑、 脂肝、脂肌及脂胰等对话，形成复杂反馈网络。调节下丘脑、垂体、肾上腺轴及性 腺轴功能，调节胰岛素分泌、肌细胞胰岛素受体的敏感性以及g l u t 4 的表达、转位 等以维持糖脂代谢，调节血管内皮功能等。 成肌作用是一个复杂并受到高度调控的过程，包括细胞周期阻滞和肌肉特异性 转录因子的表达( b u c k i n g h a m ，2 0 0 6 ；k i t z m a n na n df e r n a n d e z ，2 0 01 ) 。骨骼肌已经被确 定作为一个主要的糖代谢组织( c o r e o r a n e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。肌细胞内脂质，作为一种重要 的能量来源，在运动中提供线粒体氧化所需要的能量( s c h r a u w e n h i n d e r l i n ge ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。然而，越来越多的研究证明，肌细胞内脂质过度积累与胰岛素抵抗明显呈正 相关，这可能最终导致2 型糖尿病的发生( g o o d p a s t e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。最近，有一些研 究表明，肌细胞内脂肪酸合成和氧化之间的平衡，对骨骼肌胰岛素抵抗的发展起着 重要的作用( c o r c d r a n e ta 1 ，2 0 0 7 ；s c h r a u w e n - h i n d e r l i n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 1 脂肪细胞与脂肪细胞因子 脂肪细胞起源于脂肪组织中存在的间充质干细胞，与骨髓基质中存在的干细胞 一样，该细胞因具有自我更新、活力持久及多向分化潜能等干细胞特征而被称为脂肪 源性干细胞。脂肪组织是生物体内最大的储能组织，主要以甘油三脂的形式储存能 量，脂肪组织可分白色脂肪组织和褐色脂肪组织。白色脂肪组织是主要的能量储存 器官，并且对能量的平衡有重要的作用，在营养丰富的情况下以甘油三脂的形式储 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 存能量，在营养缺乏的情况下释放游离脂肪酸( f f a s ) 张a l l i l ，2 0 0 0 ；s p i e g e l m a na n d f l i e r , 2 0 0 1 ) 。白色脂肪组织可在机体摄取食物后将剩余的能量以中性脂肪形式贮存 起来，然后在机体需要时，以脂肪酸和甘油的形式提供给机体各组织细胞。白色脂 肪组织在营养缺乏的时候是一种生存优势，但是，在当今营养富足的年代，过剩的 白色脂肪组织与肥胖相关的健康问题联系在一起。白色脂肪组织一般指的是皮下脂 肪或内脏脂肪，白色脂肪组织过量沉积就称为肥胖。褐色脂肪组织存在于肩脚间或 腋窝部，存在量很少，可将脂肪氧化分解并作为热量释放出来，具有消耗、散发剩 余热量的功能。脂肪细胞体积的变化主要由游离脂肪酸吸收、脂肪生成和脂肪分解 等过程决定的。 表1 脂肪细胞因子及功能 t a b l e1a d i p o k i n e sa n dt h e i rf u n c t i o n 名称功能 a d i p o n e c f i n l e p t i n t n f 吨 r e s i s t i n i l 6 m i f a d i p s i n a n g i o t e n s i n o g e n p a i 1 a s p t g f 9 i g f - i a d i p o s e r b p 4 v i s f a t i n m c p 1 增加机体对胰岛素的敏感性，防止动脉粥样硬化的形成 调节食欲和能量消耗 干扰胰岛素受体信号，参与了肥胖中胰岛素抵抗的形成 参与调控炎症、葡萄糖耐受、胰岛素抵抗 与免疫、糖脂代谢相关 参与促炎反应和免疫调节 与脂肪组织代谢相关 血管紧张素的前体，调节血压 纤溶酶原的抑制因子 调控脂肪组织中甘油三脂的合成速率 有广泛的生物学功能，能够调节细胞的增殖、分化、凋亡、 促进各种细胞的增殖，调节大量生长激素的作用 抑制脂肪积累 减少胰岛素敏感性 促进脂肪细胞脂解；损伤胰岛b 细胞 能够诱导脂肪细胞和肌细胞胰岛素抵抗 长时间以来，脂肪细胞一直被认为仅具有存储能量的“消极”作用。