（分析化学专业论文）可连续换样的集成化重力驱动微流控芯片连续流动分析系统.pdf

浙江大掌硕士掌位论文摘要 摘要 微全分析系统是当前分析化学发展的前沿领域之一，代表了当今分析设备微 型化集成化和便携化的发展趋势。微流控芯片系统的核心是对微流体的控制。微 流体的驱动是微流控操作的基础，目前微流控芯片分析系统中使用较多的驱动方 式是电渗流和微量注射泵，前者多用于芯片毛细管电泳系统，需多点高压电源设 备，驱动系统较为庞大复杂；后者多应用于芯片连续流动体系，为获得稳定微量 的流速( p l n l m i n ) ，对泵的加工精度要求很高，因此造价昂贵。芯片上重力驱 动的优点是不需要额外的驱动力源和任何驱动装置，造价低廉，使用方便，可显 著提高整体系统的集成度，目前较多应用于芯片上连续流动分析体系。但目前文 献所报道的此类分析系统均采用手工进样方式，不具连续自动换样功能，换样操 作繁琐费时，效率低，影响了系统对不同试样的分析通量和实用性。 本文针对该问题，建立了一种可连续换样的集成化重力驱动微流控芯片连续 流动分析系统，系统采用化学发光检测法。文中第一章介绍了目前微流控芯片分 析领域内，重力驱动技术、连续换样技术和化学发光检测技术的发展现状及存在 的问题。第二章为本工作的实验部分，详细描述和总结了与本工作有关的玻璃芯 片的制造和使用技术。第三章是本工作的结果与讨论部分。 在本文所建立的集成化重力驱动微流控芯片连续流动分析系统中，采用套管 型接口的连续换样系统，利用l u m i n o l - - k 3 f e ( c n ) 6 】一h 2 0 2 化学发光体系考察系 统分析性能。换样时间仅为1 5s ，可使分析系统的分析速度达到1 0 0 样，j 、时的 高通量。同时，系统中还采用了水平贮液池和出口引流管等重力驱动流体控制技 术，使得液流速度更加稳定，增加了系统连续工作时间，显著降低试剂和样品的 消耗。系统对h 2 0 2 检测的重现性为o 3 ( r s d ，n = 5 ) ，线性范围1 1 0 。6 l 1 0 4m o l l ，检钡0 限为2 0 1 0 m o l l 。 实验结果表明，本工作建立的重力驱动微流控芯片连续流动分析系统具有结 构简单，体积微小，集成度高，操作简便，分析速度快等特点。 坠! ! ! ! ! 兰2 i 彗：盘壁2 已2 l 三皇盘i 磐墨譬罂盐：銎i 缸垒2 2 堡2 垒 a b s t r a c t m i c r o c h i p b a s e df l o wa n a l y s i ss y s t e m sw i t l ll i q u i df l o w so p e r a t e db yg r a v i t ya r e b e n e f i t e db yn or e q u i r e m e n tf o ra ne x t e m a lp o w e rs o u r c e ，a sw e l la sa n y “v i n g e q u i p m e n t t h u se x t r e m e l ys i m p l i f i e ds y s t e m s c a l lb ed e v e l o p e d h o w e v e r , p r o b a b l y f o r a c h i e v i n gr e l i a b l eo p e r m i o nw i t hp l a s t i cc h i p s ，i nm o s tc h i p b a s e da n a l y t i c a l s y s t e m s w i t h g r a v i t y - d r i v e n f l o w sh i t h e r t o p u b l i s h e d ，t h es a m p l e i n t r o d u c t i o n p e r f o r m e d i nm a n u a lm o d e c o n t i n u o u s ，r e s u l t i n gi nr e l a t i v e l yl o n ga n a l y s i s t i m e am i c r o f l u i d i cc h i pw i t h g r a v i t y - d r i v e nf l o w i sd e s c r i b e d ，f e a t u r i n gl o w s a m p l ea n d r e a g e n tc o n s u m p t i o n ，s t a b l e f l o wr a t e ，a n d n o n - i n t e r r u p t e d c o n t i n u o u s s a m p l e i n t r o d u c t i o n c o n t i n u o u s s a m p l e i n t r o d u c t i o nw a sa c h i e v e di nt h i s s y s t