（药理学专业论文）高糖诱导的肾小球系膜细胞内氧化应激对mnsod的影响及其机制.pdf

徐州医学院硕士学位论文 缩略词 b c 口 d n h g m c m d a 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称中文全称 5 - b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y p h o s p h a t e 5 一溴一4 - 氯一3 吲哚磷酸 d i a b e t i cn e p h r o p a t h y h i 曲g l u c o s eg r o u p m e s a n g i a lc e l l m a l o n d i a l d e h y d e m n s o d m a n g a n e s es u p e r o x i d ed i s m u t a s e n b t n s r o s n i t r o b l u et e t r a z o l i u m n o r m a ls t a n d a r dg r o u p r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 糖尿病肾病 高糖模型组 肾小球系膜细胞 丙二醛 锰超氧化物歧化酶 氮蓝四唑 正常组 活性氧 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h m nr e a c t i o n 反转录聚合酶链反应 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t g f p 1t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - b e t a i 超氧化物歧化酶 转化生长因子一d 1 枷6 3帅9 姗44舢8l-脚y 睁 徐州医学院硕士学位论文 高糖培养的肾小球系膜细胞内氧化应激对 m n s o d 的影响及其机制 中文摘要 目的研究高糖培养的肾小球系膜细胞( m e s a n g i a lc e l l ，m c ) 内氧化应激状态 与锰超氧化物歧化酶( m ns u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，m n s o d ) 表达的关系及其可能的 分子机制。 方法本实验主要通过体外高糖培养大鼠m c 进行研究。设立正常组( n s 组) 、 甘露醇组( m a 组) 、高糖组( h g 组) 、溶媒对照组( d m s o 组) 、过氧化氢组( h 2 0 2 组) 、t g f - p 1 抑制剂组( s b4 3 1 5 4 2 组) 、过氧化氢与t g f p 1 抑制剂共培养组( h s 组) 、抗氧化剂组( n a c 组) 、p 1 3 k 抑制剂组( l y - 2 9 4 ，0 0 2 组) 。按需要，分别在 培养1 6h 时检测以下各项指标：流式细胞仪检测细胞中r o s 的水平( h g 组检测 4 h 、1 0 h 、1 6 h 、2 8 h4 个时间点) ；r t - p c r 法测定t g f p lm r n a 、m n s o dm r n a 的相对含量；w e s t e r nb l o t 法测定细胞中a k t ，p - a k t ，f o x 0 3 a , p - f o x 0 3 a ，m n s o d 蛋 白表达水平；可见光分光光度法测定胞浆t - s o d 和m d a 抗氧化指标的水平。 结果所有结果均显示，n s 组与m a 组比较，差异无统计学意义( 胗0 0 5 ) ； h g 组与d m s o 组比较，差异无统计学意义( 胗0 0 5 ) 。 1 对t - s o d 及m d a 含量的影响 与n s 组比较，h g 组表现出t - s o d 含量减少( p o 0 1 ) ，m d a 水平提高( p 0 0 1 ) ， 差异有统计学意义；与d m s o 组比较，s b4 3 1 5 4 2 组、n a c 组、l y - 2 9 4 ，0 0 2 组表现 出t - s o d 含量增加( 氏0 0 1 ) ，m d a 水平下降( 尸 o 0 1 ) ，差异有统计学意义。 2 r o s 的变化 h g 组检测4h 、1 0h 、1 6h 、2 8h4 个时间点时r o s 的释放量，其他各组均只检 测1 6h 时的结果。h g 组与n s 组比较，在4 h 、1 0h 、1 6h 、2 8h4 个时间点h g 组r o s 释放量均增加，差异有统计学意义( p o 0 1 ) ，且随时间的延长，r o s 的生成量有 2 徐州医学院硕士学位论文 增加的趋势；与d m s o 组相比较，s b4 3 1 5 4 2 组、l y - 2 9 4 ，0 0 2 组及n a c 组r o s 的生 成量均减少，且差异有统计学意义( p o 0 1 ) 。 