然而，近 年来的大量研究表明，脂肪细胞的内分泌功能在机体的能量平衡中扮演重要角色 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 ( m a t s u z a w a , 2 0 0 6 ；m e i e ra n dg r e s s n e r , 2 0 0 4 ) 。研究人员发现，大量的激素、生长因子 和细胞因子实际上都是脂肪组织分泌的( 表1 ) 。其中包括一些重要的信号分子，如 瘦素、脂联素、白介素6 等；还有一些重要脂蛋白代谢调控子，如脂蛋白脂酶、载脂 蛋白e 、胆固醇酯转运蛋白：以及血管紧张素原基因、纤溶酶原激活物抑制因子1 、 转化生长因子。脂肪细胞的内分泌功能的发现使得人们认识到，脂肪细胞的功能不 仅仅是存储甘油三脂，它在能量代谢，免疫应答，心血管疾病，饮食调控上的重要 性日益显现。比如，t n f 0 【不仅能抑制脂肪细胞分化，用它处理成熟的脂肪细胞还 能降低脂肪细胞基因的表达水平( s t e p h e n se ta 1 ，1 9 9 2 a ；s t e p h e n se ta 1 ，1 9 9 2 b ) ，另外， 研究人员还发现，t n f q 参与了肥胖相关的胰岛素抗性的形成( p e r a l d ie ta 1 ，1 9 9 6 ) ， 根据报道t n f a 增加了脂肪细胞中m i f 的分泌，这使得m i f 与t n f a 相关的胰岛素抵 抗也关联起来( h i r o k a w ae ta 1 ，1 9 9 7 ) ；血管紧张素原基因( a n g i o t e n s i n o g e n ) 和纤溶酶原 激活物抑制因子l ( p a i 1 ) 两者都是脂肪细胞分泌的因子，血管紧张素原基因在调节脂 肪细胞血液供应和脂肪酸释放中发挥重要作用( s h i m o m u r ae ta 1 ，1 9 9 6 ) ，纤溶酶原激 活物抑制因子在中心性肥胖个体中明显升高，并且参与了异常肥胖导致的血管类疾 病( a l e s s ie ta 1 ，19 9 7 ) 。 近十年的研究已明确显示，脂肪细胞不但具有内分泌功能，同时还兼有旁分泌 和自分泌功能。在调控能量平衡的同时，脂肪组织还调节多种生理过程。 1 2 肌肉中糖脂代谢 1 2 1 概述 肌肉分为心肌，平滑肌，骨骼肌三种不同的类型。骨骼肌是体内重量最大的组 织，人体处于安静状态时，脂肪酸和酮体是肌肉的主要能源，而对于葡萄糖的利用 情况与血浆胰岛素的水平有关，胰岛素可以加速葡萄糖通过细胞膜进入细胞被氧化 或合成糖元，糖元贮存在肌肉中供运动时需要。所以，饭后血糖升高，胰岛素也升 高，肌肉细胞中葡萄糖氧化和糖元合成也加强。当血糖和胰岛素恢复正常时，肌肉 就利用脂肪酸和酮体，以有氧代谢形式为主。骨骼肌被认为是体内最大的糖代谢组 织，在体内胰岛素刺激的葡萄糖吸收7 5 8 0 发生在骨骼肌( c o r c o r a ne ta 1 ，2 0 0 7 ； t i m m e r se ta 1 ，2 0 0 8 ) 。骨骼肌内甘油三酯浓度和胰岛素抵抗紧密相关，并且肌肉细胞 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 内脂质供应过多导致了胰岛素活性的减少，然而，肌细胞内脂质沉积与肌肉胰岛素 抵抗的产生的分子机理仍然不清楚( t i m m e r se ta 1 ，2 0 0 8 ) 。