e mb y c o n t i n u o u s l yd e l i v e r i n gt h es a m p l es o l u t i o n a to 2 4m l m i n ( p r o p e l l e d b y a p e r i s t a l t i c p u m p ) i n t o t h es a m p l er e s e r v o i rv i aa c a p i l l a r y ( 2 5 0m ni d ，5 0 0 ”mo d ) ，w h i c hw a s i n s e r t e di n t ot h er e s e r v o i r t h es a m p l ew a sa l l o w e dt of l o wf r e e l yf r o mt h er e s e r v o i t , g u i d e db y af i l t e rp a p e rr o l l ( 1r n n lo d ) t om a i n t a i naf i x e dl i q u i dl e v e l al o n g e r ( 1 0 0 m m ) a n dw i d e r ( 1 2i t n t ii d ) c h a n n e lw a su s e dd o w n s 廿e a mo f t h ed e t e c t i o nz o n et o i n c r e a s et h eo v e r a l lh y d r o s t a t i cp r e s s u r ea n df l o w - r a t et oa b o u t4 3 0n l m i nw i t h o u t i n c r e a s i n g t h e l e n g t ho ft h e c h a n n e lu p s t r e a mo ft h ed e t e c t i o nz o n e h o r i z o n t a l t u b u l a r r e s e r v o i r s l 3 1 ( 1 5 l l l m i d ) w e r e u s e di nt h i sw o r kt om a i n t a i ns t a b l e h y d r o s t a t i cp r e s s u r e i nt h e c h i pc h a n n e l s ，d u r i n gp r o l o n g e dw o r k i n gp e r i o d s d e p e n d i n g o nt h ef l o w r a t ea n dr e s e r v o i rc a p a c i t y , n o n - i n t e r r u p t e dw o r k i n gf o rh o u r s o re v e nd a y si sa c h i e v a b l e f l u i d sw e r ek e p tw i t h i nt h eh o r i z o n t a lr e s e r v o i r s b y s u r f a c et e n s i o n ，w h i l eb e i n g g r a d u a l l yc o n s u m e db yg r a v i t y f l o w s t h ep e r f o r m a n c eo ft h es y s t e mw a st e s t e du s i n gh 2 0 2a sam o d e ls a m p l ew i t h c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n b y t h e h u n i n o l k 3 f e ( c n ) 6 h 2 0 2 r e a c t i o n f o r c h e m i l u m i n e s c e n c em e a s u r e m e n t s ，t h ed e t e c t i o nz o n e ( 1 5 1 5 m m ) o ft h ec h i pw a s p o s i t i o n e dd i r e c t l ya g a i n s tt h ew i n d o w o fa p h o t o nc o u n t e r t h ed e t e c t i o nl i m i t sf o r h 2 0 2i s 2 0 1 0 7m o l lw i t hal i n e a r r a n g e o f1 1 0 - 6 1 1 0 _ 4m o l la n d r e p e a t a b i l i t yo f 0 3 ( r s d ，n = 5 ) t h es a m p l i n gt h r o u g h p u tf o rt h es y s t e m i s8 0 1 0 0 h w i t has a m p l e c h a n g i n g t i m eo f1 5sa n da n a n a l y s i st i m eo f 4 0 s 浙江大学硕士毕业论文 第一章绪论 1 1 微流控芯片分析系统的发展 面临2 1 世纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学正经历着深 刻的变革，其中一个日益明显的发展趋势就是化学分析设备的微型化、集成化、 与便携化。