3 t g f p lm r n a 水平的变化 p c r 结果显示，与n s 组比较，h g 组、h 2 0 2 组t g f d lm r n a 水平有所提高，差 异有统计学意义( p 0 0 5 ) ；与d m s o 组比较，s b4 3 1 5 4 2 组、n a c 组t g f d lm r n a 水平下降，差异有统计学意义( p ，0 0 5 ) ；与h 2 0 2 组比较，h s 组t g f p 1m r n a 水 平下降，差异有统计学意义( 氏o 0 5 ) 。 4 a k t 蛋白磷酸化水平的变化 w e s t e r nb l o t 结果显示，各组间总a k t 蛋白表达无明显变化( 胗o 0 5 ) ；与n s 组比较，h g 组、h 2 0 2 组p a k t t - a k t 值升高，差异有统计学意义( p o 0 5 船 0 0 1 ) ； 与d m s o 组比较，s b 4 3 1 5 4 2 组、n a c 组p - a k t t - a k t 值降低，差异有统计学意义 ( p o 0 5 ) ；h s 组结果与h 2 0 2 组比较，p - a k t t - a k t 值降低，差异有统计学意义 衅o 0 1 ) 。 5 f o x 0 3 a 蛋白磷酸化水平的变化 w e s t e r nb l o t 结果显示，各组间总f o x 0 3 a 蛋白表达无明显变化( 胗o 0 5 ) ；与 n s 组比较，h g 组、h 2 0 2 组p f o x 0 3 a t - f o x 0 3 a 值升高，差异有统计学意义 ( p o 0 5 ) ；与d m s o 组比较，s b4 3 1 5 4 2 组、n a c 组、l y - 2 9 4 ，0 0 2 组p f o x 0 3 a t - f o x 0 3 a 值均降低，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) ；h s 组结果与h 2 0 2 组比较， p - f o x 0 3 a t - f o x 0 3 a 值降低，差异有统计学意义俨 o 0 1 ) 。 6 m n s o d 表达的差异 与n s 组比较，h g 组和h 2 0 2 组m n s o dm r n a 水平及其蛋白表达均降低，差异 有统计学意义( p 0 0 5 ) ；与d m s o 组比较，s b4 3 1 5 4 2 组、n a c 组、l y - 2 9 4 ，0 0 2 组 m n s o dm r n a 水平及蛋白表达均升高，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ) ；与h 2 0 2 组 比较，h s 组m n s o dm r n a 水平及蛋白表达升高，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 1 c o m p a r e d 学位论文 w i t ht h en sg r o u p ，t h eh gg r o u pc a n s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et - s o d ，( 尸 0 0 1 ) ，b u ti n c r e a s em d a ，俨如0 1 ) c o m p a r e dw i t h t h ed m s o g r o u p ，t h es b4 3 15 4 2g r o u p ，t h en a cg r o u pa n dt h el y - 2 9 4 ，0 0 2g r o u pc a l l s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et - s o d ，衅0 01 ) ，b u td e c r e a s em d a ，( 艮0 01 ) 2 t h eh gg r o u p w a sl a u n c h e df o u rd a t a - s a m p l i n go p e r a t i o n so v e r4h ，10h ，16h ，2 8ht i m ei n t e r v a l ，a n d o t h e rg r o u p sw e r ed e t e c t e da t16h c o m p a r e dw i t ht h en sg r o u p ，r o sp r o d u c e d b y m co ft h eh i g hg l u c o s eg r o u p ( 4t i m ei n t e r v a l ) w e r es t r i k i n g l yi n c r e a s e d ，c p 0 0 1 ) c o m p a r e dw i t ht h ed m s og r o u p ，r o sp r o d u c e db ym c o ft h es b4 315 4 2g r o u pa n d t h en a cg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ，帜0 0 1 ) 3 c o m p a r e dw i t ht h en sg