一些脂肪细胞因子已经显 示了直接或间接的影响胰岛素敏感性，他们通过调节胰岛素信号途径以及在糖和脂 代谢途径中的一些分子来发挥作用( f o n s e e a - a l a n i ze ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 1 2 2 糖代谢 糖是一类化学本质为多羟醛或多羟酮及其衍生物的有机化合物。在人体内糖的 主要形式是葡萄糖及糖原。葡萄糖是糖在血液中的运输形式，在机体糖代谢中占据 主要地位；糖原是葡萄糖的多聚体，包括肝糖原、肌糖原和肾糖原等，是糖在体内的 储存形式。葡萄糖与糖原都能在体内氧化提供能量。食物中的糖是机体中糖的主要 来源，被人体摄入经消化成单糖吸收后，经血液运输到各组织细胞进行合成代谢和 分解代谢。机体内糖的代谢途径主要有葡萄糖的无氧酵解、有氧氧化、磷酸戊糖途 径、糖原合成与糖原分解、糖异生以及其他己糖代谢等。骨骼肌被认为是体内最大 的糖代谢组织，肌肉中，胰岛素刺激的葡萄糖吸收主要是由g l u t 4 介导的。 葡萄糖转运蛋白4 ( g l u t 4 ) 是脂肪细胞和骨骼肌细胞协助葡萄糖转运的主要蛋 白质，主要存在于骨骼肌、脂肪细胞的胞浆中，一般情况下，不能起转运葡萄糖的 作用，仅在胰岛素的信号刺激下，才能通过易位作用转运到细胞膜上，促进饭后葡 萄进入上述组织中储存起来。在骨骼肌内，胰岛素刺激葡萄糖转运过程如下：首先 胰岛素与细胞膜上的受体结合，刺激g l u t 4 从胞内移动到细胞膜，然后与膜融合， 将g l u t 4 分子固定在细胞膜上，从而发挥转运葡萄糖的作用( g 孤r v e ye ta 1 ，1 9 9 8 ； m u e c k l e r ，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 脂代谢 脂类分脂肪和类脂两大类，类脂又包括磷脂、糖脂、固醇等。脂类广泛存在于 自然界，是动植物体重要的组成部分。脂类不溶于水而易溶于乙醚、氯仿等有机溶 剂中。脂类因其组成和存在部位的不同，而具有不同的生理功用和效能，主要有： ( 1 ) 生物体内主要的贮能和功能物质；( 2 ) 维持生物膜的结构和功能；( 3 ) 促进脂 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 溶性维生素的吸收；( 4 ) 维持体温，保护脏器；( 5 ) 转变成体内具有重要生理功能 的类固醇物质。由于可见，脂类物质和脂代谢有着重要的意义。 1 2 3 1 脂肪酸氧化 早在2 0 世纪初，脂肪酸的降解已经成为探讨的对象。k n o o p 最早用苯环作为标 记，追踪脂肪酸在动物体内的转变过程，并在其实验基础上提出了脂肪酸的1 3 氧化 学说。他推论脂肪酸氧化是从羧基端的p 一位碳原子开始，每次分解出一个二碳片段。 脂肪酸的p 氧化作用主要发生在线粒体中。脂肪酸通过1 3 氧化作用可完全降解乙酰 c o a ，然后乙酰c o a 再进入三羧酸循环彻底氧化成c 0 2 和h 2 0 ，并产生大量能量。 脂肪酸代谢的最终结果是b 氧化生成a t p 。在哺乳动物中，过氧化体对1 3 氧化 有重要影响，其生理性底物包括长链脂肪酸、中长链二羧酸和多不饱和脂肪酸。与线 粒体中1 3 氧化的结构和功能相比，过氧化体更适合于代谢长链脂肪酸，大鼠过氧化体 中有多种1 3 氧化酶，提示过氧化体的脂质氧化体系对应底物的多样性，特别是对长链 脂肪酸的多样性。乙酰辅酶a 氧化酶似c o ) 是脂肪酸在过氧化体中进行氧化的第一 步，也是限速步骤。a c o 基因是过氧化体氧化增殖的标志。a c o 基因主要在脂肪组 织，骨骼肌和肝脏中大量表达，并受到过氧化体增殖物激活型受体a ( p p a r a ) 的调控 ( y o o ne ta 1 ，2 0 0 6 ) ，p p a r a 是一种配体激活的核激素受体，在脂肪酸氧化器官如肝脏 和骨骼肌中高度表达( e s t h e re ta 1 2 0 0 1 ) 。 1 2 3 2 脂肪酸合成 生物机体脂类合成是十分活跃的，特别在高等动物的肝脏、脂肪组织和乳腺中 占优势。在肝脏中主要是脂肪酸和胆固醇的合成。脂肪酸的合成是在胞液中进行的。 