2 0 世纪9 0 年代初，瑞士的m a n z 和w i d m e r 提出了“微型全分析系 统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e mu t a s ) ”概念，就是通过化学分析设备的 微型化与集成化，通过微电加工技术( m e m s ) 把在微米数量级的各种组件集 成在由硅、玻璃、石英或者塑料等材料制成的器件中，最大限度地把分析实验 室的功能转移到便携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的微小器件上。代表 了当今分析设备微型化集成化和便携化的发展趋势，它最终的目标是实现分析 试验室的“个人化”“家用化”【”l 。 u t a s 分为两类，包括微流控芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p s ) 和微阵列芯片 ( m i c r o a r r a yc h i p s ) 。微流控芯片是儿一t a s 中当前最活跃的领域和发展前沿，其 核心是对微流体的控制，通过各种方法实现对微通道网络内流体的控制，完成 分析过程所需的的各种操作。 本工作的主要内容是有关重力驱动微流控芯片连续流动分析系统的试样引 入技术的研究，系统采用化学发光法检测。因此以下分别对当前芯片驱动技术、 芯片连续换样技术、芯片化学发光检测技术的进展作一简要综述。 1 2 芯片重力驱动技术的发展现状 1 2 1 微流体驱动技术 依据不同的要素，微流体的驱动系统可有多种分类方式。依据驱动系统有 无活动的机械部件，可分为有活动机械驱动部件和无活动机械驱动部件的微驱 动系统( 泵) ，即机械和非机械驱动系统。依据微泵中流体控制部件的组成不同， 第一章睹论 可分为有阀和无阀微泵。依据微驱动系统所用驱动( 致动) 动力的不同，可分 为电渗动力、电磁动力、重力( 流体静压力) 、气动动力、热气动动力、表面张 力、剪切力、离心力、声波动力、压电动力等。微流控分析系统中目前出现的 一常见的微流体驱动系统的分类表如图1 1 。 图1 1 微流体驱动系统的分类表 目前，电渗流是微流控芯片分析系统中使用最广的驱动和控制技术，尤其 浙江大学硕士毕业论文 在发展较为迅速的芯片毛细管电泳系统中是占主导地位的驱动技术。电渗驱动 的原理是利用微通道表面存在的固定电荷进行驱动，属于致动力直接作用于流 体的驱动方式。电渗驱动的优势是：可以实现无阀无机械部件的微流控操作； 液流流动无脉动；通过设计各端点施加的电压及电压变换程序，可完成较为复 杂的微流控操作。但采用电渗驱动也有一定的局限性，如驱动需高电压( 电场 强度在5 0v c m 5 0 0 0v c m 之间) ，驱动系统外部设备体积较大，结构复杂；电 渗流依靠通道双电层的存在进行驱动，而双电层易受多种因素变化的影响，如 外加电场强度、通道壁性质、介质解离性、离子强度、粘度等，甚至试样的试 样中组分的吸附，因此电渗流对通道表面性质的变化较为敏感，系统在长时间 工作中的稳定性有待提高。 此外，在微流控芯片连续流动分析系统中使用较多的是芯片集成化微机械 泵。微机械泵中目前以往复式机械微泵最为常见，通常由致动器和两个单向阀 构成。按致动器类型的不同分类，包括压电微泵、电磁微泵、静电微泵、气动 微泵、热气动微泵、双金属微泵等。虽然微机械泵具有体积微小，集成度高， 驱动可靠等优点，但其结构较为复杂，集成化加工难度很大，对微加工设备和 技术要求均较高，系统造价昂贵。此外，通常微泵的外部控制系统体积也较大。 1 2 2 重力驱动技术 重力驱动技术在常规的流动分析系统中早有应用，在微系统中使用，被赋 予了一些新的特性，其主要优点是： ( 1 ) 采用重力为驱动力，泵的结构极其简单，没有活动机械部件，无需专门的 制动系统和能源系统，加工不需或仅需简单的微加工技术； ( 2 ) 泵的操作简单，调节泵速只需简单改变通道进口液面与出口液面之间的压 差即可，且可调范围较大，覆盖纳升至毫升的范围； ( 3 ) 液流流动无脉动现象： ( 4 ) 适合应用于连续流动分析系统。 ( 5 ) 对液流性质要求不高，无论是导体或非导体液体，水溶液或有机溶剂均可 驱动。因此可以应用于有生物活性的物质。 在应用于连续流动分析系统时，重力驱动系统也有它的局限性：液流更换 第一章绪论 较为不便，需耗费较多时间，不易实现芯片换样操作的自动化。目前多用于系 统中固定液体的连续输送。 下面将详细介绍重力驱动技术在微流控连续流动分析系统中的使用情况。 