r o u p ， t g f - p lm r n al e v e lo ft h eh gg r o u pa n dt h eh 2 0 2g r o u ps i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ， ( f o 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h ed m s og r o u p ，t g f p lm r n a l e v e lo ft h es b4 315 4 2 g r o u p ，t h en a cg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eh 2 0 2g r o u p ， t g f p lm r n al e v e lo ft h eh sg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d 衅0 0 5 ) 4 t h e r ew e r g n os i g n i f i c a n tc h a n g eo ft - a k ta m o n gp r o c e s s i n gf a c t o r sg r o u p s p 0 0 5 ) c o m p a r e d w i t ht h en sg r o u p ，p - a k t t - a k tp r o t e i nr a t i oo ft h eh gg r o u pa n dt h eh 2 0 2g r o u p s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p o 0 5o r p 0 01 ) c o m p a r e dw i t ht h ed m s og r o u p ， p - a k t t - a k tp r o t e i nr a t i oo ft h es b4 315 4 2g r o u p ，t h en a cg r o u pa n dt h el y - 2 9 4 ，0 0 2 g r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eh 2 0 2g r o u p ，p a k t p - a k t p r o t e i nr a t i oo ft h eh sg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ，休0 0 5 ) 5 t h e r ew e r en o s i g n i f i c a n tc h a n g eo ft - f o x 0 3 aa m o n gp r o c e s s i n gf a c t o r sg r o u p s ，0 5 ) c o m p a r e d w i t ht h en sg r o u p ，p - f o x 0 3 a t - f o x 0 3 ap r o t e i nr a t i oo ft h eh gg r o u pa n dt h eh 2 0 2 g r o u ps i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 俨0 0 5 ) c o m p a r e d w i t ht h ed m s og r o u p ， p f o x 0 3 a t - f o x 0 3 ap r o t e i nr a t i oo ft h es b4 3 15 4 2g r o u p ，t h en a cg r o u pa n dt h e l y - 2 9 4 ，0 0 2g r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eh 2 0 2g r o u p ， p - f o x 0 3 ap r o t e i nr a t i oo ft h eh sg r o u ps i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p 0 0 5 ) 6 c o m p a r e d w i t ht h en sg r o u p ，t h eh i g hg l u c o s ea n dt h eh 2 0 2g r o u pc a ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et h e m n s o dm r n aa n dp r o t e i no fm c ，( p 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h ed m s og r o u p ，t h es b 4 315 4 2g r o u p ，t h en a c g r o u pa n dt h el y - 2 9 4 ，0 0 2g r o u pc a ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h e m n s o dm r n aa n dp r o t e i no fm c ( 尸 o 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eh 2 0 2g r o u p ，t h eh s g r o u pc a ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h em n s o d m r n aa n dp r o t e i no fm c ，( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n s1 o x i d a t i v es t r e s si n d u c e db yh i g hg l u c o s ec a ng e n e r a t eal a r g e n u m b e ro fr o si nt h er a tm c ，w h i c hc a nu p - r e g u l a t i n gt h el e v e lo ft g f p l ，a n d 6 徐州医学院硕士学位论文 a c t i v a t i n gi t sd o w n s t r e a mp 1 3 k a k t f o x 0 3 as i g n a lp a t h w a y , a n df i n a l l yn e g a t i v i t y r e g u l a t i n gm n s o de x p r e s s i o ni nt h er a tm c 2 l e s se x p r e s s i o no fm n s o d c a nd a m a g et h e a b i l i t yo fm i t o c h o n d r i at og e tr i do fr o s ，s oa st om a k er o sg e n e r o u s l yi n c r e a s e 3 t h e r e i sp r o b a b l yav i c i o u sc y c l eo fr o sp r o d u c t i o ni nm cc u l t i v a t e db yh i g hg l u c o s ew h i c h i si n d u c e db yo x i d a t i v es t r e s sa n dt g f - p lp l a y st h em a j o rr o l e k e yw o r d sh i g l lg l o c o s e ；m e s a n g i a lc e l l ；o x i d a t i v es t r e s s ；t g f - p 1 ；m n s o d 7 徐州医学院硕士学位论文 曲兰 刖舌 糖尿病肾病( d i a b e t i cn c p h r o p a t h y , d n ) 是糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，d m ) 最 严重的并发症之一，大约有3 0 胰岛素依赖型( i 型) 和5 3 0 非胰岛素依 赖型( i i 型) 糖尿病患者发展成为d n ，其中1 3 的患者发展为终末期肾病【l l ，由 此带来的透析和肾移植等治疗费用在整个医疗支出中所占的比例正在逐年增加， 给患者和社会造成极大的经济负担。随着整个社会医疗水平的提高，糖尿病患者 的平均寿命明显延长，但由于d n 发生发展的机制尚未明确，且临床缺乏有效的 防治办法，故d n 已经成为影响糖尿病预后及糖尿病患者生存质量的最主要因素 之一。d n 大多起病隐匿，在临床早期若不加以控制，一旦出现明显的蛋白尿，病 情进展将难以逆转，终致发展为终末期肾衰。因此，研究d n 由早期向恶性终末 期转变的病变机制，对开发d n 的防治药物、寻找更为有效的临床治疗方案将起 到积极的推动作用。 d n 的发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明。高血糖被认为是d n 形成过程 中的主要启动因子。高糖可以通过激活多种细胞内信号因子导致靶器官损伤。d n 主要的病理改变是肾小球病变，早期主要表现为肾脏肥大，弥漫性和渗出性肾小 球病变，肾小球基底膜( g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e 。g b m ) 增厚，系膜基质扩 张和系膜细胞增生。肾小球系膜细胞( m e s a n g i a lc e l l ，m c ) 是系膜区的主要细胞， 能合成和分泌细胞外基质成分及多种细胞因子和血管活性物质，并参与g b m 的修 复和更新。因此，m c 是肾小球中最活跃的反应性细胞，对维持肾小球的正常结构 和功能具有非常重要的作用【2 】，在d n 的发生发展中也处于非常重要的地位。 糖尿病状态下高糖引起的活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 水平增高对 d n 的发生发展起到极为关键的作用。