c 1 6 以下的饱和脂肪酸的合成是以1 分子乙酰c o a 作为引物，以其它乙酰c o a 作为 碳源供体，通过丙二酰单酰c o a 的形式，在脂肪酸合成酶系的催化下，经缩合、还 原、脱水、再还原反应步骤来完成的。c 1 6 以上的饱和脂肪酸合成自是在延长系统的 催化下，以软脂酸为基础，进一步延长碳链形成的。不饱和脂肪酸的合成则是通过 氧化脱氢途径进行的，催化这个反应的酶称为脱饱和酶。它在0 2 和n a d p h + h + 参 与下，将长链饱和脂肪酸转化为相应的不饱和脂肪酸。 脂肪酸合成酶( f a s ) 是体内合成脂肪途径中的一个关键酶，主要存在于脂肪、肝 5 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 脏等组织中。它通过催化乙酰c o a 和丙二酰c o a ，生成长链脂肪酸。f a s 的活性高 低直接控制着体内脂肪合成的强弱，从而影响整个机体中的脂肪含量( w a n ge ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。f a s 表达水平升高能显著增加甘油三酯在体内的沉积。脂肪组织中f a s 表达 量比肝中高7 倍，但是在肌肉组织中表达量非常低( d i n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 3 脂肪酸水解 细胞内脂肪以甘油三酯的形式储存，它是由甘油的三个羟基和三个脂肪酸分子 缩合、失水后形成的酯。脂肪降解的第一步是水解成甘油和脂肪酸，此反应由脂肪 酶催化。激素敏感酯酶( h s l ) 是目前研究最多的水解甘油三酯的脂肪酶。非活化的 h s l ，存在于胞质之中。在脂解刺激条件下，导致p k a 介导的激素敏感脂肪酶的磷 酸化，使激素敏感酯酶从细胞液易位到脂滴表面，开始脂解作用。 1 3 脂肪与肌肉的对话 肌肉组织作为体内最大的能量代谢组组织，脂肪组织能分泌许多细胞因子，如 l e p f i n ，a d i p o n e c t i n ，r e s i s t i n ，t n f 0 【，m c p 1 ，r b p 4 等，对肌肉能量代谢起着重要 的调控作用，研究脂肪骨骼肌之间的对话( c r o s s t a l k ) 对骨骼肌胰岛素抵抗的发生有非 常重要的意义。 脂肪细胞能够分泌大量细胞因子，脂联素和瘦素已经被证明能够增加脂肪酸氧 化并减少肌肉脂肪含量，因此增加肌肉胰岛素敏感性( 图1 ) ，而另外两种脂肪细胞 因子，r e s i s t i n 和t n f q 显示了能够促进胰岛素抵抗( d y c ke ta 1 ，2 0 0 6 ) ，m c p 1 能够 诱导脂肪细胞和肌细胞胰岛素抵抗( s e l le ta 1 ，2 0 0 6 ) ，r b p 4 能够促进体内胰岛素抵 抗( y a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 以前研究认为，棕色和白色脂肪细胞来自同一种成脂肪前体细胞，但最近的研 究发现，棕色脂肪是骨骼肌的一种衍生物，棕色脂肪细胞起源于表达m y f i 基因( 迄 今只在肌肉细胞中发现的一种标记) 的成骨细胞( s e a l ee ta 1 ，2 0 0 8 ) 。除此之外，目前 的一些研究结果已提出除脂肪组织外，骨骼肌也能像内分泌器官一样释放一些分子 影响远处的靶器官，如白介素1 5 ( 1 l 一1 5 ) ，在脂代谢方面起着重要的作用( a l m e n d r o e ta 1 ，2 0 0 8 ；a r m i t a g ee ta 1 ，19 9 5 ) 。 