在w u 等。1 建立的重力驱动的分析系统中，利用一段6 5a m 长的毛细管作为 动力源进行停流检测。如图1 2 ，实验过程中，当把毛细管末端移动到芯片下 方，使得进样和出口处液面高度差为5 0c m 时，流体利用液位差产生的动力进 样，当把毛细管末端移动到芯片高度一致时，由于进样和出口处液面高度差为 0 ，此时停止进样，通道内液体通过扩散混合发生化学发光反应。系统被用于过 氧化氢的测定。其试样流速为o 3g l s ，进样重现性为7 3 ，对过氧化氢的检 测限达1 0 7 m 。分析时间约1 2 0s 样。 l m m n 哪r c p o o o i 嘲 图1 2 过氧化氢重力驱动芯片结构示意图 每个进样小孔连接的毛细管( 2 0 0 岬li d ，3 6 0t i mo d ，长6 5c m ) 1 9 9 9 年，y a g e r 等【4 古1 报道了一种利用重力驱动的多相层流分离分析系统， 用于血浆分析。芯片大小只有5 2c m x 8 3a m ，其进出口液面间高度差为5c m ， 其中液体的流速约为9 7n l s 。其系统装置如图1 3 ( a ) 。其操作方法是：将试 - 4 - 浙江大学硕士毕业论文 样和试剂注入通道和贮液池后，将芯片竖立，利用重力驱动试样和试剂溶液向 下流动，进行多相层流分离和混合反应。该系统设计了包含三相层流的分离反 应和校正系统，在对试样进行分析的同时，对层流间物质传输效率进行校正。 由图可见，系统结构简单，没有任何专门的致动系统和能源系统，体积小，缺 点是其样品池液面随试样的消耗而变化，不能提供连续长时间的稳定的流速， 而且换样不便。根据微通道内的层流扩散原理，也可以将重力驱动用于芯片试 样纯化“1 的系统。芯片结构如图1 3 ( b ) 所示，系统分离了荧光素和经过标记的 右旋糖苷分子，操作简单，省去了高速离心机等体积较大设备的使用。 ab 图3 重力驱动的卡片式微流动分析芯片 a 血液分析芯片；b 过滤纯化芯片 2 0 0 2 年，李丹妮等1 8 叫报道一种重力驱动芯片连续流动分析系统。芯片构型 如图1 4 所示。系统采用水平贮液池结构，提供长时间的稳定液流流速。即在 系统工作时，将进、出口液池水平放置，在较长时间内，液流的流动只会使液 面产生水平位置的平移，而不会改变系统中的液位差。系统采用化学发光检测 器。芯片上各个贮液池内的溶液进入通道流动( 流速为1 0 0n l m i n ) 、混合，在 检测区域发生反应产生化学发光。反应通道设计预期可以实现葡萄糖等酶体系 5 - 第一章睹论 的检测。 图1 4 重力驱动多通道汇合化学发光检测微流控分析芯片 a 鲁米诺：b 铁氰化钾；c 葡萄糖酶：d 葡萄糖溶液 z h u 等 1o 】也提出了类似的系统提供重力驱动下的连续长时间的稳定流速。 c h o 等“则直接将这类重力驱动系统应用于活性精子筛选。其芯片结构如图1 5 ( a ) 所示。芯片由玻璃做底板，在p d m s 盖片上用软刻蚀方法制作通道和小 槽。芯片有两个进口，一个用于含活体精子样品的进样，另一孔用于载流进样， 流速o 0 0 8u l s 。具体的筛选过程如图1 5 ( b ) 所示。当样品溶液在长的通道 内流动时，由于形成了层流，细通道内的失去活性的死精子和经标记的圆形小 颗粒不会扩散到缓冲液粗通道内，但是由于活体精子自身具有游动能力，有一 部分游动到了缓冲液通道，最后从筛分通道筛选出活动能力比较强的精予。由 于使用了重力作为驱动力，对具有生物活性的样品没有特殊要求和破坏作用， 而且不需特制能源系统，整个系统装置很简单。 ，6 - 浙江大学硕士毕业论文 图1 5 重力驱动两相层流筛分社物活性物质微流控芯片分析系统 a 芯片外观图 b 芯片通道内筛分过程示意图 综上所述，目前文献报道的重力驱动芯片分析系统虽具有系统结构简单， 体积小，容易操作等优点，但多数系统未能解决芯片系统的连续自动换样问题， 系统换样基本依靠手工完成。本文的主要研究目标即是解决重力驱动系统的连 续自动换样问题。 第一幸睹论 1 3 芯片试样引入技术 任何独立的分析系统，包括常规分析系统和微芯片分析系统，均存在一个 与外部分析对象的衔接问题。微流控芯片分析系统内部进行的是体积在皮升至 纳升级液体的操作，在与其联系的外部分析对象中则进行的是微升、毫升，甚 至升级液体的操作。因此，需要在芯片分析系统中采用试样引入接口实现这种 宏观系统与微观系统的衔接。目前在该领域内的研究较为薄弱。微流控分析中 通常采用的间歇式换样方法，换样需要中断分析过程，更换液池试样，操作繁 琐，难实现多样品连续检测，分析时间较长，效率低，不利实现自动化，使得 芯片分析速度快的主要优势难以在实际应用中得到充分的发挥。 当前，微流控芯片系统中试样引入技术的研究主要集中于芯片毛细管电泳， 图1 6 为部分典型的毛细管电泳芯片试样引入接口的结构示意图“。图1 6 ( a ) 采用固定试样池型接口，通常以手工操作进行间歇换样，其装置和操作均较为 简单，是目前文献中采用较多的技术。但其操作步骤繁琐费时，效率低，换样 的时间常远远超过分析时间，是实现系统自动化的主要瓶颈之一。