高糖状态下r o s 的超量主要与线粒体的功 能紊乱有关。当血糖升高时，三羧酸循环过程生成大量还原性电子载体，使线粒 体膜内外电化学势能明显增加，超氧化物生成显著增加。正常情况下，机体通过 徐州医学院硕士学位论文 抗氧化防御系统如还原型谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 、超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，s o d ) 等可迅速清除自由基，以保证r o s 的代谢平衡。而高糖时，抗 氧化物质不能提供有效的代偿反应，细胞内氧化还原平衡难以维持，r o s 超量氧 释放，氧化应激将随之产生【3 棚。超量释放的r o s 可以激活多元醇途径、糖基化终 末产物( a d v a n c e dg l y c o s y l a t i o ne n dp r o d u c t s ，a g e s ) 途径、己糖胺旁路和蛋白激酶 c ( p r o t e i nl 【i n 嬲ec ，p k c ) 途径【3 ，7 ，8 1 ，从不同环节促进d n 的病理进程。 研究表明，糖尿病时高糖刺激所致的转化生长因子1 l ( t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r - i l ，t g f p 1 ) 大量表达。t g f 1 1 是d n 发病的核心因子，具有促进肾纤维化和 系膜细胞病变的作用。本课题组的前期研究工作已经发现，高糖可导致t g f 一8 1 在 大鼠m c 中的表达升高【9 1 2 1 ，以t g f p l 作为核心的细胞因子通过其复杂的信号转导 网络，最终可以激活核内细胞外基质成分如各型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋 白等基因启动子的活性，从而增加细胞外基质的合成，使细胞外基质大量堆积， 基底膜增厚，肾脏纤维化【2 , 1 3 。d n 时，t g f 1 3 l 介导m c 增殖凋亡的作用越来越受 到人们的重视。 磷酸肌醇一3 激酶丝苏氨酸蛋白激酶( p h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e p r o t e i nk i n 弱e b ，p 1 3 k a l ( t ) 信号通路参与很多重要生物学过程的调控。a k t 信号通路主要由磷脂 酰肌醇- 3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 1 ( i n 弱e ，p 1 3 k ) 始动的生物信息传导，p 1 3 k 激活后可以促进下游主要作用靶点a k t 的磷酸化激活，而磷酸化的a k t 又可致凋 亡诱导因子f o x 0 3 a 磷酸化，进而改变f o x 0 3 a 的胞内定位。在无a k t 作用的情况 下，f o x 0 3 a 定位于核内，最终上调以m n 2 十为辅基的超氧化物歧化酶( m ns u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，m n s o d ) 1 4 , 1 5 1 ；。在a k t 作用下，f o x 0 3 a 磷酸化失活，磷酸化的f o x 0 3 a 在自身核输出序列的引导下发生核排斥，从而使f o x 0 3 a 以磷酸化的失活态在胞浆 中滞留【16 1 。伴随f o x 0 3 a 的磷酸化失活的，是m n s o d 表达的减少。m n s o d 是存 在于细胞线粒体中的一种抗氧化酶，在含有大量线粒体的人组织如肝脏、心脏、 肾脏中的含量都较高。m n s o d 的诱导表达对机体防护氧胁迫具有重要作用，它具 徐州医学院硕士学位论文 有清除r o s 自由基、抗癌和延缓衰老等多种生物学功能，与许多氧化应激损伤引 起的疾病有关，可以保护细胞免于氧化应激所致的损伤，其表达的降低也直接影 响着r o s 的清除，在抗氧化酶中具有特殊的重要地位。对m n s o d 的研究，以往 多集中于探讨其生理学功能以及对不同动物进行该基因的克隆和结构分析，而对 m n s o d 基因表达的调节机制研究尚少。m n s o d 的合成是诱导性的，许多因素都 可诱导m n s o d 活性的增加，如电离辐射、肿瘤坏死因子和白介素1 等，通常这 些因素可同时诱导r o s 的产生。因此我们推测r o s 有可能参与了对m n s o d 基因 表达的调控。 在内皮细胞中，t g f p l 可以通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t ea c i d ，n a d p h ) 氧化酶的方式诱导r o s 的产生【1 6 1 。 b r o w n l e e 教授亦在2 0 0 4 年提出线粒体r o s 生成过多是糖尿病并发症的共同上游 机制【6 】，且已有研究表明t g f p l 可激活p 1 3 k a k t f o x 0 3 a 通路及其下游基因介导 m c 的病变【8 ，1 7 , 18 1 。