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 图1 瘦素和脂联素刺激肌肉脂肪酸氧化并减少脂肪含量 f i g u r e1p r o p o s e dm e c h a n i s mb yw h i c hl e p t i na n da d i p o n e c t i ns t i m u l a t ef a o x i d a t i o na n dr e d u c el i p i da c c u m u l a t i o ni ns k e l e t a lm u s c l e 1 4 脂联素基因 1 4 1 脂联素基因的发现和功能 脂联素是最近才发现的一个脂肪细胞分泌的因子，脂联素也被称为 a c r p 3 0 ( s c h e r c re ta 1 ，1 9 9 5 ) ，a d i p o q ( h ue ta 1 ，1 9 9 6 ) ，a p m l ( m a e d ae ta 1 ，1 9 9 6 ) ，或者 是g b p 2 8 ( n a k a n oe ta 1 ，1 9 9 6 ) ，最初被四个不同的研究小组用不同的方法发现的。 脂联素基因编码了一种分泌型的蛋白，这种蛋白仅仅只在白色脂肪组织和褐色脂肪 组织中表达。脂联素羧基末端是球状区域，氨基末端是胶原结构域，结构类似于 c 1 q ( s h a p i r oa n ds c h e r e r , 1 9 9 8 ；y o k o t ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ， 脂联素的表达能够减少肥胖，胰岛素抵抗( h u c ta 1 ，1 9 9 6 ) 。重要的是，脂联素水 平的减低是发生在这些动物患糖尿病的初期，并且与胰岛素敏感性的减低是相并联 的( h o t t ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在肥胖的人群中血浆脂联素水平也同样是减低，特别是那些内 脏肥胖的人群，与胰岛素抵抗相反的联系在一起( a r i t ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。预期的和纵向的 研究表明低浓度的脂联素伴随着高的糖尿病发病率。减少血液中脂联素水平也同样 能观察到许多种伴随着胰岛素抵抗的疾病，像心血管疾病和高血压。 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 脂联素具有调节代谢的作用( f r u e b i se ta 1 ，2 0 0 1 ) ，啮齿动物注射脂联素的球状区 能加速肌肉中游离脂肪酸的氧化，脂联素球状区和全长脂联素能刺激并活化肌肉中 a m p kt h r l 7 2 磷酸化( t o m a se ta 1 ，2 0 0 2 ；w ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。a p p l l 与a d i p o r l 结合之 后能调节这种功能( m a oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 4 2 脂联素基因和蛋白质的结构 人脂联素基因位于染色体3 q 2 7 ，全基因组扫描研究发现，3 q 2 7 是2 型糖尿病 和其他代谢症的易感区，所以推测脂联素与这些症状有关( k i s s e b a he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。人 脂联素基因全长约1 6 k b ，含有3 个外显子和2 个内含子，组织形式符合g t a g 规 则。蛋白质从第二个外显子开始编码( 1 w a k ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 人脂联素前体由四个部分组成( 图2 ) ，包括n 端信号肽( 氨基酸1 1 9 ) 、非 同源区( 氨基酸2 0 - - 一4 2 ) 、胶原区( 氨基酸4 3 - - - 1 0 8 ) 和c 端球状区( 氨基酸1 0 9 - - - 2 4 4 ) 。成熟形式的脂联素进行多种修饰，如糖基化、多聚化和蛋白酶切割。