图1 6 ( b “”“1 ， c ，d “”) 则在系统中采用带有进出口的流通式试样引入接口，通过在芯片上微通 道旁加工与其相通的专用的试样引入通道，首先将外界试样试样引入通道内， 再由此进入芯片微通道内。采用该类型接口可实现自动连续的试样引入。图 1 6 ( c ) “7 1 采用溢流式试样引入接口，在连续引入试样时从池内溢出的液体由滤 纸圈导流，保证了芯片试样池液位的相对恒定，较好的解决了引入试样时候流 动所产生的流体压力对电泳进样分离操作的干扰问题。系统被应用于异硫氰酸 荧光素( f i t c ) 标记的氨基酸的分离及标记反应过程的在线监测。当系统在使用 蠕动泵驱动试样流速低于0 6m l m i n 时，可实现连续换样，不需调整液位等操 作，可保证1 小时内稳定工作，对不同氨基酸组分分析的重现性为1 5 2 6 r s d ( n = 1 1 ) 。系统分析速度可达到4 0 8 0 样d , 时，系统换样量8 0 - 2 4 0h l 。图1 6 ( e ) 为何巧红掣】报道的另一类试样引入接口模式取样探针式接口，特点是取 样体积小，仅数百n l 。加工方法是在芯片通道的一侧打孔，将3 5c m 长的石英 毛细管( 5 0 岫i d ，3 2 5l a r no d ，作为取样探针使用) 插入，与芯片耦合。取 - 8 - 浙江大学硕士毕业论文 图1 6 各类试样引入接口结构示意图 ( a )固定贮液池接口：( b ) 流通式接口：( c ) 流通溢流式接口0 ：( d ) 流通滴液式接 口：( e ) 取样探针式接口 样电极连同毛细管一起伸入水平放置的试样小管中。采用激光诱导荧光法进行 - 9 第一章绪论 检测。分离测定f i t c 标记的精氨酸、苯丙氨酸混合物，试样消耗量仅为0 2 5 此， 分析速度达到3 6 样胁，空白携出少于3 。 综上所述，目前微流控芯片的试样引入技术研究主要集中于芯片毛细管电 泳系统。缺乏与重力驱动芯片系统相匹配的自动换样方法，尤其是对于水平贮 液池的重力驱动系统，如何在完成换样操作时保证系统工作的稳定是需要研究 的课题。 1 4 芯片化学发光检测技术 目前，众多基于不同检测原理的检测方法都被用于微流控芯片分析系统中。 微流控芯片检测器一般按其检测原理进行分类，大致可以分为光学检测器、电 化学检测器、质谱检测器等。图1 7 为微流控芯片检测器的分类。 质谱法、核磁共振法等仪器由于使用的检测器体积庞大，造价昂贵而使用 受到较大局限，不易普及。电化学检测法使用较为普遍，但需要在芯片上加工 微电极，对设备和工艺要求较高。此外，目前芯片电化学检测系统工作的稳定 性有待进一步提高。芯片上紫外一可见吸收光度检测的有效光程受通道尺度限 制，导致灵敏度较低。目前，在微流控芯片分析系统中使用最多的是激光诱导 荧光检测法( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 。其特点是检测灵敏度高。需要 使用激光光源，还需要较复杂的光学系统，检测系统体积较大不易实现微型化 和集成化。化学发光在芯片上众多检测方法中，因灵敏度高，线性范围宽，仪 器设备简单的特点而具有独特优势。在本工作所建立的芯片分析系统中，选择 采用化学发光检测方法。以下将简要介绍芯片化学发光检测方法的进展。 化学发光检测方法的优点有：不需要任何光源，消除了光源不稳定和杂散 光所带来的影响，也不存在背景光。具有高的检测灵敏度，一般在n g m l p g m l 数量级；对于一些无机离子测定下限可达到1 0 。2g m l ，比光度分析法高3 4 个数量级。检测线性范围宽，反应物的发光强度与待测物的浓度可在4 5 个数 量级范围内成线性关系。所使用的检测装置比较简单，无复杂的光路系统，在 系统微型化方面具有独特的优势。化学发光检测的另一个优点是所谓“化学谱 带变窄”效应，这是由于化学发光反应的动力学速度很快，在样品还未来得及 1 0 浙江大学项士毕业论文 充分扩散到本体溶液前就已产生化学发光信号；它适合于在线快速检测，记录 信号峰尖锐，不会造成明显的区带展宽【1 9 1 。 图1 7 微流控芯片检测器分类图 化学发光检测方法的局限性有：由于化学发光现象一般比较短暂且随时间 变化较大，在使用间歇式手工操作时较难取得良好精度；方法的选择性不高， 有时需要与分离方法结合起来；一些化学发光反应在非水介质中进行( 如t c p o 第一幸培论 h 2 0 2 体系) ，或反应中有气体产生( 如l u m i n o l - h 2 0 2 体系) ：对环境因素，如温 度、酸度、试剂、离子强度的变化敏感。在选择化学发光作为微流控芯片分析 系统的检测器时应考虑其不利影响。 2 0 0 0 年x u 等1 2 0 1 将化学发光检测用于有混合反应器的芯片系统，测定了水 溶液中的c r ( 1 l i ) 。采用的微反应芯片及化学发光检测装置结构如图1 8 ( a ) 和图 l _ 8 ( b ) 所示，在5 n l l n 1 0 m l n 的芯片上，通道总长6c m ，宽1 6 0 l a m ，深5 8r t m ， 通道内部体积约o 5 3 此，管路长6c m ，管路体积o 4 8 l ，总体积1 0 1 皿。流路 总死体积3 5 5 吐。