其具体机制仍有待进一步研究。 那么，在糖尿病肾病状态下，肾小球系膜细胞氧化应激的过程中，r o s 与d n 发病的核心因子t g f p l 及其下游p 1 3 列黼o x 0 3 a 信号通路间存在着何种具体的 调节关系? 目前国内外未见报道。我们根据前述文献资料推测，高糖持续刺激下 m c 中的氧化还原失衡促使r o s 超量生成，进而r o s 可能通过t g f p 1 及其下游 p 1 3 l 址t f o x 0 3 a 通路负性调控靶基因m n s o d 的表达，使线粒体清除r o s 自由 基的能力下降，从而进一步推动r o s 生成的异常增多，形成高糖诱导的r o s 生成 的正反馈过程。 为证明以上假设，我们的实验用高糖培养大鼠m c ，并用h 2 0 2 模拟氧化应激 状态下的r o s 环境，采用t g f d 1 激酶受体抑制剂、抗氧化剂以及p 1 3 k 抑制剂分 别对其进行干预，对上述重要靶点如氧化应激、t g f p l 、a k t 、m n s o d 进行研究， 以期明确氧化应激状态下的r o s 超量、t g f p l 过表达及m n s o d 表达变化之间的 内在联系。 徐州医学院硕士学位论文 d n 是糖尿病的严重并发症，了解其从早期向恶性期转变的病变机制对d n 的 防治具有重要意义。我们通过体外培养大鼠m c ，探讨高糖环境下r o s 、t g f d l 以及m n s o d 三者间的内在联系，从新的角度进一步阐释d n 发生发展的病理机制， 将有助于进一步了解d n 的发病机制，为寻找控制早期d n 向恶性终末期转变的新 靶点乃至为寻找新的d n 防治药物提供初步的实验依据。 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 l 材料 1 1 试剂 h b z t - i 大鼠肾小球系膜细胞( m c ) d m e m ( w i m d g l u c o s ea t5 5 6m m o f l ) d m e m ( w i t h d g l u c o s ea t2 5m m o f l ) 总r n a 提取试剂盒( n o d p 4 1 9 ) q u i t 一步法r t - p c r 试剂盒( n o k r l1 3 ) t g f p 1 ，m n s o d 和p - a c t i n 引物 b i o w e s ta g r o s e ( n o 1 0 1 7 1 0 ) d 2 0 0 0 ( n o m d l1 4 0 1 ) 四氮唑蓝( m t t ) ( n o m 2 1 2 8 ) 新生牛血清( l o t 7 1 7 0 3 6 8d ) 细胞裂解液及p m s f ( n o p 0 0 1 3 ) 胰蛋白酶( n o 2 7 2 5 0 0 1 8 ) 武汉大学中国典型培养物保藏中心 美国h i t r o g e ng i b c o 公司 美国m v i t r o g e ng i b c o 公司 天根生化科技( 北京) 有限公司 天根生化科技( 北京) 有限公司 上海生工生物工程有限公司 西班牙b i o w e s t 公司 天根生化科技( 北京) 有限公司 美国s i g m a 公司 美国h l v i t r o g e ng i b c o 公司 碧云天生物技术研究所 美国h l v i t r o g e ng i b c o 公司 青霉素链霉素溶液( 1 0 0 x )( 编号：c 0 2 2 2 )碧云天生物技术研究所 h e p e s ( f w ：2 3 8 3a m0 51 1 ) 甘露醇 b c a ( 编号：p 0 0 1 2 s ) 美国b i o s h a r p 公司 江苏恩华药业集团股份有限公司 碧云天生物技术研究所 、 j - 徐州医学院硕士学位论文 s d s p a g e 蛋白上样缓冲液( 5 x ) ( 编号：p 0 0 1 5 ) 碧云天生物技术研究所 彩色预染蛋白质分子量标准( 编号：p 0 0 6 8 )碧云天生物技术研究所 a k t 抗体( 编号：a a 3 2 6 )碧云天生物技术研究所 p h o s p h o a k t ( s e r4 7 3 ) 抗体( 编号：a a 3 2 9 ) 碧云天生物技术研究所 活性氧检测试剂盒( 编号：s 0 0 3 3 )碧云天生物技术研究所 一抗稀释液( 编号：p 0 0 2 3 a ) 二抗稀释液( 编号：p 0 0 2 3 d ) 封闭液( 编号：p 0 0 2 3 b ) n b t ( s 3 8 0 c2 5 8 9 0 0 0 3 ) b c i p ( s 3 8 1 c2 6 4 3 2 4 0 3 ) t e m e d ( 编号：s t 7 2 8 ) 1 0 s d s ( 编号：s t 6 2 8 ) 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 碧云天生物技术研究所 碧云天生物技术研究所 s c 1 6 1 6 rr a b b i ta n t i a c t i n( 1 1 9 )r 