胶原区 有四个l y s 进行了羟基一糖基化( o - g l u g a l ) ( w a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) ，分别是l y s 6 8 、l y s 7 1 、 l y s 8 0 和l y s l 0 4 。另外，p r 0 9 4 进行了羟基化。脂联素是属于一种能形成多聚体蛋 白的家族( c r o u c he ta 1 ，1 9 9 4 ；m c c o r m a c ke ta 1 ，1 9 9 7 ) ，脂联素通过其胶原结构形成3 种低聚物形式：低分子量的三聚体( l m w ) ，中等分子量的六聚体( m m w ) ，和高 分子量的1 2 1 8 聚体脂联素( h m w ) ( v a j v a n ie ta 1 ，2 0 0 3 ；w a k ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。球状区 ( g l o b u l a rd o m a i n ) 与补体因子c l q 、v l 型x 型胶原等的球状区有较高同源性，在 血液中独立存在，但含量很少( f r u e b i se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在不同物种之间脂联素保守性很 强。人、牛、小鼠与猪相比，同源性分别为8 7 、8 8 和8 5 。 8 华中农业大学2 0 0 9 月硕士学位论i c 3 e ( s ) v a 6 a b l e l0 自 g l o b t d a t i d o m a i nd o t r i n n 二】强驻圜匪受曼互曩曩娶互互曩互夏趸霾c 11口421 q 燕 、 哺。g m ，。蛳d g i 。岛曲d p g 叼脚删。m 。：；蠢 g - x y ”p e 出t h a tb f ma ”睁kh e l i xi s s - j “湘b o r 山dc y s t g , p ：* e c 硼p l e m e n t m p q w m c t q d o m a i n 一佃r 咖删m b g y w 曲t n 轴r e c e p t o r - b i n d i r d d m a i n ) p c o n s e r v e d p r 。| i n e h 州t d m m e d p r 0 4 1 n e 目c 州捧i n o m 州咖蛐i y 刮柏d 图2 人脂联素结构 f i 9 2 d o m a i as t r u c t u r e o f h u m a na d i p o n e c t i n 脂联素在在血浆中含量很高，在健康人血浆中达到1 g m g m l 1 70 m g m l ( a r i t ae t a 1 1 9 9 9 ) 。位于非同源区的c y s 3 6 对脂联素形成六聚体非常重要( 图2 ) 。脂联素单 体与另一个单体之自j 形成二硫键，然后与第三个单体形成三三聚体，最后第三个单体 通过自身的c y s 3 6 与另一个三聚体形成六聚体。h m w 由非共价键连接，但依赖于 完整的六聚体形成。另外，对脂联索的高级结构进行研究发现，脂联素球状区的高 级结构与t n f 家旅蛋白质很相似( 尽管一绒结构没有同源性) 。说明二者在进化上 有一定的亲缘关系( s h a p i ma n ds c h e r c r 。1 9 9 8 ) 。 1 5 脂联素受体基因 l5 1 脂联素受体的发现 y a m a u c h j 等用脂联素的球状结构域( g a d ) 筛选骨骼肌表达文库发现脂联素有两 个受体a d i p o r l 和a d i p o r 2 ( y a m a u c h i 毗a l ，2 0 0 3 ) ，受体l 和2 都古有七个跨膜结构 域，但是与g 蛋白偶联的受体有着明显的区别( 图3 ) ，他们通过激活p p a ra ，a m p k 和p 3 8m a p k 等信号分子来发挥作用。受体1 和2 可