本实验采用此微型。发光检测区域的长度为21 1 1 1 1 1 ，发光信 泵1 2 m m a 记录仪b 图1 8 微混合反应化学发光芯片 a 结构示意图；b 检测装置示意图。 - 1 2 - 浙江大学项士平业论文 号用光电倍增管检测。使用2 5 皿的微注射泵进样，用毛细管( 5 0i n ni d ) 和 p t f e 管( 0 0 1 2c m i d ) 连接泵和芯片进样1 ：3 ，总计死体积3 5 5 n l ，试样流速 3 1 2 5g l m i n 。试剂和样品在芯片微混合器里混合，在通道末端选一区域检测。 检测c r ( 1 l i ) 的线性范围为1 0 - 61 0 m o l l ，检出限为1 0 m o l l 。 2 0 0 1 年，林金明等 2 1 - 2 2 1 设计了一种毛细管电泳芯片用于茶多酚的分离与化 学发光检测。2 0 0 3 年时又与微流泵结合，将其应用于过渡金属离子的化学发光 测定【圳。芯片通道构型如图1 9 所示。在微芯片上将毛细管电泳分离与化学发 光检测联用，成功地实现了金属离子c u 2 、c 0 2 + 、n i 2 + 的电泳分离化学发光检 测，检测限分别为5 0 x1 0 。9 ，5 0 1 0 。1 和1 0 1 0 m o l l 。实验中被检测的样品 由电渗流驱动，电泳分离后被分离的组分到达反应小池6 ，与由微流泵驱动的 鲁米诺( 4 ) 和过氧化氢( 5 ) 混合溶液汇合，发生化学发光反应。 2 0 0 1 年，g r e e n w a y 等 卅采用电渗驱动样品进样的芯片体系，结合化学发 光检测分析了硝酸盐，进样速度0 3 此，m i n ，进样重现性8 3 ，检测限为o 5 1 i t m o l l 。之后在芯片上对比了电渗和压力泵驱动系统的性能【2 “，采用化学发光 法分析c o ( i i ) 。采用电渗进样：进样速度2 3 j l m i n ，进样重现性6 9 。使 用压力泵进样：进样速度o _ 3m l m i n ，样品消耗达1 5 此。进样重现性4 5 ， 检测限1 0 m m o i l 。 2 0 0 0 年，g r e e n w a y 掣2 q 利用三联吡啶钌发光体系，分析了可待因，通过 加入非离子表面活性剂( t r i t o nx - 4 5 ) 来增强化学发光效率及改变电渗流，采 用p m t 检测。使用的芯片底层是用湿法刻蚀的玻璃芯片，通道宽度2 0 0i n n ， 深1 0 0 “i 。上层是带有3 个3m l n 内径液池的1 7r n r n 厚的塑料板，整体大小为 2 5 2 0c m 。该体系的电渗进样速度1 8g l m i n ，分析重现性为8 ，线性范围 达到三个数量级，检出限为8 3 1 0 - 1m o l l 。 1 9 9 8 年，m a n g r u m 等【2 7 】报道了一种芯片毛细管电泳化学发光检测系统用 于免疫分析。芯片的通道结构见图1 1 0 。芯片化学发光检测区域的背面镀上铝 膜反射镜用于增大光收集效率。采用辣根过氧化物酶( h r p ) 催化鲁米诺和过 氧化氢的化学发光反应，通过检测免疫反应产物中的h r p 标记羊抗鼠i g g ，间 接测定鼠i g g 。反应试剂鲁米诺加在分离缓冲液中，过氧化氢在反应通道上游 第一幸睹论 图1 9 毛细管电泳芯片。1 样品池；2 样品废液池；3 缓冲液池；4 l u m i n o l 进样池；5 过氧化氢进样池；6 反应检测池；7 废液池 弓多 。_ 图1 1 0 毛细管电泳化学发光微流控芯片通道结构示意图 b 鲁米诺一缓冲溶液；s 试样溶液；w 废液；r 过氧化氢试剂 s c 分离通道；r c 反应通道；d 检测点 - 1 4 浙江大学硕士毕业论文 y 型口处与分离通道的溶液汇流，化学发光信号由光电倍增管检测。在采用化 学发光检测方法的系统中，提高分析选择性的一种方法是将酶催化反应与发光 检测结合。此类体系多应用于芯片上连续流动分析系统。 2 0 0 1 年，k i b a 等【2 8 l 制作了一个螺旋形化学发光反应流通池( 2 5 2 5 1 t o n i 3 ) ，分析了雨水中的过氧化氢。过氧化氢酶被固定在螺旋形流通池的通道壁 上，流通池通道环绕2 0 圈，长5 0c m ，宽1 5 0p a n ，深2 0 岬，体积有1 4 皿。 对过氧化氢的检测线性范围是5n m o l l 5 “r n o l l ，检测限是1n m o l l 。 2 0 0 1 年，n a k a m u r a 等 2 9 1 在单晶硅片上刻蚀了反应室、混合室和螺旋型通 道，底部用玻璃封合，并在反应室中填入固定化乳酸氧化酶( l o d ) 玻璃微珠， 构成了集反应器、混合池、螺旋型发光检测池为一体的集成芯片( 图1 1 1 ) 。芯 片大小为1 5 2 0 l l l l n ，通道内体积为1 2 2 皿。该芯片的螺旋型发光检测池下方 固定了一个硅光电二极管用于检测。结合外置的流动注射分析系统，乳酸与0 2 产生过氧化氢的催化反应在反应室进行，而过氧化氢与鲁米诺，铁氰化钾的化学 发光反应在混合室完成，解决t - 酸氧化酶反应和化学发光反应所需酸度不同 的问题。