北京中杉金桥生物技术有限公司 ( l o t g 2 2 0 9 ) f o x 0 3 aa n t i b o d y ( n o 9 4 6 7 )美国c e l ls i g n a l i n g 公司 p h o s p h o - f o x 0 3 a ( s e r 2 5 3 ) a n t i b o d y ( n o 9 4 6 6 s ) 美国c e l ls i g n a l i n g 公司 m n s o d ( n o b s 1 0 8 0 r )博奥森生物技术有限公司 山羊抗兔i g g 碱磷酶标记( z b - 2 3 0 8 批号：北京中杉金桥生物技术有限公司 u 0 9 1 2 ) s b4 3 1 5 4 2 ( n o $ 4 3 1 7 5 m g ) l y - 2 9 4 ，0 0 2 ( n o l 9 9 0 8 1m g ) 1 3 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 徐州医学院硕士学位论文 t r i s b a s e ( l o t ：2 0 11 1 2 ) g l y c i n e ( l o t ：2 0 1i 0 9 ) s d s ( l o t ：2 0 1 i 0 9 ) 醋酸纤维素膜 1 2 仪器 t s 1 脱色摇床 c l a s s1 0 0 型c 0 2 培养箱 p c r 反应仪 p s 3 0 0 b 电泳仪电源( 编号：m l 0 2 4 7 0 0 0 ) 5 4 1 7 r 台式高速冷冻离心机 1 2 8 c e 酶标仪 d k - 8 d 型电热恒温水槽 超纯水机( c a tn o 2 r q s s 0 0 5 yl o tn o f 8 n n 2 5 4 7 4 ) x y j 1 4 5 0 d 医用净化工作台 7 0 冰箱 倒置显微镜 b i o r a d 凝胶照相分析系统( 型号：g e l d o c ) e v 2 6 5 型电泳转运系统 p h 计( 型号：p b - 2 1 ) f a c sc a l i b u r 流式细胞仪 1 3 试剂的配制 美国b i o s h a r p 公司 美国b i o s h a r p 公司 美国b i o s h a r p 公司 英国a m e r s h a mb i o s c i e n e e s 公司 海门市麒麟医用仪器厂 美国t h e r m os c i e n t i f i c 公司 美国p e r k i ne l m e r 公司 北京泰亚赛福科技发展有限责任公司 德国e p p e n d o r f 公司 澳大利亚c l i n i b i o 公司 上海医用恒温设备厂 美国m i l l i p o r e 公司 苏州净化设备公司 美国f o r m a 公司 日本奥林巴斯公司 美国b i o r a d 公司 美国h o e f e r 公司 德国s a r t o r i u s 公司 美国b e c t o nd i c k i n s o n 公司 徐州医学院硕士学位论文 1 3 1 d m e m 培养液d m e m 培养基干粉1 袋，n a h c 0 3 3 7g ，加双蒸水到9 5 0m l 左右，调p h 值为7 1 ，加h e p e s2 5g ，用双蒸水配成1 0 0 0m l ，加入青、链霉素 1 0m l ，再用0 2 2p m 微孔滤膜过滤，分装后，2 0 。c 保存。 1 3 2 o 0 1 mp b sb u f f e r ( p h 7 4 ) 分别称量n a c i8 0g ，k h 2 p 0 40 2g ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 5 9 ，k c l0 2 9 ，加双蒸水至u 9 5 0m l 左右，调p h 值为7 4 ，用双蒸水 配成1 0 0 0m l ，再用0 2 2l a m 微孔滤膜过滤，分装后，2 0 保存。 1 3 3 t b e ( p h 8 0 ) 分别称量t r i s1 0 8g ， 硼酸5 5g ，e d t a0 7 4 4g ，加双 蒸水至1 j 9 5 0m l 左右，调p h 值为8 0 ，用双蒸水配成1 0 0 0m l ，室温保存。 1 3 4 电泳液( e l e c t r o p h o r e s i sb u f f e r ，p h9 0 ) 氨基丁三醇3 0 2 5g ，甘氨酸1 8 ，7 5 g ，十二烷基硫酸钠1 0g 加双蒸水至1 0 0 0m l ，不需特别调定p h 值。 1 3 5 电转液( t r a n s f e rb u f f e r ，p h8 3 8 8 )氨基丁三醇2 4 2g ，甘氨酸1 1 5 2g ， 十二烷基硫酸钠o 4g 和甲醇1 6 0m l ，加双蒸水至8 0 0m l ，不需特别调定p h 值。 1 3 6 洗涤液( w a s h i n gb u f f e r ，w b ，p h7 5 ) 氨基丁三醇1 2 1g ，n a c l5 8 4g ， 吐温- 2 0 ( t w e e n 一2 0 ) 1m l ，加双蒸水至1 0 0 0m l ，用数显酸度p h 计调定p h 值。 