用该装置对人血清中的乳酸进行化学发光检测，线性范围0 5 5 0 m m o l l 。系统进样流速2 0 3 0g l m i n ，分析重现性3 2 ，每次测定所需的时间 少于3 0s ，试样消耗为0 2 吐，该系统虽然混合反应池和螺旋状的检测通道加 工于芯片上，但鲁米诺溶液和铁氰化钾溶液的混合以及混合溶液的注入、磷酸 缓冲溶液和乳酸盐溶液的注入都是用流动注射注射阀从芯片系统的外部进行 的。 2 0 0 3 年，x u l 3 0 墚用与文献【2 0 1 相同的微芯片化学反应器，进行酶催化化学 发光测定葡萄糖的研究。两个注射泵分别泵入反应试剂混合液和葡萄糖样品， 试样流速1 2 51 t l m i n ，系统测定了正常人和糖尿病患者血清中的葡萄糖含量。 - 1 5 - 第一幸绪论 图i 11 集成化芯片化学发光流通检测系统 系统结构图：1 耐热玻璃2 s i 层3 化学发光检测器放置处4 废液孔a 废液b 载液c 化学 发光溶液5 周定化酶反应器6 微珠阻挡器7 v 型沟槽8 混合池 侧面：1 丙烯酸树脂板：2 固定螺丝；3 硅橡胶垫片；4 集成芯片；5 硅光电二极管；6 导 线：7 不锈钢连接管：化学发光试液a 、废液b 、载流c 2 0 0 3 年，j o r g e n s e n 等3 1 1 制作了芯片化学发光法酶反应器，如图1 1 2 所示。 利用流动注射进样，分析了过氧化氢含量。芯片大小有1 0 2 0 珊n 2 ，流通池体 积1 4 皿，光电二极管检测，进样速度4 0i _ t l m i n ，分析速度8 0s 样。流动 注射的采样环为3 2i x l ，进样重现性为5 ，检测限为1 0 0g m o l l 。实际只用 - l 矗 浙江大学硕士毕业捂文 于过氧化氢的检测，尚未将固定化反应器应用于实际测定中。 l b 图1 _ 1 2 固定化酶化学发光法反应器 a 正面两个反应混合器； b 反面排列成l 型的进出口小孔和微阵列排列的光电二极管。 2 0 0 3 年l v 等 3 2 】采用用固定化酶微珠芯片反应器，以化学发光法分析了血 液中的葡萄糖。实验采用的芯片结构如图1 1 3 ，微通道为1 5 0 m 宽，反应小 池r 直径为1 5i t i n l ，1 0 0p m 高。将固定化葡萄糖氧化酶微珠放置在小孔a 中， 鲁米诺和铁氰化钾被固定于一种离子交换树腊上，放在小池b 中。实验中先在 a 中放入反应物反应4m m ，b 中放入缓冲液( n a 3 p 0 4 一n a o h ，p h = 7 4 ) ，然后 再用蠕动泵吸取样品混合。系统特点是使用了空气作为载流。发光信号用p m t 检测，进样流速0 2 5 l ，s ，分析速度1 2 样m ，检测限为0 1m m o l l 。 第一幸绪论 脚p l j a e 图1 1 3 固定化酶微珠芯片反应器 a 司定化酶池；b 化学发光试剂池；c 通道；& 反应池。 2 0 0 1 年，k a m i d a t e 等口3 1 利用肾上腺素和光泽精发生的化学发光，考察两种 微混合芯片的性能，如图1 1 4 所示。系统进样流速1 0p l m i n ，样品消耗5u l ， 两种构型的检测限分别是5 1 0 6 m o l l ( a ) 和8 1 0 7 m 0 1 l ( b ) 。 - l b - 3 浙江大学硕士毕业论文 b 图l t1 4 两种化学发光通道构型图 综上所述，目前有关芯片上的化学发光检测系统的研究自2 0 0 0 年以来呈较 快的上升势头d ”。化学发光体系所使用的驱动手段主要以电渗流和流体动力驱 动方法( 包括外加注射泵或重力) 为主，通常液流流速在p - l m l m i n 之间，试 样试剂消耗较大；连续流动系统中的化学发光检测池体积偏大( 数u , l ) ，一定 程度上也增加试样试剂消耗，以及延长了分析时间。此外，芯片驱动系统多需 附加体积较大的外部设备。将重力驱动与芯片化学发光法结合，一方面可减少 试样、试剂消耗，另一方面可简化仪器结构，在系统微型化方面具有突出优势。 如能解决芯片上的连续换样问题，将迸一步提高系统的自动化和集成化水平。 1 5 参考文献 【1 】方肇伦发掰羟分颜荔学北京，科学出版社，2 0 0 3 【2 】k r i c k al j c i n c h i m a c t a2 0 0 1 ，3 0 7 ：2 19 【3 】3 w u x ，s u z u k im ，s a w a d at ，k i t a m o r ita n a ls c i 2 0 0 0 1 6 ：3 2 1 第一章培论 【4 】w e i g lb h ，k r i e b e lj ，m a y e r sk j ，b u it ，y a g e rpm i k r o c h i m a c t a 1 9 9 9 1 3 1 ：7 5 【5 】w e i g lb h ，b a r d e l lr ，s c h u l t et ，w i l l i a m sc m i c r ot o t a la n a l y s i s s y s t e m s2 0 0 0 2 0 0 0 ：2 9 9 f 6 】6w e i g lb h ，b a r d e l lr ，k e s l e rn ，m o r r i sc j f r e s e n i u s j ，a n a lc h e m ， 2 0 0 1 ，3 7 1 ：9 7 【7 】w w w m i c r o n i c s n e t 【8 】方群李丹妮，徐光明，方肇伦考属全厚缴全分疹绘议碰屯缀系察北京。 2 0 0 2 ：4 4 【9 】方群，李丹妮，陈宏微分析芯片贮液池内的液位稳定装置及其使用方法， 乒厚发穷考烈申请专利号：0 31 1 47 3 4 8 ，2 0 0 3 f 1 0 z h ux ，p h a d k en ，c h a n gd ，c h ob s ，h u hd 。t a k a y a m as m i c r ot o t a l a n a l y s i ss y s t e m s 2 0 0 22 0 0 2 ：15 1 【11 c h ob s ，s u c h u s t e rtg ，z h ux c h a n gd ，s m i t hg d a n a lc h e m 2 0 0 3 ，7 5 ：1 6 7 1 【12 f a n gq a n a lb i o a n a lc h e m 2 0 0 4 ，3 7 8 ：4 9 【1 3 a t t i y as ，j e m e r ea b ，t a n g 丁，f i l z p a r t r i c kg ，s e i l e rk ，c h i e mn ， h a r r i s o nd j e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 1 ，2 2 ：3 1 8 【1 4 a u s s e r e rwa ，b o u s s el ，g a l l a g h e rs j ，k e n n e d yc b 。p h a nh l j a l a 2 0 0 1 6 ：6 9 【1 5 l i nyh ，l e egb ，l ic w ，h u a n ggr ，c h e ns 。h j - c h r o m a t o g r a 2 0 0 1 9 3 7 ：1 1 5 f 1 6 f a n g q ，j i a z j ，f a n g z l m i c r o t o t a l a n a l y s i s s y s t e m s 2 0 0 2 2 0 0 2 ：6 8 5 【1 7 f a n gq ，x ugm ，f a n gz l a n a lc h e m 2 0 0 2 7 4 ：1 2 2 3 f 1 8 】何巧红方群，黄艳贞，晏雷，方肇伦第八届中国化学会分析化学年会， 广西酾范大学学报( 自然科学秘毡2 0 0 3 。2 1 ：2 9 3 【19 】章竹君，李保新，郑行望分笏斌验嘉2 0 0 3 ，2 2 ：9 5 【2 0 x uy ，b e s s o t hfg ，e i j k e lj c t m a n z a a n a l y s t 2 0 0 0 1 2 5 ：6 7 7 2 0 浙江大学硕士毕业论文 【2 1 林金明第八届中国化学会分析化学年会，广西炳澎才学学按f 自然剥学 版) 2 0 0 3 。2 1 ：2 0 【2 2 林金明，屈锋分钎婪糙2 0 0 1 ，2 0 ( 增刊) ：3 1 1 【2 3 】苏荣国，林金明，屈锋，高云华，陈志锋纪学譬勺踞2 0 0 3 ，6 1 ：8 8 5 【2 4 p e t s u lph ，g r e e n w a ygm ，h a s w e l ls j a n a lc h # n a c t a2 0 0 1 ，4 2 8 ： 1 5 5 1 2 5 n e l s t r o pl j ，g r e e n w o o dpa ，g r e e n w a yg m l a bo nac h p2 0 0 1 1 ： 1 3 8 【2 6 g m e n w a yg m ，n e l s t r o pl j ，p o r ts n a n a lc h # n a c t a2 0 0 0 ，4 0 5 ：4 3 f 2 7 m a n g r us d ，h a r r i s o nd j e l e c t r o p h o r e s i s1 9 9 8 ，1 9 ：2 3 0 1 【2 8 k i b an ，t o k i z a w at ，k a t os 。t a c h i b a n am ，t a n ik ，k o i z u m ih ，e d om ， y o n e z a w ae a n a ls c i 2 0 0 1 17 ：8 9 【2 9 n a k a m u r ah ，m u r a k a m iy y o k o y a m ak ，t a m i y ae k a r u b ei a n a l c h e m 2 0 0 1 ，7 3 ：3 7