1 3 7a pb u f f e r1 0 0m m 0 1 l - 1 i r i s h c l ( p h9 o ) ，1 5 0m m 0 1 l 1n a c l ，1m m 0 1 l 1 m g c l 2 。 1 3 8s b4 3 1 5 4 2 ( 1 0 t m o l l 1 )将该试剂按一定量溶于d m s o 中，溶解后再将 液体分别溶到l g 和h g 培养基中，分别定容到1 0 0m l 使其终浓度为1 0l x m o l l 。 1 3 9h 2 0 2 ( 1 0 一m o l l - 1 ) 取一定量h 2 0 2 溶解到l g 培养基中，使其终浓度为 1 0 一m o l l - 1 的h 2 0 2 溶液。 。 1 3 1 0s h 将s b4 3 1 5 4 2 溶于1 0 一m o l l h 2 0 2 的l g 培养基中，配成含s b 4 3 1 5 4 21 0l a m o l l ，含h 2 0 21 0 m o l l - 1 的溶液。 1 3 11n a c ( 5 0p m o l l 1 )将该试剂按一定量溶于d m s o 中，溶解后再将液体 分别溶到l g 和h g 培养基中，分别定容到1 0 0m l 使其终浓度为5 0i t m o l l 1 。 1 3 1 2l y 2 9 4 ，0 0 2 ( 2 01 t m o l l 以)将该试剂按一定量溶于d m s o 中，溶解后再 1 5 徐州医学院硕士学位论文 将液体溶到h g 培养基中，定容到1 0 0m l 使其终浓度为2 0l a m o l l 。 2 方法 2 1 实验流程图 大鼠m c 培养2 4h ( 含5 5 6m m o l l 1 葡萄糖的d m e m ) 上1 l上上上土上上上 n s m ah gd m s o h 2 0 2 s b4 3 1 5 4 2n a cu n 2 9 4 0 0 2h s 1r 各组继续培养 1 6 h 收细胞 町见光分光光度法流式细胞仪检测细胞r t - p c r 检测 w e s t e r nb l o t 检测 测定胞浆b s o d 和中r o s 的水平 t g f p lm r n a 和 a k t ，p - a k t , f o x 0 3 a , m d a 抗氧化指标的 m n s o dm r n a 水平 p - f o x 0 3 a , m n s o d 蛋 水平白表达 i。 啊 it g f - 1 3 l p 1 3 k a k t f o x 0 3 a 通路对高糖诱导的r o s 生成释放的影响 2 2m c 细胞培养 将取回的m c 置于3 7 、含有5 c 0 2 的培养箱中培养。倒置显微镜下观察， 见细胞处于8 0 9 0 汇合阶段进行传代，一般三天传代一次。吸取培养瓶内培养 基，p b s 冲洗2 次，向瓶内加入0 2 5 的胰蛋白酶2m l 后于倒置显微镜下观察， 当发现细胞回缩至近圆形但尚未脱落时，立即终止消化。弃去胰蛋白酶液，加入 徐州医学院硕士学位论文 d m e m 低糖培养基5m l 轻轻吹打细胞使成细胞悬液，以1 0 x 1 0 6 m l 的密度传代。 2 3 细胞抗氧化能力的测定 2 。3 1m c 细胞分组m c 细胞按2 1 培养2 4h 后，分为8 组，分组如表( 表1 ) 。 表1细胞抗氧化能力的测定实验分组 2 3 2 取对数生长期的m c 细胞，以1 0 x 1 0 6 m l 的密度按一定体积传代，2 4 h 后弃去培养基，按表5 分组情况，分别加入处理因素的培养基7m l 继续培养。 1 6h 后，用p b s2m l 洗涤3 次，用胰酶3m l 消化至细胞半脱落状态，倒去胰酶， 用lm lp b s 吹打，尽量将细胞全部吹下。用1 5m 1e p 管收集起来，离心1 0 0 0r p m 5m i n 。3 次，弃上清，用1m lp b s 重悬，再同条件离心，重复3 遍。最后一遍弃上 清后，向e p 管中加4 0 0p lp b s 吹打均匀，用匀浆机匀浆细胞，条件为，工作1 0s ， 间歇2 0s ，工作1 0 次，工作时，将e p 管插入冰浴中。匀浆结束后，用b c a 试剂 盒检测溶液中蛋白浓度。严格按照s o d 和微量m d a 试剂盒要求操作。将所得反 应液用酶标仪检测，s o d 为a s s o ，微量m d a 为a 5 3 2 。 徐州医学院硕士学位论文 2 4细胞内r o s 的测定 按2 2 方法培养细胞，取对数生长期的m c 细胞，以1 0 1 0 6 m l 的密度按一 定体积传代，2 4h 后弃去培养基，按表2 分组情况分别加入处理因素的培养基7m l 。 表2r o s 测定实验细胞分组 继续培养。1 6h 后，弃去培养液，用2m lp b s 洗涤2 遍，n s 组、m a 组、h s 组 加上2m l1 0 x n o l l l g d c f h d a ，h g 组、d m s o 组、s b4 3 1 5 4 2 组、n a c 组、 l y - 2 9 4 ，0 0 2 组加上2m l1 0g m o l l h g d c f h d a 继续培养半小时，加